Summary
שיטות נוכחיות לטעינת צלחות 96-באר עבור עקירות DNA יכול להיות נוטה זיהום. אנו מפרטים שיטה חדשה לטעינת צלחות 96-באר המפחיתה את הסיכון לזיהום צולב בין בארות. השיטה שלנו תסייע לחוקרים אחרים לנצל את היעילות של טכניקות חילוץ DNA בתפוקה גבוהה ולמזער את הסיכון לזיהום.
Abstract
טכניקות רצף DNA בתפוקה גבוהה תרמו באופן משמעותי להתקדמות בהבנת מערכות היחסים שלנו בין קהילות מיקרוביאליות, מאפייני מארחים ופונקציות אקוסיסטם רחבות יותר. עם עלייה מהירה זו ברוחב ועומק של יכולות רצף הגיעו שיטות לחלץ, להגביר, לנתח ולפרש DNA סביבתי בהצלחה ביעילות מקסימלית. למרבה הצער, ביצוע עקירות DNA במהירות יכול לבוא במחיר של הגדלת הסיכון לזיהום בין דגימות. בפרט, עקירות בתפוקה גבוהה המבוססות על דגימות הכלולות בצלחת 96-באר מציעות שיטה מהירה יחסית, בהשוואה עקירות צינור יחיד, אבל גם להגדיל את ההזדמנויות עבור טוב לבאר זיהום צולב. כדי למזער את הסיכון לזיהום צולב בין דגימות, תוך שמירה על היתרונות של טכניקות חילוץ בתפוקה גבוהה, פיתחנו שיטה חדשה לטעינת דגימות סביבתיות לתוך צלחות 96 באר. השתמשנו בסרטי איטום PCR הניתנים לפינוק כדי לכסות כל צלחת תוך טעינת דגימות והוספנו דגימות תחילה לצינורות PCR לפני העברתן לבארות; יחד, שיטות אלה להפחית את הסיכון של סחיפה מדגם וטעינה כפולה לא מכוונת של בארות. השיטה המתוארת בנייר זה מספקת לחוקרים גישה למקסם את טכניקות החילוץ הזמינות בתפוקה גבוהה תוך הפחתת הסיכון לזיהום צולב הטבוע בצלחות של 96 בארות. אנו מספקים מתאר מפורט שלב אחר שלב של איך לעבור מאיסוף מדגם לחילוץ DNA תוך מזעור הסיכון של זיהום צולב לא רצוי.
Introduction
ההתפתחויות האחרונות בהקפת תפוקה גבוהה של קהילות מיקרוביאליות מספקות עומק רצף שאין שני לו, וכתוצאה מכך, הצצה לא מנומקת לתפקוד ולמגוון של המיקרוביום1 של כדור הארץ. ככל שהיכולת לדגום יותר ויותר דגימות על נתיב רצף יחיד גדלה, חילוץ DNA צינור יחיד יש פוטנציאל להפוך צעד הגבלת קצב בדור של נתונים אקולוגיים. עם זאת, שיטות חדשות בתפוקה גבוהה עקירות DNA להחזיק הבטחה לעיבוד כמויות גדולות של דגימות סביבתיות עם יעילות רבה יותר מאשר בעבר היה אפשרי2. שיטות אלה כרוכות לעתים קרובות באמצעות 96-באר צלחות במקום חד צינוריות, ובכך להגדיל את המספר האפשרי של עקירות שיכולות להתרחש בו זמנית. בתור שכזה, המעשיות והיעילות של שיטות חילוץ בתפוקה גבוהה ניכרות ומיושמות לעיבוד דגימות סביבתיות החלקרקע 3,,4 ורקמות צמח3,,5 כדי חומר צואתי אנושי2.
