Summary
Nuværende metoder til lastning 96-brønd plader til DNA-ekstraktioner kan være tilbøjelige til forurening. Vi beskriver en ny metode til lastning af 96-brøndplader, der reducerer risikoen for krydskontaminering blandt brønde. Vores metode vil hjælpe andre forskere udnytte effektiviteten af høj-throughput DNA-ekstraktion teknikker og minimere risikoen for forurening.
Abstract
Høj-throughput DNA sekventering teknikker har bidraget væsentligt til fremskridt i vores forståelse af relationer mellem mikrobielle samfund, vært egenskaber, og bredere økosystem funktioner. Med denne hurtige stigning i bredden og dybden af sekventering kapaciteter er kommet metoder til at udtrække, forstærke, analysere og fortolke miljømæssige DNA med succes med maksimal effektivitet. Desværre kan udførelse af DNA-ekstraktioner hurtigt komme på bekostning af at øge risikoen for forurening blandt prøver. Især høj-throughput ekstraktioner, der er baseret på prøver indeholdt i en 96-brønd plade tilbyder en forholdsvis hurtig metode, sammenlignet med enkelt-rør ekstraktioner, men også øge mulighederne for godt-til-godt krydskontaminering. For at minimere risikoen for krydskontaminering blandt prøver, samtidig med at fordelene ved høj-throughput ekstraktion teknikker, vi udviklet en ny metode til lastning miljøprøver i 96-brønd plader. Vi brugte gennemborelige PCR forsegling film til at dække hver plade, mens lastning prøver og tilføjede prøver først til PCR rør, før du flytter dem ind i brønde; denne praksis reducerer risikoen for prøvedrift og utilsigtet dobbeltbelastning af brønde. Den metode, der er skitseret i dette papir giver forskerne en tilgang til at maksimere tilgængelige high-throughput udvinding teknikker og samtidig reducere risikoen for krydskontaminering iboende til 96-brønd plader. Vi giver en detaljeret trin for trin skitse af, hvordan man flytter fra prøveindsamling til DNA-ekstraktion og samtidig minimerer risikoen for uønsket krydskontaminering.
Introduction
De seneste fremskridt inden for høj-gennemløb sekventering af mikrobielle samfund giver uovertruffen sekventering dybde og dermed en upræfærdig indblik i funktion og mangfoldighed af Jordens mikrobiom1. Efterhånden som evnen til at multiplex flere og flere prøver på en enkelt sekventering lane stiger, enkelt rør DNA-ekstraktion har potentiale til at blive en sats-begrænsende skridt i produktionen af økologiske data. Men nye metoder i høj-throughput DNA-ekstraktioner holde løfte om behandling af store mængder af miljøprøver med større effektivitet end tidligere har været muligt2. Disse metoder indebærer ofte brug af 96-brøndplader i stedet for enkeltrør, hvilket øger det mulige antal ekstraktioner, der kan forekomme samtidigt. Som sådan er det praktisk og effektivt af høj-throughput ekstraktionsmetoder er indlysende og er blevet gennemført til behandling af miljøprøver lige frajord 3,,4 og plantevæv3,5 til humant fækalmateriale2.
Mens disse metoder dramatisk kan fremskynde langs prøve forarbejdning og DNA-ekstraktion, det første trin i lastning jord og andre økologiske prøver i 96-brønd plader er modtagelige for cross-prøve forurening. Denne type brønd-til-brønd forurening kan forekomme underDNA-ekstraktioner 6,7,8, og brønde er særligt sårbare i dette første trin, før prøverne er suspenderet i en buffer løsning. McPherson et al.9 demonstrere en metode til at indlæse rhizosfærejord i 96-brønd plader ved hjælp af tragte og 8-godt PCR stripdæksler, men mens deres metode er en mere kontrolleret tilgang til lastning plader, det stadig giver rig mulighed for forurening af tilstødende brønde, når lastning hver prøve. Derudover giver de åbne brønde mulighed for en distraheret forsker til at placere en prøve i den forkerte brønd eller tilføje en prøve i en brønd, der allerede er blevet indlæst. Desuden viser en række forskellige stikprøvetyper sig at være dårligt egnede til lastning med denne metode. våde prøver ofte holde sig til tragte og tørre prøver 'hoppe' mellem brønde på grund af statisk elektricitet.
