Summary
Gli attuali metodi per il caricamento di piastre di 96 well per le estrazioni di DNA possono essere soggetti a contaminazione. Dettagliamo un nuovo metodo per caricare piastre a 96 pozzi che riduce il rischio di contaminazione incrociata tra i pozzetti. Il nostro metodo aiuterà altri ricercatori a capitalizzare l'efficienza delle tecniche di estrazione del DNA ad alto rendimento e a ridurre al minimo il rischio di contaminazione.
Abstract
Tecniche di sequenziamento del DNA ad alto rendimento hanno contribuito notevolmente a far progredire la nostra comprensione delle relazioni tra le comunità microbiche, le caratteristiche dell'ospite e le funzioni più ampie dell'ecosistema. Con questo rapido aumento di ampiezza e profondità delle capacità di sequenziamento sono venuti metodi per estrarre, amplificare, analizzare e interpretare il DNA ambientale con successo con la massima efficienza. Purtroppo, l'esecuzione rapida di estrazioni di DNA può costare il rischio di contaminazione tra i campioni. In particolare, le estrazioni ad alta velocità che si basano su campioni contenuti in una piastra di 96 po 'offrono un metodo relativamente veloce, rispetto alle estrazioni a tubo singolo, ma aumentano anche le opportunità di contaminazione incrociata ben bene. Per ridurre al minimo il rischio di contaminazione incrociata tra i campioni, pur mantenendo i benefici delle tecniche di estrazione ad alto rendimento, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per caricare campioni ambientali in piastre a 96 poteggiamenti. Abbiamo usato pellicole di tenuta PCR forabili per coprire ogni piastra durante il caricamento dei campioni e abbiamo aggiunto campioni prima ai tubi PCR prima di spostarli in pozzi; insieme, queste pratiche riducono il rischio di deriva del campione e di doppio carico involontario di pozzi. Il metodo descritto in questo documento fornisce ai ricercatori un approccio per massimizzare le tecniche di estrazione ad alto rendimento disponibili, riducendo al contempo il rischio di contaminazione incrociata inerente alle piastre a 96 pozze. Forniamo una descrizione dettagliata passo dopo passo di come passare dalla raccolta dei campioni all'estrazione del DNA, riducendo al minimo il rischio di contaminazione incrociata indesiderata.
Introduction
I recenti progressi nel sequenziamento ad alto rendimento delle comunità microbiche stanno fornendo una profondità di sequenziamento senza precedenti e, di conseguenza, uno sguardo senza precedenti sul funzionamento e la diversità del microbiomaterrestre 1. Con l'aumentare della capacità di multiplex sempre più campioni su una singola corsia di sequenziamento, l'estrazione del DNA a tubo singolo potrebbe diventare un passo limitante nella generazione di dati ecologici. Tuttavia, i nuovi metodi nelle estrazioni di DNA ad alto rendimento promettono di elaborare grandi quantità di campioni ambientali con una maggiore efficienza di quanto sia stato possibile inprecedenza 2. Questi metodi spesso comportano l'utilizzo di piastre di 96-pozzo invece di tubi singoli, aumentando così il possibile numero di estrazioni che possono verificarsi contemporaneamente. Di conseguenza, la praticità e l'efficienza dei metodi di estrazione ad alto rendimento sono evidenti e sono state implementate per la lavorazione di campioni ambientali che vannodal suolo 3,4 e tessutivegetali 3,5 alla materia fecaleumana 2.
Mentre questi metodi possono accelerare notevolmente lungo l'elaborazione dei campioni e l'estrazione del DNA, la fase iniziale di caricamento del suolo e di altri campioni ecologici in piastre a 96 po 'è suscettibile alla contaminazione da campioni incrociati. Questo tipo di contaminazione ben bene può verificarsi durante le estrazioni di DNA6,7,8e i pozzi sono particolarmente vulnerabili in questa prima fase prima che i campioni siano sospesi in una soluzione tampone. McPherson et al.9 dimostrano un metodo per caricare i suoli di rizosfera in lastre di 96 pozzi utilizzando imbuti e coperture a strisce PCR a 8 pozzi, ma mentre il loro metodo è un approccio più controllato al caricamento delle piastre, offre ancora ampie opportunità per la contaminazione dei pozzi vicini durante il caricamento di ogni campione. Inoltre, i pozzi aperti permettono la possibilità per un ricercatore distratto di inserire un campione nel pozzo non corretto o aggiungere un campione in un pozzo che è già stato caricato. Inoltre, una varietà di tipi di campione si rivelano inadatto per il caricamento con questo metodo; i campioni umidi spesso si attaccano agli imbuti e i campioni secchi "saltano" tra i pozzetti a causa dell'elettricità statica.