בעוד שיטות אלה יכול להאיץ באופן דרמטי לאורך עיבוד מדגם וחילוץ DNA, השלב הראשוני של טעינת קרקע ודגימות אקולוגיות אחרות לתוך 96-באר צלחות הוא רגיש זיהום חוצה דגימות. סוג זה של זיהום טוב יכול להתרחשבמהלךעקירות DNA 6,7,8 , בארות פגיעותבמיוחדבשלב הראשון זה לפני דגימות מושהות בתמיסת חיץ. McPherson ואח'9 להפגין שיטה לטעון קרקעות rhizosphere לתוך 96-גם צלחות באמצעות משפך ו8-well כיסויים רצועת PCR, אבל בעוד השיטה שלהם היא גישה מבוקרת יותר לטעינת צלחות, זה עדיין מספק הזדמנות מספיקה לזיהום של בארות שכנות בעת טעינת כל מדגם. בנוסף, בארות פתוחות לאפשר את ההזדמנות עבור חוקר מוסח למקם דגימה לתוך הבאר הלא נכונה או להוסיף דגימה לתוך באר שכבר נטען. בנוסף, מגוון סוגי דגימות להוכיח להיות לא מתאים לטעינה עם שיטה זו; דגימות רטובות לעתים קרובות להיצמד משפך ודגימות יבש 'לקפוץ' בין בארות בשל חשמל סטטי.
כדי להפחית את ההזדמנויות לזיהום בין בארות בשלב הראשון של עקירות DNA בתפוקה גבוהה, פיתחנו גישה חדשה להעמסת דגימות קרקע לתוך צלחות 96-באר. השיטות שלנו מגנות על בארות מפני חשיפה סביבתית ומונעות מאיתנו לטעון בטעות דגימות מרובות לבאר אחת (טעינה כפולה). אנו מאמינים השיטה שדווחה להלן מבטיח להפחית את הפוטנציאל לזיהום ולכן מספק אמצעי מבוקר יותר לטעון 96-well צלחות עבור הפקת DNA עוקבות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ספסל מעבדה והכנת כלי להעמסת צלחת 96 באר
- ספסל נקי על ידי ערפל עם 70% אתנול. מנגבים ותנו לאוויר להתייבש לפני ריסוס הספסל עם 10% אקונומיקה. נגב את הספסל יבש.
- לחטא מיקרו סקופולה, מרית, ומספריים כירורגיים (מעוקל) על ידי טבילה ב 95% אתנול ולאחר מכן לחשוף להבה. טובלים כל אחד ב-10% אקונומיקה ומאפשרים לייבש אוויר לפני השימוש.
הערה: יש לחטא כלים בין כל דוגמה.
2. הכנת דגימה משנה ודגימה
- לחטא כפפות באמצעות אתנול לפני דגימה משנה.
- המגן דגימות קרקע ביסודיות לפני דגימת משנה.
- באמצעות כלים מעותים, טען צינור צנטריפוגה 2 מ"ל עם מדגם עד כחצי מלא.
- חזור על שלב 2.2 עד שכל 95 הדגימות נדגמו תת-דגימה לצינורות צנטריפוגה של 2 מ"ל. הבארה-96 צריכה לשמש כריק חילוץ.
הערה: שלבים 2.3 ו- 2.4 נעשים כדי למזער את שטח האחסון הנדרש ולמנוע דגימה מעל או כפולה. - לאחסן 2 מ"ל תת מדגם צינורות על קרח עד טעינת צלחת.
- תווית 96 סטרילי 200 μL שטוח כתרים PCR שפופרות A1\u2012A12, B1\u2012B12, .... H1\u2012H12. מניחים את הצינורות האלה לפי סדר במדף של 96 באר.
- הקצה מזהה לדוגמה עם מיקום טוב (A1\u2012H12) והקלט אותו.
3. הכנת צלחת
- מוציאים את כיסוי הגומי מצלחת 96 באר(איור 1A-1C)ומניחים אותו בשקית פלסטיק סטרילית (ראה טבלת חומרים). לאטום את שקית הפלסטיק כדי למנוע זיהום.
- לכסות את צלחת 96-באר עם סרט איטום (איור 1D-1E); לדוגמה, השתמש בסרט איטום ניתן לחיתוך מראש (ראה טבלת החומרים). ודאו את החותם על-ידי גלגול עם רולר גומי.
