Summary
Aktuelle Methoden zum Beladen von 96-Well-Platten für DNA-Extraktionen können anfällig für Verunreinigungen sein. Wir beschreiben eine neue Methode zum Beladen von 96-Well-Platten, die das Risiko einer Kreuzkontamination zwischen Brunnen reduziert. Unsere Methode wird anderen Forschern helfen, von der Effizienz von DNA-Extraktionstechniken mit hohem Durchsatz zu profitieren und das Risiko einer Kontamination zu minimieren.
Abstract
DNA-Sequenzierungstechniken mit hohem Durchsatz haben wesentlich zu Fortschritten in unserem Verständnis von Beziehungen zwischen mikrobiellen Gemeinschaften, Host-Eigenschaften und breiteren Ökosystemfunktionen beigetragen. Mit dieser raschen Zunahme der Breite und Tiefe der Sequenzierung sequencing Fähigkeiten haben Methoden zu extrahieren, zu verstärken, analysieren, und interpretieren Umwelt-DNA erfolgreich mit maximaler Effizienz. Leider kann die schnelle Durchführung von DNA-Extraktionen auf Kosten der Erhöhung des Kontaminationsrisikos unter den Proben gehen. Insbesondere Hochdurchsatzextraktionen, die auf Proben basieren, die in einer 96-Well-Platte enthalten sind, bieten im Vergleich zu Einrohrextraktionen eine relativ schnelle Methode, erhöhen aber auch die Möglichkeiten für eine gut zu-gut-kreuz-Kontamination. Um das Risiko einer Kreuzkontamination zwischen Proben zu minimieren und gleichzeitig die Vorteile von Extraktionstechniken mit hohem Durchsatz beizubehalten, haben wir eine neue Methode entwickelt, um Umweltproben in 96-Well-Platten zu laden. Wir verwendeten durchbohrbare PCR-Dichtungsfolien, um jede Platte während des Ladens von Proben abzudecken, und fügten Proben zuerst zu PCR-Röhren hinzu, bevor wir sie in Brunnen bewegten; Zusammen reduzieren diese Praktiken das Risiko von Probendrift und unbeabsichtigter Doppelbelastung von Brunnen. Die in diesem Papier beschriebene Methode bietet Forschern einen Ansatz zur Maximierung der verfügbaren Extraktionstechniken mit hohem Durchsatz bei gleichzeitiger Verringerung des Risikos einer Kreuzkontamination, die 96-Well-Platten innewohnt. Wir bieten einen detaillierten Schritt für Schritt, wie man von der Probenentnahme zur DNA-Extraktion übergeht und gleichzeitig das Risiko einer unerwünschten Kreuzkontamination minimiert.
Introduction
Die jüngsten Fortschritte bei der Hochdurchsatzsequenzierung mikrobieller Gemeinschaften bieten eine unvergleichliche Sequenzierungstiefe und damit einen beispiellosen Einblick in das Funktionieren und die Vielfalt des Erdmikrobioms1. Da die Fähigkeit, immer mehr Proben auf eine einzige Sequenzierungsspur zu multiplen, zunimmt, hat die DNA-Extraktion von Einzelrohren das Potenzial, ein ratenbegrenzender Schritt bei der Generierung ökologischer Daten zu werden. Neue Methoden in DNA-Extraktionen mit hohem Durchsatz versprechen jedoch die Verarbeitung großer Mengen von Umweltproben mit größerer Effizienz als bisher möglich2. Bei diesen Methoden werden häufig 96-Well-Platten anstelle von Einrohren verwendet, wodurch die mögliche Anzahl von Extraktionen erhöht wird, die gleichzeitig auftreten können. Als solche sind die Praktikabilität und Effizienz von Hochdurchsatzextraktionsmethoden offensichtlich und wurden für die Verarbeitung von Umweltproben von Boden3,4 und Pflanzengewebe3,5 bis zu menschlichen Fäkalien2umgesetzt.