For at reducere mulighederne for forurening blandt brønde i det første trin af høj-throughput DNA-ekstraktioner, udviklede vi en ny tilgang til lastning jordprøver i 96-brønd plader. Vores metoder både beskytte brønde fra miljøeksponering og forhindre os i ved et uheld at indlæse flere prøver i en brønd (dobbelt-loading). Vi mener, at den metode, der rapporteres nedenfor, giver løfte om at reducere risikoen for forurening og som sådan giver et mere kontrolleret middel til at indlæse 96-brøndsplader til efterfølgende DNA-ekstraktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Laboratoriebænk og værktøjsforberedelse til læsning af en 96-brøndplade
- Klar bordplade ved dugning med 70% ethanol. Tør og lad luften tørre før sprøjtning bænk top med 10% blegemiddel. Tør bordpladen tør.
- Steriliser mikro-scoopula, spatel og kirurgisk saks (buet) ved at dyppe i 95% ethanol og derefter udsætte for en flamme. Dyp hver i 10% blegemiddel og lad det lufttørre før brug.
BEMÆRK: Værktøj skal steriliseres mellem hver prøve.
2. Delprøvetagning og forberedelse af prøver
- Steriliser handsker ved hjælp af ethanol før underprøvetagning.
- Homogeniser jordprøver grundigt før delprøvetagning.
- Ved hjælp af steriliserede værktøjer, indlæse en mærket 2 ml centrifuge rør med prøve, indtil ca halv fuld.
- Trin 2.2 gentages, indtil alle 95 prøver er blevet subprøvet i mærket 2 ml centrifugerør. Den 96th godt bør anvendes som en ekstraktion blank.
BEMÆRK: Trin 2.3 og 2.4 udføres for at minimere den nødvendige lagerplads og for at forhindre over- eller dobbeltudtagning. - Opbevar 2 ml delprøverør på is, indtil pladen læsses.
- Label 96 sterile 200 μL flat-capped PCR rør A1\u2012A12, B1\u2012B12, .... H1\u2012H12. Anbet disse rør i orden i en 96-brønd rack.
- Tildel et eksempel-id med en placering (A1\u2012H12), og optag det.
3. Pladeforberedelse
- Fjern gummidækslet fra 96-brøndpladen (Figur 1A-1C), og læg det i en steril plastikpose (se Materialetabel). Indse plastposen for at undgå forurening.
- Dæk den 96-brønd plade med forsegling film( Figur 1D-1E); brug forskæring af forseglingsfilm (se materialetabellen). Sørg for tætning ved at rulle med en gummivalse.
BEMÆRK: Pierceable silikone måtter kunne potentielt tilbyde en genbrugelig mulighed, forudsat passende rengøring mellem anvendelser, men silikone måtter, som vi testede let opdele langs gennemboringer og ville ikke tilbyde lige beskyttelse til følgende plader. - Sæt pladen i køleskab (4 °C) for at holde den afkøle.
4. Overførsel af delprøver
BEMÆRK: Se trin 4.13 for ændringer, når jordprøven er meget lille.
- 24 af de 2 ml delprøver skal indbemærkes i en isblok til koldopbevaring.
- Ved hjælp af prøvenavnet og brøndplaceringsarket skal du vælge det korrekte 200 μL pcr-rør med flad 200 μL.
- Tag en 2 ml sub-prøve rør og vortex for ~ 5 s for at sikre homogenisering.
- Ved hjælp af flamme- og blegemiddelsteriliserede værktøjer indlæses ~200 μL af den første prøve i det korrekte pcr-rør med flad loft (figur 1F).
- Gentag trin 4.2\u20124.4, indtil alle 24 prøver er indlæst. Gå derefter til trin 4.6.
- Brug en blegepapirserviet, rengør ydersiden af det 200 μL flat-capped PCR-rør.
- Inverter røret og tryk på bænken for at flytte prøven til toppen af røret. Med bleget og flammesteriliseret saks skal du klippe bunden af PCR-røret for at skabe en åbning, så prøven kan falde ned i 96-brøndpladen (Figur 1G).
