Summary
DNA ekstraksiyonları için 96 kuyulu plakayükleme için mevcut yöntemler kontaminasyona yatkın olabilir. Kuyular arasında çapraz kontaminasyon riskini azaltan 96 kuyulu plakaların yüklenmesi için yeni bir yöntem ayrıntılı olarak inceleniyoruz. Yöntemimiz, diğer araştırmacıların yüksek verimli DNA çıkarma tekniklerinin verimliliğinden yararlanmalarına ve kontaminasyon riskini en aza indirmelerine yardımcı olacaktır.
Abstract
Yüksek verimli DNA dizileme teknikleri mikrobiyal topluluklar, ev sahibi özellikleri ve daha geniş ekosistem fonksiyonları arasındaki ilişkileri anlamamızda önemli ölçüde katkıda bulunmuştur. Genişlik ve sıralama yetenekleri derinliği bu hızlı artış ile ayıklamak için yöntemler geldi, yükseltmek, analiz etmek, ve maksimum verimlilik ile başarılı bir şekilde çevresel DNA yorumlamak. Ne yazık ki, hızlı bir şekilde DNA çıkarma gerçekleştirme örnekleri arasında kontaminasyon riskini artırma pahasına gelebilir. Özellikle, 96 kuyulu bir plakada bulunan numunelere dayanan yüksek iş çıkarmalar, tek tüplü ekstraksiyonlara kıyasla nispeten hızlı bir yöntem sunmakla birlikte, iyiye çapraz kontaminasyon olanaklarını da artırır. Numuneler arasında çapraz kontaminasyon riskini en aza indirmek için, yüksek iş hacmi çıkarma tekniklerinin avantajlarını korurken, çevresel numuneleri 96 kuyulu plakalara yüklemek için yeni bir yöntem geliştirdik. Numuneleri yüklerken her plakayı kapsayacak şekilde delilebilir PCR sızdırmazlık filmlerini kullandık ve numuneleri kuyulara taşımadan önce PCR tüplere ekledik; birlikte, bu uygulamalar örnek sürüklenme ve kuyuların istenmeyen çift yükleme riskini azaltır. Bu makalede özetlenen yöntem, araştırmacılara mevcut yüksek iş gücü çıkarma tekniklerini en üst düzeye çıkarma yaklaşımı sağlarken, 96 kuyulu plakalara doğal çapraz kontaminasyon riskini de azaltır. İstenmeyen çapraz kontaminasyon riskini en aza indirirken örnek toplamadan DNA çıkarmasına nasıl geçebileceğimize dair adım adım ayrıntılı bir adım sayılmayı sağlıyoruz.
Introduction
Mikrobiyal toplulukların yüksek iş bölümü ndeki son gelişmeler benzersiz sıralama derinliği ve sonuç olarak, Dünya'nın mikrobiyom1'inişleyişi ne ve çeşitliliğine emsalsiz bir bakış sağlamaktadır. Tek bir sıralama şeridine daha fazla numune katlandırma yeteneği arttıkça, tek tüpLÜ DNA çıkarma, ekolojik veri üretiminde hız sınırlayıcı bir adım olma potansiyeline sahiptir. Ancak, yüksek verimli DNA ekstraksiyonları yeni yöntemler daha önce mümkün olandan daha fazla verimlilik ile çevresel örneklerin büyük miktarlarda işlenmesi için söz tutun2. Bu yöntemler genellikle tek tüpler yerine 96-iyi plakalar kullanarak, bu nedenle aynı anda oluşabilir ekstraksiyon olası sayısını artırarak içerir. Bu nedenle, yüksek verimli çıkarma yöntemlerinin pratikliği ve verimliliği belirgindir ve toprak3,,4 ve bitki dokularından3,,5'e, insan dışkı madde2'yekadar değişen çevresel örneklerin işlenmesi için uygulanmıştır.