Während diese Methoden die Probenverarbeitung und DNA-Extraktion dramatisch beschleunigen können, ist der erste Schritt der Beladung von Boden und anderen ökologischen Proben in 96-Well-Platten anfällig für kreuzprobenübergreifende Kontamination. Diese Art der Brunnenkontamination kann während der DNA-Extraktionen6,7,8und Brunnen in diesem ersten Schritt besonders anfällig sein, bevor Proben in einer Pufferlösung suspendiert werden. McPherson et al.9 demonstrieren eine Methode, um Rhizosphärenböden mit Trichtern und 8-Well-PCR-Streifenabdeckungen in 96-Well-Platten zu laden, aber obwohl ihre Methode ein kontrollierterer Ansatz zum Beladen von Platten ist, bietet sie dennoch reichlich Gelegenheit zur Kontamination benachbarter Brunnen beim Laden jeder Probe. Darüber hinaus ermöglichen die offenen Brunnen einem abgelenkten Forscher die Möglichkeit, eine Probe in den falschen Brunnen zu legen oder eine Probe in einen Brunnen zu geben, der bereits geladen wurde. Darüber hinaus erweisen sich eine Vielzahl von Probentypen als ungeeignet für die Beladung mit diesem Verfahren; Nassproben kleben oft an den Trichtern und trockenen Proben "springen" zwischen Brunnen aufgrund statischer Elektrizität.
Um die Kontaminationsmöglichkeiten zwischen Brunnen im ersten Schritt der DNA-Extraktion mit hohem Durchsatz zu verringern, haben wir einen neuen Ansatz entwickelt, um Bodenproben in 96-Well-Platten zu verladen. Unsere Methoden schützen Brunnen vor Umweltbelastungen und verhindern, dass wir versehentlich mehrere Proben in einen Brunnen laden (Doppelbelastung). Wir glauben, dass die unten beschriebene Methode verspricht, das Kontaminationspotenzial zu verringern und als solches eine kontrolliertere Möglichkeit bietet, 96-Well-Platten für die nachfolgende DNA-Extraktion zu laden.
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Protocol
1. Laborbank und Werkzeugvorbereitung zum Beladen einer 96-Well-Platte
- Klare Bankspitze durch Vernebelung mit 70% Ethanol. Wischen und lassen Sie die Luft trocknen, bevor Sie die Bank mit 10% Bleichmittel besprühen. Wischen Sie die Bank oben trocken.
- Sterilisieren Sie Mikro-Scoopula, Spachtel und chirurgische Schere (gekrümmt) durch Eintauchen in 95% Ethanol und setzen Sie dann einer Flamme aus. Tauchen Sie jeweils in 10% Bleichmittel und lassen Sie die Luft vor der Verwendung trocknen.
HINWEIS: Werkzeuge sollten zwischen jeder Probe sterilisiert werden.
2. Unterprobe und Probenvorbereitung
- Sterilisieren Sie Handschuhe mit Ethanol vor der Subprobenahme.
- Homogenisieren Sie Bodenproben vor der Unterprobe gründlich.
- Mit sterilisierten Werkzeugen ein beschriftetes 2 ml Zentrifugenrohr mit der Probe beladen, bis es etwa halb voll ist.
- Wiederholen Sie Schritt 2.2, bis alle 95 Proben in beschrifteten 2 ml Zentrifugenröhrchen subprobt wurden. Der96. Brunnen sollte als Extraktionsrohling verwendet werden.
HINWEIS: Die Schritte 2.3 und 2.4 werden durchgeführt, um den erforderlichen Speicherplatz zu minimieren und eine Über- oder Doppelte-Probenahme zu verhindern. - 2 ml Unterprobenrohre bis zum Beladen der Platte auf Eis lagern.
- Etikett 96 sterile 200 l flach gekapselte PCR-Rohre A1-u2012A12, B1-u2012B12, .... H1-u2012H12. Stellen Sie diese Rohre in Ordnung in ein 96-Well-Rack.
- Weisen Sie eine Beispiel-ID mit einer Bohrstelle (A1-u2012H12) zu und zeichnen Sie sie auf.
3. Plattenvorbereitung
- Entfernen Sie die Gummiabdeckung von der 96-Well-Platte (Abbildung 1A-1C) und legen Sie sie in eine sterile Plastiktüte (siehe Tabelle der Materialien). Versiegeln Sie den Plastikbeutel, um eine Kontamination zu verhindern.
