Модифицированные методы загрузки высокой пропускной способности пластин извлечения ДНК снижают потенциал загрязнения

Summary

Современные методы загрузки 96-х пластин для извлечения ДНК могут быть подвержены загрязнению. Мы подробно описали новый метод погрузки пластин 96 скважин, который снижает риск перекрестного загрязнения скважин. Наш метод поможет другим исследователям извлечь выгоду из эффективности высокой пропускной способности методов извлечения ДНК и свести к минимуму риск заражения.

Abstract

Методы секвенирования ДНК с высокой пропускной способностью в значительной степени способствовали прогрессу в нашем понимании взаимосвязей между микробными сообществами, характеристиками хозяина и более широкими функциями экосистем. При этом быстрое увеличение широты и глубины возможностей секвенирования пришли методы для извлечения, усиления, анализа и интерпретации ДНК окружающей среды успешно с максимальной эффективностью. К сожалению, быстрое выполнение извлечения ДНК может произойти за счет увеличения риска заражения образцов. В частности, экстракции с высокой пропускной способностью, основанные на образцах, содержащихся в пластине 96-й пластины, предлагают относительно быстрый метод, по сравнению с однотрубными извлечениями, но также увеличивают возможности для хорошого перекрестного загрязнения. Чтобы свести к минимуму риск перекрестного загрязнения образцов, сохраняя при этом преимущества высокой пропускной способности методов экстракции, мы разработали новый метод загрузки образцов окружающей среды в 96-колодец пластин. Мы использовали проколочные пленки уплотнения ПЦР для покрытия каждой пластины при загрузке образцов и добавили образцы сначала в ПЦР трубки перед перемещением их в скважины; в совокупности такая практика снижает риск дрейфа проб и непреднамеренной двойной загрузки скважин. Метод, изложенный в настоящем документе, предоставляет исследователям подход к максимальному использованию доступных методов экстракции с высокой пропускной способностью при одновременном снижении риска перекрестного загрязнения, присущего пластинам 96-й пластины. Мы предоставляем подробный шаг за шагом наброски того, как перейти от сбора образцов к извлечению ДНК при минимизации риска нежелательного перекрестного загрязнения.

Introduction

Недавние достижения в области секвенирования микробных сообществ с высокой пропускной способностью обеспечивают беспрецедентную глубину секвенирования и, следовательно, беспрецедентный взгляд на функционирование и разнообразие микробиома^{Земли 1}. По мере увеличения способности мультиплекса все больше и больше образцов на одну полосу секвенирования, извлечение ДНК одной трубки может стать ограничивающим скорость шагом в генерации экологических данных. Тем не менее, новые методы в высокой пропускной способности ДНК извлечения обещают для обработки больших количеств образцов окружающей среды с большей эффективностью, чем это было^{ранее возможно 2}. Эти методы часто включают в себя использование 96-хорошо пластин вместо однотрубных труб, тем самым увеличивая возможное количество извлечений, которые могут произойти одновременно. Таким образом, практичность и эффективность высокой пропускной способности методов экстракции очевидны и были реализованы для обработки экологических^{образцов,}начиная^{от почвы 3,4} и^{растительных тканей 3,,5} до фекального вещества^{человека 2}.

Хотя эти методы могут резко ускорить обработку образцов и извлечение ДНК, начальный этап загрузки почвы и других экологических образцов в 96-хорошо пластин подвержены перекрестному загрязнению. Этот тип хорошо загрязнения может произойти во время извлечения^{ДНК 6,,7,,}8 ,^{и скважины}особенно уязвимы на этом первом этапе, прежде чем образцы приостановлены в буферный раствор. McPherson et al.^{9 демонстрируют метод загрузки} корневища почв в 96-колодец пластин с использованием воронок и 8-хорошо ПЦР полосы охватывает, но в то время как их метод является более контролируемым подходом к погрузке пластин, он по-прежнему предоставляет широкие возможности для загрязнения соседних скважин при загрузке каждого образца. Кроме того, открытые скважины позволяют отвлеченного исследователя поместить образец в неправильную скважину или добавить образец в колодец, который уже был загружен. Кроме того, различные типы образцов оказались неподходят для загрузки с помощью этого метода; влажные образцы часто прилипают к воронки и сухие образцы “прыгать” между скважинами из-за статического электричества.

Чтобы уменьшить возможности загрязнения скважин на первом этапе экстракции ДНК с высокой пропускной способностью, мы разработали новый подход к загрузке образцов почвы в пластины 96 скважин. Наши методы защищают скважины от воздействия окружающей среды и не позволяют нам случайно загрузить несколько образцов в одну скважину (двойная загрузка). Мы считаем, что метод, о которого сообщается ниже, обещает уменьшить потенциал загрязнения и как таковой обеспечивает более контролируемые средства для загрузки 96-хорошо пластин для последующей экстракции ДНК.

Protocol

1. Лабораторная скамейка и подготовка инструмента для загрузки пластины из 96 колодец Очистить верхнюю скамейку, затуманив 70% этанола. Протрите и дайте воздуху высохнуть перед распылением скамейке сверху с 10% отбеливателя. Протрите скамейку сверху сухой. Стерилизовать микро-sc…

Representative Results

Этот новый метод был успешно использован для загрузки 96-ну пластины извлечения ДНК. Сравнение методов загрузки пластин показало, что наш метод имеет самую низкую концентрацию ДНК в пустых скважинах. Концентрация ДНК в пустых скважинах была значительно ниже, чем метод предложил мой McPhers…

Discussion

Этот метод уменьшает возможности для хорошо колодец перекрестного загрязнения при загрузке высокой пропускной способности образца извлечения пластин и предлагает более контролируемые средства для загрузки 96-хорошо пластин за пределами существующих стратегий^{загрузки пла?…}

Materials

18 oz WhirlPak	Nasco	B01065
2 mL centrifuge tubes	Fisherbrand	05-408-129
200 µL micro-PCR tubes	Thermo Scientific	AB 2000
96-well PowerSoil DNA extraction kit	Qiagen	12955-4	We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work.
Ice block for 2 mL centrifuge tubes	Any	Any	Any ice block made for 2 mL tubes will work
Ice block for 200 µL micro-PCR tubes	Any	Any	Any ice block made for 200 µL tubes will work
Micro scoopula	Any	Any
Precut Pierceable Sealing Film	Excel Scientific	XPS25
Spatula	Any	Any
Surgical scissors	Any	Any