Summary
डीएनए अर्क के लिए ९६-अच्छी प्लेटें लोड करने के लिए वर्तमान तरीकों संदूषण के लिए प्रवण हो सकता है । हम ९६-अच्छी प्लेटों को लोड करने के लिए एक नई विधि का विस्तार करते हैं जो कुओं के बीच क्रॉस-संदूषण के जोखिम को कम करता है । हमारी विधि अन्य शोधकर्ताओं को उच्च थ्रूपुट डीएनए निष्कर्षण तकनीकों की दक्षता को भुनाने और संदूषण के जोखिम को कम करने में मदद करेगी।
Abstract
उच्च थ्रूपुट डीएनए अनुक्रमण तकनीकों ने माइक्रोबियल समुदायों, मेजबान विशेषताओं और व्यापक पारिस्थितिकी तंत्र कार्यों के बीच संबंधों की हमारी समझ में प्रगति में काफी योगदान दिया है। विस्तार क्षमताओं की चौड़ाई और गहराई में इस तेजी से वृद्धि के साथ अधिकतम दक्षता के साथ सफलतापूर्वक पर्यावरण डीएनए निकालने, बढ़ाना, विश्लेषण करने और व्याख्या करने के तरीके आए हैं। दुर्भाग्य से, डीएनए निष्कर्षण जल्दी से प्रदर्शन नमूनों के बीच संदूषण के जोखिम को बढ़ाने की कीमत पर आ सकता है । विशेष रूप से, उच्च-थ्रूपुट निष्कर्षण जो 96-अच्छी प्लेट में निहित नमूनों पर आधारित होते हैं, एकल-ट्यूब निष्कर्षण की तुलना में अपेक्षाकृत त्वरित विधि प्रदान करते हैं, लेकिन अच्छी तरह से क्रॉस-संदूषण के अवसरों में भी वृद्धि करते हैं। नमूनों के बीच क्रॉस-संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए, उच्च थ्रूपुट निष्कर्षण तकनीकों के लाभों को बनाए रखते हुए, हमने पर्यावरणीय नमूनों को 96-अच्छी प्लेटों में लोड करने के लिए एक नई विधि विकसित की। हमने नमूने लोड करते समय प्रत्येक प्लेट को कवर करने के लिए पियर्सेबल पीसीआर सीलिंग फिल्मों का उपयोग किया और उन्हें कुओं में ले जाने से पहले पीसीआर ट्यूबों में पहले नमूने जोड़े; साथ में, ये प्रथाएं नमूने बहाव और कुओं की अनपेक्षित डबल लोडिंग के जोखिम को कम करते हैं। इस पेपर में उल्लिखित विधि शोधकर्ताओं को उपलब्ध उच्च-थ्रूपुट निष्कर्षण तकनीकों को अधिकतम करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करती है, जबकि ९६-अच्छी प्लेटों के लिए निहित क्रॉस-संदूषण के जोखिम को कम करती है । हम अवांछित क्रॉस-संदूषण के जोखिम को कम करते हुए नमूना संग्रह से डीएनए निष्कर्षण तक कैसे स्थानांतरित किया जाए, इसकी विस्तृत रूपरेखा प्रदान करते हैं।
Introduction
माइक्रोबियल समुदायों के उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण में हाल की प्रगति अद्वितीय अनुक्रमण गहराई प्रदान कर रही है और इसके परिणामस्वरूप, पृथ्वी के माइक्रोबायोम1के कामकाज और विविधता में एक अप्रत्याशित झलक । चूंकि एक अनुक्रमण लेन पर अधिक से अधिक नमूनों को मल्टीप्लेक्स करने की क्षमता बढ़ जाती है, एकल ट्यूब डीएनए निष्कर्षण में पारिस्थितिक डेटा की पीढ़ी में दर-सीमित कदम बनने की क्षमता है। हालांकि, उच्च थ्रूपुट डीएनए निष्कर्षण में नए तरीके पहले से संभव होने की तुलना में अधिक दक्षता के साथ बड़ी मात्रा में पर्यावरणीय नमूनों को संसाधित करने का वादा करतेहैं। इन तरीकों में अक्सर एकल ट्यूबों के बजाय 96-अच्छी प्लेटों का उपयोग करना शामिल होता है, जिससे एक साथ होने वाले निष्कर्षों की संभावित संख्या बढ़ जाती है। इस प्रकार, उच्च-थ्रूपुट निष्कर्षण विधियों की व्यावहारिकता और दक्षता स्पष्ट है और इसे मिट्टी3, 4और पौधों के ऊतकों,3,5 से लेकर मानव मल पदार्थ2तक के पर्यावरणीय नमूनों के प्रसंस्करण के लिए लागू किया गया है।5 2