הערה: מחצלות סיליקון ניתן לפירסינג עשויות להציע אפשרות שימוש חוזר, בתנאי ניקוי מתאים בין שימושים, אבל מחצלות הסיליקון שבדקנו לפצל בקלות לאורך פירסינג ולא יציע הגנה שווה לכל הצלחות הבאות. - מניחים את הצלחת במקרר (4°C) כדי לשמור על קור רוח.
4. העברת תת-דגימות
הערה: ראה שלב 4.13 לשינויים כאשר דגימת הקרקע קטנה מאוד.
- מניחים 24 מתוך 2 דגימות משנה מ"ל לתוך בלוק קרח לאחסון קר.
- באמצעות שם המדגם וגליון מיקום היטב לבחור את נכון 200 μL שטוח כתרים PCR שפופרת.
- קח צינור תת-מדגם 2 מ"ל ומערבולת עבור ~ 5 s כדי להבטיח homogenization.
- באמצעות להבה ואקונומיקה כלים מעוקרים לטעון ~ 200 μL של הדגימה הראשונה לתוך צינור PCR שטוח כתרים הנכון(איור 1F).
- חזור על שלבים 4.2\u20124.4 עד שכל 24 הדגימות נטענו. ואז תעבור לשלב 4.6.
- באמצעות מגבון נייר טבול באקונומיקה, נקה את החלק החיצוני של צינור PCR שטוח 200 μL.
- הפוך את הצינור והקש על הספסל כדי להעביר דגימה לראש הצינור. עם מספריים מולבן ועיקור להבה, קליפ החלק התחתון של צינור PCR כדי ליצור פתח עבור מדגם ליפול לתוך צלחת 96-באר(איור 1G).
- אתר את הבאר הנכונה על צלחת 96-באר ולהעביר את הצינור על פני צלחת עם קצה לחתוך פונה כלפי למעלה עד שהגיע לבאר זו. הטה מעט את הצלחת כדי להקל על ניקור של סרט איטום ניתן פירסינג מראש, ורק כאשר הצינור הוא ישירות מעל הנכון היטב בזהירות להפוך אותו כך קצה לחתוך מתאים לתוך הבאר. באמצעות כלים מחטאים, הקש על החלק העליון של צינור PCR עד שכל האדמה נפלה מהצינור לתוך הבאר. להשאיר את הצינור בתוך הבאר עם מכסה סגור(איור 1H-1J).
- הסר אחד שטוח כתרים 200 μL PCR שפופרת בכל פעם ולהוסיף 750 μL של תמיסת חרוז לבאר זו(איור 1K). לדחוף את 200 μL שטוח כתרים PCR צינור כל הדרך למטה לתוך הבאר ולסמן את החלק העליון עם חדות כדי לציין כי גם זו כבר נטען. חזור על פעולה זו עבור כל דוגמה.
- לאחר כל 24 הדגימות נטענו פתרון חרוז נוסף, להסיר את 2 mL תת מדגם צינורות ולהחליף עם 24 צינורות לא מדגמים.
- חזור על שלבים 4.1\u20124.10 עד שכל 95 הבאות נטענו עם פתרון מדגם או ריק וחרוז. הסר צינורות מבלי להעביר אותם מעל בארות פתוחות(איור 1L).
- בזהירות להסיר סרט פירסינג ולהחליף את כיסוי גומי כדי להגן על הצלחת עד תחילת החילוץ (איור 1M-1O).
- עבור כמויות קטנות מאוד של אדמה כי הם גם דק מגורען, להוסיף 750 μL של תמיסת חרוז לצינור המדגם ולהשתמש קצה פיפטה רחב נשא להעביר את כל התוכן לבאר המתאימה. מקם שפופרת PCR לתוך הפתח כדי למנוע טעינה כפולה.
הערה: היזהר בעת יישום שינוי זה כחומר אורגני חלקיקים או שברי סלע קטנים גדולים יותר מהשעמם של קצה פיפטה יכול לסתום את הפיפטה והפוך את העברת slurry מדגם קשה. - כצורך להקפיא ב -20 מעלות צלזיוס ולאחסן צלחות עמוסות בתמיסת מדגם וחרוז עד לחילוץ מתוכנן.
