Summary
DNA 추출을 위한 96웰 플레이트를 적재하는 현재의 방법은 오염되기 쉽습니다. 우리는 우물 중 교차 오염의 위험을 감소 96 웰 플레이트를로드하기위한 새로운 방법을 자세히 설명합니다. 우리의 방법은 다른 연구자들이 고처리량 DNA 추출 기술의 효율성을 활용하고 오염 위험을 최소화하는 데 도움이 될 것입니다.
Abstract
높은 처리량 DNA 염기서열 분석 기술은 미생물 지역 사회, 호스트 특성 및 광범위한 생태계 기능 간의 관계에 대한 이해의 발전에 실질적으로 기여했습니다. 이러한 급속한 폭과 시퀀싱 기능이 급격히 증가함에 따라 최대 효율로 환경 DNA를 추출, 증폭, 분석 및 해석하는 방법이 왔습니다. 불행히도, DNA 추출을 신속하게 수행하는 것은 샘플 중 오염 위험을 증가시켜야 할 수 있습니다. 특히, 96웰 플레이트에 포함된 샘플을 기반으로 하는 고처리량 추출은 단일 튜브 추출에 비해 비교적 빠른 방법을 제공하지만 잘 교차 오염을 위한 기회도 증가합니다. 시료 간 교차 오염 위험을 최소화하기 위해 고처리량 추출 기술의 이점을 유지하면서 환경 샘플을 96웰 플레이트에 적재하는 새로운 방법을 개발했습니다. 우리는 샘플을로드하는 동안 각 플레이트를 커버하기 위해 피어싱 식 PCR 밀봉 필름을 사용하고 우물로 이동하기 전에 PCR 튜브에 먼저 샘플을 추가했습니다. 이러한 관행은 함께 샘플 드리프트및 의도하지 않은 이중 유정 의 위험을 줄입니다. 이 논문에 설명된 방법은 연구원들에게 96웰 플레이트에 내재된 교차 오염 위험을 줄이면서 사용 가능한 고처리량 추출 기술을 극대화하는 방법을 제공합니다. 우리는 원치 않는 교차 오염의 위험을 최소화하면서 샘플 수집에서 DNA 추출로 이동하는 방법에 대한 자세한 단계를 제공합니다.
Introduction
미생물 공동체의 고처리량 시퀀싱의 최근 발전은 비교할 수 없는 시퀀싱 깊이를 제공하고 있으며, 결과적으로 지구의 미생물군유전체1의기능과 다양성을 엿볼 수 있습니다. 단일 시퀀싱 레인에 점점 더 많은 샘플을 멀티플렉스하는 능력이 증가함에 따라 단일 튜브 DNA 추출은 생태 데이터 생성에서 속도 제한 단계가 될 가능성이 있습니다. 그러나, 고처리량 DNA 추출의 새로운 방법은 이전에 가능했던 것보다 더 큰 효율을 가진 다량의 환경 샘플을 처리하기위한 약속을보유2. 이러한 방법은 종종 단일 튜브 대신 96 웰 플레이트를 사용하여 동시에 발생할 수있는 추출 수를 증가시키는 것을 포함합니다. 이와 같이, 고처리량 추출 방법의 실용성과 효율이 분명하고 토양3,4 및 식물 조직33,5에서 인간의 배설물물질 2에이르기까지 환경 샘플의 처리를 위해 구현되었다.,
이러한 방법은 시료 처리 및 DNA 추출을 따라 극적으로 속도를 낼 수 있지만 토양 및 기타 생태 샘플을 96웰 플레이트로 적재하는 초기 단계는 교차 시료 오염에 취약합니다. 이러한 유형의 잘 오염은 DNA 추출6,7,7,8동안 발생할 수 있으며, 우물은 이 첫 번째 단계에서 특히 취약하여 샘플이 완충액에서 일시 중단됩니다. McPherson외. 9는 깔때기와 8 웰 PCR 스트립 커버를 사용하여 96 웰 플레이트에 뿌리 권구 토양을 적재하는 방법을 보여 주지만, 그 방법은 플레이트를 적재하는 보다 통제된 접근 방식이지만, 각 시료를 적재할 때 주변 우물의 오염을 위한 충분한 기회를 제공한다. 또한, 오픈 웰은 산만 한 연구원이 잘못된 우물에 샘플을 배치하거나 이미로드 된 우물에 샘플을 추가 할 수있는 기회를 허용합니다. 또한 다양한 샘플 유형이 이 방법으로 로딩에 적합하지 않은 것으로 판명되었습니다. 젖은 샘플은 종종 정전기로 인해 우물 사이에 깔때기와 건조 샘플 '점프'에 충실합니다.
