Summary
Nåværende metoder for lasting av 96-brønnplater for DNA-ekstraksjoner kan være utsatt for forurensning. Vi beskriver en ny metode for lasting av 96-brønnplater som reduserer risikoen for krysskontaminering blant brønner. Vår metode vil hjelpe andre forskere kapitalisere på effektiviteten av høy gjennomstrømning DNA utvinning teknikker og minimere risikoen for forurensning.
Abstract
Dna-sekvenseringsteknikker med høy gjennomstrømning har bidratt vesentlig til fremskritt i vår forståelse av relasjoner mellom mikrobielle samfunn, vertsegenskaper og bredere økosystemfunksjoner. Med denne raske økningen i bredde og dybde av sekvensering evner har kommet metoder for å trekke ut, forsterke, analysere, og tolke miljø-DNA vellykket med maksimal effektivitet. Dessverre kan utføre DNA-ekstraksjoner raskt komme på bekostning av å øke risikoen for forurensning blant prøver. Spesielt tilbyr høy gjennomstrømningsutvinninger som er basert på prøver i en 96-brønns plate en relativt rask metode, sammenlignet med enkeltrørsekstraksjoner, men også øke mulighetene for godt til brønn krysskontaminering. For å minimere risikoen for krysskontaminering blant prøver, samtidig som vi beholdt fordelene med høy gjennomstrømningsteknikker, utviklet vi en ny metode for lasting av miljøprøver i 96-brønnplater. Vi brukte gjennomborbare PCR-forseglingsfilmer for å dekke hver plate mens vi lastet prøver og la til prøver først til PCR-rør før vi flyttet dem inn i brønner; sammen reduserer disse praksisene risikoen for prøvedrift og utilsiktet dobbel lasting av brønner. Metoden som er skissert i dette papiret gir forskerne en tilnærming til å maksimere tilgjengelige høygjennomstrømningsutvinningsteknikker samtidig som risikoen for krysskontaminering iboende til 96-brønnplater. Vi gir en detaljert trinnvis oversikt over hvordan du går fra prøveinnsamling til DNA-ekstraksjon samtidig som risikoen for uønsket krysskontaminering minimeres.
Introduction
Nylige fremskritt innen høy gjennomstrømning sekvensering av mikrobielle samfunn gir enestående sekvensering dybde og følgelig et upretent glimt inn i funksjon og mangfold av jordens mikrobiome1. Etter hvert som muligheten til å multipleks flere og flere prøver på en enkelt sekvensering kjørefelt øker, enkelt rør DNA utvinning har potensial til å bli en hastighetsbegrensende trinn i generering av økologiske data. Nye metoder i DNA-ekstraksjoner med høy gjennomstrømning holder imidlertid løfte om behandling av store mengder miljøprøver med større effektivitet enn det som tidligere har vært mulig2. Disse metodene innebærer ofte å bruke 96-brønnplater i stedet for enkeltrør, og dermed øke mulig antall ekstraksjoner som kan oppstå samtidig. Som sådan er det praktiske og effektiviteten av høy gjennomstrømningsutvinningsmetoder tydelige og har blitt implementert for behandling av miljøprøver som spenner frajord 3,,4 og plantevev3,5 til menneskelig fekal materie2.
Mens disse metodene kan dramatisk øke hastigheten langs prøvebehandling og DNA-ekstraksjon, er det første trinnet med lasting av jord og andre økologiske prøver i 96-brønnplater utsatt for kryssprøvekontaminering. Denne typen brønn-til-brønn-kontaminering kan forekomme under DNA-ekstraksjoner6,,7,,8,og brønner er spesielt sårbare i dette første trinnet før prøvene suspenderes i en bufferløsning. McPherson et al.9 demonstrerer en metode for å laste jordsmonom i 96-brønners plater ved hjelp av trakter og 8-brønns PCR-stripedeksler, men mens metoden er en mer kontrollert tilnærming til lasteplater, gir den fortsatt rikelig mulighet for forurensning av nærliggende brønner ved lasting av hver prøve. I tillegg gir de åpne brønnene muligheten for en distrahert forsker til å plassere en prøve i feil brønn eller legge til en prøve i en brønn som allerede er lastet inn. I tillegg viser en rekke utvalgstyper seg å være dårlig egnet for lasting med denne metoden; våte prøver holder seg ofte til traktene og tørre prøver "hopper" mellom brønner på grunn av statisk elektrisitet.
