Summary
Huidige methoden voor het laden van 96-well platen voor DNA-extracties kunnen gevoelig zijn voor verontreiniging. We beschrijven een nieuwe methode voor het laden van 96-well platen die het risico op kruisbesmetting tussen putten vermindert. Onze methode zal andere onderzoekers helpen om te profiteren van de efficiëntie van dna-extractietechnieken met hoge doorvoer en het risico op besmetting te minimaliseren.
Abstract
Dna-sequencingtechnieken met hoge doorvoer hebben aanzienlijk bijgedragen aan de vooruitgang in ons begrip van relaties tussen microbiële gemeenschappen, gastheerkenmerken en bredere ecosysteemfuncties. Met deze snelle toename van de breedte en diepte van de sequencing mogelijkheden zijn gekomen methoden om te extraheren, versterken, analyseren en interpreteren milieu-DNA met succes met maximale efficiëntie. Helaas kan het uitvoeren van DNA-extracties snel ten koste gaan van het verhogen van het risico op besmetting tussen monsters. Met name extracties met hoge doorvoer die gebaseerd zijn op monsters in een 96-putplaat bieden een relatief snelle methode, in vergelijking met extracties met één buis, maar vergroten ook de mogelijkheden voor goed tot goed kruisbesmetting. Om het risico van kruisbesmetting tussen monsters te minimaliseren, met behoud van de voordelen van technieken voor het afzuiden van hoge doorvoer, hebben we een nieuwe methode ontwikkeld voor het laden van milieumonsters in 96-putplaten. We gebruikten pierceable PCR afdichtingsfolies om elke plaat te bedekken tijdens het laden van monsters en voegden eerst monsters toe aan PCR-buizen voordat we ze in putten verplaatsten; samen verminderen deze praktijken het risico op monsterdrift en onbedoelde dubbele belasting van putten. De methode die in dit document wordt beschreven, biedt onderzoekers een aanpak om de beschikbare technieken voor het uitstipperen van hoge doorvoerextractie te maximaliseren en tegelijkertijd het risico op kruisbesmetting te verminderen dat inherent is aan 96-putplaten. We geven een gedetailleerd stap voor stap overzicht van hoe je van monsterverzameling naar DNA-extractie gaan en tegelijkertijd het risico op ongewenste kruisbesmetting minimaliseert.
Introduction
Recente vooruitgang in high-throughput sequencing van microbiële gemeenschappen bieden ongeëvenaarde sequencing diepte en, bijgevolg, een onvoorwaardelijke blik in de werking en diversiteit van het microbioom van de aarde1. Naarmate de mogelijkheid om multiplex meer en meer monsters op een enkele sequencing lane toeneemt, single tube DNA extractie heeft het potentieel om een tarief-beperkende stap in de generatie van ecologische gegevens. Nieuwe methoden bij dna-extracties met hoge doorvoer beloven echter grote hoeveelheden milieumonsters met een grotere efficiëntie dan voorheen mogelijk was2. Deze methoden omvatten vaak het gebruik van 96-well platen in plaats van single-tubes, waardoor het mogelijke aantal extracties die gelijktijdig kunnen optreden. Als zodanig zijn de uitvoerbaarheid en efficiëntie van extractiemethoden met hoge doorvoer duidelijk en zijn zij toegepast voor de verwerking van milieumonsters, variërend van bodem3,4 en plantaardige weefsels3,5 tot menselijke fecale stoffen2.
Hoewel deze methoden drastisch kunnen versnellen langs monsterverwerking en DNA-extractie, is de eerste stap van het laden van grond en andere ecologische monsters in 96-put platen gevoelig voor kruismonsterverontreiniging. Dit type van goed-tot-welzijn besmetting kan optreden tijdens DNA-extracties6,7,8, en putten zijn bijzonder kwetsbaar in deze eerste stap voordat monsters worden opgehangen in een bufferoplossing. McPherson et al.9 tonen een methode om rhizosfeerbodems in 96-putplaten te laden met behulp van trechters en 8-well PCR-striphoezen, maar terwijl hun methode een meer gecontroleerde benadering van laadplaten is, biedt het nog steeds voldoende gelegenheid voor verontreiniging van naburige putten bij het laden van elk monster. Bovendien bieden de open putten de kans voor een afgeleide onderzoeker om een monster in de onjuiste put te plaatsen of een monster toe te voegen in een put die al is geladen. Bovendien blijken verschillende monstersoorten niet geschikt te zijn om met deze methode te worden geladen; natte monsters vaak vasthouden aan de trechters en droge monsters 'springen' tussen putten als gevolg van statische elektriciteit.