Per ridurre le opportunità di contaminazione tra i pozzi nella prima fase delle estrazioni di DNA ad alto rendimento, abbiamo sviluppato un nuovo approccio per caricare campioni di terreno in piastre a 96 pozzi. I nostri metodi proteggono i pozzi dall'esposizione ambientale e ci impediscono di caricare accidentalmente più campioni in un unico pozzo (doppio caricamento). Crediamo che il metodo riportato di seguito offra una promessa per ridurre il potenziale di contaminazione e come tale fornisce un mezzo più controllato per caricare piastre a 96 po 'per la successiva estrazione del DNA.
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Protocol
1. Panca di laboratorio e preparazione dell'utensile per il caricamento di una piastra da 96
- Panca chiara con 70% di etanolo. Pulire e lasciare asciugare l'aria prima di spruzzare panca con 10% di candeggina. Pulire la panca asciutta.
- Sterilizzare micro-scoopula, spatola e forbici chirurgiche (curve) immergendo nel 95% l'etanolo e quindi esporre a una fiamma. Immergere ciascuno in candeggina 10% e lasciare asciugare l'aria prima dell'uso.
NOTA: gli utensili devono essere sterilizzati tra ogni campione.
2. Sotto-campionamento e preparazione del campione
- Sterilizzare i guanti usando l'etanolo prima del sotto-campionamento.
- Omogeneizzare accuratamente i campioni di suolo prima del sotto-campionamento.
- Utilizzando strumenti sterilizzati, caricare un tubo centrifugato di 2 mL con campione fino a circa mezzo pieno.
- Ripetere il passaggio 2.2 fino a quando tutti i 95 campioni non sono stati sotto-campionati in tubi centrifugati da 2 mL etichettati. Il pozzo 96th deve essere utilizzato come un vuoto di estrazione.
NOTA: i passaggi 2.3 e 2.4 vengono eseguiti per ridurre al minimo lo spazio di archiviazione necessario e per impedire il campionamento in corso o doppio. - Conservare i tubi sottosionati da 2 mL sul ghiaccio fino al caricamento della piastra.
- Etichetta 96 sterile 200 tubi PCR a porta piatta A1,u2012A12, B1,u2012B12, .... H1-u2012H12. Posizionare questi tubi in ordine in un rack 96-pozzo.
- Assegnare un ID di esempio con una posizione di pozzo (A1-u2012H12) e registrarlo.
3. Preparazione della piastra
- Rimuovere il coperchio in gomma dalla piastra a 96 po ' (Figura 1A–1C) e posizionarlo in un sacchetto di plastica sterile (vedi Tabella dei materiali). Sigillare il sacchetto di plastica per evitare la contaminazione.
- Coprire la piastra da 96 con pellicola di tenuta (Figura 1D–1E); ad esempio, utilizzare una pellicola di tenuta forabile pretagliabile (vedere la Tabella dei Materiali). Assicurarsi di sigillare rotolando con un rullo di gomma.
NOTA: I tappetini in silicone perforabili potrebbero potenzialmente offrire un'opzione riutilizzabile, a condizione che la pulizia appropriata tra gli usi, ma i tappetini in silicone che abbiamo testato facilmente si dividono facilmente lungo le forchette e non offrirebbe uguale protezione alle piastre seguenti. - Mettere la piastra in frigorifero (4 gradi centigradi) per mantenere il fresco.
4. Trasferimento di sottose samples
NOTA: vedere il punto 4.13 per le modifiche quando il campione del suolo è molto piccolo.
- Inserire 24 dei sottosezzi da 2 mL in un blocco di ghiaccio per la conservazione a freddo.
- Utilizzando il nome del campione e il foglio di posizione del pozzo, scegliete il tubo PCR a 200 gradi piatti corretto.
- Prendere un tubo sottostraccia di 2 mL e un vortice per 5 s per garantire l'omogeneizzazione.