고처리량 DNA 추출의 첫 번째 단계에서 우물 간 오염 기회를 줄이기 위해 토양 샘플을 96웰 플레이트로 적재하는 새로운 접근법을 개발했습니다. 우리의 방법은 모두 환경 노출로부터 우물을 보호하고 실수로 여러 샘플을 하나의 우물 (이중 로딩)에적재하지 못하게합니다. 우리는 아래에 보고된 방법이 오염가능성을 감소시키는 것을 약속하고 그 같은 후속 DNA 추출을 위한 96 웰 플레이트를 적재하는 더 통제된 수단을 제공한다는 것을 믿습니다.
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Protocol
1. 실험실 벤치 및 96 웰 플레이트를적재딩하기 위한 공구 준비
- 70%에탄올로 미스티로 벤치 탑을 클리어합니다. 10% 표백제로 벤치 탑을 뿌리기 전에 공기를 닦고 건조시키십시오. 벤치 탑을 말리십시오.
- 마이크로 스쿠뮬라, 주걱 및 외과 가위 (곡선)를 95 %에탄올에 담근 다음 화염에 노출하여 살균하십시오. 각 10%의 표백제에 담그고 사용하기 전에 공기 건조를 허용합니다.
참고: 각 샘플 간에 도구를 소독해야 합니다.
2. 하위 샘플링 및 샘플 준비
- 서브 샘플링 전에 에탄올을 사용하여 장갑을 살균하십시오.
- 하위 샘플링 전에 토양 샘플을 균질화합니다.
- 멸균 도구를 사용하여 라벨이 부착된 2mL 원심분리기 튜브를 샘플로 적재하여 약 절반까지 충전할 수 있습니다.
- 모든 95개의 샘플이 라벨이 부착된 2mL 원심분리기 튜브로 하위 샘플링될 때까지 2.2를 반복합니다. 96th 우물추출 공백으로 사용되어야 합니다.
참고: 2.3 단계와 2.4단계는 필요한 저장 공간을 최소화하고 오버 또는 이중 샘플링을 방지하기 위해 수행됩니다. - 플레이트를 적재할 때까지 2mL 서브 샘플 튜브를 얼음에 보관하십시오.
- 라벨 96 멸균 200 μL 플랫 캡 PCR 튜브 A1\u2012A12, B1\u2012B12, .... H1\u2012H12. 이 튜브를 96웰 랙에 넣습니다.
- 위치가 좋은 샘플 ID(A1\u2012H12)를 지정하고 기록합니다.
3. 플레이트 준비
- 96웰플레이트(그림 1A-1C)에서고무 커버를 분리하여 멸균 비닐 봉지에 넣습니다(재료표참조). 오염을 방지하기 위해 비닐 봉지를 밀봉하십시오.
- 밀봉 필름으로 96웰 플레이트를덮습니다(그림 1D-1E); 예를 들어, 사전 절단 피어싱 가능한 밀봉 필름을 사용합니다(재료표참조). 고무 롤러로 롤링하여 밀봉을 보장합니다.
참고: 피어싱 가능한 실리콘 매트는 사용 간에 적절한 세척을 제공하는 재사용 가능한 옵션을 제공할 수 있지만, 우리가 쉽게 피어싱을 따라 분할테스트한 실리콘 매트는 다음 플레이트에 동등한 보호를 제공하지 않습니다. - 냉장고 (4 °C)에 접시를 놓고 시원함을 유지합니다.
4. 하위 샘플 의 전송
참고: 토양 샘플이 매우 작은 경우 수정을 위한 4.13 단계를 참조하십시오.
- 2mL 하위 샘플 중 24개샘플을 얼음 블록에 넣고 냉장 보관합니다.
- 샘플 이름과 위치 시트를 사용하여 올바른 200 μL 플랫 캡 PCR 튜브를 선택합니다.
- 균질화를 보장하기 위해 ~ 5 s에 대한 2 mL 하위 샘플 튜브와 소용돌이를 가져 가라.
- 화염 및 표백제 살균 도구를 사용하여 올바른 평면 캡 PCR 튜브(도 1F)에첫 번째 샘플의 ~ 200 μL을로드합니다.
- 모든 24개의 샘플이 로드될 때까지 4.2\u20124.4단계를 반복합니다. 그런 다음 4.6 단계로 이동합니다.
