Summary
Nuvarande metoder för att lasta 96-brunnsplattor för DNA-extraktioner kan vara benägna att kontamineras. Vi detaljerar en ny metod för lastning av 96-brunnsplåtar som minskar risken för korskontaminering bland brunnar. Vår metod kommer att hjälpa andra forskare att dra nytta av effektiviteten i hög genomströmning DNA extraktionstekniker och minimera risken för kontaminering.
Abstract
Dna-sekvenseringstekniker med hög genomströmning har bidragit avsevärt till framsteg i vår förståelse av relationer mellan mikrobiella samhällen, värdegenskaper och bredare ekosystemfunktioner. Med denna snabba ökning av bredd och djup av sekvensering kapacitet har kommit metoder för att extrahera, förstärka, analysera och tolka miljö-DNA framgångsrikt med maximal effektivitet. Tyvärr kan utföra DNA-extraktioner snabbt komma till kostnaden för att öka risken för kontaminering bland prover. Särskilt höggenomströmningsextraktioner som är baserade på prover som finns i en 96-brunnsplatta erbjuder en relativt snabb metod, jämfört med enrörsextraktioner, men ökar också möjligheterna till väl till väl korskontaminering. För att minimera risken för korskontaminering bland prover, samtidigt som vi behåller fördelarna med hög genomströmningsextraktionsteknik, utvecklade vi en ny metod för att lasta miljöprover i 96-brunnsplattor. Vi använde pierceable PCR tätning filmer för att täcka varje platta medan lastning prover och lagt prover först till PCR rör innan du flyttar dem i brunnar; tillsammans minskar dessa metoder risken för provdrift och oavsiktlig dubbellastning av brunnar. Den metod som beskrivs i detta dokument ger forskare med en metod för att maximera tillgängliga hög genomströmning extraktion tekniker samtidigt minska risken för korskontaminering inneboende till 96-brunnsplattor. Vi ger en detaljerad steg för steg konturering av hur man flyttar från provinsamling till DNA-extraktion samtidigt som risken för oönskad korskontaminering minimeras.
Introduction
De senaste framstegen inom hög genomströmning sekvensering av mikrobiella samhällen ger oöverträffad sekvensering djup och därmed en oförberedd inblick i funktionen och mångfalden av jordens mikrobiom1. Som förmågan att multiplex fler och fler prover på en enda sekvensering körfält ökar, enda rör DNA-utvinning har potential att bli en takt-begränsande steg i generering av ekologiska data. Nya metoder vid DNA-extraktioner med hög genomströmning håller dock löfte om bearbetning av stora mängder miljöprover med större effektivitet än vad som tidigare varit möjligt2. Dessa metoder innebär ofta att använda 96-brunnsplåtar istället för enrörs, och därigenom öka det möjliga antalet extraktioner som kan förekomma samtidigt. Som sådan, det praktiska och effektivitet av hög genomströmning utvinning metoder är uppenbara och har genomförts för bearbetning av miljöprover från jord3,4 och vävnaderväxt 3,5 till mänskliga fekal materia2.
Även om dessa metoder dramatiskt kan hastighet längs provbearbetning och DNA-extraktion, det första steget för att ladda jord och andra ekologiska prover i 96-brunnsplattor är mottagliga för korsprov kontaminering. Denna typ av väl-till-brunn-kontaminering kan uppstå vidDNA-extraktioner 6,7,8, och brunnar är särskilt sårbara i detta första steg innan prover suspenderas i en buffertlösning. McPherson et al.9 demonstrera en metod för att ladda rhizosfären jordar i 96-brunns plattor med hjälp av trattar och 8-väl PCR remsa täcker, men medan deras metod är en mer kontrollerad strategi för lastning plattor, det ger fortfarande gott om möjligheter till kontaminering av angränsande brunnar vid lastning varje prov. Dessutom tillåter de öppna brunnarna chansen för en distraherad forskare att placera ett prov i den felaktiga brunnen eller lägga till ett prov i en brunn som redan har lästs in. Dessutom visar sig en mängd olika provtyper vara dåligt lämpade för lastning med denna metod; våta prover fastnar ofta på trattar och torra prover "hoppa" mellan brunnar på grund av statisk elektricitet.
