Summary
Les méthodes actuelles de chargement des plaques de 96 puits pour les extractions d’ADN peuvent être sujettes à la contamination. Nous détaillons une nouvelle méthode de chargement des plaques de 96 puits qui réduit le risque de contamination croisée entre les puits. Notre méthode aidera d’autres chercheurs à tirer parti de l’efficacité des techniques d’extraction de l’ADN à haut débit et à minimiser les risques de contamination.
Abstract
Les techniques de séquençage de l’ADN à haut débit ont grandement contribué aux progrès de notre compréhension des relations entre les communautés microbiennes, des caractéristiques de l’hôte et des fonctions plus larges de l’écosystème. Avec cette augmentation rapide de l’ampleur et de la profondeur des capacités de séquençage sont venus des méthodes pour extraire, amplifier, analyser et interpréter l’ADN environnemental avec succès avec une efficacité maximale. Malheureusement, l’extraction rapide de l’ADN peut se faire au prix d’augmenter le risque de contamination entre les échantillons. En particulier, les extractions à haut débit qui sont basées sur des échantillons contenus dans une plaque de 96 puits offrent une méthode relativement rapide, par rapport aux extractions à tube unique, mais augmentent également les possibilités de contamination croisée bien-à-bien. Afin de minimiser le risque de contamination croisée entre les échantillons, tout en conservant les avantages des techniques d’extraction à haut débit, nous avons mis au point une nouvelle méthode de chargement d’échantillons environnementaux dans des plaques de 96 puits. Nous avons utilisé des films d’étanchéité PCR perçables pour couvrir chaque plaque pendant le chargement des échantillons et ajouté des échantillons d’abord aux tubes PCR avant de les déplacer dans des puits; ensemble, ces pratiques réduisent le risque de dérive des échantillons et de double chargement involontaire des puits. La méthode décrite dans le présent document fournit aux chercheurs une approche pour maximiser les techniques d’extraction à haut débit disponibles tout en réduisant le risque de contamination croisée inhérent aux plaques de 96 puits. Nous fournissons un aperçu détaillé étape par étape de la façon de passer de la collecte d’échantillons à l’extraction de l’ADN tout en minimisant le risque de contamination croisée non désirée.
Introduction
Les progrès récents dans le séquençage à haut débit des communautés microbiennes fournissent une profondeur de séquençage inégalée et, par conséquent, un aperçu sans précédent du fonctionnement et de la diversité du microbiome de la Terre1. À mesure que la capacité de multiplex sur une seule voie de séquençage augmente, l’extraction de l’ADN à tube unique pourrait devenir une étape limitant les taux dans la production de données écologiques. Toutefois, les nouvelles méthodes d’extraction d’ADN à haut débit sont prometteuses pour le traitement de grandes quantités d’échantillons environnementaux avec une plus grande efficacité qu’auparavant2. Ces méthodes impliquent souvent l’utilisation de plaques de 96 puits au lieu de tubes simples, augmentant ainsi le nombre possible d’extractions qui peuvent se produire simultanément. En tant que tel, l’aspect pratique et l’efficacité des méthodes d’extraction à haut débit sont évidents et ont été mis en œuvre pour le traitement d’échantillons environnementaux allant du sol3,4 et les tissus végétaux3,5 à la matière fécale humaine2.
Bien que ces méthodes puissent accélérer considérablement le traitement des échantillons et l’extraction de l’ADN, la première étape du chargement du sol et d’autres échantillons écologiques dans des plaques de 96 puits est susceptible de contamination par des échantillons croisés. Ce type de contamination bien-à-puits peut se produire pendant les extractions d’ADN6,,7,8 , et les puits sontparticulièrementvulnérables dans cette première étape avant que les échantillons soient suspendus dans une solution tampon. McPherson et coll.9 démontrent une méthode pour charger les sols rhizosphères en plaques de 96 puits à l’aide d’entonnoirs et de couvertures de bandes DE PCR de 8 puits, mais bien que leur méthode soit une approche plus contrôlée des plaques de chargement, elle offre encore amplement d’occasions de contamination des puits voisins lors du chargement de chaque échantillon. De plus, les puits ouverts permettent à un chercheur distrait de placer un échantillon dans le puits incorrect ou d’ajouter un échantillon dans un puits qui a déjà été chargé. En outre, une variété de types d’échantillons s’avèrent mal adaptés au chargement avec cette méthode; les échantillons humides collent souvent aux entonnoirs et les échantillons secs « sautent » entre les puits en raison de l’électricité statique.