Om de kans op verontreiniging tussen putten te verminderen in de eerste stap van dna-extracties met hoge doorvoer, ontwikkelden we een nieuwe aanpak voor het laden van bodemmonsters in 96-putplaten. Onze methoden beschermen putten tegen blootstelling aan het milieu en voorkomen dat we per ongeluk meerdere monsters in één put laden (dubbelladen). Wij geloven dat de onderstaande methode belooft het potentieel voor verontreiniging te verminderen en als zodanig een meer gecontroleerde manier biedt om 96-well platen te laden voor latere DNA-extractie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Laboratoriumbank en gereedschapsvoorbereiding voor het laden van een 96-putplaat
- Heldere banktop door nevelen met 70% ethanol. Veeg af en laat de lucht drogen voordat u de bank met 10% bleekwater besproeit. Veeg de bank boven droog.
- Steriliseren micro-scoopula, spatel, en chirurgische schaar (gebogen) door dompelen in 95% ethanol en vervolgens bloot te stellen aan een vlam. Dip elk in 10% bleekmiddel en laat de lucht drogen voorafgaand aan gebruik.
OPMERKING: Hulpmiddelen moeten tussen elk monster worden gesteriliseerd.
2. Subbemonstering en monsterbereiding
- Steriliseren handschoenen met behulp van ethanol voorafgaand aan sub-bemonstering.
- Homogeniseren bodemmonsters grondig voorafgaand aan subbemonstering.
- Met behulp van gesteriliseerde gereedschappen, laad een gelabelde 2 mL centrifuge buis met monster tot ongeveer de helft vol.
- Herhaal stap 2.2 totdat alle 95 monsters zijn onderbemonsterd in gelabelde 2 mL centrifugebuizen. De96e put moet worden gebruikt als een extractie leeg.
OPMERKING: De stappen 2.3 en 2.4 worden uitgevoerd om de benodigde opslagruimte te minimaliseren en over- of dubbele bemonstering te voorkomen. - Bewaar 2 mL submonsterbuizen op ijs tot het laden van de plaat.
- Label 96 steriele 200 μL platgetopte PCR buizen A1\u2012A12, B1\u2012B12, .... H1\u2012H12. Plaats deze buizen in een 96-put rek.
- Wijs een voorbeeld-ID met een bronlocatie toe (A1\u2012H12) en neem deze op.
3. Plaatbereiding
- Verwijder de rubberen deksel van 96-put plaat (Figuur 1A-1C) en plaats het in een steriele plastic zak (zie tabel van materialen). Sluit de plastic zak af om besmetting te voorkomen.
- Bedek de 96-put plaat met afdichtingsfilm (Figuur 1D–1E); gebruik bijvoorbeeld een voorgesneden doorborenbare afdichtingsfilm (zie de tabel met materialen). Zorg voor afdichting door te rollen met een rubberen roller.
OPMERKING: Pierceable siliconen matten kunnen mogelijk bieden een herbruikbare optie, mits de juiste reiniging tussen toepassingen, maar de siliconen matten die we getest gemakkelijk gesplitst langs de pierces en zou niet bieden gelijke bescherming voor eventuele volgende platen. - Plaats de plaat in de koelkast (4 °C) om koel te blijven.
4. Overdracht van submonsters
OPMERKING: Zie stap 4.13 voor wijzigingen wanneer het bodemmonster erg klein is.
- Plaats 24 van de 2 mL submonsters in een ijsblok voor koude opslag.
- Kies met de monsternaam en het goedlocatieblad de juiste 200 μL plat afgetopte PCR-buis.
- Neem een 2 mL submonster buis en vortex voor ~ 5 s om homogenisatie te garanderen.
- Met behulp van vlam- en bleekmiddelgesteriliseerde gereedschappen laden ~200 μL van het eerste monster in de juiste plat afgetopte PCR-buis(figuur 1F).
- Herhaal stap 4.2\u20124.4 totdat alle 24 monsters zijn geladen. Ga dan naar stap 4.6.
- Maak met behulp van een gebleekt papierdoek de buitenkant van de 200 μL plat afgetopte PCR-buis schoon.
- Keer de buis om en tik op de bank om het monster naar de bovenkant van de buis te verplaatsen. Met gebleekte en vlam-gesteriliseerde schaar, clip de onderkant van de PCR buis om een opening voor monster te vallen in de 96-put plaat(Figuur 1G) te creëren.