För att minska möjligheterna till kontaminering bland brunnar i det första steget av höggenomströmning DNA extraktioner, utvecklade vi en ny metod för att ladda jordprover i 96-brunnsplattor. Våra metoder skyddar både brunnar från miljöexponering och hindrar oss från att av misstag lasta flera prover i en brunn (dubbellastning). Vi tror att den metod som rapporteras nedan ger löfte om att minska risken för kontaminering och som sådan ger ett mer kontrollerat sätt att ladda 96-brunnsplattor för efterföljande DNA-extraktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Laboratoriebänk och verktygsberedning för lastning av en 96-brunnsplatta
- Tydlig bänkskiva genom imma med 70% etanol. Torka och låt lufttorka innan du sprayar bänkskiva med 10% blekmedel. Torka bänkskivan torr.
- Sterilisera mikro-scoopula, spatel, och kirurgisk sax (böjda) genom doppning i 95% etanol och sedan utsätta för en flamma. Doppa var och en i 10% blekmedel och låt lufttorka före användning.
OBS: Verktyg ska steriliseras mellan varje prov.
2. Delprovtagning och provberedning
- Sterilisera handskar med hjälp av etanol före delprovtagning.
- Homogenisera jordprover noggrant före delprovtagning.
- Använd steriliserade verktyg, ladda ett märkt 2 mL centrifugrör med prov fram till ungefär halvfullt.
- Upprepa steg 2.2 tills alla 95 proverna har delprovats i märkta 2 mL centrifugerör. Den96:e brunnen ska användas som extraktionstomt.
OBS: Steg 2.3 och 2.4 görs för att minimera erforderligt lagringsutrymme och för att förhindra över eller dubbel provtagning. - Förvara 2 st st delprovrör på is fram till inläsning av plåt.
- Etikett 96 steril 200 μL flat-capped PCR-rör A1\u2012A12, B1\u2012B12, .... H1\u2012H12. Placera dessa rör i ordning i en 96-brunn rack.
- Tilldela ett exempel-ID med en brunnsplats (A1\u2012H12) och spela in det.
3. Beredning av plattan
- Ta bort gummiskyddet från 96-brunnsplatta (figur 1A–1C) och placera det i en steril plastpåse (se Tabell över material). Förslut plastpåsen för att förhindra kontaminering.
- Täck 96-brunnsplattan med tätningsfilm (Figur 1D–1E); till exempel använda en förskuren stickningsbar tätningsfilm (se tabellen över material). Säkerställ tätning genom att rulla med en gummivals.
OBS: Pierceable silikonmattor skulle kunna erbjuda ett återanvändbart alternativ, förutsatt lämplig rengöring mellan användningar, men silikonmattor som vi testade enkelt delas längs pierces och skulle inte erbjuda lika skydd för någon följande plattor. - Placera plattan i kylskåp (4 °C) för att hålla sval.
4. Överföring av delprov
OBS: Se steg 4.13 för ändringar när jordprovet är mycket litet.
- Placera 24 av delproverna på 2 mL i ett isblock för kylförvaring.
- Med hjälp av provet namn och väl plats ark välja rätt 200 μL platt-capped PCR röret.
- Ta en 2 mL sub-provrör och virvel för ~ 5 s för att säkerställa homogenisering.
- Använda flam- och bleksteriliserade verktyg ladda ~200 μL av det första provet i rätt platt-utjämnade PCR-röret (Bild 1F).
- Upprepa steg 4.2\u20124.4 tills alla 24 prov har lästs in. Flytta sedan till steg 4.6.
- Med hjälp av en blekdoppad papperstork rengör du utsidan av det 200 μL-flat-capped PCR-röret.
- Invertera röret och peka på bänken för att flytta prov till toppen av röret. Med blekt och flamsteriliserad sax, klipp ner pcr-röret för att skapa en öppning för prov att falla i 96-brunnsplattan (Bild 1G).