- Find den korrekte brønd på en 96-brønd plade og passere røret på tværs af plade med skåret ende vender op, indtil de når så godt. Vip pladen en smule for at lette punktering af forskæring gennemborelig forsegling film, og kun når røret er direkte over den korrekte godt omhyggeligt invertere det, så skåret spidsen passer ind i brønden. Brug steriliserede værktøjer, tryk på toppen af PCR rør, indtil al jord er faldet fra røret ind i brønden. Lad røret stå i brønden med låget lukket( Figur 1H-1J).
- Der fjernes et fladset 200 μL PCR-rør ad gangen, og der tilsættes 750 μL perleopløsning til brønden (Figur 1K). Skub det 200 μL fladklædte PCR-rør helt ned i brønden og marker toppen med sharpie for at indikere, at denne brønd er blevet indlæst. Gentag dette for hver prøve.
- Når alle 24 prøver er blevet tilsat, og perleopløsningen er tilsat, fjernes de 2 ml delprøverør og udskiftes med 24 ikke-samplede rør.
- Gentag trin 4.1\u20124.10, indtil alle 95 brønde er blevet fyldt med prøve eller tom og perle opløsning. Fjern rør uden at passere dem over åbne brønde (Figur 1L).
- Fjern forsigtigt gennemborelig film og udskift gummidækslet for at beskytte pladen, indtilekstraktionenbegynder ( Figur 1M-1O).
- For meget små mængder jord, der også er finkornet, tilsættes 750 μL perleopløsning til prøverøret, og der anvendes en pipettespids med bred boring til at overføre alt indhold til den relevante brønd. Placer PCR-røret i åbningen for at forhindre dobbelt belastning.
BEMÆRK: Vær forsigtig, når du implementerer denne ændring, da partikler organisk materiale eller små stenfragmenter større end pipettespidsens boring kan tilstoppe pipetten og gøre det vanskeligt at overføre prøvesalgenren. - Efter behov fryse ved -20 °C og opbevares plader lastet med prøve og perleopløsning indtil planlagt ekstraktion.
5. Sammenligning af pladebelastningsmetoder
BEMÆRK: For at verificere vores nye metode til lastning af 96-brønd DNA ekstraktionsplader, delte vi en enkelt 96-brønd plade i tre sektioner. Vi brugte tre forskellige metoder til pladebelastning til at sammenligne risikoen for utilsigtet belastning af jord og krydskontaminering. De tre metoder, vi brugte, var de metoder, der er skitseret i McPherson et al.9, Qiagen's standard loading protokol10, og den protokol, vi skitserer i denne publikation.
- Lastning jord i pladen
- Afsnit en 96-brønd plade i tre fire-kolonne blokke. Indlæs hver blok ved hjælp af en af de tre ovennævnte metode.
- Læg jord i hver anden brønd, så prøve og blanke brønde er forskudt. Dette arrangement giver mulighed for maksimal mulighed for utilsigtet prøvebelastning og krydskontaminering.
- Frys 96-brøndpladen ved -20 °C, indtil DNA-ekstraktionen.
- DNA-ekstraktion
- Uddrag DNA i henhold til producentens 96-brønd plade ekstraktion protokol10.
- DNA-ekstrakterne opbevares ved -20 °C indtil videre analyse.
- Kvantificering af DNA i tomme brønde
- Tø DNA ekstrakter ved stuetemperatur, vortex og spin ned ved hjælp af en plade spinner.
- Mål og optag DNA-koncentrationer af tomme brønde ved hjælp af et spektrofotometer.
- Brug ANVOA og Tukey's post-hoc test til at analysere forskelle i gennemsnitlig DNA-koncentration i tomme brønde.
BEMÆRK: Der blev rapporteret signifikante forskelle ved α = 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne nye metode blev anvendt med succes til at indlæse 96-brønd DNA ekstraktionsplader. Sammenligning af pladebelastningsmetoder viste, at vores metode til at have den laveste DNA-koncentration i de tomme brønde. DNA-koncentrationen i de tomme brønde var betydeligt lavere end den foreslåede metode min McPherson et al.9 (p < 0,05), selv om DNA-koncentrationer i vores metode ikke var statistisk forskellige fra Qiagen standardmetode (Figur 2). Alle tre metoder producerede gennemsnitlige DNA-koncentrationer under 2 ng/μL, selv om kun vores nye metode producerede brønde uden målbar DNA-koncentration.
