Summary
DNA抽出用に96ウェルプレートをロードする現在の方法は、汚染を起こしやすい可能性があります。ウェル間のクロスコンタミネーションのリスクを低減する96ウェルプレートの新しいロード方法を詳しく説明します。当社の方法は、他の研究者が高スループットDNA抽出技術の効率を活用し、汚染のリスクを最小限に抑えるのに役立ちます。
Abstract
高スループットのDNAシーケンシング技術は、微生物群集間の関係、宿主特性、およびより広範な生態系機能の理解の進歩に大きく貢献しています。このシーケンシング能力の急速な増加に伴い、環境DNAを最大限の効率で抽出、増幅、分析、解釈する方法が得られます。残念ながら、DNA抽出を迅速に行うことは、サンプル間の汚染のリスクを高める費用がかかります。特に、96ウェルプレートに含まれるサンプルに基づくハイスループット抽出は、単一チューブ抽出と比較して比較的迅速な方法を提供しますが、ウェル・トゥ・ウェル・クロスコンタミネーションの機会も増加します。サンプル間のクロスコンタミネーションのリスクを最小限に抑えるため、高スループット抽出技術のメリットを維持しながら、環境サンプルを96ウェルプレートにロードする新しい方法を開発しました。サンプルをロードしながら、各プレートをカバーするためにピアス可能なPCRシールフィルムを使用し、サンプルをウェルに移動する前にPCRチューブに最初に追加しました。これらのプラクティスは、サンプルドリフトとウェルの意図しない二重積み込みのリスクを軽減します。本稿で概説した手法は、96ウェルプレートに固有のクロスコンタミネーションのリスクを低減しながら、利用可能なハイスループット抽出技術を最大化するアプローチを研究者に提供します。サンプル採取からDNA抽出への移行方法を、不要なクロスコンタミネーションのリスクを最小限に抑えながら、詳細なステップバイステップの概要を提供します。
Introduction
微生物群集のハイスループットシーケンシングの最近の進歩は、比類のないシーケンシング深さを提供しており、その結果、地球のマイクロバイオーム1の機能と多様性を前例のない一見に見ることができます。単一のシーケンシングレーンに多重化する能力が増加するにつれて、単一のチューブDNA抽出は、生態学的データの生成におけるレート制限ステップになる可能性を有する。しかし、高スループットDNA抽出における新しい方法は、これまで可能であったよりも効率の良い大量の環境サンプルを処理する約束を保持する2。これらの方法は、多くの場合、単一のチューブの代わりに96ウェルプレートを使用して、同時に発生する可能性のある抽出の数を増加させることが含まれます。このように、高スループット抽出方法の実用性および効率は明らかであり、土壌33、4および4植物組織3、55からヒト便物質2に至るまでの環境試料3の処理のために実施されている。
これらの方法は、サンプル処理とDNA抽出に沿って劇的にスピードアップすることができますが、土壌やその他の生態学的サンプルを96ウェルプレートにロードする最初のステップは、クロスサンプル汚染の影響を受けやすいです。このタイプの井戸汚染は、DNA抽出,6、7、87の6間に発生する可能性があり、サンプルが緩衝溶液に懸濁される前のこの最初のステップでは特に脆弱です。8McPhersonら 9 は、漏斗と 8 ウェル PCR ストリップ カバーを使用して 96 ウェルプレートに根球土壌をロードする方法を示していますが、その方法はプレートのローディングに対するより制御されたアプローチですが、各サンプルをロードする際に隣接するウェルの汚染に十分な機会を提供します。さらに、オープンウェルは、気が散った研究者が誤った井戸にサンプルを入れるか、すでにロードされている井戸にサンプルを追加する機会を可能にします。さらに、さまざまなサンプルタイプがこのメソッドでの読み込みに適さないことを証明しています。湿ったサンプルは、多くの場合、漏斗に固執し、乾燥サンプルは静電気のために井戸間の「ジャンプ」します。
ハイスループットDNA抽出の第1ステップで井戸間の汚染の機会を減らすために、土壌サンプルを96ウェルプレートにロードする新しいアプローチを開発しました。私たちの方法は両方とも環境暴露から井戸を保護し、誤って1つの井戸に複数のサンプルをロードするのを防ぎます(ダブルローディング)。以下に報告されているこの方法は、汚染の可能性を減らすという約束を提供し、その後のDNA抽出のために96ウェルプレートをロードするより制御された手段を提供すると考えています。
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Protocol
1. 96ウェルプレートを積み込む実験室ベンチと工具の準備
- 70%エタノールでミストでベンチトップをクリア。拭き取り、空気を乾燥させてから、10%漂白剤でベンチトップをスプレーします。ベンチトップを乾かします。
- 95%エタノールに浸漬してマイクロスクラ、ヘラ、手術用ハサミ(湾曲)を殺菌し、炎にさらします。10%漂白剤にそれぞれ浸し、使用前に空気乾燥させます。
注:ツールは、各サンプル間で滅菌する必要があります。
2. サブサンプリングとサンプル調製