Bu yöntemler numune işleme ve DNA çıkarma boyunca önemli ölçüde hız alabilse de, toprak ve diğer ekolojik numuneleri 96 kuyulu plakalara yüklemenin ilk adımı çapraz numune kontaminasyonuna karşı hassastır. Dna ekstraksiyonu sırasında iyi-to-well kontaminasyon Bu türoluşabilir 6,7,8, ve kuyular örnekler bir tampon çözeltisi askıya önce bu ilk adımda özellikle savunmasızdır. McPherson ve ark.9 huniler ve 8-iyi PCR şerit kapakları kullanarak 96-iyi plakalar içine rizosfer toprak yüklemek için bir yöntem göstermek, ancak onların yöntemi yükleme plakaları için daha kontrollü bir yaklaşım olsa da, hala her örnek yükleme komşu kuyuların kirlenmesi için yeterli fırsat sağlar. Ayrıca, açık kuyular, dikkati dağılmış bir araştırmacının yanlış kuyuya bir örnek yerleştirmesine veya zaten yüklenmiş bir kuyuya numune eklemesine olanak sağlar. Buna ek olarak, çeşitli örnek türleri bu yöntemle yükleme için uygun olmadığını kanıtlamaktadır; ıslak numuneler genellikle hunilere yapışır ve kuru numuneler statik elektrik nedeniyle kuyular arasında 'atlatır'.
Yüksek iş türündeki DNA çıkarmalarının ilk adımında kuyular arasında kontaminasyon olanaklarını azaltmak için, toprak örneklerini 96 kuyulu plakalara yüklemek için yeni bir yaklaşım geliştirdik. Yöntemlerimiz hem kuyuları çevreye maruz kalmaktan korur hem de yanlışlıkla birden fazla numuneyi tek bir kuyuya yüklememizi engeller (çift yükleme). Aşağıda bildirilen yöntemin kontaminasyon potansiyelini azaltma sözü verdiğine ve bu nedenle sonraki DNA ekstraksiyonu için 96 kuyuluk plakaları yüklemek için daha kontrollü bir araç sağladığına inanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 96 kuyulu bir plakanın yüklenmesi için laboratuvar tezgahı ve takım hazırlığı
- % 70 etanol ile sisleme tarafından tezgah üst temizleyin. % 10 çamaşır suyu ile tezgah üst püskürtme önce silin ve hava kuru izin. Tezgahın üstlerini kurutun.
- Mikro-scoopula sterilize, spatula, ve cerrahi makas (kavisli) daldırma tarafından 95% etanol ve daha sonra bir alev maruz. Her biri %10 çamaşır suyu daldırın ve kullanmadan önce havanın kurumasını bekleyin.
NOT: Araçlar her numune arasında sterilize edilmelidir.
2. Alt örnekleme ve numune hazırlama
- Alt örnekleme den önce etanol kullanarak eldivenleri sterilize edin.
- Alt örneklemeden önce toprak örneklerini iyice homojenize edin.
- Sterilize edilmiş aletler kullanarak, yaklaşık yarısı dolana kadar numune ile etiketlenmiş 2 mL santrifüj tüp yükleyin.
- 95 numunenin tümü etiketli 2 mL santrifüj tüpe alt örneklenene kadar adım 2.2'yi tekrarlayın. 96kuyu bir çıkarma boş olarak kullanılmalıdır.
NOT: Gerekli depolama alanını en aza indirmek ve aşırı veya çift örneklemeyi önlemek için 2.3 ve 2.4 adımları yapılır. - Plaka yüklenirken 2 mL alt numune tüpünü buz üzerinde saklayın.
- Etiket 96 steril 200 μL düz kapaklı PCR tüpler A1\u2012A12, B1\u2012B12, .... H1\u2012H12. 96-iyi raf içine sırayla bu tüpler yerleştirin.
- İyi bir konuma (A1\u2012H12) sahip örnek bir kimlik atayın ve kaydedin.
3. Plaka hazırlama
- Kauçuk kapağı 96 kuyulu plakadan çıkarın(Şekil 1A–1C)ve steril bir plastik torbaya yerleştirin (bkz. Malzemeler Tablosu). Kontaminasyonu önlemek için plastik torbayı kapatın.
- 96 kuyulu plakayı sızdırmazlık filmi ile kaplayın (Şekil 1D-1E); örneğin, önceden kesilebilir bir sızdırmazlık filmi kullanın (Bkz. Malzemeler Tablosu). Bir kauçuk rulo ile haddeleme tarafından mühür emin olun.