हालांकि इन तरीकों नाटकीय रूप से नमूना प्रसंस्करण और डीएनए निष्कर्षण के साथ गति कर सकते हैं, ९६-अच्छी तरह से प्लेटों में मिट्टी और अंय पारिस्थितिक नमूनों लोड करने का प्रारंभिक कदम पार नमूना संदूषण के लिए अतिसंवेदनशील है । इस प्रकार का अच्छी तरह से संदूषण डीएनए निष्कर्षण6,7, 8केदौरानहो सकता है और नमूनों को बफर समाधान में निलंबित किए जाने से पहले इस पहले चरण में कुएं विशेष रूप से कमजोर होते हैं।, मैकफर्सन एट अल9 फ़नल और 8-अच्छी तरह से पीसीआर स्ट्रिप कवर का उपयोग करके 96-अच्छी तरह से प्लेटों में राइजोस्फीयर मिट्टी लोड करने के लिए एक विधि प्रदर्शित करता है, लेकिन जब उनकी विधि प्लेटों को लोड करने के लिए एक अधिक नियंत्रित दृष्टिकोण है, तो यह अभी भी प्रत्येक नमूने को लोड करते समय पड़ोसी कुओं के प्रदूषण के लिए पर्याप्त अवसर प्रदान करता है। इसके अतिरिक्त, खुले कुओं एक विचलित शोधकर्ता के लिए मौका गलत अच्छी तरह से एक नमूना जगह या एक अच्छी तरह से है कि पहले से ही लोड किया गया है में एक नमूना जोड़ने के लिए अनुमति देते हैं । इसके अलावा, विभिन्न प्रकार के नमूना प्रकार इस विधि के साथ लोडिंग के लिए बीमार साबित होते हैं; गीले नमूने अक्सर स्थिर बिजली के कारण कुओं के बीच फ़नल और सूखे नमूनों 'कूद' से चिपके रहते हैं।
उच्च थ्रूपुट डीएनए अर्क के पहले कदम में कुओं के बीच संदूषण के अवसरों को कम करने के लिए, हमने मिट्टी के नमूनों को ९६-अच्छी प्लेटों में लोड करने के लिए एक नया दृष्टिकोण विकसित किया । हमारे तरीके दोनों पर्यावरण जोखिम से कुओं की रक्षा और हमें गलती से एक अच्छी तरह से (डबल लोडिंग) में कई नमूनों लोड से रोकने के । हमारा मानना है कि नीचे रिपोर्ट की गई विधि संदूषण की क्षमता को कम करने का वादा करती है और इस तरह बाद के डीएनए निष्कर्षण के लिए ९६-अच्छी प्लेटों को लोड करने के लिए अधिक नियंत्रित साधन प्रदान करती है ।
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Protocol
1. प्रयोगशाला बेंच और एक ९६ अच्छी तरह से थाली लोड करने के लिए उपकरण की तैयारी
- 70% इथेनॉल के साथ गलत करके बेंच टॉप को साफ करें। पोंछें और 10% ब्लीच के साथ बेंच टॉप छिड़काव से पहले हवा सूखने दें। बेंच टॉप ड्राई पोंछें।
- 95% इथेनॉल में डुबकी लगाकर माइक्रो-स्कूपुला, स्पैटुला और सर्जिकल कैंची (घुमावदार) को स्टरलाइज करें और फिर एक लौ को बेनकाब करें। प्रत्येक को 10% ब्लीच में डुबोएं और उपयोग करने से पहले हवा सूखने दें।
नोट: उपकरण प्रत्येक नमूने के बीच निष्फल किया जाना चाहिए।
2. उप-नमूना और नमूना तैयार करना
- उप-नमूने से पहले इथेनॉल का उपयोग करके दस्ताने को स्टरलाइज करें।
- उप-नमूने से पहले मिट्टी के नमूनों को अच्छी तरह से समरूप बनाना।
- निष्फल उपकरणों का उपयोग करके, लगभग आधा भरा होने तक नमूने के साथ एक लेबल 2 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब लोड करें।
- दोहराने कदम 2.2 जब तक सभी 95 नमूनों को लेबल 2 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में उप-नमूना किया गया है। 96वें कुएं को एक्सट्रैक्टिंग ब्लैंक के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