For å redusere mulighetene for forurensning blant brønner i første trinn av DNA-ekstraksjoner med høy gjennomstrømning utviklet vi en ny tilnærming til lasting av jordprøver i 96-brønnplater. Våre metoder beskytter begge brønner mot miljøeksponering og hindrer oss i å laste flere prøver i en brønn ved et uhell (dobbeltlasting). Vi mener metoden som er rapportert nedenfor, lover å redusere potensialet for forurensning, og gir derfor et mer kontrollert middel for å laste 96-brønnplater for påfølgende DNA-ekstraksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Laboratoriebenk og verktøy forberedelse for lasting av en 96-brønns plate
- Klar benkeplate ved å tåke med 70% etanol. Tørk av og la luften tørke før du sprayer benkeplate med 10% blekemiddel. Tørk av benketoppen tørr.
- Steriliser mikroskjekuler, slikkepott og kirurgisk saks (buet) ved å dyppe i 95% etanol og deretter utsettes for en flamme. Dypp hver i 10% blekemiddel og la lufttørke før bruk.
MERK: Verktøy skal steriliseres mellom hver prøve.
2. Underprøvetaking og prøveklargjøring
- Steriliser hansker ved hjelp av etanol før sub-prøvetaking.
- Homogeniser jordprøver grundig før underprøvetaking.
- Bruk steriliserte verktøy, legg i et merket 2 ml sentrifugerør med prøve til det er omtrent halvfullt.
- Gjenta trinn 2.2 til alle 95 prøvene er underprøvet i merkede 2 ml sentrifugerør. Brønnenpå 96 skal brukes som ekstraksjon blank.
MERK: Trinn 2.3 og 2.4 gjøres for å minimere nødvendig lagringsplass og for å forhindre over- eller dobbeltprøvetaking. - Oppbevar 2 ml underprøverør på is til det er lagt i bruk av plate.
- Etikett 96 sterile 200 μL flat-caped PCR rør A1\u2012A12, B1\u2012B12, .... H1\u2012H12. Plasser disse rørene i rekkefølge i et 96-brønnsstativ.
- Tilordne en eksempel-ID med en brønnplassering (A1\u2012H12) og registrer den.
3. Plate forberedelse
- Fjern gummidekselet fra 96-brønnsplaten (figur 1A–1C) og legg det i en steril plastpose (se Materialtabell). Forsegle plastposen for å hindre kontaminering.
- Dekk 96-brønnplaten med tetningsfilm (figur 1D–1E); Bruk for eksempel en precut pierceable tetningsfilm (se Materialse bordet). Sørg for at tetningen rulles med en gummirulle.
MERK: Pierceable silikonmatter kan potensielt tilby et gjenbrukbart alternativ, forutsatt passende rengjøring mellom bruksområdene, men silikonmatter som vi testet lett deles langs pierces og ville ikke tilby lik beskyttelse til følgende plater. - Sett platen i kjøleskap (4 °C) for å holde seg avkjølt.
4. Overføring av underprøver
MERK: Se trinn 4.13 for modifikasjoner når jordprøven er svært liten.
- Plasser 24 av de 2 ml underprøvene i en isblokk for kald lagring.
- Ved hjelp av eksempelnavnet og brønnplasseringsarket velger du riktig 200 μL flatt behandlet PCR-rør.
- Ta en 2 ml sub-sample tube og vortex for ~ 5 s for å sikre homogenisering.
- Bruk av flamme- og blekemiddelsteriliserte verktøy last ~200 μL av den første prøven inn i riktig flat-caped PCR tube (Figur 1F).
- Gjenta trinn 4.2\u20124.4 til alle de 24 prøvene er lastet inn. Deretter går du til trinn 4.6.
- Bruk en blekemiddeldyppet papirsletting til å rengjøre utsiden av pcr-røret med 200 μl.
- Inverter røret og trykk på benken for å flytte prøven til toppen av røret. Med bleket og flammesterilisert saks, klipp bunnen av PCR-røret for å lage en åpning for prøve å falle inn i 96-brønnplaten (figur 1G).