NOT: Delinebilir silikon paspaslar potansiyel olarak kullanımlar arasında uygun temizlik sağlanan yeniden kullanılabilir bir seçenek sunabilir, ancak test ettiğimiz silikon paspaslar delikler boyunca kolayca bölünebilir ve aşağıdaki plakalara eşit koruma sağlamaz. - Serin tutmak için tabağı buzdolabına (4 °C) yerleştirin.
4. Alt numunelerin transferi
NOT: Toprak numunesi çok küçük olduğunda modifikasyonlar için 4.13.
- 2 mL alt numuneden 24'ünün soğuk hava depolanması için bir buz bloğuna yerleştirin.
- Örnek adı ve iyi konum sayfasını kullanarak doğru 200 μL düz kapaklı PCR tüp seçin.
- Homojenizasyonu sağlamak için ~5 s için 2 mL alt numune tüpü ve girdap alın.
- Alev ve çamaşır suyu sterilize edilmiş aletlerin kullanılması, ilk numunenin ~200 μL'sini doğru düz kapaklı PCR tüpüne yükler(Şekil 1F).
- 24 numunenin tümü yüklenene kadar 4.2\u20124.4 adımlarını yineleyin. Sonra adım 4.6'ya geç.
- Ağartıcı daldırma kağıt silme kullanarak, 200°L düz kapaklı PCR tüpünün dışını temizleyin.
- Tüpü ters çevirin ve numuneyi tüpün üstüne taşımak için tezgaha dokunun. Ağartılmış ve alev lesterilize edilmiş makaslarla, pcr tüpünün alt kısmını keserek numunenin 96 kuyulu plakaya düşmesi için bir açıklık oluşturabilirsiniz(Şekil 1G).
- 96-iyi plaka üzerinde doğru iyi bulmak ve kesme ucu o kadar bakan plaka boyunca tüp geçmek kadar iyi ulaşana kadar. Önceden kesilebilir sızdırmazlık filminin delinmesini kolaylaştırmak için plakayı hafifçe yatırın ve sadece tüp doğrudan doğru kuyunun üzerinde olduğunda, kesme ucunun kuyuya sığması için dikkatlice ters çevirin. Sterilize edilmiş aletler kullanarak, tüm toprak tüpten kuyuya düşene kadar PCR tüpünün üst kısmına dokunun. Kapağı kapalı kuyu içinde tüp bırakın (Şekil 1H-1J).
- Bir seferde bir adet düz kapaklı 200°L PCR tüpçıkarın ve bu kuyuya 750 μL boncuk çözeltisi ekleyin (Şekil 1K). 200 μL düz kapaklı PCR tüpünü kuyuya kadar itin ve bu kuyunun yüklendiğini belirtmek için üstünü sharpie ile işaretleyin. Her örnek için bunu tekrarlayın.
- 24 numunenin tümü yüklendikten ve boncuk çözeltisi eklendikten sonra, 2 mL alt numune tüpünü çıkarın ve 24 örneklenmemiş tüple değiştirin.
- Tüm 95 kuyu örnek veya boş ve boncuk çözeltisi ile yüklenene kadar adımları 4.1\u20124.10 tekrarlayın. Tüpleri açık kuyuların üzerinden geçirmeden çıkarın (Şekil 1L).
- Delilebilir filmi dikkatlice çıkarın ve plakayı korumak için kauçuk kapağı değiştirin (Şekil 1M–1O).
- Aynı zamanda ince taneli olan çok az miktarda toprak için, numune tüpüne 750 μL boncuk çözeltisi ekleyin ve tüm içeriği uygun kuyuya aktarmak için geniş delikli pipet ucu kullanın. Çift yüklemeyi önlemek için PCR tüpünü açıklığa yerleştirin.
NOT: Bu değişikliği, pipet ucunun deliklerinden daha büyük partikül organik madde veya küçük kaya parçaları pipetleri tıkayabileceği ve numune bulamacının transferini zorlaştırabileceği için uygularken dikkatli olun. - Gerektiğinde -20 °C'de dondurularak, numune ve boncuk çözeltisi yüklü plakalar planlı ekstraksiyona kadar dondurulmalıdır.