- Bedecken Sie die 96-Well-Platte mit Dichtungsfolie(Abbildung 1D–1E); Verwenden Sie z. B. eine vorgeschnittene, durchlässige Dichtfolie (siehe Materialtabelle). Sicherstellen Der Dichtung durch Walzen mit einer Gummiwalze.
HINWEIS: Pierceable Silikonmatten könnten möglicherweise eine wiederverwendbare Option bieten, vorausgesetzt, eine angemessene Reinigung zwischen den Anwendungen, aber die Silikonmatten, die wir getestet haben, spalten sich leicht entlang der Pierces und würden keinen gleichen Schutz für nachfolgende Platten bieten. - Teller in den Kühlschrank (4 °C) stellen, um kühl zu bleiben.
4. Übertragung von Unterproben
HINWEIS: Siehe Schritt 4.13 für Änderungen, wenn die Bodenprobe sehr klein ist.
- 24 der 2 ml-Unterproben in einen Eisblock für die Kühllagerung geben.
- Wählen Sie unter Verwendung des Beispielnamens und des Gut-Lage-Blatts das richtige 200-L-Flachkappen-PCR-Rohr aus.
- Nehmen Sie ein 2 ml Unterprobenrohr und Wirbel für 5 s, um die Homogenisierung zu gewährleisten.
- Mit Flammen- und Bleichsterilwerkzeugen die erste Probe mit 200 l in das richtige flachgekapselte PCR-Rohr(Abbildung 1F)einzuladen.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.2-u20124.4, bis alle 24 Samples geladen wurden. Wechseln Sie dann zu Schritt 4.6.
- Reinigen Sie die Außenseite des 200-L-Flachkappen-PCR-Rohrs mit einem Bleichpapiertuch.
- Invertieren Sie das Rohr und tippen Sie auf die Bank, um die Probe nach oben zu bewegen. Mit gebleichten und flammensterilisierten Scheren, klemmen Sie die Unterseite des PCR-Rohrs, um eine Öffnung für die Probe zu erstellen, um in die 96-Well-Platte zu fallen (Abbildung 1G).
- Suchen Sie den richtigen Brunnen auf einer 96-Well-Platte und passieren Sie das Rohr über die Platte mit Schnittende nach oben, bis sie diesen Brunnen erreichen. Neigen Sie die Platte leicht, um das Punktieren von vorgeschnittenen pierceablen Dichtungsfilm zu erleichtern, und nur, wenn Rohr direkt über dem richtigen gut sorgfältig invertieren, so dass geschnittene Spitze passt in den Brunnen. Tippen Sie mit sterilisierten Werkzeugen auf die Oberseite des PCR-Rohrs, bis der gesamte Boden aus dem Rohr in den Brunnen gefallen ist. Lassen Sie das Rohr im Brunnen mit geschlossenem Deckel(Abbildung 1H–1J).
- Entfernen Sie jeweils ein flaches 200-L-PCR-Rohr, und fügen Sie dem Brunnen 750 l Perlenlösung hinzu(Abbildung 1K). Schieben Sie das 200-L-Flachkappen-PCR-Rohr ganz nach unten in den Brunnen und markieren Sie die Oberseite mit Sharpie, um anzuzeigen, dass dieser Brunnen geladen wurde. Wiederholen Sie dies für jedes Beispiel.
- Nachdem alle 24 Proben geladen und eine Perlenlösung hinzugefügt wurden, entfernen Sie die 2 ml-Unterprobenröhrchen und ersetzen Sie sie durch 24 nicht gesampelte Rohre.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.1-u20124.10, bis alle 95 Bohrungen mit Einerprobe oder leer ergehen und eine Perlenlösung installiert wurden. Entfernen Sie Rohre, ohne sie über offene Brunnen zu übergeben (Abbildung 1L).
- Entfernen Sie vorsichtig pierceable Folie und ersetzen Sie die Gummiabdeckung, um die Platte bis zum Beginn der Extraktion zu schützen (Abbildung 1M–1O).