- Finn riktig brønn på en 96-brønns plate og pass røret over platen med kuttet ende vendt opp til den når så godt. Vipp platen litt for å lette punktering av precut pierceable tetningsfilm, og bare når røret er rett over riktig godt, snu den forsiktig slik at kuttspissen passer inn i brønnen. Bruk steriliserte verktøy til å trykke på toppen av PCR-røret til all jord har falt fra røret og inn i brønnen. La røret stå i brønnen med lokket lukket (figur 1H–1J).
- Fjern ett flatt 200 μL PCR-rør om gangen og tilsett 750 μL perleoppløsning til den brønnen (figur 1K). Skyv 200 μL flat-caped PCR-røret helt ned i brønnen og merk toppen med sharpie for å indikere at denne brønnen er lastet. Gjenta dette for hvert eksempel.
- Når alle 24 prøvene er lastet og perleløsning lagt til, fjern 2 ml underprøverør og erstatt med 24 usamplede rør.
- Gjenta trinn 4.1\u20124.10 til alle 95 brønner er lastet med prøve- eller tom- og perleløsning. Fjern rør uten å passere dem over åpne brønner (figur 1L).
- Fjern den gjennomborbare filmen forsiktig og sett gummidekselet tilbake for å beskytte platen til du begynner å avsug (figur 1M–1O).
- For svært små mengder jord som også er finkornet, tilsett 750 μL perleoppløsning til prøverøret og bruk en bredbar pipettespiss for å overføre alt innhold til riktig brønn. Plasser PCR-røret i åpningen for å unngå dobbel lasting.
MERK: Vær forsiktig når du implementerer denne endringen som svevestøv organisk materiale eller små steinfragmenter større enn boringen på pipettespissen kan tette pipetten og gjøre overføringen av prøveslammen vanskelig. - Etter behov fryse ved -20 °C og lagre plater lastet med prøve og perle løsning til planlagt ekstraksjon.
5. Sammenligning av platelastemetoder
MERK: For å verifisere vår nye metode for lasting av 96-brønns DNA-ekstraksjonsplater, delte vi en enkelt 96-brønnsplate i tre seksjoner. Vi brukte tre forskjellige metoder for platelasting for å sammenligne potensialet for utilsiktet lasting av jord og krysskontaminering. De tre metodene vi brukte var metodene som er skissert i McPherson et al.9, Qiagens standardlasteprotokoll 10, og protokollen vi skisserer i denne publikasjonen.
- Laster jord inn i platen
- Del en 96-brønnsplate i tre firekolonners blokker. Last hver blokk ved hjelp av en av de tre metodene nevnt ovenfor.
- Last jord inn i alle andre brønner slik at prøven og tomme brønner er forskjøvet. Denne ordningen gir maksimal mulighet for utilsiktet prøvelasting og krysskontaminering.
- Frys 96-brønnplaten ved -20 °C til DNA-ekstraksjon.
- DNA-ekstraksjon
- Trekk ut DNA i henhold til produsentens 96-brønns plateekstraksjonsprotokoll10.
- Oppbevar DNA-ekstraktene ved -20 °C inntil videre analyse.
- Kvantifisering av DNA i tomme brønner
- Tin DNA-ekstrakter ved romtemperatur, virvel og spinn ned ved hjelp av en platespinner.
- Mål og registrer DNA-konsentrasjoner av tomme brønner ved hjelp av et spektrofotometer.
- Bruk ANVOA og Tukeys post-hoc-test for å analysere forskjeller i gjennomsnittlig DNA-konsentrasjon i tomme brønner.
MERK: Signifikante forskjeller ble rapportert ved α = 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne nye metoden ble brukt med hell til å laste 96-brønns DNA-ekstraksjonsplater. Sammenligning av platelastemetoder viste vår metode for å ha den laveste DNA-konsentrasjonen i de tomme brønnene. DNA-konsentrasjonen i de tomme brønnene var betydelig lavere enn metoden foreslo min McPherson et al.9 (p < 0,05), selv om DNA-konsentrasjoner i vår metode ikke var statistisk forskjellig fra Qiagen standardmetoden (figur 2). Alle tre metodene produserte gjennomsnittlige DNA-konsentrasjoner under 2 ng/μL, men bare vår nye metode produserte brønner uten målbar DNA-konsentrasjon.