- Zoek de juiste put op een 96-put plaat en passeer de buis over plaat met gesneden einde naar boven tot het bereiken van dat goed. Kantel de plaat iets om het doorboren van voorgesneden doorborende afdichtingsfilm te vergemakkelijken, en alleen wanneer de buis direct boven de juiste put is, omkeren deze zorgvuldig, zodat de snijpunt in de put past. Tik met gesteriliseerde gereedschappen op de bovenkant van de PCR-buis totdat alle grond uit de buis in de put is gevallen. Laat de buis in de put met deksel gesloten (Figuur 1H–1J).
- Verwijder één met platte maximum afgetopte 200 μL PCR-buis per keer en voeg 750 μL kraaloplossing toe aan die put(figuur 1K). Duw de 200 μL flat-capped PCR buis helemaal naar beneden in de put en markeer de top met sharpie om aan te geven dat deze put is geladen. Herhaal dit voor elk monster.
- Zodra alle 24 monsters zijn geladen en kraal oplossing toegevoegd, verwijder de 2 mL submonster buizen en vervangen door 24 ongestempelde buizen.
- Herhaal stap 4.1\u20124.10 totdat alle 95 putten zijn geladen met monster of blanco en kraaloplossing. Verwijder buizen zonder ze over open putten te laten gaan(figuur 1L).
- Verwijder voorzichtig doorborenbare folie en vervang de rubberen deksel om de plaat te beschermen tot het begin van de extractie(figuur 1M–1O).
- Voor zeer kleine hoeveelheden grond die ook fijnkorrelig zijn, voeg 750 μL kraaloplossing toe aan de monsterbuis en gebruik een brede pipettip om alle inhoud naar de juiste put over te brengen. Plaats PCR buis in de opening om dubbele belasting te voorkomen.
OPMERKING: Wees voorzichtig bij de uitvoering van deze wijziging als deeltjes organische stof of kleine rotsfragmenten groter dan de boring van de pipet tip kan verstoppen de pipet en maken de overdracht van het monster drijfmest moeilijk. - Zo nodig bevriezen bij -20 °C en platen met monster en kraaloplossing op te slaan tot geplande extractie.
5. Vergelijking van plaatbeladingsmethoden
OPMERKING: Om onze nieuwe methode voor het laden van 96-well DNA-extractieplaten te verifiëren, hebben we een enkele plaat van 96 put in drie secties verdeeld. We gebruikten drie verschillende methoden van plaatbelasting om het potentieel voor onbedoelde belasting van grond en kruisverontreiniging te vergelijken. De drie methoden die we gebruikten waren de methoden die in McPherson et al.9, Qiagen's standaard lading protocol10, en het protocol dat we schetsen in deze publicatie.
- Grond in de plaat laden
- Sectie een 96-put plaat in drie vier-kolom blokken. Laad elk blok met behulp van een van de drie hierboven genoemde methode.
- Laad de grond in elke andere put, zodat monster en lege putten worden gespreid. Deze regeling biedt maximale mogelijkheden voor onbedoelde monsterbelasting en kruisbesmetting.
- Bevries de 96-put plaat bij -20 °C tot DNA-extractie.
- DNA-extractie
- Haal DNA eruit volgens het 96-well plate extractieprotocol10van de fabrikant.
- Bewaar de DNA-extracten op -20 °C tot nader onderzoek.
- Kwantificering van DNA in lege putten
- Dooi DNA-extracten bij kamertemperatuur, vortex en spin naar beneden met behulp van een plaat spinner.
- Meet en neem DNA-concentraties van lege putten met behulp van een spectrofotometer.
- Gebruik anvoa en Tukey's post-hoc test om verschillen in gemiddelde DNA-concentratie in lege putten te analyseren.
OPMERKING: Significante verschillen werden gemeld bij α = 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze nieuwe methode werd met succes gebruikt om 96-well DNA extractieplaten te laden. Vergelijking van plaatbeladingsmethoden toonde onze methode om de laagste DNA-concentratie in de lege putten te hebben. De DNA-concentratie in de lege putten was aanzienlijk lager dan de voorgestelde methode mijn McPherson et al.9 (p < 0,05), hoewel dna-concentraties in onze methode statistisch niet verschilden van de Qiagen standaardmethode(figuur 2). Alle drie de geproduceerde methoden betekenen DNA-concentraties onder 2 ng/μL, hoewel alleen onze nieuwe methode putten produceerde zonder meetbare DNA-concentratie.