Afin de réduire les possibilités de contamination entre les puits dans la première étape des extractions d’ADN à haut débit, nous avons développé une nouvelle approche pour charger les échantillons de sol dans des plaques de 96 puits. Nos méthodes protègent les puits contre l’exposition à l’environnement et nous empêchent de charger accidentellement plusieurs échantillons dans un puits (double chargement). Nous croyons que la méthode rapportée ci-dessous offre la promesse de réduire le potentiel de contamination et en tant que telle fournit un moyen plus contrôlé de charger des plaques de 96 puits pour l’extraction ultérieure d’ADN.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Banc de laboratoire et préparation d’outils pour le chargement d’une plaque de 96 puits
- Haut de banc clair en confondant avec 70% d’éthanol. Essuyez et laissez sécher l’air avant de pulvériser le dessus du banc avec 10% d’eau de Javel. Essuyez le dessus du banc à sec.
- Stériliser la micro-scoopule, la spatule et les ciseaux chirurgicaux (courbés) en trempant dans 95% d’éthanol, puis exposer à une flamme. Tremper chacun dans 10% d’eau de Javel et laisser sécher à l’air avant l’utilisation.
REMARQUE : Les outils doivent être stérilisés entre chaque échantillon.
2. Sous-échantillonnage et préparation d’échantillons
- Stériliser les gants à l’aide d’éthanol avant le sous-échantillonnage.
- Homogénéiser les échantillons de sol à fond avant le sous-échantillonnage.
- À l’aide d’outils stérilisés, chargez un tube de centrifugeuse étiqueté de 2 mL avec un échantillon jusqu’à ce qu’il soit à moitié plein.
- Répétez l’étape 2.2 jusqu’à ce que les 95 échantillons aient été sous-échantillonnés en tubes de centrifugeuse de 2 mL étiquetés. Le puits96 e doit être utilisé comme un blanc d’extraction.
REMARQUE : Les étapes 2.3 et 2.4 sont effectuées afin de réduire au minimum l’espace de stockage requis et d’empêcher l’échantillonnage au-dessus ou à double. - Conserver 2 tubes de sous-échantillon mL sur la glace jusqu’au chargement de la plaque.
- Étiquette 96 stériles 200 tubes PCR à capuchon plat A1\u2012A12, B1\u2012B12, .... H1\u2012H12. Placez ces tubes dans un rack de 96 puits.
- Affectez un exemple d’ID avec un emplacement de puits (A1\u2012H12) et enregistrez-le.
3. Préparation des plaques
- Retirez le couvercle en caoutchouc de la plaque de 96 puits (figure 1A–1C)et placez-le dans un sac en plastique stérile (voir tableau des matériaux). Sceller le sac en plastique pour éviter la contamination.
- Couvrir la plaque de 96 puits d’un film d’étanchéité(figure 1D–1E); par exemple, utiliser un film d’étanchéité perçable précoupé (voir le Tableau des matériaux). Assurer le joint en roulant à l’aide d’un rouleau en caoutchouc.
NOTE : Les tapis de silicone perçables pourraient potentiellement offrir une option réutilisable, à condition d’un nettoyage approprié entre les utilisations, mais les tapis de silicone que nous avons testés se divisent facilement le long des perçages et n’offriraient pas une protection égale aux plaques suivantes. - Placer la plaque au réfrigérateur (4 °C) pour garder au frais.
4. Transfert de sous-échantillons
REMARQUE : Voir l’étape 4.13 pour les modifications lorsque l’échantillon de sol est très petit.
- Placer 24 des sous-échantillons de 2 mL dans un bloc de glace pour le stockage à froid.
- À l’aide du nom de l’échantillon et de la feuille d’emplacement du puits, choisissez le tube PCR à capuchon plat de 200 μL.
- Prenez un tube de sous-échantillon de 2 ml et un vortex pour environ 5 s pour assurer l’homogénéisation.
- À l’aide d’outils stérilisés à l’aide de flammes et d’eau de Javel, chargez ~200 μL du premier échantillon dans le tube PCR à capuchon plat correct (figure 1F).
- Répétez les étapes 4.2\u20124.4 jusqu’à ce que les 24 échantillons aient été chargés. Ensuite, passez à l’étape 4.6.
- À l’aide d’un essuie-tout trempé d’eau de Javel, nettoyez l’extérieur du tube PCR à capuchon plat de 200 μL.
- Inversez le tube et appuyez sur le banc pour déplacer l’échantillon vers le haut du tube. À l’une des ciseaux blanchis et stérilisés par flamme, coupez le fond du tube PCR pour créer une ouverture pour que l’échantillon tombe dans la plaque de 96 puits (Figure 1G).