- 표백제 담근 종이 닦아를 사용하여 200 μL 평면 캡 PCR 튜브의 외부를 청소하십시오.
- 튜브를 반전시키고 벤치를 탭하여 샘플을 튜브 위로 이동합니다. 표백 및 화염 멸균 가위를 사용하여 PCR 튜브의 바닥을 잘라 96 웰 플레이트(도 1G)에빠질 수있는 시료를 만듭니다.
- 96웰 플레이트에서 올바른 것을 찾아 서 잘 도달할 때까지 잘라낸 끝이 있는 플레이트를 가로질러 튜브를 통과합니다. 플레이트를 약간 기울여 미리 절단된 피어싱 식 밀봉 필름의 구멍을 용이하게 하고 튜브가 올바른 바로 위에 있을 때만 잘 뒤집어 잘라낸 팁이 잘 들어갑니다. 살균 도구를 사용하여 모든 토양이 튜브에서 우물로 떨어질 때까지 PCR 튜브의 상단을 누릅니다. 뚜껑이 닫혀 있는 우물 안에 튜브를 둡니다(그림1H-1J).
- 한 번에 하나의 평면 캡 200 μL PCR 튜브를 제거하고 잘 비드 용액750 μL을 추가(그림 1K). 200 μL 플랫 캡 PCR 튜브를 끝까지 우물로 밀어 넣고 상단을 날카로운 것으로 표시하여 이 우물이 로드되었음을 나타냅니다. 각 샘플에 대해 이 작업을 반복합니다.
- 24개의 시료가 모두 적재되고 비드 용액이 추가되면 2mL 하위 샘플 튜브를 제거하고 24개의 비샘플링 튜브로 교체하십시오.
- 모든 95 개의 우물이 샘플 또는 빈 및 비드 솔루션으로로드 될 때까지 4.1\u20124.10 단계를 반복하십시오. 열린 우물 위에 전달하지 않고 튜브를 제거합니다(그림1L).
- 조심스럽게 관통 필름을 제거하고 추출(그림 1M-1O)까지플레이트를 보호하기 위해 고무 커버를 교체합니다.
- 또한 세분화 된 토양의 매우 작은 양의 경우, 샘플 튜브에 비드 용액의 750 μL을 추가하고 적절한 우물에 모든 내용을 전송하는 넓은 보어 파이펫 팁을 사용합니다. PCR 튜브를 개구부에 배치하여 이중 로딩을 방지합니다.
참고: 파이펫 팁의 보어보다 큰 미립자 유기물 또는 작은 암석 조각으로 이 수정을 구현할 때 파이펫을 막고 시료 슬러리의 전달을 어렵게 만들 수 있습니다. - 필요에 따라 -20°C에서 동결하고 계획 추출될 때까지 시료및 비드 용액이 적재된 플레이트를 저장합니다.
5. 플레이트 로딩 방법의 비교
참고 : 96 웰 DNA 추출 플레이트의 로딩에 대한 우리의 새로운 방법을 확인하기 위해, 우리는 세 섹션으로 하나의 96 웰 플레이트를 분할. 우리는 토양과 교차 오염의 의도하지 않은 적재 가능성을 비교하기 위해 판 로딩의 세 가지 다른 방법을 사용했다. 우리가 사용한 세 가지 방법은 McPherson 외9,Qiagen의 기본 로딩 프로토콜10및 이 출판물에서 설명하는 프로토콜에 설명된 메서드였습니다.
- 접시에 토양을 적재
- 96웰 플레이트를 3개의 4열 블록으로 섹션화합니다. 위에서 언급한 세 가지 방법 중 하나를 사용하여 각 블록을 로드합니다.
- 토양을 다른 모든 우물에 적재하여 샘플과 빈 우물이 비틀거리게 됩니다. 이 배열을 통해 부주의한 시료 적재 및 교차 오염에 대한 최대 기회를 허용합니다.
- DNA 추출될 때까지 -20°C에서 96웰 플레이트를 동결합니다.
- DNA 추출
- 제조업체의 96웰 플레이트 추출프로토콜(10)에따라 DNA를 추출한다.
- DNA 추출물을 추가 분석할 때까지 -20°C에 저장합니다.
- 빈 우물에서 DNA의 정량화
- 실온, 소용돌이에서 DNA 추출물을 해동하고 플레이트 스피너를 사용하여 아래로 회전합니다.
- 분광광계를 사용하여 빈 우물의 DNA 농도를 측정하고 기록합니다.