Figur 1: Trin for trin metoder til at indlæse prøver i 96-brønd plader til DNA-ekstraktion og samtidig minimere potentialet for krydskontaminering blandt brønde. Mørkegrå dæksler (til stede i trin A, B, N og O) repræsenterer siliciumdækslet, der følger med ekstraktionssættet. Det lysegråt dæksel (anvendt i trin D, fjernet efter trin L) repræsenterer det gennemborbare PCR-bånd, der bruges til at dække pladen under indlæsning. Selvom det ikke er afbilledet, skal værktøjer steriliseres før lastning hver prøve, og PCR rør bør tørres med blegemiddel før piercing PCR tape. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: DNA-koncentrationer af tomme brønde. DNA-koncentrationen er repræsenteret i ng/μL. Bogstaverne indikerer signifikante parvise forskelle i DNA-koncentrationer ved α = 0,05. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metode reducerer mulighederne for godt-til-brønd krydskontaminering, mens du lægger høj-throughput prøveudsugningsplader og giver en mere kontrolleret måde at indlæse 96-brønd plader ud over de eksisterende pladebelastningsstrategier9,10. Kontaminering blandt brønde kan være mere udbredt i 96-brøndpladeekstraktioner end i enkeltrørsekstraktioner, især når automatiseret6,7, og, men ikke specifikt testet i nogen metode, kan risikoen for krydskontaminering antages at være størst, når ekstraktionspladernes brønde efterlades åbne under hele pladebelastningen. I betragtning af den øgede mulighed for krydskontaminering i pladebaserede ekstraktioner sammenlignet med enkeltrørsekstraktioner bør beskyttelse af brønde med et sterilt dæksel betragtes som et vigtigt første skridt i lastning af prøver i en 96-brøndplade. På trods af dette behov, instruktioner i høj-throughput ekstraktion kits blot sige at indlæse pladen og "undgå krydskontaminering mellem prøven brønde," men giver ikke yderligere oplysninger om, hvordan man gør det10. For at reducere forureningen, mens du tilføjer prøver til en 96-brøndudsugningsplade, foreslår McPherson et al.9, der dækker pladen med afskårne strimler af PCR-tætningstape, og skræller dem tilbage for at få adgang til hver brønd. Denne metode reducerer den samlede tid, hvor alle brønde er åbne, men brønde er åbne i ulige mængder tid, og nogle af de brønde, der er mest modtagelige for forurening – dem, der er tættest på den prøve, der er ved at blive indlæst – eksponeres under indlæsningshændelsen. Desuden har peeling af PCR-tætningsbånd potentiale til at skabe statisk elektricitet, som resulterer i, at jorden overføres fra brønd til brønd og kan være ansvarlig for de højere DNA-koncentrationer i tomme brønde observeret i vores ekstraktion. Desuden kræver denne metode, at prøverne overføres over udækkede brønde, før de placeres i brønden valg, og intet forhindrer en forsker i ved et uheld at indlæse to prøver i en enkelt brønd (dobbelt belastning) eller blande placeringen af to eller flere prøver. Hvis fanget, dobbelt lastning udgør intet mere end spild af ressourcer. Hvis en dobbelt belastning eller blanding af prøveplaceringer imidlertid går ubemærket hen, kan forsøgsresultaterne fordrejes7.
Den metode, vi skitserede ovenfor, giver et kontrolleret middel til at indlæse dna-ekstraktionsplader med høj gennemløb. Konkret sænker vores metode risikoen for krydskontaminering ved at holde brønde dækket til enhver tid. Brøndene er i første omgang dækket af tætningstape og holdes derefter dækket af PCR-røret, der anvendes til prøvebelastning. Ikke alene reducerer denne metode risikoen for krydskontaminering, men forhindrer også helt risikoen for at indlæse to prøver i en enkelt brønd. Når vi indlæse en prøve i en brønd, PCR rør fungerer som en blok, forhindrer tilsætning af en anden prøve. Ved at mærke alle rør med pladeplacering (f.eks. H11, H12) før lastning prøver, denne metode giver også en endelig kontrol for at sikre, at alle prøver er blevet indlæst, og ingen brønde er blevet savnet. Mens denne metode giver en mere kontrolleret midler til at indlæse brønde, alle lastning en plade bør tage ekstra forsigtig, når de passerer et snit PCR rør over pladen. Selv om brøndene er forseglet, kan alle prøvepartikler, der falder på overfladen af den forseglede plade finde vej ind i utilsigtede brønde, når teknikeren gennemborer filmen for at indlæse de korrekte prøver i disse brønde. For at undgå dette problem vi vippe 96-brønd plade til ~ 40 ° før punktering af forseglingen tape med PCR rør. Denne fremgangsmåde hjælper med at holde den åbne ende af røret oprejst og væk fra de forkerte brønde.