- Lokalisera rätt brunn på en 96-brunn platta och passera röret över plattan med skär vänd uppåt tills nå att väl. Luta plattan något för att underlätta punktering av precut pierceable tätning film, och endast när röret är direkt ovanför rätt noga invertera den så att skuren spets passar in i brunnen. Med hjälp av steriliserade verktyg, knacka på toppen av PCR röret tills all jord har fallit från röret i brunnen. Låt röret vara kvar i brunnen med lock stängt( Bild 1H–1J).
- Ta bort ett platt-utjämnat 200 μL PCR-rör åt gången och tillsätt 750 μL pärllösning till den brunnen (Bild 1K). Tryck 200 μL flat-capped PCR-röret hela vägen ner i brunnen och markera toppen med sharpie för att indikera att denna brunn har laddats. Upprepa detta för varje prov.
- När alla 24 prov har lastats och pärllösning tillsatts, avlägsna subprovrören på 2 mL och ersätts med 24 ej uppkopplade rör.
- Upprepa steg 4.1\u20124.10 tills alla 95 brunnarna har laddats med prov eller blank och pärlebelösning. Ta bort rör utan att passera dem över öppna brunnar (Bild 1L).
- Ta försiktigt bort genomborrbar film och sätt tillbaka gummiskyddet för att skydda plattan tills början extraktion (Figur 1M–1O).
- För mycket små mängder jord som också är finkornig, tillsätt 750 μL pärllösning till provröret och använd en bredborrade pipettspets för att överföra allt innehåll till lämplig brunn. Placera PCR-röret i öppningen för att förhindra dubbel lastning.
OBS: Var försiktig när du genomför denna modifiering som partiklar organiskt material eller små bergfragment större än borren av pipetten spets kan täppa till pipetten och göra överföring av provet slurry svårt. - Vid behov frysa vid -20 °C och förvara plattor lastade med prov och pärla lösning fram till planerad extraktion.
5. Jämförelse av plåtladdningsmetoder
OBS: För att verifiera vår nya metod för lastning av 96-väl DNA extraktion plattor, delade vi en enda 96-väl platta i tre sektioner. Vi använde tre olika metoder för plåtbelastning för att jämföra potential för oavsiktlig lastning av jord och korskontaminering. De tre metoder vi använde var de metoder som beskrivs i McPherson et al.9, Qiagens standard inläsningsprotokoll10, och det protokoll vi beskriver i denna publikation.
- Laddar jord i plattan
- Dela upp en 96-brunnsplatta i tre fyrakolumnsblock. Ladda varje block med en av de tre metod som nämns ovan.
- Ladda jord i varannan brunn så att prov och tomma brunnar är förskjutna. Detta arrangemang möjliggör maximal möjlighet för oavsiktlig provbelastning och korskontaminering.
- Frys 96-brunnsplattan vid -20 °C tills DNA-extraktion.
- DNA-extraktion
- Extrahera DNA enligt tillverkarens 96-brunnssplättseringsprotokoll10.
- Förvara DNA-extrakten vid -20 °C tills vidare analys.
- Kvantifiering av DNA i blanka brunnar
- Tina DNA-extrakt i rumstemperatur, virvel och snurra ner med hjälp av en tallrik spinner.
- Mät och registrera DNA-koncentrationer av blanka brunnar med hjälp av en spektrofotometer.
- Använd ANVOA och Tukeys post-hoc test för att analysera skillnader i medel-DNA-koncentration i blanka brunnar.
OBS: Väsentliga skillnader rapporterades vid α = 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna nya metod användes framgångsrikt för att ladda 96-väl DNA extraktion plattor. Jämförelse av plattan lastning metoder visade vår metod för att ha den lägsta DNA-koncentrationen i de tomma brunnarna. DNA-koncentrationen i de tomma brunnarna var betydligt lägre än den metod som föreslogs min McPherson et al.9 (p < 0,05), fast DNA-koncentrationer i vår metod inte statistiskt sett skiljer sig från Qiagens standardmetod (figur 2). Alla tre metoder som produceras genomsnittliga DNA-koncentrationer under 2 ng/μL, men bara vår nya metod produceras brunnar utan mätbar DNA-koncentration.