- サブサンプリング前にエタノールを使用して手袋を殺菌します。
- サブサンプリングの前に土壌サンプルを十分に均質化します。
- 滅菌ツールを使用して、約半分になるまでサンプルとラベル付けされた2 mL遠心管をロードします。
- 95個のサンプルすべてをサブサンプリングして2 mL遠心管にサブサンプリングするまで、ステップ2.2を繰り返します。96番目 の井戸は、抽出ブランクとして使用する必要があります。
注: 手順 2.3 と 2.4 は、必要なストレージ領域を最小限に抑え、オーバーサンプリングまたはダブル サンプリングを防止するために実行されます。 - プレートを装填するまで氷の上に2 mLのサブサンプルチューブを保管してください。
- ラベル 96 無菌 200 μL フラットキャップ PCR チューブ A1\u2012A12、B1\u2012B12..H1\u2012H12.これらのチューブを96ウェルラックに順番に入れ替えます。
- 適切な場所 (A1\u2012H12) を持つサンプル ID を割り当てて、それを記録します。
3. プレートの準備
- 96ウェルプレート(図1A-1C)からゴムカバーを取り外し、滅菌プラスチック袋に入れます( 材料表を参照)。ビニール袋を密封して汚染を防ぎます。
- 96ウェルプレートをシールフィルムで覆います(図1D-1E)。たとえば、プレカットピアス可能なシールフィルムを使用します( 資料表を参照)。ゴムローラーで転がしてシールを確保します。
注:ピアス可能なシリコーンマットは、使用間の適切な洗浄を提供する再利用可能なオプションを提供する可能性がありますが、テストしたシリコーンマットはピアスに沿って簡単に分割され、次のプレートと同等の保護を提供しません。 - 冷ましておくために冷蔵庫(4°C)にプレートを置きます。
4. サブサンプルの転送
注:土壌サンプルが非常に小さい場合の変更については、ステップ4.13を参照してください。
- 2 mLサブサンプルのうち24個を氷塊に入れ、冷蔵します。
- サンプル名と位置シートを使用して、正しい200 μLフラットキャップPCRチューブを選択します。
- 2 mL サブサンプルチューブと渦を~5 s で取り、均質化を確実にします。
- 炎と漂白剤の滅菌ツールを使用すると、最初のサンプルの約200 μLが正しいフラットキャップ PCR チューブにロードされます (図 1F)。
- 24 個のサンプルがすべてロードされるまで、手順 4.2\u20124.4 を繰り返します。次に、ステップ 4.6 に移動します。
- 漂白紙ワイプを使用して、200 μLのフラットキャップPCRチューブの外側を洗浄します。
- チューブを反転し、チューブの上にサンプルを移動するためにベンチをタップします。漂白および炎滅菌されたはさみで、PCRチューブの底部をクリップして、サンプルが96ウェルプレートに落ちるための開口部を作成します(図1G)。
- 96ウェルプレート上の正しい井戸を見つけ、その井戸に達するまでカットエンドを向けてプレートを横切ってチューブを渡します。プレートを少し傾けてプレカットピアス可能なシールフィルムの穿刺を容易にし、チューブが正しい上にある場合にのみ慎重に反転してカットチップがウェルに収まるようにします。滅菌ツールを使用して、すべての土壌がチューブからウェルに落ちるまでPCRチューブの上部をタップします。蓋を閉じた状態でチューブを井戸内に置いたままにしておきます(図1H-1J)。
- フラットキャップの200 μL PCRチューブを一度に1本取り除き、750 μLのビーズ溶液をそのウェルに加えます(図1K)。200 μL のフラットキャップ PCR チューブをウェルに押し込み、上部にシャーピーを付けて、このウェルがロードされたことを示します。各サンプルに対してこの手順を繰り返します。
- 24個のサンプルをすべてロードしてビーズ溶液を追加したら、2 mLサブサンプルチューブを取り外し、24個の未サンプリングチューブに交換します。
- 手順 4.1\u20124.10 を繰り返し、95 個のウェルすべてにサンプルまたはブランクとビーズのソリューションがロードされます。開いた井戸の上にチューブを渡さずにチューブを取り外します(図1L)。
- 慎重に穿孔可能なフィルムを取り外し、ゴムカバーを交換して、抽出を開始するまでプレートを保護します(図1M-1O)。
- また、細粒度の高い土壌の非常に少量の場合は、サンプルチューブにビーズ溶液の750 μLを追加し、適切な井戸にすべての内容物を転送するために広ボアピペットチップを使用しています。二重の負荷を防ぐために、開口部にPCRチューブを置きます。
注:この変更を実装する場合は、粒子状有機物やピペットチップの穴よりも大きい小さな岩石の破片がピペットを詰まらせ、サンプルスラリーの移動を困難にする可能性があります。 - 必要に応じて -20 °C で凍結し、計画抽出までサンプルとビーズ溶液を積んだプレートを保管します。
5. プレートローディング方法の比較