Figuur 1: Stap voor stap methoden om monsters te laden in 96-well platen voor DNA-extractie, terwijl het minimaliseren van de kans op kruisbesmetting tussen putten. Donkergrijze covers (aanwezig in stappen A, B, N en O) vertegenwoordigen de siliciumhoes die bij de extractiekit wordt geleverd. De lichtgrijze afdekking (toegepast in stap D, verwijderd na stap L) vertegenwoordigt de doorborenbare PCR-tape die wordt gebruikt om de plaat tijdens het laden te bedekken. Hoewel niet afgebeeld, tools moeten worden gesteriliseerd voorafgaand aan het laden van elk monster, en PCR buizen moeten worden afgeveegd met bleekmiddel voorafgaand aan piercing de PCR tape. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: DNA-concentraties van lege putten. DNA-concentratie wordt vertegenwoordigd in ng/μL. Letters geven significante paarsverschillen in DNA-concentraties aan bij α = 0,05. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze methode vermindert de mogelijkheden voor goed tot goed kruisbesmetting tijdens het laden van monsterextractieplaten met hoge doorvoer en biedt een meer gecontroleerd middel om platen met 96-bron te laden die verder gaan dan de bestaande strategieën voor het laden van platen9,10. Verontreiniging tussen putten kan meer alomtegenwoordig zijn bij 96-put plaatextracties dan bij extracties met één buis, vooral wanneer geautomatiseerde6,7, en, hoewel niet specifiek getest in een methodologie, het risico van kruisbesmetting het hoogst kan worden aangenomen wanneer de putten van de extractieplaten open blijven voor de duur van het laden van de plaat. Gezien de toegenomen kans op kruisbesmetting bij extracties op basis van platen in vergelijking met extracties met één buis, moet de bescherming van putten met een steriele afdekking worden beschouwd als een belangrijke eerste stap in het laden van monsters in een 96-putplaat. Ondanks deze behoefte, instructies in high-throughput extractie kits gewoon zeggen om de plaat te laden en om "te voorkomen dat kruisbesmetting tussen monster putten," maar bieden geen aanvullende informatie over hoe dit te doen10. Om verontreiniging te verminderen terwijl het toevoegen van steekproeven aan een 96-goed extractieplaat, stelt McPherson et al.9 voor het behandelen van de plaat met gesneden stroken VAN PCR het verzegelen band, die hen terug pellen om tot elke put toegang te krijgen. Deze methode vermindert de totale tijd dat alle putten open zijn, maar putten staan open voor ongelijke hoeveelheden tijd en sommige van de putten die het meest gevoelig zijn voor verontreiniging - degenen die het dichtst bij het monster liggen dat wordt geladen - worden blootgesteld tijdens de laadgebeurtenis. Bovendien heeft peeling van PCR afdichting-tape het potentieel om statische elektriciteit te creëren die ertoe leidt dat de bodem van goed naar goed wordt overgebracht en verantwoordelijk zou kunnen zijn voor de hogere DNA-concentraties in lege putten die in onze extractie worden waargenomen. Bovendien vereist deze methode dat monsters worden doorgegeven over ongedekte putten voordat ze in de bron van keuze worden geplaatst, en niets belet een onderzoeker om per ongeluk twee monsters in een enkele put te laden (dubbele belasting) of de locatie van twee of meer monsters te mengen. Als gevangen, dubbele lading vormt niets meer dan een verspilling van middelen. Indien echter een dubbele belasting of vermenging van monsterlocaties onopgemerkt blijft, kunnen de experimentele resultaten worden vervormd7.
De methode die we hierboven beschreven biedt een gecontroleerd middel om hoge doorvoer DNA-extractie platen te laden. Met name onze methode verlaagt het risico op kruisbesmetting door putten te allen tijde gedekt te houden. De putten worden in eerste instantie bedekt met afdichtingstape en worden vervolgens bedekt met de PCR-buis die wordt gebruikt voor het laden van monsters. Deze methode vermindert niet alleen het risico op kruisbesmetting, maar voorkomt ook volledig het risico van het laden van twee monsters in één put. Zodra we een monster in een put laden, dient de PCR-buis als een blok, waardoor toevoeging van een ander monster wordt voorkomen. Door alle buizen te labelen met plaatlocatie (bijv. A1, A2... H11, H12) voorafgaand aan het laden van monsters, deze methode biedt ook een laatste controle om ervoor te zorgen dat alle monsters zijn geladen en geen putten zijn gemist. Hoewel deze methode een meer gecontroleerd middel biedt om putten te laden, moet iedereen die een plaat laadt extra voorzichtig zijn bij het passeren van een gesneden PCR-buis over de plaat. Hoewel de putten zijn verzegeld, kunnen alle monsterdeeltjes die op het oppervlak van de verzegelde plaat vallen hun weg vinden in onbedoelde putten wanneer de technicus de film doorboort om de juiste monsters in die putten te laden. Om dit probleem te voorkomen, kantelen we de 96-put plaat naar ~ 40° voordat we de afdichtingstape met de PCR-buis doorboren. Deze aanpak helpt om het open uiteinde van de buis rechtop en uit de buurt van de onjuiste putten te houden.