Figur 1: Steg för steg metoder för att ladda prover i 96-brunnsplattor för DNA-extraktion samtidigt som potentialen för korskontaminering bland brunnar minimeras. Mörkgrå omslag (som finns i steg A, B, N och O) representerar det kiselhölje som medföljer extraktionssatsen. Det ljusgråa skyddet (som appliceras i steg D, avlägsnas efter steg L) representerar det genomborrbara PCR-bandet som används för att täcka plattan vid inläsning. Även om inte avbildas, verktyg bör steriliseras före lastning varje prov, och PCR rör bör torkas med blekmedel innan piercing PCR-bandet. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: DNA-koncentrationer av tomma brunnar. DNA-koncentration är representerad i ng/μL. Bokstäver indikerar signifikanta parvissa skillnader i DNA-koncentrationer vid α = 0,05. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna metod minskar möjligheterna till väl till väl korskontaminering medan lastning med hög genomströmning prov extraktionsplattor och erbjuder ett mer kontrollerat sätt att ladda 96-väl plattor utöver befintliga strategier plattan lastning9,10. Kontamination bland brunnar kan vara mer genomgripande i 96-brunnsplåtutdragningar än vid enrörsextraktioner, särskiltnär de är automatiserade 6,7, och, dock inte specifikt testad i någon metod, risken för korskontaminering kan antas vara störst när utvinningsplattornas brunnar lämnas öppna under hela plåtlastningen. Med tanke på den ökade möjligheten till korskontaminering i plåtbaserade extraktioner jämfört med enrörsextraktioner, bör skydda brunnar med ett sterilt överdrag betraktas som ett viktigt första steg vid lastning av prover i en 96-brunnsplatta. Trots detta behov, instruktioner som tillhandahålls i hög genomströmning extraktion kit helt enkelt säga att ladda plattan och att "undvika korskontaminering mellan prov brunnar," men inte ge någon ytterligare information om hur man gördet 10. För att minska kontaminering samtidigt lägga till prover till en 96-brunn extraktionsplatta, McPherson et al.9 föreslår täcker plattan med skurna remsor av PCR tätningstejp, peeling dem tillbaka för att komma åt varje brunn. Den här metoden minskar den totala tid som alla brunnar är öppna, men brunnar är öppna för ojämlika mängder tid och några av de brunnar som är mest mottagliga för kontaminering— de närmaste provet som lastas — exponeras under lastningshändelsen. Dessutom har peeling av PCR-tätningstejp potential att skapa statisk elektricitet som resulterar i att jord överförs från brunn till brunn och kan vara ansvarig för de högre DNA-koncentrationerna i tomma brunnar som observerats i vår extraktion. Dessutom kräver denna metod att prover överförs över avtäckta brunnar innan de placeras i brunnen val, och ingenting hindrar en forskare från att av misstag lasta två prover i en enda brunn (dubbel lastning) eller blanda upp placeringen av två eller flera prover. Om den fångas, utgör dubbel lastning inget annat än ett slöseri med resurser. Om en dubbel lastning eller blandning av provplatser däremot går obemärkt förbi, kan experimentella resultat förvanskas7.
Den metod vi skisserat ovan ger ett kontrollerat sätt att ladda hög genomströmning DNA extraktion plattor. Specifikt sänker vår metod risken för korskontaminering genom att hålla brunnar täckta hela tiden. Brunnarna täcks inledningsvis av tätningstejp och hålls sedan täckta av pcr-röret som används för provlastning. Denna metod minskar inte bara risken för korskontaminering, utan den förhindrar också helt risken att lasta två prover i en enda brunn. När vi laddar ett prov i en brunn, fungerar PCR-röret som ett block, vilket förhindrar tillägg av ett annat prov. Genom att märka alla rör med skyltplats (t.ex. A1, A2... H11, H12) före lastning av prover, denna metod ger också en slutlig kontroll för att säkerställa att alla prover har laddats och inga brunnar har missats. Medan denna metod ger ett mer kontrollerat sätt att ladda brunnar, alla lastning en platta bör vara extra försiktig när de passerar en klippa PCR röret över plattan. Även om brunnarna är förseglade, kan alla provpartiklar som faller på ytan av den förseglade plattan hitta sin väg in i oavsiktliga brunnar när teknikern genomborrar filmen för att ladda rätt prover i dessa brunnar. För att undvika denna fråga, vi lutar 96-brunnsplattan till ~ 40 ° före punktering tätningstejpen med PCR röret. Detta tillvägagångssätt hjälper till att hålla den öppna änden av röret upprätt och borta från de felaktiga brunnarna.