- L'utilizzo di utensili sterilizzati a fiamma e candeggina carica 200 L del primo campione nel tubo PCR a tappo piatto corretto (Figura 1F).
- Ripetere i passaggi 4.2-u20124.4 fino a quando non sono stati caricati tutti i 24 campioni. Passare quindi al passaggio 4.6.
- Utilizzando una salvietta di carta sbiancata, pulire l'esterno del tubo PCR a tappo piatto da 200 L.
- Invertire il tubo e toccare il panca per spostare il campione in cima al tubo. Con le forbici sbiancate e sterilizzate a fiamma, agganciare il fondo del tubo PCR per creare un'apertura per il campione per cadere nella piastra 96-well (Figura 1G).
- Individuare il pozzo corretto su una piastra 96-well e passare il tubo attraverso piastra con estremità taglio rivolto verso l'alto fino a raggiungere quel pozzo. Inclinare leggermente la piastra per facilitare la foratura della pellicola di tenuta forabile pretagliabile, e solo quando il tubo è direttamente sopra il pozzo corretto, invertirla con attenzione in modo che la punta di taglio si adatti al pozzo. Utilizzando strumenti sterilizzati, toccare la parte superiore del tubo PCR fino a quando tutto il terreno è caduto dal tubo nel pozzo. Lasciare il tubo all'interno del pozzo con il coperchio chiuso (Figura 1H–1J).
- Rimuovere un tubo PCR a 200 L con tappo piatto alla volta e aggiungere 750 L di soluzione di perline a quel pozzo (Figura 1K). Spingere il tubo PCR a 200 L con tappo piatto fino in fondo nel pozzo e contrassegnare la parte superiore con sharpie per indicare che questo pozzo è stato caricato. Ripetere questa operazione per ogni campione.
- Una volta caricati tutti i 24 campioni e aggiunti la soluzione di perline, rimuovere i tubi sottocampioni da 2 mL e sostituirli con 24 tubi non campionati.
- Ripetere i passaggi 4.1-u20124.10 fino a quando tutti i 95 pozzetti non sono stati caricati con soluzione campione o vuoto e perline. Rimuovere i tubi senza passarli sopra i pozzetti aperti (Figura 1L).
- Rimuovere con attenzione la pellicola forabile e sostituire il coperchio in gomma per proteggere la piastra fino all'inizio dell'estrazione (Figura 1M–1O).
- Per quantità molto piccole di terreno che sono anche a grana fine, aggiungere 750 L di soluzione di perline al tubo campione e utilizzare una punta di pipetta a foro largo per trasferire tutto il contenuto al pozzo appropriato. Posizionare il tubo PCR nell'apertura per evitare il doppio caricamento.
NOTA: Quando si implementa questa modifica, prestare attenzione, poiché la materia organica del particolato o piccoli frammenti di roccia più grandi del foro della punta della pipetta può intasare la pipetta e rendere difficile il trasferimento del liquame del campione. - Se necessario, congelare a -20 gradi centigradi e conservare le piastre caricate con soluzione di campione e perline fino all'estrazione pianificata.
5. Confronto dei metodi di caricamento delle piastre
NOTA: Al fine di verificare il nostro nuovo metodo per il caricamento di piastre di estrazione del DNA di 96-well, abbiamo diviso una singola piastra 96-well in tre sezioni. Abbiamo utilizzato tre diversi metodi di carico delle placche per confrontare il potenziale di carico involontario del suolo e della contaminazione incrociata. I tre metodi che abbiamo usato sono stati i metodi descritti in McPherson et al.9, il protocollo di caricamento predefinito di Qiagen10e il protocollo che si delinea in questa pubblicazione.
- Caricamento del terreno nella piastra
- Sezionare una piastra a 96 potegram0 in tre blocchi a quattro colonne. Caricare ogni blocco utilizzando uno dei tre metodi sopra menzionati.
- Caricare il terreno in ogni altro pozzo in modo che i pozzetti campione e vuoto siano sfalsati. Questa disposizione consente la massima opportunità di caricamento involontario del campione e contaminazione incrociata.
- Congelare la piastra a 96 gradi centigradi a -20 gradi centigradi fino all'estrazione del DNA.
- Estrazione del DNA
- Estrarre il DNA secondo il protocollo di estrazione della piastra 96-well delproduttore 10.
- Conservare gli estratti di DNA a -20 gradi centigradi fino a ulteriori analisi.