- ANVOA와 Tukey의 포스트 혹 후 테스트를 사용하여 빈 우물의 평균 DNA 농도의 차이를 분석하십시오.
참고: α = 0.05에서 상당한 차이가 보고되었습니다.
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Representative Results
이 새로운 방법은 96웰 의 DNA 추출 플레이트를 로드하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 플레이트 로딩 방법의 비교는 빈 우물에서 가장 낮은 DNA 농도를 갖는 우리의 방법을 보여 주었다. 빈 우물의 DNA 농도는 내 맥퍼슨 외9 (p< 0.05)를 제안한 방법보다 현저히 낮았지만, 우리의 방법의 DNA 농도는 Qiagen 기본 방법(도 2)과통계적으로 다르지 않았다. 생성된 세 가지 방법 모두 2 ng/μL 미만의 DNA 농도를 의미하지만, 우리의 새로운 방법만이 측정 가능한 DNA 농도없이 우물을 생산했습니다.
그림 1: 단계별 방법으로 샘플을 DNA 추출을 위한 96웰 플레이트에 적재하는 동시에 우물 간 교차 오염 가능성을 최소화합니다. 다크 그레이 커버(A, B, N 및 O 단계에 있음)는 추출 키트와 함께 제공되는 실리콘 커버를 나타냅니다. 라이트 그레이 커버(단계 D에 적용되고, 단계 L 후 제거됨)는 적재 하는 동안 플레이트를 덮는 데 사용되는 피어싱 식 PCR 테이프를 나타냅니다. 그림은 아니지만 각 샘플을 적재하기 전에 공구를 소독해야 하며 PCR 튜브는 PCR 테이프를 관통하기 전에 표백제로 닦아야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 빈 우물의 DNA 농도. DNA 농도는 ng/μL에서 표현된다. 편지는 α = 0.05에서 DNA 농도에 있는 유의한 쌍별 차이를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 방법은 높은 처리량 샘플 추출 플레이트를 적재하는 동안 잘 교차 오염에 대한 기회를 줄이고 기존 플레이트 로딩 전략9,,10을넘어 96 웰 플레이트를 로드하는 보다 제어된 수단을 제공한다. 우물 간의 오염은 단일 튜브 추출보다 96웰 의 플레이트 추출에 더 널리 퍼질 수 있으며, 특히자동화된 6,,7의경우, 어떤 방법론에서도 구체적으로 테스트되지는 않지만, 판적 하중 기간 동안 추출 플레이트의 우물이 열려 있을 때 교차 오염의 위험이 가장 높은 것으로 가정될 수 있다. 단일 튜브 추출에 비해 플레이트 기반 추출에서 교차 오염의 기회가 증가하면 멸균 커버로 우물을 보호하는 것이 샘플을 96웰 플레이트에 적재하는 중요한 첫 번째 단계로 간주되어야 합니다. 이러한 필요성에도 불구하고, 높은 처리량 추출 키트에 제공된 지침은 단순히 접시를 적재하고 "샘플 우물 사이의 교차 오염을 피하기 위해"라고 말하지만10을수행하는 방법에 대한 추가 정보를 제공하지 는 않습니다. 96웰 추출 플레이트에 샘플을 추가하면서 오염을 줄이기 위해 McPherson 외.9는 PCR 밀봉 테이프의 컷 스트립으로 플레이트를 덮고 각 우물에 다시 액세스하도록 벗겨내는 것이 좋습니다. 이 방법은 모든 우물이 열려 있는 총 시간을 줄여주지만, 우물은 불평등한 양의 시간 동안 열려 있으며, 오염에 가장 취약한 우물 중 일부(로드되는 샘플에 가장 가까운 우물)가 로딩 이벤트 중에 노출됩니다. 또한 PCR 밀봉 테이프의 필링은 토양이 잘 전달되는 정전기를 생성할 수 있으며 추출에서 관찰되는 빈 우물에서 더 높은 DNA 농도를 담당할 수 있습니다. 또한, 이 방법론은 샘플이 선택의 우물에 배치되기 전에 발견 된 우물을 통해 전달되어야하며, 연구원이 실수로 두 개의 샘플을 단일 우물 (이중 로딩)에 로드하거나 두 개 이상의 샘플의 위치를 혼합하는 것을 막을 수는 없습니다. 잡히면 이중 로딩은 자원 낭비에 지나지 않습니다. 그러나 샘플 위치의 이중 로딩 또는 혼합이 눈에 띄지 않으면 실험 결과가7으로왜곡될 수 있습니다.