नोट: चरण 2.3 और 2.4 आवश्यक भंडारण स्थान को कम करने और अधिक या डबल नमूने को रोकने के लिए किए जाते हैं। - प्लेट लोड होने तक बर्फ पर 2 एमएल सब-सैंपल ट्यूब स्टोर करें।
- लेबल 96 बाँझ 200 μL फ्लैट-छाया पीसीआर ट्यूब A1\u2012A12, B1\u2012B12, .... H1\u2012H12। इन ट्यूबों को 96-वेल रैक में क्रम में रखें।
- एक अच्छी तरह से स्थान (A1\u2012H12) के साथ एक नमूना आईडी असाइन करें और इसे रिकॉर्ड करें।
3. प्लेट तैयार करना
- 96-वेल प्लेट(चित्रा 1ए-1 सी)से रबर कवर निकालें और इसे बाँझ प्लास्टिक बैग (सामग्री की तालिकादेखें) में रखें। प्रदूषण को रोकने के लिए प्लास्टिक बैग को सील करें।
- सीलिंग फिल्म के साथ 96-अच्छी तरह से प्लेट को कवर करें(चित्रा 1डी-1E); उदाहरण के लिए, एक प्रीकट पियर्सेबल सीलिंग फिल्म (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें। रबर रोलर के साथ रोलिंग द्वारा सील सुनिश्चित करें।
नोट: पियर्सेबल सिलिकॉन मैट संभावित रूप से एक पुन: प्रयोज्य विकल्प प्रदान कर सकता है, उपयोगों के बीच उचित सफाई प्रदान करता है, लेकिन सिलिकॉन मैट जिसे हमने आसानी से पियर्स के साथ विभाजित किया है और किसी भी निम्नलिखित प्लेटों को समान सुरक्षा प्रदान नहीं करेगा। - ठंडा रखने के लिए प्लेट को फ्रिज (4 डिग्री सेल्सियस) में रखें।
4. उप-नमूनों का स्थानांतरण
नोट: जब मिट्टी का नमूना बहुत छोटा है तो संशोधनों के लिए चरण 4.13 देखें।
- कोल्ड स्टोरेज के लिए 2 एमएल सब-सैंपल में से 24 को आइस ब्लॉक में रखें ।
- नमूना नाम और अच्छी तरह से स्थान पत्रक का उपयोग सही 200 μL फ्लैट छाया पीसीआर ट्यूब चुनें।
- समरूपता सुनिश्चित करने के लिए ~ 5 एस के लिए 2 एमएल सब-सैंपल ट्यूब और भंवर लें।
- लौ और ब्लीच निष्फल उपकरण का उपयोग सही फ्लैट-कैप्ड पीसीआर ट्यूब(चित्रा 1F)में पहले नमूने के ~ 200 μL लोड।
- सभी 24 नमूनों को लोड किए जाने तक कदम 4.2\u20124.4 दोहराएं। फिर 4.6 कदम पर जाएं।
- ब्लीच-डूबा हुआ पेपर वाइप का उपयोग करके, 200 माइक्रोन फ्लैट-कैप्ड पीसीआर ट्यूब के बाहर साफ करें।
- ट्यूब को उलटें और ट्यूब के ऊपर नमूना स्थानांतरित करने के लिए बेंच पर टैप करें। प्रक्षालित और लौ-निष्फल कैंची के साथ, 96-वेल प्लेट(चित्रा 1G)में गिरने के लिए नमूने के लिए एक खोलने बनाने के लिए पीसीआर ट्यूब के नीचे क्लिप करें।
- एक ९६ अच्छी तरह से थाली पर सही अच्छी तरह से पता लगाने और कट अंत के साथ थाली भर में ट्यूब पास है कि अच्छी तरह से पहुंचने तक का सामना करना पड़ रहा । प्रीकट पियर्सबल सीलिंग फिल्म के पंचर की सुविधा के लिए प्लेट को थोड़ा झुकाएं, और केवल तभी जब ट्यूब सीधे सही से ऊपर होता है तो ध्यान से इसे उलटा करें ताकि कट टिप अच्छी तरह से फिट हो जाए। निष्फल उपकरणों का उपयोग करना, पीसीआर ट्यूब के शीर्ष पर टैप करें जब तक कि सभी मिट्टी ट्यूब से कुएं में गिर न जाए। ढक्कन बंद(चित्रा 1एच-1J)के साथ अच्छी तरह से ट्यूब के भीतर छोड़ दें ।