När jordprover är av mycket små mängder och/eller extremt finkorniga, kan det vara effektivare att använda en bredborrade pipettspets i stället för att lasta jordprover i PCR-rör för att överföra varje prov. För denna modifiering bör den första buffertlösningen tillsättas provröret och därefter både prov och lösning pipetteras i 96-brunnsplattan. Lägga till en PCR-röret till varje väl efter detta steg kommer att förhindra dubbel-lastning. Som nämnts i protokollet avsnitt, när du använder denna modifiering, bör forskaren eller teknikern vara mycket medveten om partiklar organiskt material eller små fragment berg eftersom dessa har potential att täppa till bar av pipetten.
Även om ingen metod för provlastning helt kan eliminera risken för provkontaminering, ger den metod vi skisserar ovan ett sätt att minska dessa risker väsentligt och helt eliminera risken för dubbel lastning och blandning av provplatser. Sammantaget anser vi att denna metod vara en stor förbättring av befintliga tekniker för lastning med hög genomströmning DNA extraktion plattor och föreslår att alla mikrobiologer med hjälp av hög genomströmning extraktionsplattor flytta till med hjälp av en metod som den som beskrivs ovan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna rapporterar inga intressekonflikter och har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av Microbial Ecology Collaborative med finansiering från NSF award #EPS-1655726.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 oz WhirlPak | Nasco | B01065 | |
| 2 mL centrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 200 µL micro-PCR tubes | Thermo Scientific | AB 2000 | |
| 96-well PowerSoil DNA extraction kit | Qiagen | 12955-4 | We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work. |
| Ice block for 2 mL centrifuge tubes | Any | Any | Any ice block made for 2 mL tubes will work |
| Ice block for 200 µL micro-PCR tubes | Any | Any | Any ice block made for 200 µL tubes will work |
| Micro scoopula | Any | Any | |
| Precut Pierceable Sealing Film | Excel Scientific | XPS25 | |
| Spatula | Any | Any | |
| Surgical scissors | Any | Any |
References
- Thompson, L. R., et al. A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity. Nature. 551 (7681), 457-463 (2017).
- Davis, A., et al. Improved yield and accuracy for DNA extraction in microbiome studies with variation in microbial biomass. BioTechniques. 66 (6), 285-289 (2019).
- Marotz, C., et al. Triplicate PCR reactions for 16S rRNA gene amplicon sequencing are unnecessary. BioTechniques. 67 (1), 29-32 (2019).
- Romdhane, S., et al. Cover crop management practices rather than composition of cover crop mixtures affect bacterial communities in no-till agroecosystems. Frontiers in Microbiology. 10, 1618 (2019).
- Rochefort, A., et al. Influence of environment and host plant genotype on the structure and diversity of the Brassica napus seed microbiota. Phytobiomes Journal. 3 (4), 326-336 (2019).
- Minich, J. J., et al. Quantifying and understanding well-to-well contamination in microbiome research. mSystems. 4 (4), 00186 (2019).
- Walker, A. W. A lot on your plate? Well-to-well contamination as an additional confounder in microbiome sequence analyses. mSystems. 4 (4), 00362 (2019).
- Eisenhofer, R., et al. Contamination in low microbial biomass microbiome studies: issues and recommendations. Trends in Microbiology. 27 (2), 105-117 (2019).
- McPherson, M. R., et al. Isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass Experiments. Journal of Visualized Experiments. (137), e57932 (2018).
- Qiagen, D. N., et al. easy PowerSoil HTP 96 Kit Handbook. , Hilden, Germany. (2019).