注:96ウェルDNA抽出プレートの読み込みに関する新しい方法を検証するために、1つの96ウェルプレートを3つのセクションに分割しました。私たちは、土壌とクロス汚染の意図しないローディングの可能性を比較するために、プレートローディングの3つの異なる方法を使用しました。私たちが使用した3つの方法は、マクファーソンら9、Qiagenのデフォルトのロードプロトコル10、および本書で概説するプロトコルで概説されている方法でした。9
- プレートに土壌をロードする
- 96ウェルプレートを3つの4列ブロックに切り分けます。上記の 3 つの方法のいずれかを使用して、各ブロックを読み込みます。
- サンプルと空白の井戸がずらすように、他のすべての井戸に土壌をロードします。この配置は不注意なサンプルの負荷および交差汚染のための最大の機会を可能にする。
- 96ウェルプレートを-20°CでDNA抽出まで凍結します。
- DNA抽出
- メーカーの96ウェルプレート抽出プロトコル10に従ってDNAを抽出する。
- DNA抽出物は、さらなる分析まで-20°Cで保存します。
- ブランクウェル内のDNAの定量化
- DNA抽出物を室温で解凍し、プレートスピナーを使用して渦とスピンダウンを行います。
- 分光光度計を用いて、ブランクウェルのDNA濃度を測定し、記録します。
- ANVOAとTukeyのポストホック検査を使用して、ブランクウェル内の平均DNA濃度の違いを分析します。
注意:α= 0.05で有意差が報告されました。
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Representative Results
この新しい方法は、96ウェルDNA抽出プレートをロードするために正常に使用されました。プレートローディング方法の比較は、ブランクウェル内で最も低いDNA濃度を有する我々の方法を示した。ブランクウェル中のDNA濃度は、私のMcPhersonら (p<0.05)の方法よりも有意に低かったが、我々の方法におけるDNA濃度はQiagenデフォルト法と統計的に異なっていない(図2)。3つの方法はすべて2ng/μLの下で平均DNA濃度を産生したが、我々の新しい方法だけが測定可能なDNA濃度を持たない井戸を産生した。
図1:井戸間の交差汚染の可能性を最小限に抑えながら、DNA抽出のためにサンプルを96ウェルプレートにロードするステップバイステップの方法。濃い灰色のカバー(ステップA、B、N、およびOに存在する)は、抽出キットに付属のシリコンカバーを表します。ライトグレーのカバー(ステップDで塗布され、ステップLの後に取り除く)は、装填中にプレートを覆うために使用される穿孔可能なPCRテープを表す。写真は示されていませんが、各サンプルをロードする前にツールを滅菌し、PCRテープを貫通する前にPCRチューブを漂白剤で拭く必要があります。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ブランクウェルのDNA濃度。DNA濃度はng/μLで表され、文字はα= 0.05でのDNA濃度の有意な対方向の差を示す。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この方法は、高スループットのサンプル抽出プレートをロードしながら、ウェルツーウェルクロスコンタミネーションの機会を減らし、既存のプレートローディング戦略99,1010を超えて96ウェルプレートをロードするためのより制御された手段を提供する。井戸間の汚染は、特に自動化された66、77の場合よりも96ウェルプレート抽出でより普及することができ、特に方法論では特にテストされていないが、プレートローディングの期間中、抽出プレートの井戸を開いたままにした場合、クロスコンタミネーションのリスクが最も高いと仮定することができる。単一チューブ抽出と比較してプレートベースの抽出におけるクロスコンタミネーションの機会が増えることを考えると、滅菌カバーによる保護井戸は、サンプルを96ウェルプレートにロードする重要な第一歩と考えるべきです。この必要性にもかかわらず、ハイスループット抽出キットで提供される指示は、単にプレートをロードし、「サンプルウェル間の交差汚染を避ける」と言うが、これを行う方法に関する追加情報を提供しない10.96ウェル抽出プレートにサンプルを添加しながら汚染を減らすために、McPhersonら 9は、プレートをPCRシーリングテープのカットストリップで覆い、それらを剥離して各ウェルにアクセスすることを提案する。この方法では、すべての井戸が開いている合計時間が短縮されますが、井戸は不等時間で開き、汚染の影響を最も受けやすいウェルの一部(読み込まれるサンプルに最も近い井戸)がロードイベント中に露出します。さらに、PCRシーリングテープの剥離は、土壌が井戸から井戸に移る静電気を作り出す可能性があり、抽出で観察された空白の井戸のDNA濃度が高くなる可能性があります。さらに、この方法論では、選択した井戸に置かれる前にサンプルが発見された井戸の上に渡される必要があり、研究者が誤って2つのサンプルを単一の井戸にロードしたり(二重ローディング)したり、2つ以上のサンプルの位置を混ぜたりすることを妨げるものは何もありません。捕まえられた場合、二重負荷はリソースの無駄に過ぎません。しかし、サンプルの場所の二重の積み込みまたは混合が気付かれない場合、実験結果は7.