Når jordprøverne er af meget små mængder og/eller ekstremt finkornet, kan det være mere effektivt at overføre hver prøve ved hjælp af en pipettespids med bred boring i stedet for at lægge jordprøver i PCR-rør. Til denne ændring tilsættes den første bufferopløsning til prøverøret og derefter både prøve- og opløsningsrøret i 96-brøndpladen. Tilføjelse af et PCR-rør til hver brønd efter dette trin vil forhindre dobbelt-indlæsning. Som nævnt i protokolafsnittet, når du bruger denne ændring, bør forskeren eller teknikeren være meget opmærksom på partikler organisk materiale eller små stenfragmenter, da disse har potentiale til at tilstoppe pipettens boring.
Mens ingen metode til prøvebelastning helt kan eliminere risikoen for prøvekontaminering, giver den metode, vi skitserer ovenfor, et middel til at reducere disse risici væsentligt og helt eliminere risikoen for dobbeltbelastning og blanding af prøvesteder. Samlet set mener vi, at denne metode er en stor forbedring af eksisterende teknikker til lastning af dna-ekstraktionsplader med høj gennemløb og foreslår, at alle mikrobiologer, der bruger højoverførselsekstraktionsplader, flyttes til ved hjælp af en metode som den, der er skitseret ovenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne rapporterer ingen interessekonflikter og har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af Microbial Ecology Collaborative med finansiering fra NSF tildeling #EPS-1655726.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 oz WhirlPak | Nasco | B01065 | |
| 2 mL centrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 200 µL micro-PCR tubes | Thermo Scientific | AB 2000 | |
| 96-well PowerSoil DNA extraction kit | Qiagen | 12955-4 | We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work. |
| Ice block for 2 mL centrifuge tubes | Any | Any | Any ice block made for 2 mL tubes will work |
| Ice block for 200 µL micro-PCR tubes | Any | Any | Any ice block made for 200 µL tubes will work |
| Micro scoopula | Any | Any | |
| Precut Pierceable Sealing Film | Excel Scientific | XPS25 | |
| Spatula | Any | Any | |
| Surgical scissors | Any | Any |
References
- Thompson, L. R., et al. A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity. Nature. 551 (7681), 457-463 (2017).
- Davis, A., et al. Improved yield and accuracy for DNA extraction in microbiome studies with variation in microbial biomass. BioTechniques. 66 (6), 285-289 (2019).
- Marotz, C., et al. Triplicate PCR reactions for 16S rRNA gene amplicon sequencing are unnecessary. BioTechniques. 67 (1), 29-32 (2019).
- Romdhane, S., et al. Cover crop management practices rather than composition of cover crop mixtures affect bacterial communities in no-till agroecosystems. Frontiers in Microbiology. 10, 1618 (2019).
- Rochefort, A., et al. Influence of environment and host plant genotype on the structure and diversity of the Brassica napus seed microbiota. Phytobiomes Journal. 3 (4), 326-336 (2019).
- Minich, J. J., et al. Quantifying and understanding well-to-well contamination in microbiome research. mSystems. 4 (4), 00186 (2019).
- Walker, A. W. A lot on your plate? Well-to-well contamination as an additional confounder in microbiome sequence analyses. mSystems. 4 (4), 00362 (2019).
- Eisenhofer, R., et al. Contamination in low microbial biomass microbiome studies: issues and recommendations. Trends in Microbiology. 27 (2), 105-117 (2019).
- McPherson, M. R., et al. Isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass Experiments. Journal of Visualized Experiments. (137), e57932 (2018).
- Qiagen, D. N., et al. easy PowerSoil HTP 96 Kit Handbook. , Hilden, Germany. (2019).