- एक समय में एक फ्लैट-कैप्ड 200 माइक्रोन पीसीआर ट्यूब निकालें और उस कुएं(चित्रा 1K)में 750 μL मनका समाधान जोड़ें। 200 μL फ्लैट-छाया पीसीआर ट्यूब को कुएं में नीचे धकेलें और यह इंगित करने के लिए कि यह कुआं लोड किया गया है, शार्पी के साथ शीर्ष को चिह्नित करें। प्रत्येक नमूने के लिए इसे दोहराएं।
- एक बार सभी 24 नमूनों को लोड कर लिया गया है और मनका समाधान जोड़ा गया है, 2 एमएल उप नमूना ट्यूबों को हटा दें और 24 अनसाम्प्ड ट्यूबों के साथ बदलें।
- जब तक सभी 95 कुओं को नमूना या खाली और मनका समाधान से भरा नहीं गया है तब तक चरण 4.1\u20124.10 दोहराएं। उन्हें खुले कुओं(चित्रा 1L)पर पारित किए बिना ट्यूबों को हटा दें ।
- ध्यान से छेदने योग्य फिल्म को हटा दें और प्लेट को निष्कर्षण शुरू होने तक बचाने के लिए रबर कवर को बदलें(चित्रा 1एम-1O)।
- मिट्टी की बहुत कम मात्रा के लिए जो ठीक-ठाक भी हैं, नमूना ट्यूब में 750 माइक्रोन का समाधान जोड़ें और सभी सामग्री को उचित कुएं में स्थानांतरित करने के लिए एक विस्तृत बोर पिपेट टिप का उपयोग करें। डबल लोडिंग को रोकने के लिए पीसीआर ट्यूब को खोलने में रखें।
नोट: इस संशोधन को कण कार्बनिक पदार्थ या पिपेट टिप के बोर से बड़े छोटे रॉक टुकड़े के रूप में लागू करते समय सावधान रहें, पिपेट को रोक सकते हैं और नमूना घोल का हस्तांतरण मुश्किल बना सकते हैं। - के रूप में -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज की जरूरत है और दुकान प्लेटें नमूना और मनका समाधान के साथ भरी हुई जब तक की योजना बनाई निष्कर्षण।
5. प्लेट लोडिंग विधियों की तुलना
नोट: 96-अच्छी तरह से डीएनए निष्कर्षण प्लेटों को लोड करने के लिए हमारे उपन्यास विधि को सत्यापित करने के लिए, हमने एक 96-अच्छी प्लेट को तीन वर्गों में विभाजित किया। हमने मिट्टी के गैरइरादतन लोडिंग और क्रॉस संदूषण की क्षमता की तुलना करने के लिए प्लेट लोडिंग के तीन विभिन्न तरीकों का उपयोग किया। हमारे द्वारा उपयोग किए जाने वाले तीन तरीके मैकफर्सन एट अल9,क्यूइगेन के डिफ़ॉल्ट लोडिंग प्रोटोकॉल10में उल्लिखित तरीके थे, और इस प्रकाशन में हम प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करते हैं।
- थाली में मिट्टी लोड
- धारा एक ९६-अच्छी तरह से थाली तीन चार कॉलम ब्लॉकों में । ऊपर उल्लिखित तीन विधि में से एक का उपयोग करके प्रत्येक ब्लॉक लोड करें।
- हर दूसरे कुएं में मिट्टी लोड करें ताकि नमूना और खाली कुएं कंपित हों। यह व्यवस्था अनजाने नमूना लोडिंग और क्रॉस संदूषण के लिए अधिकतम अवसर की अनुमति देती है।
- डीएनए निकालने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर 96-अच्छी तरह से प्लेट फ्रीज करें।
- डीएनए निष्कर्षण
- निर्माता के ९६-अच्छी तरह से प्लेट निष्कर्षण प्रोटोकॉल10के अनुसार डीएनए निकालें ।
- आगे के विश्लेषण तक डीएनए अर्क को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- खाली कुओं में डीएनए का मात्राकरण
- गल डीएनए कमरे के तापमान पर अर्क, भंवर और एक प्लेट स्पिनर का उपयोग कर नीचे स्पिन ।
- स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके खाली कुओं की डीएनए सांद्रता को मापें और रिकॉर्ड करें।
- खाली कुओं में मतलब डीएनए एकाग्रता में मतभेदों का विश्लेषण करने के लिए ANVOA और Tukey के बाद तदर्थ परीक्षण का प्रयोग करें ।
नोट: महत्वपूर्ण मतभेद α = 0.05 पर सूचित किया गया.