上で概説した方法は、高スループットのDNA抽出プレートをロードするための制御手段を提供する。具体的には、当社の方法は、常に井戸を覆い続けることによって、クロス汚染のリスクを低減します。ウェルは、最初はシーリングテープで覆われ、サンプルローディングに使用されるPCRチューブで覆われます。この方法は、クロスコンタミネーションのリスクを低減するだけでなく、2つのサンプルを単一の井戸にロードするリスクを完全に防ぎます。サンプルをウェルにロードすると、PCRチューブはブロックとして機能し、別のサンプルの添加を防ぎます。プレート位置を持つすべてのチューブにラベルを付ける(例えば、A1、A2..H11、H12)サンプルをロードする前に、このメソッドは、すべてのサンプルがロードされ、ウェルが見逃されていないことを確認するための最終チェックも提供します。この方法は、井戸をロードするためのより制御された手段を提供しますが、プレートをロードする人は、プレート上にカットPCRチューブを渡す際に特別な注意を払う必要があります。井戸は密閉されていますが、密閉されたプレートの表面に落ちるサンプル粒子は、技術者がフィルムを突き刺して正しいサンプルをそれらの井戸に積み込むとき、意図しない井戸に入る可能性があります。この問題を回避するために、PCRチューブでシーリングテープを穿刺する前に、96ウェルプレートを〜40°に傾けます。このアプローチは、チューブの開いた端を直立し、間違った井戸から遠ざけるのに役立ちます。
土壌サンプルが非常に少量または非常にきめ細かい場合、土壌サンプルをPCRチューブにロードする代わりに広いボアピペットチップを使用すると、各サンプルを転送する方が効果的です。この変更のために、最初のバッファー溶液をサンプルチューブに加え、次にサンプルと溶液の両方を96ウェルプレートにピペット化する必要があります。このステップの後に各ウェルにPCRチューブを追加すると、二重ローディングを防ぐことができます。プロトコルセクションで述べたように、この改変を使用する場合、研究者または技術者は、ピペットのボアを詰まらせる可能性を持つため、粒子状有機物または小さな岩石の破片を非常に認識する必要があります。
サンプルローディングの方法はサンプル汚染のリスクを完全に排除することはできませんが、上記の方法は、これらのリスクを大幅に低減し、サンプル位置の二重の積み込みと混合のリスクを完全に排除する手段を提供します。全体として、この方法は、高スループットのDNA抽出プレートをロードするための既存の技術の大きな改善であると考えており、ハイスループット抽出プレートを使用するすべての微生物学者が上記のような方法を使用することを示唆しています。
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Disclosures
著者らは利益相反を報告せず、開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、NSF賞#EPS-1655726からの資金援助を受けた微生物生態学によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 oz WhirlPak | Nasco | B01065 | |
| 2 mL centrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 200 µL micro-PCR tubes | Thermo Scientific | AB 2000 | |
| 96-well PowerSoil DNA extraction kit | Qiagen | 12955-4 | We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work. |
| Ice block for 2 mL centrifuge tubes | Any | Any | Any ice block made for 2 mL tubes will work |
| Ice block for 200 µL micro-PCR tubes | Any | Any | Any ice block made for 200 µL tubes will work |
| Micro scoopula | Any | Any | |
| Precut Pierceable Sealing Film | Excel Scientific | XPS25 | |
| Spatula | Any | Any | |
| Surgical scissors | Any | Any |
References
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