Figur 1: Trinnvise metoder for å laste prøver inn i 96-brønnplater for DNA-ekstraksjon samtidig som potensialet for krysskontaminering mellom brønner minimeres. Mørkegrå deksler (til stede i trinn A, B, N og O) representerer silisiumdekselet som følger med ekstraksjonssettet. Det lysegrå dekselet (påføres i trinn D, fjernet etter trinn L) representerer det gjennomborbare PCR-båndet som brukes til å dekke platen under lasting. Selv om det ikke er avbildet, bør verktøy steriliseres før du laster hver prøve, og PCR-rør bør tørkes med blekemiddel før piercing av PCR-båndet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: DNA-konsentrasjoner av tomme brønner. DNA-konsentrasjon er representert i ng/μL. Bokstaver indikerer signifikante forskjeller i DNA-konsentrasjoner ved α = 0,05. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metoden reduserer muligheter for godt til godt krysskontaminering ved lasting av høy gjennomstrømningsprøveekstraksjonsplater og tilbyr et mer kontrollert middel for å laste 96-brønnplater utover eksisterende platelastestrategier9,,10. Kontaminering mellom brønner kan være mer gjennomgripende i 96-brønns plateavsug enn i enkeltrørsekstraksjoner, spesielt nårautomatiserte 6,,7, og, men ikke spesifikt testet i noen metodikk, kan risikoen for krysskontaminering antas høyest når brønnene på ekstraksjonsplatene er åpne for varigheten av platelasting. Gitt den økte muligheten for krysskontaminering i platebaserte ekstraksjoner sammenlignet med enkeltrørsekstraksjoner, bør beskyttelse av brønner med sterilt deksel betraktes som et viktig første skritt i å laste prøver inn i en 96-brønnsplate. Til tross for dette behovet, instruksjoner gitt i høy gjennomstrømning ekstraksjon kits bare si å laste platen og å "unngå krysskontaminering mellom prøvebrønner," men ikke gi noen ytterligere informasjon om hvordan du gjør det10. For å redusere kontaminering samtidig som du legger til prøver på en 96-brønns ekstraksjonsplate, foreslår McPherson et al.9 å dekke platen med kuttede strimler av PCR-tetningstape, og peeling dem tilbake for å få tilgang til hver brønn. Denne metoden reduserer den totale tiden alle brønner er åpne, men brønnene er åpne for ulike mengder tid, og noen av brønnene som er mest utsatt for forurensning – de nærmeste prøven som lastes – eksponeres under lastehendelsen. I tillegg har peeling av PCR-tetningstape potensial til å skape statisk elektrisitet som resulterer i at jord overføres fra brønn til brønn og kan være ansvarlig for de høyere DNA-konsentrasjonene i tomme brønner observert i utvinningen vår. Videre krever denne metodikken at prøver overføres over avdekkede brønner før de plasseres i valgbrønnen, og ingenting hindrer en forsker i å laste to prøver inn i en enkelt brønn (dobbel lasting) eller blande opp plasseringen av to eller flere prøver. Hvis fanget, dobbel lasting utgjør ikke noe mer enn sløsing med ressurser. Hvis imidlertid en dobbel lasting eller blanding av prøvesteder går ubemerket hen, kan eksperimentelle resultater bli forvrengt7.
Metoden vi skisserte ovenfor gir et kontrollert middel for å laste DNA-ekstraksjonsplater med høy gjennomstrømning. Spesielt reduserer vår metode risikoen for krysskontaminering ved å holde brønner dekket til enhver tid. Brønnene dekkes i utgangspunktet av tetningstape og holdes deretter dekket av PCR-røret som brukes til prøvelasting. Ikke bare reduserer denne metoden risikoen for krysskontaminering, men det forhindrer også helt risikoen for å laste to prøver inn i en enkelt brønn. Når vi laster en prøve inn i en brønn, fungerer PCR-røret som en blokk, og forhindrer tilsetning av en annen prøve. Ved å merke alle rørene med plateplassering (f.eks. A1, A2... H11, H12) før du laster prøver, gir denne metoden også en endelig kontroll for å sikre at alle prøver er lastet og ingen brønner har blitt savnet. Selv om denne metoden gir et mer kontrollert middel for å laste brønner, bør alle som laster en plate være ekstra forsiktig når de passerer et kuttet PCR-rør over platen. Selv om brønnene er forseglet, kan eventuelle prøvepartikler som faller på overflaten av den forseglede platen finne veien inn i utilsiktede brønner når teknikeren pierces filmen for å laste de riktige prøvene inn i disse brønnene. For å unngå dette problemet vi vipp 96-brønnsplaten til ~ 40 ° før punktering av tetningstapen med PCR-røret. Denne tilnærmingen bidrar til å holde den åpne enden av røret oppreist og borte fra feil brønner.