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Representative Results
इस उपन्यास विधि का उपयोग 96-अच्छी तरह से डीएनए निष्कर्षण प्लेटों को लोड करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया था। प्लेट लोडिंग विधियों की तुलना में खाली कुओं में सबसे कम डीएनए एकाग्रता के लिए हमारी विधि दिखाई दी। खाली कुओं में डीएनए एकाग्रता काफी विधि से कम था मेरे McPherson एट अल9 (पी & ०.०५) का प्रस्ताव है, हालांकि हमारी विधि में डीएनए सांद्रता सांख्यिकीय Qiagen डिफ़ॉल्ट विधि(चित्रा 2)से अलग नहीं थे । सभी तीन तरीकों का उत्पादन 2 एनजी के तहत डीएनए सांद्रता का मतलब है/
चित्रा 1: कुओं के बीच क्रॉस-संदूषण की क्षमता को कम करते हुए डीएनए निष्कर्षण के लिए ९६-अच्छी प्लेटों में नमूनों को लोड करने के लिए कदम से कदम । डार्क ग्रे कवर (चरण ए, बी, एन और ओ में मौजूद) सिलिकॉन कवर का प्रतिनिधित्व करते हैं जो निष्कर्षण किट के साथ आता है। हल्के ग्रे कवर (चरण डी में लागू, चरण एल के बाद हटाया गया) लोडिंग के दौरान प्लेट को कवर करने के लिए उपयोग किए जाने वाले पियर्सेबल पीसीआर टेप का प्रतिनिधित्व करता है। हालांकि चित्र नहीं है, उपकरण प्रत्येक नमूना लोड करने से पहले निष्फल किया जाना चाहिए, और पीसीआर ट्यूबों पीसीआर टेप भेदी से पहले ब्लीच के साथ मिटा दिया जाना चाहिए । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: खाली कुओं की डीएनए सांद्रता। डीएनए एकाग्रता एनजी/μL में प्रतिनिधित्व किया है । पत्र α = 0.05 पर डीएनए सांद्रता में महत्वपूर्ण जोड़ीवार अंतर का संकेत मिलता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
यह विधि उच्च-थ्रूपुट नमूना निष्कर्षण प्लेटें लोड करते समय अच्छी तरह से क्रॉस-संदूषण के अवसरों को कम करती है और मौजूदा प्लेट लोडिंग रणनीतियों9,10से परे 96-अच्छी प्लेटों को लोड करने के लिए अधिकनियंत्रितसाधन प्रदान करती है। कुओं के बीच संदूषण एकल-ट्यूब निष्कर्षण की तुलना में 96-अच्छी प्लेट अर्क में अधिक व्यापक हो सकता है, खासकर जब स्वचालित6,,7,और, हालांकि विशेष रूप से किसी भी पद्धति में परीक्षण नहीं किया जाता है, जब निष्कर्षण प्लेटों के कुओं को प्लेट लोडिंग की अवधि के लिए खुला छोड़ दिया जाता है तो क्रॉस-संदूषण का जोखिम सबसे अधिक माना जा सकता है। एकल ट्यूब अर्क की तुलना में प्लेट आधारित निष्कर्षण में पार संदूषण के लिए वृद्धि के अवसर को देखते हुए, एक बाँझ कवर के साथ कुओं की रक्षा एक ९६-अच्छी तरह से थाली में नमूनों लोड करने में एक महत्वपूर्ण पहला कदम माना जाना चाहिए । इस आवश्यकता के बावजूद, उच्च-थ्रूपुट निष्कर्षण किट में प्रदान किए गए निर्देश बस प्लेट लोड करने और "नमूना कुओं के बीच क्रॉस संदूषण से बचने" के लिए कहते हैं, लेकिन ऐसा करने के लिए कोई अतिरिक्त जानकारी प्रदान नहीं करते हैं10। एक ९६-अच्छी तरह से निष्कर्षण प्लेट में नमूने जोड़ने के दौरान संदूषण को कम करने के लिए, मैकफर्सन एट अल 