- Localisez le puits correct sur une plaque de 96 puits et passez le tube à travers la plaque avec la fin de coupe face jusqu’à atteindre ce puits. Inclinez légèrement la plaque pour faciliter la perforation du film d’étanchéité perçable précut, et seulement lorsque le tube est directement au-dessus du puits correct soigneusement l’inverser de sorte que la pointe de coupe s’adapte dans le puits. À l’aide d’outils stérilisés, appuyez sur le dessus du tube pcr jusqu’à ce que tout le sol soit tombé du tube dans le puits. Laissez le tube dans le puits avec couvercle fermé (Figure 1H–1J).
- Retirez un tube PCR à 200 μL à capuchon plat à la fois et ajoutez 750 μL de solution de perles à ce puits (Figure 1K). Poussez le tube PCR à capuchon plat de 200 μL jusqu’au puits et marquez le dessus avec sharpie pour indiquer que ce puits a été chargé. Répétez cette opération pour chaque échantillon.
- Une fois que les 24 échantillons ont été chargés et que la solution de perles a été ajoutée, retirez les tubes sous-échantillon de 2 mL et remplacez-les par 24 tubes non momplés.
- Répétez les étapes 4.1\u20124.10 jusqu’à ce que les 95 puits aient été chargés d’échantillons ou de solutions vierges et de perles. Retirez les tubes sans les passer par-dessus les puits ouverts (Figure 1L).
- Retirez soigneusement le film perçable et remplacez le couvercle en caoutchouc pour protéger la plaque jusqu’à ce qu’elle commence l’extraction (figure 1M–1O).
- Pour de très petites quantités de sol qui sont également à grain fin, ajouter 750 μL de solution de perles au tube d’échantillon et utiliser une pointe de pipette à large alésage pour transférer tout le contenu dans le puits approprié. Placez le tube PCR dans l’ouverture pour éviter le double chargement.
REMARQUE : Lorsque vous implémentez cette modification, car les particules organiques ou les petits fragments de roche plus gros que l’alésage de la pointe de la pipette peuvent obstruer la pipette et rendre le transfert de l’échantillon de boue difficile. - Au besoin, congeler à -20 °C et conserver les plaques chargées de l’échantillon et de la solution de perles jusqu’à l’extraction prévue.
5. Comparaison des méthodes de chargement des plaques
REMARQUE : Afin de vérifier notre nouvelle méthode de chargement des plaques d’extraction d’ADN de 96 puits, nous avons divisé une seule plaque de 96 puits en trois sections. Nous avons utilisé trois méthodes différentes de chargement des plaques pour comparer le potentiel de chargement involontaire du sol et de contamination croisée. Les trois méthodes que nous avons utilisées étaient les méthodes décrites dans McPherson et coll.9, le protocole de chargement par défaut10de Qiagen et le protocole que nous décrivons dans cette publication.
- Chargement du sol dans la plaque
- Section d’une plaque de 96 puits en trois blocs à quatre colonnes. Chargez chaque bloc à l’aide de l’une des trois méthodes mentionnées ci-dessus.
- Chargez le sol dans tous les autres puits afin que les puits d’échantillonnage et de puits vierges soient décalés. Cet arrangement permet une possibilité maximale de chargement par inadvertance et de contamination croisée.
- Congeler la plaque de 96 puits à -20 °C jusqu’à l’extraction de l’ADN.
- Extraction d’ADN
- Extraire l’ADN selon le protocole d’extraction de plaques de 96 puits du fabricant10.
- Conserver les extraits d’ADN à -20 °C jusqu’à une analyse plus poussée.
- Quantification de l’ADN dans des puits vierges
- Décongeler les extraits d’ADN à température ambiante, vortex et tourner vers le bas à l’aide d’un spinner plaque.
- Mesurer et enregistrer les concentrations d’ADN des puits vierges à l’aide d’un spectrophotomètre.
- Utilisez le test post-hoc d’ANVOA et de Tukey pour analyser les différences de concentration moyenne d’ADN dans les puits blancs.
REMARQUE : Des différences significatives ont été signalées à α = 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cette nouvelle méthode a été utilisée avec succès pour charger des plaques d’extraction d’ADN de 96 puits. La comparaison des méthodes de chargement des plaques a montré que notre méthode avait la plus faible concentration d’ADN dans les puits vides. La concentration d’ADN dans les puits vierges était significativement inférieure à la méthode proposée par McPherson et coll.9 (p < 0,05), bien que les concentrations d’ADN dans notre méthode n’aient pas été statistiquement différentes de la méthode par défaut de Qiagen (figure 2). Les trois méthodes ont produit des concentrations moyennes d’ADN inférieures à 2 ng/μL, bien que seule notre nouvelle méthode ait produit des puits sans concentration mesurable d’ADN.