- Für sehr kleine Mengen von Böden, die ebenfalls feinkörnig sind, fügen Sie dem Probenröhrchen 750 l Perlenlösung hinzu und verwenden Sie eine breitgebohrte Pipettenspitze, um alle Inhalte in den entsprechenden Brunnen zu übertragen. Legen Sie pcR-Rohr in die Öffnung, um eine Doppelbelastung zu verhindern.
HINWEIS: Seien Sie vorsichtig bei der Umsetzung dieser Modifikation als Partikel organische Substanz oder kleine Gesteinsfragmente größer als die Bohrung der Pipettenspitze kann die Pipette verstopfen und machen die Übertragung der Probe Gülle erschweren. - Bei Bedarf bei -20 °C einfrieren und Platten mit Probe- und Perlenlösung beladen bis zur geplanten Extraktion lagern.
5. Vergleich der Plattenlademethoden
HINWEIS: Um unsere neuartige Methode zur Beladung von 96-Well-DNA-Extraktionsplatten zu überprüfen, haben wir eine einzelne 96-Well-Platte in drei Abschnitte unterteilt. Wir verwendeten drei verschiedene Methoden der Plattenbeladung, um das Potenzial für unbeabsichtigte Verschmutzung von Boden und Kreuzkontamination zu vergleichen. Die drei Methoden, die wir verwendeten, waren die Methoden, die in McPherson et al.9beschrieben wurden, Qiagens Standardladeprotokoll10, und das Protokoll, das wir in dieser Publikation skizzieren.
- Beladung von Erde in die Platte
- Sektion eine 96-Well-Platte in drei vierspaltige Blöcke. Laden Sie jeden Block mit einer der drei oben genannten Methoden.
- Boden in jeden anderen Brunnen eintragen, so dass Proben- und Rohbrunnen versetzt werden. Diese Anordnung ermöglicht maximale Möglichkeiten für unbeabsichtigte Probenbelastung und Kreuzkontamination.
- Einfrieren der 96-Well-Platte bei -20 °C bis zur DNA-Extraktion.
- DNA-Extraktion
- Extrahieren Sie DNA gemäß dem 96-Well-Plattenextraktionsprotokoll des Herstellers10.
- Bewahren Sie die DNA-Extrakte bis zur weiteren Analyse bei -20 °C auf.
- Quantifizierung der DNA in Rohbrunnen
- Dna-Extrakte bei Raumtemperatur auftauen, Wirbel und Spin down mit einem Plattenspinner.
- Messen und aufzeichnen Sie DNA-Konzentrationen von Rohbrunnen mit einem Spektralphotometer.
- Verwenden Sie den Post-hoc-Test von ANVOA und Tukey, um Unterschiede in der mittleren DNA-Konzentration in Rohbrunnen zu analysieren.
ANMERKUNG: Es wurden erhebliche Unterschiede bei 0,05 gemeldet.
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Representative Results
Diese neuartige Methode wurde erfolgreich verwendet, um 96-Well-DNA-Extraktionsplatten zu laden. Der Vergleich der Plattenlademethoden zeigte, dass unsere Methode die niedrigste DNA-Konzentration in den Rohbrunnen aufweist. Die DNA-Konzentration in den Rohbrunnen war signifikant niedriger als die vorgeschlagene Methode mein McPherson et al.9 (p < 0,05), obwohl sich die DNA-Konzentrationen in unserer Methode statistisch nicht von der Qiagen-Standardmethode unterschieden (Abbildung 2). Alle drei produzierten Methoden bedeuten DNA-Konzentrationen unter 2 ng/l, obwohl nur unsere neue Methode Brunnen ohne messbare DNA-Konzentration produzierte.