Når jordprøver er av svært små mengder og / eller ekstremt finkornet, kan bruk av en bred-bore pipette tips i stedet for å laste jordprøver i PCR-rør være mer effektive i overføring av hver prøve. For denne endringen bør den første bufferløsningen legges til prøverøret og deretter både prøven og løsningen pipettert inn i 96-brønnsplaten. Legge til en PCR tube til hver brønn etter dette trinnet vil hindre dobbel-lasting. Som nevnt i protokolldelen, når du bruker denne endringen, bør forskeren eller teknikeren være veldig klar over svevestøv organisk materiale eller små steinfragmenter, da disse har potensial til å tette pipettens boring.
Selv om ingen metode for prøvelasting helt kan eliminere risikoen for prøveforurensning, gir metoden vi skisserer ovenfor et middel for å redusere disse risikoene betydelig og helt eliminere risikoen for dobbel lasting og blanding av prøvesteder. Samlet sett mener vi at denne metoden er en stor forbedring på eksisterende teknikker for lasting av DNA-ekstraksjonsplater med høy gjennomstrømning og foreslår at alle mikrobiologer som bruker høy gjennomstrømningsutvinningsplater, beveger seg til å bruke en metode som den som er skissert ovenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne rapporterer ingen interessekonflikter og har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av Microbial Ecology Collaborative med finansiering fra NSF award #EPS-1655726.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 oz WhirlPak | Nasco | B01065 | |
| 2 mL centrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 200 µL micro-PCR tubes | Thermo Scientific | AB 2000 | |
| 96-well PowerSoil DNA extraction kit | Qiagen | 12955-4 | We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work. |
| Ice block for 2 mL centrifuge tubes | Any | Any | Any ice block made for 2 mL tubes will work |
| Ice block for 200 µL micro-PCR tubes | Any | Any | Any ice block made for 200 µL tubes will work |
| Micro scoopula | Any | Any | |
| Precut Pierceable Sealing Film | Excel Scientific | XPS25 | |
| Spatula | Any | Any | |
| Surgical scissors | Any | Any |
References
- Thompson, L. R., et al. A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity. Nature. 551 (7681), 457-463 (2017).
- Davis, A., et al. Improved yield and accuracy for DNA extraction in microbiome studies with variation in microbial biomass. BioTechniques. 66 (6), 285-289 (2019).
- Marotz, C., et al. Triplicate PCR reactions for 16S rRNA gene amplicon sequencing are unnecessary. BioTechniques. 67 (1), 29-32 (2019).
- Romdhane, S., et al. Cover crop management practices rather than composition of cover crop mixtures affect bacterial communities in no-till agroecosystems. Frontiers in Microbiology. 10, 1618 (2019).
- Rochefort, A., et al. Influence of environment and host plant genotype on the structure and diversity of the Brassica napus seed microbiota. Phytobiomes Journal. 3 (4), 326-336 (2019).
- Minich, J. J., et al. Quantifying and understanding well-to-well contamination in microbiome research. mSystems. 4 (4), 00186 (2019).
- Walker, A. W. A lot on your plate? Well-to-well contamination as an additional confounder in microbiome sequence analyses. mSystems. 4 (4), 00362 (2019).
- Eisenhofer, R., et al. Contamination in low microbial biomass microbiome studies: issues and recommendations. Trends in Microbiology. 27 (2), 105-117 (2019).
- McPherson, M. R., et al. Isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass Experiments. Journal of Visualized Experiments. (137), e57932 (2018).
- Qiagen, D. N., et al. easy PowerSoil HTP 96 Kit Handbook. , Hilden, Germany. (2019).