위에서 설명한 방법은 고처리량 DNA 추출 플레이트를 로드하는 제어된 수단을 제공합니다. 특히, 우리의 방법은 항상 덮여 우물을 유지하여 교차 오염의 위험을 낮춥니다. 우물은 처음에 밀봉 테이프로 덮여 있으며 샘플 로딩에 사용되는 PCR 튜브에 의해 덮여 유지됩니다. 이 방법은 교차 오염의 위험을 줄일 뿐만 아니라 두 개의 샘플을 하나의 우물로 로드할 위험을 완전히 방지합니다. 샘플을 우물에 적재하면 PCR 튜브는 블록 역할을 하여 다른 샘플을 추가하지 않습니다. 플레이트 위치(예: A1, A2 등)로 모든 튜브에 라벨을 부착하여 라벨을 부착할 수 있습니다. H11, H12) 시료를 적재하기 전에 이 방법은 모든 샘플이 로드되고 우물이 누락되지 않았는지 확인하기 위한 최종 검사도 제공합니다. 이 방법은 우물을 적재하는 보다 제어된 수단을 제공하지만, 플레이트를 적재하는 사람은 플레이트 위에 절단 된 PCR 튜브를 통과 할 때 각별한주의를 기울여야합니다. 우물이 밀봉되어 있더라도, 밀폐된 판의 표면에 떨어지는 모든 샘플 입자는 기술자가 필름을 관통하여 올바른 샘플을 그 우물에 로드할 때 의도하지 않은 우물로 들어갈 수 있습니다. 이 문제를 피하기 위해 PCR 튜브로 밀봉 테이프를 뚫기 전에 96 웰 플레이트를 ~40°로 기울입니다. 이 방법은 잘못된 우물에서 튜브의 열린 끝을 똑바로 유지하는 데 도움이됩니다.
토양 샘플이 매우 소량 및/또는 매우 세분화된 경우 토양 샘플을 PCR 튜브에 적재하는 대신 넓은 보어 파이펫 팁을 사용하여 각 샘플을 이송하는 데 더 효과적일 수 있습니다. 이 수정을 위해 첫 번째 버퍼 용액을 샘플 튜브에 추가한 다음 샘플과 용액을 모두 96웰 플레이트에 파이펫처리해야 합니다. 이 단계 후 각 웰에 PCR 튜브를 추가하면 이중 로딩이 방지됩니다. 프로토콜 섹션에서 언급 했듯이, 이 수정을 사용할 때, 연구원 또는 기술자는 파이펫의 구멍을 막을 수있는 잠재력을 가지고 있기 때문에 미립자 유기물 또는 작은 바위 조각을 매우 잘 알고 있어야합니다.
시료 적재 방법은 시료 오염위험을 완전히 제거할 수는 없지만, 위의 설명서는 이러한 위험을 실질적으로 줄이고 샘플 위치의 이중 하중 및 혼합 위험을 완전히 제거하는 방법을 제공합니다. 전반적으로, 우리는 이 방법이 고처리량 DNA 추출 플레이트를 적재하기위한 기존 기술에 큰 개선이라고 생각하고 높은 처리량 추출 플레이트를 사용하는 모든 미생물학자가 위에서 설명한 것과 같은 방법을 사용하여 이동한다는 것을 제안합니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 보고하지 않으며 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 NSF 상 #EPS-1655726에서 자금조달과 미생물 생태 협력에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 oz WhirlPak | Nasco | B01065 | |
| 2 mL centrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 200 µL micro-PCR tubes | Thermo Scientific | AB 2000 | |
| 96-well PowerSoil DNA extraction kit | Qiagen | 12955-4 | We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work. |
| Ice block for 2 mL centrifuge tubes | Any | Any | Any ice block made for 2 mL tubes will work |
| Ice block for 200 µL micro-PCR tubes | Any | Any | Any ice block made for 200 µL tubes will work |
| Micro scoopula | Any | Any | |
| Precut Pierceable Sealing Film | Excel Scientific | XPS25 | |
| Spatula | Any | Any | |
| Surgical scissors | Any | Any |
References
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- Davis, A., et al. Improved yield and accuracy for DNA extraction in microbiome studies with variation in microbial biomass. BioTechniques. 66 (6), 285-289 (2019).
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- McPherson, M. R., et al. Isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass Experiments. Journal of Visualized Experiments. (137), e57932 (2018).
- Qiagen, D. N., et al. easy PowerSoil HTP 96 Kit Handbook. , Hilden, Germany. (2019).