Abbildung 1: Schritt-für-Schritt-Methoden zum Einladen von Proben in 96-Well-Platten zur DNA-Extraktion bei gleichzeitiger Minimierung des Potenzials für Kreuzkontamination unter Brunnen. Dunkelgraue Abdeckungen (in den Schritten A, B, N und O) stellen die Silikonabdeckung dar, die mit dem Extraktionskit geliefert wird. Die hellgraue Abdeckung (in Schritt D aufgebracht, nach Schritt L entfernt) stellt das durchbohrbare PCR-Band dar, das verwendet wird, um die Platte während des Ladens zu bedecken. Obwohl nicht abgebildet, sollten Werkzeuge vor dem Laden jeder Probe sterilisiert werden, und PCR-Röhren sollten mit Bleichmittel vor dem Durchstechen des PCR-Bandes abgewischt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: DNA-Konzentrationen von Rohbrunnen. Die DNA-Konzentration ist in ng/l dargestellt. Buchstaben deuten auf signifikante paarweise Unterschiede in den DNA-Konzentrationen bei n = 0,05 hin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Diese Methode reduziert die Möglichkeiten für eine gut zu-gut-kreuz-Kontamination beim Laden von Probenextraktionsplatten mit hohem Durchsatz und bietet eine kontrolliertere Möglichkeit, 96-Well-Platten über bestehende Plattenbelastungsstrategien9,10hinaus zu laden. Die Kontamination unter Brunnen kann bei 96-Well-Plattenextraktionen stärker ausgeprägt sein als bei Einrohrextraktionen, insbesondere bei automatisierten6,,7, und obwohl das Risiko einer Kreuzkontamination nicht speziell in irgendeiner Methodik getestet wurde, kann das Risiko einer Kreuzkontamination am höchsten angenommen werden, wenn die Brunnen der Extraktionsplatten für die Dauer der Plattenbeladung offen gelassen werden. Angesichts der im Vergleich zu Einrohrextraktionen erhöhten Möglichkeiten zur Kreuzkontamination in plattenbasierten Extraktionen sollte der Schutz von Brunnen mit einer sterilen Abdeckung als ein wichtiger erster Schritt beim Laden von Proben in eine 96-Well-Platte betrachtet werden. Trotz dieser Notwendigkeit, Anweisungen in High-Through-Absaug-Extraktions-Kits nur sagen, um die Platte zu laden und "Kreuzkontamination zwischen Probenbrunnen zu vermeiden", aber keine zusätzlichen Informationen darüber, wie dies zu tun10. Um die Kontamination zu reduzieren und gleichzeitig probenweise zu einer 96-Well-Extraktionsplatte hinzuzufügen, schlagen McPherson et al.9 vor, die Platte mit geschnittenen Streifen aus PCR-Dichtungsband zu bedecken und sie zurück zu schälen, um auf jeden Brunnen zuzugreifen. Diese Methode reduziert die Gesamtzeit, die alle Brunnen geöffnet sind, aber Brunnen sind für ungleiche Zeitzeiten geöffnet und einige der Brunnen, die am anfälligsten für Verunreinigungen sind – diejenigen, die der geladenen Probe am nächsten sind – werden während des Ladeereignisses ausgesetzt. Darüber hinaus hat das Schälen von PCR-Dichtungsband das Potenzial, statische Elektrizität zu erzeugen, die dazu führt, dass der Boden von Brunnen zu Brunnen übertragen wird und für die höheren DNA-Konzentrationen in Rohbrunnen verantwortlich sein könnte, die bei unserer Extraktion beobachtet werden. Darüber hinaus erfordert diese Methode, dass Proben über unbedeckte Brunnen geleitet werden, bevor sie in den Brunnen der Wahl gelegt werden, und nichts hindert einen Forscher daran, versehentlich zwei Proben in einen einzigen Bohrbrunnen zu laden (doppelbeladung) oder die Position von zwei oder mehr Proben zu vermischen. Wenn sie erwischt wird, stellt die Doppelteladung nichts anderes als eine Verschwendung von Ressourcen dar. Wenn jedoch eine doppelte Beladung oder Vermischung von Probenpositionen unbemerkt bleibt, können die experimentellen Ergebnisse verzerrt werden7.