5. השוואה של שיטות טעינת לוחות
הערה: על מנת לאמת את השיטה החדשן שלנו לטעינת לוחות חילוץ DNA 96-באר, חילקנו צלחת אחת 96-באר לשלושה חלקים. השתמשנו בשלוש שיטות שונות של טעינת צלחת כדי להשוות פוטנציאל לטעינה לא מכוונת של אדמה וזיהום צולב. שלוש השיטות שבהן השתמשנו היו השיטות המתוארות במקפירסון ואח'9, פרוטוקול הטעינה המוגדר כברירת מחדל של Qiagen10, והפרוטוקול שאנו מתארים בפרסום זה.
- העמסת אדמה לתוך הצלחת
- חלק צלחת 96-באר לשלושה בלוקים ארבע עמודות. טען כל בלוק באמצעות אחת משלוש השיטות שהוזכרו לעיל.
- העמיסו אדמה לתוך כל באר אחרת כדי שהדגימה והבארות הריקות יתנודדו. הסדר זה מאפשר הזדמנות מקסימלית לטעינה דגימה בשוגג וזיהום צולב.
- מקפיאים את צלחת 96 באר ב -20 מעלות צלזיוס עד לחילוץ DNA.
- הפקת דנ"א
- לחלץ DNA על פי פרוטוקול החילוץ צלחת 96-באר שלהיצרן 10.
- לאחסן את תמציות ה-DNA ב -20 ° C עד לניתוח נוסף.
- כימות דנ"א בארות ריקות
- להפשיר תמציות DNA בטמפרטורת החדר, מערבולת ולהסתובב למטה באמצעות טווה צלחת.
- למדוד ולתקליט ריכוזי DNA של בארות ריקות באמצעות ספקטרופוטומטר.
- השתמש בבדיקה שלאחר הניק של ANVOA ו-Tukey כדי לנתח את ההבדלים בריכוז הדנ"א הממוצע בארות ריקות.
הערה: דווח על הבדלים משמעותיים ב- α = 0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שיטה חדשנית זו שימשה בהצלחה כדי לטעון 96-well חילוץ לוחות. השוואה בין שיטות טעינת לוחות הראתה את השיטה שלנו שיש ריכוז ה-DNA הנמוך ביותר בארות ריקות. ריכוז ה-DNA בארות הריקות היה נמוך משמעותית מהשיטה המוצעת מקפירסון ואח'שלי (p < 0.05), אם כי ריכוזי ה-DNA בשיטה שלנו לא היו שונים סטטיסטית משיטת ברירת המחדל של Qiagen(איור 2). כל שלוש השיטות המיוצרות אומר ריכוזי DNA תחת 2 ng/μL, אם כי רק השיטה החדשה שלנו הפיקה בארות ללא ריכוז DNA מדיד.
איור 1: שיטות שלב אחר שלב לטעינת דגימות לתוך לוחות 96-באר עבור הפקת DNA תוך מזעור הפוטנציאל לזיהום צולב בין בארות. כיסויים אפורים כהים (קיימים בשלבים A, B, N ו- O) מייצגים את כיסוי הסיליקון שמגיע עם ערכת החילוץ. הכיסוי האפור בהיר (מוחל בשלב D, הוסר לאחר שלב L) מייצג את סרט ה-PCR הניתן לניתור המשמש לכיסוי הלוח בעת הטעינה. למרות שלא בתמונה, כלים צריך להיות מעוקר לפני טעינת כל דגימה, וצינורות PCR צריך להיות מנגב עם אקונומיקה לפני פירסינג קלטת PCR. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: ריכוזי דנ"א של בארות ריקות. ריכוז ה-DNA מיוצג ב ng/μL. אותיות מצביעות על הבדלים משמעותיים pairwise בריכוזי DNA ב α = 0.05. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטה זו מפחיתה הזדמנויות לזיהום צולב היטב תוך טעינת לוחות חילוץ מדגם בתפוקה גבוהה ומציעה אמצעי מבוקר יותר לטעון 96-well צלחות מעבר אסטרטגיות טעינתצלחת קיימות 9,10. זיהום בין בארות יכול להיות מתפשט יותר בחילוץ צלחת 96-גם מאשר בעיות צינור יחיד, במיוחד כאשראוטומטי 6,7 , ו, אם כי לאנבדק במיוחדבכל מתודולוגיה, הסיכון של זיהום צולב ניתן להניח הגבוה ביותר כאשר הבארות של לוחות החילוץ נותרים פתוחים למשך טעינת צלחת. בהתחשב בהזדמנות המוגברת לזיהום צולב בעפקות מבוססות צלחת בהשוואה עקירות צינור יחיד, הגנה על בארות עם כיסוי סטרילי צריך להיחשב צעד ראשון מפתח בטעינת דגימות לתוך צלחת 96-באר. למרות צורך זה, הוראות המסופקות ערכות חילוץ בתפוקה גבוהה פשוט לומר לטעון את הצלחת "למנוע זיהום צולב בין בארות מדגם," אבל לא לספק כל מידע נוסף לגבי איך לעשותזאת 10. כדי להפחית את הזיהום תוך הוספת דגימות לצלחת חילוץ 96-גם, McPherson ואח '.9 מציעים לכסות את הצלחת עם רצועות חתוכות של קלטת איטום PCR, קילוף אותם בחזרה כדי לגשת לכל באר. שיטה זו מפחיתה את הזמן הכולל שבו כל הבארות פתוחות, אך בארות פתוחות למשך זמן לא שוויוני וחלק מהבארות הרגישות ביותר לזיהום - הקרובות ביותר לטעינת הדגימה - נחשפות במהלך אירוע הטעינה. בנוסף, פילינג של PCR איטום-קלטת יש פוטנציאל ליצור חשמל סטטי אשר לגרום אדמה מועברת מבאר לבאר יכול להיות אחראי על ריכוזי DNA גבוהים יותר בארות ריקות שנצפו בחילוץ שלנו. יתר על כן, מתודולוגיה זו דורשת כי דגימות מועברות מעל בארות חשופות לפני שהם ממוקמים בבאר של בחירה, ושום דבר לא מונע חוקר בטעות טעינה שתי דגימות לתוך באר אחת (טעינה כפולה) או ערבוב המיקום של שתי דגימות או יותר. אם נתפס, טעינה כפולה מהווה לא יותר מאשר בזבוז של משאבים. אם, לעומת זאת, טעינה כפולה או ערבוב של מיקומי דגימה נעלם מעיניו, תוצאות ניסיוניות עשוי להיות מעוות7.
השיטה שתיארנו לעיל מספקת אמצעי מבוקר לטעינת לוחות מיצוי דנ"א בתפוקה גבוהה. באופן ספציפי, השיטה שלנו מורידה את הסיכון לזיהום צולב על ידי שמירה על בארות מכוסות בכל עת. בארות מכוסים בתחילה על ידי סרט איטום ולאחר מכן נשמרים מכוסים על ידי צינור PCR המשמש לטעינה לדוגמה. לא רק ששיטה זו מפחיתה את הסיכון לזיהום צולב, אלא גם מונעת לחלוטין את הסיכון לטעינת שתי דגימות לבאר אחת. ברגע שאנחנו טוענים דגימה לתוך באר, צינור PCR משמש כבלוק, מניעת תוספת של מדגם אחר. על ידי תיוג כל הצינורות עם מיקום לוחית (למשל, A1, A2... H11, H12) לפני טעינת דגימות, שיטה זו מספקת גם בדיקה סופית כדי לוודא שכל הדגימות נטענו ולא הוחמצו בארות. בעוד שיטה זו מספקת אמצעי מבוקר יותר לטעון בארות, כל מי טוען צלחת צריך לקחת טיפול נוסף בעת העברת צינור PCR לחתוך מעל הצלחת. למרות הבארים אטומים, כל חלקיקי מדגם שנופלו על פני השטח של הלוח האטום יכול למצוא את דרכם לבארות לא מכוונות כאשר הטכנאי חודר את הסרט כדי לטעון את הדגימות הנכונות לתוך בארות אלה. כדי להימנע מבעיה זו, אנו להטות את צלחת 96-באר ~ 40° לפני ניקוב קלטת האיטום עם צינור PCR. גישה זו מסייעת לשמור על הקצה הפתוח של הצינור זקוף והרחק מהבארות השגויות.