5. Plaka yükleme yöntemlerinin karşılaştırılması
NOT: 96 kuyulu DNA çıkarma plakalarının yüklenmesi için yeni yöntemimizi doğrulamak için tek bir 96 kuyuluk plakayı üç bölüme ayırdık. Toprak ve çapraz kontaminasyon un kasıtsız yüklenmesi potansiyelini karşılaştırmak için üç farklı plaka yükleme yöntemi kullandık. Kullandığımız üç yöntem McPherson ve ark.9,Qiagen varsayılan yükleme protokolü10özetlenen yöntemler ve bu yayında anahat protokolü vardı.
- Toprağıtaba yükleme
- Bölüm 96-iyi plaka üç dört sütunblokları içine. Yukarıda belirtilen üç yöntemden birini kullanarak her bloğu yükleyin.
- Örnek ve boş kuyular sendelenmiş böylece her kuyuya toprak yükleyin. Bu düzenleme, yanlışlıkla numune yüklemesi ve çapraz kontaminasyon için maksimum fırsat sağlar.
- 96 kuyulu plakayı -20 °C'de DNA çıkarAna kadar dondurun.
- DNA ekstraksiyonu
- Üreticinin 96 kuyulu plaka çıkarma protokolü10'agöre DNA ayıklayın.
- DNA ekstrelerini ileri analize kadar -20 °C'de saklayın.
- Boş kuyularda DNA'nın sayısallaştırılması
- Oda sıcaklığında ÇÖZÜLME DNA özleri, girdap ve bir plaka spinner kullanarak aşağı spin.
- Spektrofotometre kullanarak boş kuyuların DNA konsantrasyonlarını ölçün ve kaydedin.
- Boş kuyularda ortalama DNA konsantrasyonu farklılıklarını analiz etmek için ANVOA ve Tukey'in post-hoc testini kullanın.
NOT: Α = 0.05'te önemli farklılıklar bildirilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yeni yöntem 96 kuyulu DNA çıkarma plakalarını yüklemek için başarıyla kullanılmıştır. Plaka yükleme yöntemlerinin karşılaştırılması, metoduzun boş kuyularda en düşük DNA konsantrasyonuna sahip olduğunu gösterdi. Boş kuyularda DNA konsantrasyonu benim McPherson et al.9 (p < 0.05) önerilen yöntemden önemli ölçüde daha düşüktü, ancak yöntemimizdeki DNA konsantrasyonları istatistiksel olarak Qiagen varsayılan yönteminden istatistiksel olarak farklı değildi(Şekil 2). Her üç yöntem de 2 ng/μL altında ortalama DNA konsantrasyonları üretti, ancak sadece yeni yöntemimiz ölçülebilir DNA konsantrasyonu olmayan kuyular üretti.
Şekil 1: Numuneleri DNA çıkarma için 96 kuyulu plakalara yüklemek ve kuyular arasında çapraz kontaminasyon potansiyelini en aza indirmek için adım adım yöntemler. Koyu gri kapaklar (A, B, N ve O adımlarında bulunan) ekstraksiyon kitiile birlikte gelen silikon kapağı temsil eder. Açık gri kapak (Adım D'de uygulanan, Adım L'den sonra kaldırıldı) yükleme sırasında plakayı kaplamak için kullanılan delilebilir PCR bandını temsil eder. Resimde olmamasına rağmen, araçlar her numuneyi yüklemeden önce sterilize edilmeli ve PCR tüpleri PCR bandı delmeden önce çamaşır suyu ile silinmelidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Boş kuyuların DNA konsantrasyonları. DNA konsantrasyonu ng/μL'de temsil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yöntem, yüksek üretim numune çıkarma plakaları yüklerken iyi-to-well çapraz kontaminasyon için fırsatları azaltır ve mevcut plaka yükleme stratejileri 9 ötesinde 96-iyi plakalar yüklemek için daha kontrollü bir araç sunuyor9,10. Kuyular arasında kontaminasyon tek tüp çıkarmalarda daha 96-iyi plaka ekstraksiyon daha yaygın olabilir, özellikle otomatik6,7, ve, herhangi bir metodoloji de özel