Die oben beschriebene Methode bietet eine kontrollierte Möglichkeit, DNA-Extraktionsplatten mit hohem Durchsatz zu laden. Insbesondere senkt unsere Methode das Risiko einer Kreuzkontamination, indem Brunnen jederzeit abgedeckt werden. Die Brunnen werden zunächst mit Dichtband abgedeckt und dann von dem PCR-Rohr abgedeckt, das für die Probenbelastung verwendet wird. Diese Methode reduziert nicht nur das Risiko einer Kreuzkontamination, sondern verhindert auch vollständig das Risiko, zwei Proben in einen einzigen Brunnen zu laden. Sobald wir eine Probe in einen Brunnen laden, dient das PCR-Rohr als Block, wodurch das Hinzufügen einer anderen Probe verhindert wird. Durch Beschriften aller Rohre mit Plattenposition (z.B. A1, A2... H11, H12) vor dem Laden von Proben bietet diese Methode auch eine abschließende Überprüfung, um sicherzustellen, dass alle Proben geladen wurden und keine Bohrungen verpasst wurden. Während diese Methode eine kontrolliertere Möglichkeit bietet, Brunnen zu laden, sollte jeder, der eine Platte lädt, besonders vorsichtig sein, wenn er ein geschnittenes PCR-Rohr über die Platte führt. Obwohl die Brunnen versiegelt sind, könnten alle Probenpartikel, die auf die Oberfläche der versiegelten Platte fallen, ihren Weg in unbeabsichtigte Brunnen finden, wenn der Techniker den Film durchbohrt, um die richtigen Proben in diese Brunnen zu laden. Um dieses Problem zu vermeiden, neigen wir die 96-Well-Platte auf 40° vor dem Durchsonzen des Dichtbandes mit dem PCR-Rohr. Dieser Ansatz hilft, das offene Ende der Röhre aufrecht und weg von den falschen Brunnen zu halten.
Wenn Bodenproben von sehr kleinen Mengen und/oder extrem feinkörnig sind, kann die Verwendung einer breitbohrungen Pipettenspitze anstelle des Ladens von Bodenproben in PCR-Rohre bei der Übertragung jeder Probe effektiver sein. Für diese Modifikation sollte die erste Pufferlösung dem Probenröhrchen hinzugefügt und dann sowohl Probe als auch Lösung in die 96-Well-Platte geleitet werden. Durch das Hinzufügen eines PCR-Rohrs zu jedem Bohrplatz nach diesem Schritt wird eine Doppelbelastung verhindert. Wie im Protokollabschnitt erwähnt, sollte der Forscher oder Techniker bei der Verwendung dieser Änderung sehr auf partikelorganische Stoffe oder kleine Gesteinsfragmente achten, da diese das Potenzial haben, die Bohrung der Pipette zu verstopfen.
Obwohl keine Methode der Probenbelastung das Risiko einer Probenkontamination vollständig beseitigen kann, bietet die oben beschriebene Methode ein Mittel, um diese Risiken erheblich zu reduzieren und das Risiko der doppelten Beladung und Vermischung von Probenstandorten vollständig zu beseitigen. Insgesamt glauben wir, dass diese Methode eine große Verbesserung gegenüber bestehenden Techniken zum Laden von DNA-Extraktionsplatten mit hohem Durchsatz darstellt, und legen nahe, dass alle Mikrobiologen, die Extraktionsplatten mit hohem Durchsatz verwenden, eine Methode wie die oben beschriebene verwenden.
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Disclosures
Die Autoren berichten von keinen Interessenkonflikten und haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde vom Microbial Ecology Collaborative mit Einer Förderung des NSF-Preises #EPS-1655726 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 oz WhirlPak | Nasco | B01065 | |
| 2 mL centrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 200 µL micro-PCR tubes | Thermo Scientific | AB 2000 | |
| 96-well PowerSoil DNA extraction kit | Qiagen | 12955-4 | We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work. |
| Ice block for 2 mL centrifuge tubes | Any | Any | Any ice block made for 2 mL tubes will work |
| Ice block for 200 µL micro-PCR tubes | Any | Any | Any ice block made for 200 µL tubes will work |
| Micro scoopula | Any | Any | |
| Precut Pierceable Sealing Film | Excel Scientific | XPS25 | |
| Spatula | Any | Any | |
| Surgical scissors | Any | Any |
References
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