כאשר דגימות קרקע הן בכמויות קטנות מאוד ו/או מאוד דק מגורען, באמצעות קצה פיפטה רחב נשא במקום לטעון דגימות קרקע לתוך צינורות PCR עשוי להיות יעיל יותר בהעברת כל מדגם. עבור שינוי זה, יש להוסיף את פתרון המאגר הראשון לצינור המדגם ולאחר מכן דגימה ופתרון pipetted לתוך צלחת 96-באר. הוספת שפופרת PCR לכל באר לאחר שלב זה תמנע טעינה כפולה. כפי שהוזכר בסעיף פרוטוקול, בעת שימוש בשינוי זה, החוקר או הטכנאי צריך להיות מודע מאוד חומר אורגני חלקיקים או שברי סלע קטנים כמו אלה יש פוטנציאל לסתום את השעמום של פיפטה.
בעוד שום שיטה של טעינה מדגם יכול לחסל לחלוטין את הסיכון של זיהום מדגם, השיטה שאנו מתארים לעיל מספק אמצעי כדי להפחית סיכונים אלה באופן משמעותי ולחסל לחלוטין את הסיכון של טעינה כפולה ערבוב של מיקומים לדוגמה. בסך הכל, אנו מאמינים ששיטה זו היא שיפור גדול בטכניקות קיימות לטעינת לוחות חילוץ DNA בתפוקה גבוהה ולהציע כי כל המיקרוביולוגים באמצעות לוחות חילוץ בתפוקה גבוהה לעבור באמצעות שיטה כגון אחד שתואר לעיל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מדווחים שאין ניגודי עניינים ואין להם מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי המיקרוביאלית אקולוגיה שיתוף פעולה עם מימון מNSF פרס #EPS-1655726.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 oz WhirlPak | Nasco | B01065 | |
| 2 mL centrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 200 µL micro-PCR tubes | Thermo Scientific | AB 2000 | |
| 96-well PowerSoil DNA extraction kit | Qiagen | 12955-4 | We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work. |
| Ice block for 2 mL centrifuge tubes | Any | Any | Any ice block made for 2 mL tubes will work |
| Ice block for 200 µL micro-PCR tubes | Any | Any | Any ice block made for 200 µL tubes will work |
| Micro scoopula | Any | Any | |
| Precut Pierceable Sealing Film | Excel Scientific | XPS25 | |
| Spatula | Any | Any | |
| Surgical scissors | Any | Any |
References
- Thompson, L. R., et al. A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity. Nature. 551 (7681), 457-463 (2017).
- Davis, A., et al. Improved yield and accuracy for DNA extraction in microbiome studies with variation in microbial biomass. BioTechniques. 66 (6), 285-289 (2019).
- Marotz, C., et al. Triplicate PCR reactions for 16S rRNA gene amplicon sequencing are unnecessary. BioTechniques. 67 (1), 29-32 (2019).
- Romdhane, S., et al. Cover crop management practices rather than composition of cover crop mixtures affect bacterial communities in no-till agroecosystems. Frontiers in Microbiology. 10, 1618 (2019).
- Rochefort, A., et al. Influence of environment and host plant genotype on the structure and diversity of the Brassica napus seed microbiota. Phytobiomes Journal. 3 (4), 326-336 (2019).
- Minich, J. J., et al. Quantifying and understanding well-to-well contamination in microbiome research. mSystems. 4 (4), 00186 (2019).
- Walker, A. W. A lot on your plate? Well-to-well contamination as an additional confounder in microbiome sequence analyses. mSystems. 4 (4), 00362 (2019).
- Eisenhofer, R., et al. Contamination in low microbial biomass microbiome studies: issues and recommendations. Trends in Microbiology. 27 (2), 105-117 (2019).
- McPherson, M. R., et al. Isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass Experiments. Journal of Visualized Experiments. (137), e57932 (2018).
- Qiagen, D. N., et al. easy PowerSoil HTP 96 Kit Handbook. , Hilden, Germany. (2019).