- Quantificazione del DNA in pozzi vuoti
- Scongelare gli estratti di DNA a temperatura ambiente, vortice e spin verso il basso utilizzando un filatore piatto.
- Misurare e registrare le concentrazioni di DNA di pozzi vuoti utilizzando uno spettrofotometro.
- Utilizzare il test post-hoc di ANVOA e Tukey per analizzare le differenze nella concentrazione media del DNA nei pozzi vuoti.
NOTA: differenze significative sono state segnalate a , 0,05.
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Representative Results
Questo nuovo metodo è stato utilizzato con successo per caricare lastre di estrazione del DNA di 96-well. Il confronto dei metodi di caricamento delle placche ha mostrato il nostro metodo per avere la più bassa concentrazione di DNA nei pozzi vuoti. La concentrazione del DNA nei pozzi vuoti era significativamente inferiore al metodo proposto il mio McPherson et al.9 (p < 0.05), anche se le concentrazioni di DNA nel nostro metodo non erano statisticamente diverse dal metodo di default Qiagen (Figura 2). Tutti e tre i metodi prodotti significano concentrazioni di DNA sotto 2 ng/L, anche se solo il nostro nuovo metodo ha prodotto pozzi senza concentrazione di DNA misurabile.
Figura 1: Metodi passo dopo passo per caricare campioni in piastre di 96 pozzi per l'estrazione del DNA, riducendo al minimo il potenziale di contaminazione incrociata tra i pozzi. Le coperture grigio scuro (presenti nei passaggi A, B, N e O) rappresentano la copertura in silicio fornita con il kit di estrazione. Il coperchio grigio chiaro (applicato nel passaggio D, rimosso dopo il passo L) rappresenta il nastro PCR forabile utilizzato per coprire la lastra durante il caricamento. Anche se non raffigurato, gli strumenti devono essere sterilizzati prima di caricare ogni campione, e tubi PCR devono essere cancellati con candeggina prima di perforare il nastro PCR. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: concentrazioni di DNA di pozzi vuoti. La concentrazione del DNA è rappresentata in ng/L. Le lettere indicano differenze significative di coppie nelle concentrazioni di DNA a 0,05 dollari. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo metodo riduce le opportunità di contaminazione incrociata ben elevata durante il caricamento di piastre di estrazione del campione ad alta velocità di produzione e offre un mezzo più controllato per caricare piastre a 96 pori oltre le strategie di caricamento delle piastreesistenti 9,10. La contaminazione tra pozzi può essere più pervasiva nelle estrazioni di lastre di 96 pozzi rispetto alle estrazioni a tubo singolo, soprattutto quandoautomatizzate 6,7e, sebbene non specificamente testate in alcuna metodologia, il rischio di contaminazione incrociata può essere assunto più alto quando i pozzi delle piastre di estrazione vengono lasciati aperti per tutta la durata del carico della piastra. Data la maggiore opportunità di contaminazione incrociata nelle estrazioni a base di placche rispetto alle estrazioni a tubo singolo, la protezione dei pozzi con una copertura sterile dovrebbe essere considerata un primo passo fondamentale nel caricamento dei campioni in una piastra a 96 pozzi. Nonostante questa ese necessità, le istruzioni fornite nei kit di estrazione ad alta velocità di trasmissione dicono semplicemente di caricare la piastra e di "evitare la contaminazione incrociata tra i pozzi campione", ma non forniscono ulteriori informazioni su come farlo10. Per ridurre la contaminazione aggiungendo campioni a una piastra di estrazione di 96 poteslucchi, McPherson et al.9 suggerisce di coprire la piastra con strisce tagliate di nastro adesivo PCR, staccandoli per accedere a ciascun pozzo. Questo metodo riduce il tempo totale di apertura di tutti i pozzi, ma i pozzi sono aperti per quantità di tempo diverse e alcuni dei pozzi più suscettibili alla contaminazione, ovvero quelli più vicini al campione caricato, vengono esposti durante l'evento di caricamento. Inoltre, il peeling del nastro di tenuta PCR ha il potenziale per creare elettricità statica che si traslisse il suolo da bene a bene e potrebbe essere responsabile delle concentrazioni di DNA più elevate nei pozzi vuoti osservati nella nostra estrazione. Inoltre, questa metodologia richiede che i campioni vengano passati sopra pozzi scoperti prima di essere collocati nel pozzo di scelta, e nulla impedisce a un ricercatore di caricare accidentalmente due campioni in un unico pozzo (doppio caricamento) o di mescolare la posizione di due o più campioni. Se catturato, il doppio carico non pone altro che uno spreco di risorse. Se, tuttavia, un doppio carico o miscelazione delle posizioni dei campioni passa inosservato, i risultati sperimentali possono essere distorti7.