Wanneer bodemmonsters zeer kleine hoeveelheden en/of zeer fijnkorrelig zijn, kan het gebruik van een ruime pipetpunt in plaats van het laden van bodemmonsters in PCR-buizen effectiever zijn bij het overbrengen van elk monster. Voor deze wijziging moet de eerste bufferoplossing aan de monsterbuis worden toegevoegd en vervolgens zowel monster als oplossing in de 96-putplaat worden gepipeteerd. Het toevoegen van een PCR buis aan elke put na deze stap zal voorkomen dat dubbele laden. Zoals vermeld in het protocol sectie, bij het gebruik van deze wijziging, de onderzoeker of technicus moet zeer bewust zijn van deeltjes organische stof of kleine rotsfragmenten als deze hebben het potentieel om de boring van de pipet verstoppen.
Hoewel geen enkele methode voor het laden van monsters het risico van monsterverontreiniging volledig kan elimineren, biedt de methode die we hierboven schetsen een middel om deze risico's aanzienlijk te verminderen en het risico van dubbel laden en mengen van monsterlocaties volledig te elimineren. Over het algemeen zijn wij van mening dat deze methode een grote verbetering is ten opzichte van de bestaande technieken voor het laden van DNA-extractieplaten met hoge doorvoer en suggereren dat alle microbiologen die extractieplaten met hoge doorvoer gebruiken, overstappen naar een methode zoals hierboven beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs melden geen belangenconflicten en hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door de Microbiële Ecologie Collaborative met financiering van NSF award #EPS-1655726.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 oz WhirlPak | Nasco | B01065 | |
| 2 mL centrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 200 µL micro-PCR tubes | Thermo Scientific | AB 2000 | |
| 96-well PowerSoil DNA extraction kit | Qiagen | 12955-4 | We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work. |
| Ice block for 2 mL centrifuge tubes | Any | Any | Any ice block made for 2 mL tubes will work |
| Ice block for 200 µL micro-PCR tubes | Any | Any | Any ice block made for 200 µL tubes will work |
| Micro scoopula | Any | Any | |
| Precut Pierceable Sealing Film | Excel Scientific | XPS25 | |
| Spatula | Any | Any | |
| Surgical scissors | Any | Any |
References
- Thompson, L. R., et al. A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity. Nature. 551 (7681), 457-463 (2017).
- Davis, A., et al. Improved yield and accuracy for DNA extraction in microbiome studies with variation in microbial biomass. BioTechniques. 66 (6), 285-289 (2019).
- Marotz, C., et al. Triplicate PCR reactions for 16S rRNA gene amplicon sequencing are unnecessary. BioTechniques. 67 (1), 29-32 (2019).
- Romdhane, S., et al. Cover crop management practices rather than composition of cover crop mixtures affect bacterial communities in no-till agroecosystems. Frontiers in Microbiology. 10, 1618 (2019).
- Rochefort, A., et al. Influence of environment and host plant genotype on the structure and diversity of the Brassica napus seed microbiota. Phytobiomes Journal. 3 (4), 326-336 (2019).
- Minich, J. J., et al. Quantifying and understanding well-to-well contamination in microbiome research. mSystems. 4 (4), 00186 (2019).
- Walker, A. W. A lot on your plate? Well-to-well contamination as an additional confounder in microbiome sequence analyses. mSystems. 4 (4), 00362 (2019).
- Eisenhofer, R., et al. Contamination in low microbial biomass microbiome studies: issues and recommendations. Trends in Microbiology. 27 (2), 105-117 (2019).
- McPherson, M. R., et al. Isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass Experiments. Journal of Visualized Experiments. (137), e57932 (2018).
- Qiagen, D. N., et al. easy PowerSoil HTP 96 Kit Handbook. , Hilden, Germany. (2019).