9 पीसीआर सीलिंग टेप की कट स्ट्रिप्स के साथ प्लेट को कवर करने का सुझाव देते हैं, उन्हें प्रत्येक अच्छीतरह से एक्सेस करने के लिए वापस छीलने का सुझाव देते हैं। यह विधि सभी कुओं के खुले होने के कुल समय को कम कर देती है, लेकिन कुएं असमान मात्रा में समय के लिए खुले होते हैं और कुछ कुएं प्रदूषण के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं- जो नमूने लोड किए जाते हैं- लोडिंग घटना के दौरान उजागर होते हैं। इसके अलावा, पीसीआर सीलिंग-टेप के छीलने में स्थिर बिजली बनाने की क्षमता है जिसके परिणामस्वरूप मिट्टी को अच्छी तरह से स्थानांतरित किया जा रहा है और हमारे निष्कर्षण में देखे गए खाली कुओं में उच्च डीएनए सांद्रता के लिए जिम्मेदार हो सकता है। इसके अलावा, इस पद्धति की आवश्यकता है कि नमूने पसंद की भलाई में रखा जा रहा से पहले खुला कुओं पर पारित कर रहे हैं, और कुछ भी नहीं दुर्घटनाओं से एक भी अच्छी तरह से दो नमूनों लोड िंग से एक शोधकर्ता रोकता है (डबल लोड हो रहा है) या दो या अधिक नमूनों के स्थान मिश्रण । यदि पकड़ा जाता है, तो डबल लोडिंग संसाधनों की बर्बादी से ज्यादा कुछ नहीं बन गया है। यदि, हालांकि, नमूना स्थानों की डबल लोडिंग या मिश्रण पर किसी का ध्यान नहीं जाता है, तो प्रायोगिक परिणाम विकृत हो सकते हैं7।
हमने ऊपर उल्लिखित विधि उच्च-थ्रूपुट डीएनए निष्कर्षण प्लेटों को लोड करने के लिए एक नियंत्रित साधन प्रदान करती है। विशेष रूप से, हमारी विधि हर समय कुओं को कवर करके क्रॉस संदूषण के जोखिम को कम करती है। कुओं को शुरू में सीलिंग टेप से कवर किया जाता है और फिर सैंपल लोडिंग के लिए इस्तेमाल की जाने वाली पीसीआर ट्यूब द्वारा कवर रखा जाता है । न केवल यह विधि क्रॉस-संदूषण के जोखिम को कम करती है, बल्कि यह पूरी तरह से दो नमूनों को एक ही कुएं में लोड करने के जोखिम को भी रोकती है। एक बार जब हम एक नमूने को कुएं में लोड करते हैं, तो पीसीआर ट्यूब एक ब्लॉक के रूप में कार्य करता है, जो एक और नमूना के अलावा को रोकता है। प्लेट स्थान के साथ सभी ट्यूबों को लेबल करके (उदाहरण के लिए, A1, A2 ... H11, H12) नमूनों को लोड करने से पहले, यह विधि यह सुनिश्चित करने के लिए अंतिम जांच भी प्रदान करती है कि सभी नमूनों को लोड किया गया है और कोई कुओं को याद नहीं किया गया है । हालांकि यह विधि कुओं को लोड करने के लिए अधिक नियंत्रित साधन प्रदान करती है, प्लेट लोड करने वाले किसी भी व्यक्ति को प्लेट पर कट पीसीआर ट्यूब पास करते समय अतिरिक्त देखभाल करनी चाहिए। हालांकि कुओं सील कर रहे हैं, किसी भी नमूना कणों कि सील प्लेट की सतह पर गिर अनपेक्षित कुओं में अपना रास्ता मिल सकता है जब तकनीशियन फिल्म पियर्स उन कुओं में सही नमूने लोड करने के लिए । इस समस्या से बचने के लिए, हम पीसीआर ट्यूब के साथ सीलिंग टेप को पंचर करने से पहले 96-वेल प्लेट को ~ 40 डिग्री तक झुकाते हैं। यह दृष्टिकोण ट्यूब के खुले छोर को सीधा और गलत कुओं से दूर रखने में मदद करता है।