olarak test olmasa da, ekstraksiyon plakaları kuyuları plaka yükleme süresi boyunca açık bırakıldığında çapraz kontaminasyon riski en yüksek kabul edilebilir. Tek tüplü ekstraksiyonlara kıyasla plaka bazlı ekstraksiyonlarda çapraz kontaminasyon için artan fırsat göz önüne alındığında, steril kapaklı kuyuların korunması numunelerin 96 kuyulu bir plakaya yüklenmesinde önemli bir ilk adım olarak düşünülmelidir. Bu ihtiyaca rağmen, yüksek iş yapma eksitme kitlerinde verilen talimatlar sadece plakayı yüklemek ve "numune kuyuları arasında çapraz kontaminasyonu önlemek" demek, ancak bunu nasıl10yapmak için herhangi bir ek bilgi vermez. 96 kuyulu bir ekstraksiyon plakasına numune eklerken kontaminasyonu azaltmak için, McPherson ve ark.9, plakayı PCR sızdırmazlık bandının kesilmiş şeritleriyle kaplamanızı ve her kuyuya erişmek için geri soyulmasını öneririz. Bu yöntem, tüm kuyuların açık olduğu toplam süreyi azaltır, ancak kuyular eşit olmayan süreler için açıktır ve kirlenmeye en yatkın kuyulardan bazıları (numunenin yüklendiği ne yakın olanlar) yükleme olayı sırasında açığa alınır. Buna ek olarak, PCR sızdırmazlık bandının soyulması, toprağın kuyudan kuyuya aktarılmasına neden olan statik elektrik yaratma potansiyeline sahiptir ve çıkarmaişlemimizde gözlenen boş kuyularda daha yüksek DNA konsantrasyonlarından sorumlu olabilir. Ayrıca, bu metodoloji, numunelerin tercih edilen kuyuya yerleştirilmeden önce ortaya çıkarılan kuyuların üzerine geçirilmesini gerektirir ve hiçbir şey bir araştırmacının iki numuneyi kazara tek bir kuyuya (çift yükleme) yüklemesini veya iki veya daha fazla numunenin yerini karıştırmasını engellemez. Yakalanırsa, çift yükleme kaynak israfından başka bir şey teşkil etmez. Ancak, numune konumlarının çift yüklenmesi veya karıştırılması fark edilmezse, deneysel sonuçlar7.
Yukarıda özetlediğimiz yöntem, yüksek iş lenmeli DNA çıkarma plakalarını yüklemek için kontrollü bir araç sağlar. Özellikle, yöntemimiz kuyuları her zaman kapalı tutarak çapraz kontaminasyon riskini azaltır. Kuyular başlangıçta sızdırmazlık bandı ile kaplanır ve daha sonra numune yüklemesi için kullanılan PCR tüpü ile kaplı tutulur. Bu yöntem sadece çapraz kontaminasyon riskini azaltmakla kalmamış, aynı zamanda iki numunenin tek bir kuyuya yüklenme riskini de tamamen önler. Bir numuneyi kuyuya yükledikten sonra, PCR tüpü bir blok görevi görehizmet ederek başka bir numunenin eklenmesini önler. Plaka konumu olan tüm tüpleri etiketleyerek (örn. A1, A2... H11, H12) numuneleri yüklemeden önce, bu yöntem tüm numunelerin yüklendiğinden ve kuyuların kaçırılmadığından emin olmak için son bir kontrol de sağlar. Bu yöntem kuyuları yüklemek için daha kontrollü bir araç sağlarken, plaka yükleyen herkes plaka üzerinde kesilmiş bir PCR tüp geçerken ekstra dikkat etmelidir. Kuyular mühürlenmiş olsa bile, mühürlü plakanın yüzeyine düşen herhangi bir numune parçacıkları, teknisyen filmi delip incelendiğinde, doğru numuneleri bu kuyulara yüklemek için istenmeyen kuyulara girebiliyordu. Bu sorunu önlemek için, 96 kuyulu plakayı PCR tüple sızdırmazlık bandını delmeden önce ~40° olarak yatırıyoruz. Bu yaklaşım, tüpün açık ucunu dik ve yanlış kuyulardan uzak tutmaya yardımcı olur.