Il metodo descritto in precedenza fornisce un mezzo controllato per caricare piastre di estrazione del DNA ad alto rendimento. In particolare, il nostro metodo riduce il rischio di contaminazione incrociata mantenendo i pozzi coperti in ogni momento. I pozzetti sono inizialmente coperti da nastro adesivo e vengono quindi tenuti coperti dal tubo PCR utilizzato per il caricamento del campione. Questo metodo non solo riduce il rischio di contaminazione incrociata, ma previene anche completamente il rischio di caricare due campioni in un unico pozzo. Una volta caricato un campione in un pozzo, il tubo PCR funge da blocco, impedendo l'aggiunta di un altro campione. Etichettando tutti i tubi con posizione della piastra (ad es., A1, A2... H11, H12) prima di caricare i campioni, questo metodo fornisce anche un controllo finale per garantire che tutti i campioni siano stati caricati e che non siano stati persi pozzi. Mentre questo metodo fornisce un mezzo più controllato per caricare i pozzi, chiunque carichi una piastra dovrebbe fare particolare attenzione quando passa un tubo PCR tagliato sopra la piastra. Anche se i pozzi sono sigillati, tutte le particelle campione che cadono sulla superficie della piastra sigillata potrebbero trovare la loro strada in pozzi non intenzionali quando il tecnico fora la pellicola per caricare i campioni corretti in quei pozzi. Per evitare questo problema, incliniamo la piastra a 96 gradi a 40 dollari prima di forare il nastro di tenuta con il tubo PCR. Questo approccio aiuta a mantenere l'estremità aperta del tubo in posizione verticale e lontano dai pozzi errati.
Quando i campioni di suolo sono di piccole quantità e/o estremamente a grana fine, l'uso di una punta di pipetta a foro largo invece di caricare campioni di terreno in tubi PCR può essere più efficace nel trasferimento di ogni campione. Per questa modifica, la prima soluzione tampone deve essere aggiunta al tubo campione e quindi campione e soluzione tubottati nella piastra 96-pozzo. L'aggiunta di un tubo PCR ad ogni pozzo dopo questo passaggio impedirà il doppio caricamento. Come accennato nella sezione del protocollo, quando si utilizza questa modifica, il ricercatore o tecnico dovrebbe essere molto consapevole di materia organica di particolato o piccoli frammenti di roccia in quanto questi hanno il potenziale per intasare il foro della pipetta.
Anche se nessun metodo di caricamento del campione può eliminare completamente il rischio di contaminazione del campione, il metodo che abbiamo delineato sopra fornisce un mezzo per ridurre questi rischi in modo sostanziale ed eliminare completamente il rischio di doppio carico e miscelazione delle posizioni dei campioni. Nel complesso, riteniamo che questo metodo sia un grande miglioramento rispetto alle tecniche esistenti per il caricamento di piastre di estrazione del DNA ad alto rendimento e suggeriamo che tutti i microbiologi che utilizzano piastre di estrazione ad alta velocità di trasmissione si spostino utilizzando un metodo come quello descritto sopra.
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Disclosures
Gli autori non segnalano conflitti di interesse e non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata supportata dal Microbial Ecology Collaborative con il finanziamento del premio NSF #EPS-1655726.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 oz WhirlPak | Nasco | B01065 | |
| 2 mL centrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 200 µL micro-PCR tubes | Thermo Scientific | AB 2000 | |
| 96-well PowerSoil DNA extraction kit | Qiagen | 12955-4 | We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work. |
| Ice block for 2 mL centrifuge tubes | Any | Any | Any ice block made for 2 mL tubes will work |
| Ice block for 200 µL micro-PCR tubes | Any | Any | Any ice block made for 200 µL tubes will work |
| Micro scoopula | Any | Any | |
| Precut Pierceable Sealing Film | Excel Scientific | XPS25 | |
| Spatula | Any | Any | |
| Surgical scissors | Any | Any |
References
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