जब मृदा के नमूने बहुत कम मात्रा के होते हैं और/या अत्यंत बारीक दानेदार होते हैं, तो पीसीआर ट्यूबों में मिट्टी के नमूने लोड करने के बजाय चौड़े बोर वाले पिपेट टिप का उपयोग प्रत्येक नमूने को स्थानांतरित करने में अधिक प्रभावी हो सकता है । इस संशोधन के लिए, पहले बफर समाधान नमूना ट्यूब में जोड़ा जाना चाहिए और फिर दोनों नमूना और समाधान 96-अच्छी तरह से प्लेट में पिपेट किया जाना चाहिए। इस कदम के बाद प्रत्येक कुएं में पीसीआर ट्यूब जोड़ने से डबल लोडिंग को रोका जा सकेगा। जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग में उल्लेख किया गया है, इस संशोधन का उपयोग करते समय, शोधकर्ता या तकनीशियन को कण कार्बनिक पदार्थ या छोटे चट्टान के टुकड़ों के बारे में बहुत जानकारी होनी चाहिए क्योंकि इनमें पिपेट के बोर को रोकना करने की क्षमता होती है।
हालांकि नमूना लोडिंग की कोई विधि पूरी तरह से नमूना संदूषण के जोखिम को खत्म नहीं कर सकती है, हम ऊपर जो विधि रेखांकित करते हैं वह इन जोखिमों को काफी हद तक कम करने और नमूना स्थानों के दोहरे लोडिंग और मिश्रण के जोखिम को पूरी तरह से खत्म करने का साधन प्रदान करता है। कुल मिलाकर, हम मानते हैं कि इस विधि को उच्च-थ्रूपुट डीएनए निष्कर्षण प्लेटों को लोड करने के लिए मौजूदा तकनीकों पर एक बड़ा सुधार होना चाहिए और सुझाव है कि उच्च थ्रूपुट निष्कर्षण प्लेटों का उपयोग करने वाले सभी माइक्रोबायोलॉजिस्ट ऊपर उल्लिखित विधि का उपयोग करने के लिए आगे बढ़ते हैं।
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Disclosures
लेखकों के हितों का कोई टकराव रिपोर्ट और कुछ भी नहीं खुलासा किया है ।
Acknowledgments
इस शोध को एनएसएफ अवार्ड #EPS-1655726 से फंडिंग के साथ माइक्रोबियल इकोलॉजी सहयोगी ने समर्थन दिया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 oz WhirlPak | Nasco | B01065 | |
| 2 mL centrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 200 µL micro-PCR tubes | Thermo Scientific | AB 2000 | |
| 96-well PowerSoil DNA extraction kit | Qiagen | 12955-4 | We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work. |
| Ice block for 2 mL centrifuge tubes | Any | Any | Any ice block made for 2 mL tubes will work |
| Ice block for 200 µL micro-PCR tubes | Any | Any | Any ice block made for 200 µL tubes will work |
| Micro scoopula | Any | Any | |
| Precut Pierceable Sealing Film | Excel Scientific | XPS25 | |
| Spatula | Any | Any | |
| Surgical scissors | Any | Any |
References
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- Davis, A., et al. Improved yield and accuracy for DNA extraction in microbiome studies with variation in microbial biomass. BioTechniques. 66 (6), 285-289 (2019).
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