Figure 1 : Méthodes étape par étape pour charger des échantillons dans des plaques de 96 puits pour l’extraction de l’ADN tout en minimisant le risque de contamination croisée entre les puits. Les couvertures gris foncé (présentes aux étapes A, B, N et O) représentent la couverture en silicium qui accompagne le kit d’extraction. Le couvercle gris clair (appliqué à l’étape D, enlevé après l’étape L) représente le ruban PCR perçable utilisé pour couvrir la plaque pendant le chargement. Bien qu’ils ne soient pas représentés, les outils doivent être stérilisés avant de charger chaque échantillon, et les tubes PCR doivent être essuyés avec de l’eau de Javel avant de percer le ruban ADHÉSIF. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Concentrations d’ADN de puits vierges. La concentration d’ADN est représentée dans ng/μL. Les lettres indiquent des différences significatives dans les concentrations d’ADN à α = 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cette méthode réduit les possibilités de contamination croisée bien à bien tout en chargeant des plaques d’extraction d’échantillons à haut débit et offre un moyen plus contrôlé de charger des plaques de 96 puits au-delà des stratégies existantes de chargement des plaques9,10. La contamination entre les puits peut être plus répandue dans les extractions de plaques de 96 puits que dans les extractions à un seul tube, en particulier lorsqu’elles sont automatisées6,,7et, bien qu’elles ne soient pas spécifiquement testées dans n’importe quelle méthodologie, le risque de contamination croisée peut être supposé le plus élevé lorsque les puits des plaques d’extraction sont laissés ouverts pendant la durée de chargement des plaques. Étant donné les possibilités accrues de contamination croisée dans les extractions à base de plaques par rapport aux extractions à un seul tube, la protection des puits à couverture stérile devrait être considérée comme une première étape clé dans le chargement des échantillons dans une plaque de 96 puits. Malgré ce besoin, les instructions fournies dans les kits d’extraction à haut débit indiquent simplement de charger la plaque et d’éviter la contamination croisée entre les puits d’échantillon », mais ne fournissent pas d’informations supplémentaires sur la façon de le faire10. Pour réduire la contamination tout en ajoutant des échantillons à une plaque d’extraction de 96 puits, McPherson et coll.9 suggèrent de recouvrir la plaque de bandes coupées de ruban d’étanchéité PCR, en les épluchant pour accéder à chaque puits. Cette méthode réduit le temps total que tous les puits sont ouverts, mais les puits sont ouverts pendant des quantités inégales de temps et certains des puits les plus sensibles à la contamination — ceux qui sont les plus proches de l’échantillon chargé — sont exposés pendant l’événement de chargement. De plus, l’épluchage du ruban adhésif PCR pourrait créer de l’électricité statique qui entraîne le transfert du sol d’un puits à un puits et pourrait être responsable des concentrations plus élevées d’ADN dans les puits vierges observés lors de notre extraction. De plus, cette méthode exige que les échantillons soient passés au-dessus de puits découverts avant d’être placés dans le puits de choix, et rien n’empêche un chercheur de charger accidentellement deux échantillons dans un seul puits (double chargement) ou de mélanger l’emplacement de deux échantillons ou plus. S’il est pris, le double chargement ne représente rien de plus qu’un gaspillage de ressources. Toutefois, si une double charge ou un mélange d’échantillons passe inaperçu, les résultats expérimentaux peuvent être déformés7.
La méthode que nous avons décrite ci-dessus fournit un moyen contrôlé de charger des plaques d’extraction d’ADN à haut débit. Plus précisément, notre méthode réduit le risque de contamination croisée en gardant les puits couverts en tout temps. Les puits sont d’abord recouverts de ruban adhésif et sont ensuite recouverts par le tube PCR utilisé pour le chargement par échantillonnage. Non seulement cette méthode réduit-elle le risque de contamination croisée, mais elle prévient également entièrement le risque de chargement de deux échantillons dans un seul puits. Une fois que nous chargeons un échantillon dans un puits, le tube PCR sert de bloc, empêchant l’ajout d’un autre échantillon. En étiquetant tous les tubes avec l’emplacement de la plaque (p. ex., A1, A2... H11, H12) avant le chargement des échantillons, cette méthode fournit également une vérification finale pour s’assurer que tous les échantillons ont été chargés et qu’aucun puits n’a été oublié. Bien que cette méthode fournit un moyen plus contrôlé pour charger des puits, toute personne chargeant une plaque devrait prendre des précautions supplémentaires lors du passage d’un tube de PCR coupé sur la plaque. Même si les puits sont scellés, tous les échantillons de particules qui tombent sur la surface de la plaque scellée pourraient se retrouver dans des puits non intentionnels lorsque le technicien perce le film pour charger les échantillons corrects dans ces puits. Pour éviter ce problème, nous inclinons la plaque de 96 puits à ~40° avant de perforer le ruban d’étanchéité avec le tube PCR. Cette approche permet de garder l’extrémité ouverte du tube debout et loin des puits incorrects.