Toprak numuneleri çok küçük miktarlarda ve/veya son derece ince taneli olduğunda, toprak numunelerini PCR tüplere yüklemek yerine geniş delikli pipet ucu kullanmak her numunenin aktarılmasında daha etkili olabilir. Bu modifikasyon için, ilk tampon çözeltisi numune tüpüne eklenmeli ve daha sonra hem numune hem de çözelti 96 kuyulu plakaya borulanmalıdır. Bu adımdan sonra her kuyuya bir PCR tüp eklemek çift yüklemeyi önler. Protokol bölümünde belirtildiği gibi, bu modifikasyon u kullanırken, araştırmacı veya teknisyen pipetin deliklerini tıkama potansiyeline sahip olduğundan, partikül organik madde veya küçük kaya parçalarının çok farkında olmalıdır.
Numune yükleme yöntemi hiçbir yöntem numune kontaminasyonu riskini tamamen ortadan kaldıramamakla birlikte, yukarıda ana hatladığımız yöntem, bu riskleri önemli ölçüde azaltmak ve numune konumlarının çift yüklenmesi ve karıştırılması riskini tamamen ortadan kaldırmak için bir araç sağlar. Genel olarak, bu yöntemin yüksek işlemli DNA çıkarma plakaları yüklemek için mevcut teknikler üzerinde büyük bir gelişme olduğuna inanıyoruz ve yüksek üretim çıkarma plakaları kullanan tüm mikrobiyologlar yukarıda özetlenen gibi bir yöntem kullanarak hareket öneririz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir çıkar çatışması rapor ve ifşa etmek için hiçbir şey var.
Acknowledgments
Bu araştırma Mikrobiyal Ekoloji İşbirliği tarafından NSF ödülü #EPS-1655726 fon ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 oz WhirlPak | Nasco | B01065 | |
| 2 mL centrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 200 µL micro-PCR tubes | Thermo Scientific | AB 2000 | |
| 96-well PowerSoil DNA extraction kit | Qiagen | 12955-4 | We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work. |
| Ice block for 2 mL centrifuge tubes | Any | Any | Any ice block made for 2 mL tubes will work |
| Ice block for 200 µL micro-PCR tubes | Any | Any | Any ice block made for 200 µL tubes will work |
| Micro scoopula | Any | Any | |
| Precut Pierceable Sealing Film | Excel Scientific | XPS25 | |
| Spatula | Any | Any | |
| Surgical scissors | Any | Any |
References
- Thompson, L. R., et al. A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity. Nature. 551 (7681), 457-463 (2017).
- Davis, A., et al. Improved yield and accuracy for DNA extraction in microbiome studies with variation in microbial biomass. BioTechniques. 66 (6), 285-289 (2019).
- Marotz, C., et al. Triplicate PCR reactions for 16S rRNA gene amplicon sequencing are unnecessary. BioTechniques. 67 (1), 29-32 (2019).
- Romdhane, S., et al. Cover crop management practices rather than composition of cover crop mixtures affect bacterial communities in no-till agroecosystems. Frontiers in Microbiology. 10, 1618 (2019).
- Rochefort, A., et al. Influence of environment and host plant genotype on the structure and diversity of the Brassica napus seed microbiota. Phytobiomes Journal. 3 (4), 326-336 (2019).
- Minich, J. J., et al. Quantifying and understanding well-to-well contamination in microbiome research. mSystems. 4 (4), 00186 (2019).
- Walker, A. W. A lot on your plate? Well-to-well contamination as an additional confounder in microbiome sequence analyses. mSystems. 4 (4), 00362 (2019).
- Eisenhofer, R., et al. Contamination in low microbial biomass microbiome studies: issues and recommendations. Trends in Microbiology. 27 (2), 105-117 (2019).
- McPherson, M. R., et al. Isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass Experiments. Journal of Visualized Experiments. (137), e57932 (2018).
- Qiagen, D. N., et al. easy PowerSoil HTP 96 Kit Handbook. , Hilden, Germany. (2019).