Lorsque les échantillons de sol sont de très petites quantités et/ou extrêmement fins, l’utilisation d’une pointe de pipette à large forage au lieu de charger des échantillons de sol dans des tubes pcr peut être plus efficace pour transférer chaque échantillon. Pour cette modification, la première solution tampon doit être ajoutée au tube d’échantillon, puis à la fois l’échantillon et la solution pipetted dans la plaque de 96 puits. L’ajout d’un tube PCR à chaque puits après cette étape empêchera le double chargement. Comme il est mentionné dans la section du protocole, lorsqu’il utilise cette modification, le chercheur ou le technicien doit être très conscient des particules organiques ou de petits fragments de roche, car ceux-ci ont le potentiel d’obstruer l’alésage de la pipette.
Bien qu’aucune méthode de chargement par échantillonnage ne puisse éliminer entièrement le risque de contamination par l’échantillon, la méthode que nous décrivons ci-dessus fournit un moyen de réduire considérablement et d’éliminer complètement le risque de double chargement et de mélange des emplacements d’échantillons. Dans l’ensemble, nous croyons que cette méthode est une grande amélioration par rapport aux techniques existantes de chargement des plaques d’extraction d’ADN à haut débit et suggérons que tous les microbiologistes utilisant des plaques d’extraction à haut débit se déplacent à l’aide d’une méthode telle que celle décrite ci-dessus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts et n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été soutenue par la Microbial Ecology Collaborative avec un financement du prix NSF #EPS-1655726.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 oz WhirlPak | Nasco | B01065 | |
| 2 mL centrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 200 µL micro-PCR tubes | Thermo Scientific | AB 2000 | |
| 96-well PowerSoil DNA extraction kit | Qiagen | 12955-4 | We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work. |
| Ice block for 2 mL centrifuge tubes | Any | Any | Any ice block made for 2 mL tubes will work |
| Ice block for 200 µL micro-PCR tubes | Any | Any | Any ice block made for 200 µL tubes will work |
| Micro scoopula | Any | Any | |
| Precut Pierceable Sealing Film | Excel Scientific | XPS25 | |
| Spatula | Any | Any | |
| Surgical scissors | Any | Any |
References
- Thompson, L. R., et al. A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity. Nature. 551 (7681), 457-463 (2017).
- Davis, A., et al. Improved yield and accuracy for DNA extraction in microbiome studies with variation in microbial biomass. BioTechniques. 66 (6), 285-289 (2019).
- Marotz, C., et al. Triplicate PCR reactions for 16S rRNA gene amplicon sequencing are unnecessary. BioTechniques. 67 (1), 29-32 (2019).
- Romdhane, S., et al. Cover crop management practices rather than composition of cover crop mixtures affect bacterial communities in no-till agroecosystems. Frontiers in Microbiology. 10, 1618 (2019).
- Rochefort, A., et al. Influence of environment and host plant genotype on the structure and diversity of the Brassica napus seed microbiota. Phytobiomes Journal. 3 (4), 326-336 (2019).
- Minich, J. J., et al. Quantifying and understanding well-to-well contamination in microbiome research. mSystems. 4 (4), 00186 (2019).
- Walker, A. W. A lot on your plate? Well-to-well contamination as an additional confounder in microbiome sequence analyses. mSystems. 4 (4), 00362 (2019).
- Eisenhofer, R., et al. Contamination in low microbial biomass microbiome studies: issues and recommendations. Trends in Microbiology. 27 (2), 105-117 (2019).
- McPherson, M. R., et al. Isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass Experiments. Journal of Visualized Experiments. (137), e57932 (2018).
- Qiagen, D. N., et al. easy PowerSoil HTP 96 Kit Handbook. , Hilden, Germany. (2019).
