Métodos modificados para carregamento de placas de extração de DNA de alto rendimento reduzem o potencial de contaminação
Summary
Os métodos atuais de carregamento de placas de 96 poços para extrações de DNA podem ser propensos à contaminação. Detalhamos um novo método para carregar placas de 96 poços que reduz o risco de contaminação cruzada entre os poços. Nosso método ajudará outros pesquisadores a capitalizar a eficiência das técnicas de extração de DNA de alto rendimento e minimizar o risco de contaminação.
Abstract
Técnicas de sequenciamento de DNA de alto rendimento contribuíram substancialmente para avanços na nossa compreensão das relações entre comunidades microbianas, características de hospedagem e funções ecossistêmicas mais amplas. Com esse rápido aumento na amplitude e profundidade das capacidades de sequenciamento vieram métodos para extrair, amplificar, analisar e interpretar o DNA ambiental com sucesso com a máxima eficiência. Infelizmente, a realização de extrações de DNA rapidamente pode vir ao custo de aumentar o risco de contaminação entre as amostras. Em particular, extrações de alto rendimento que são baseadas em amostras contidas em uma placa de 96 poços oferecem um método relativamente rápido, em comparação com extrações de tubo único, mas também aumentam as oportunidades de contaminação cruzada bem-para-bem. Para minimizar o risco de contaminação cruzada entre as amostras, mantendo os benefícios das técnicas de extração de alto rendimento, desenvolvemos um novo método para carregar amostras ambientais em placas de 96 poços. Usamos filmes de vedação PCR perfurantes para cobrir cada placa enquanto carregamos amostras e adicionamos amostras primeiro aos tubos PCR antes de movê-las para poços; juntas, essas práticas reduzem o risco de deriva amostral e carregamento duplo não intencional de poços. O método descrito neste artigo fornece aos pesquisadores uma abordagem para maximizar as técnicas disponíveis de extração de alto rendimento, reduzindo o risco de contaminação cruzada inerente a placas de 96 poços. Fornecemos um esboço detalhado passo a passo de como passar da coleta de amostras para a extração de DNA, minimizando o risco de contaminação cruzada indesejada.
Introduction
Os recentes avanços no sequenciamento de alto rendimento das comunidades microbianas estão fornecendo profundidade de sequenciamento sem precedentes e, consequentemente, um vislumbre não precedente do funcionamento e da diversidade do microbioma da Terra1. À medida que a capacidade de multiplex mais e mais amostras em uma única pista de sequenciamento aumenta, a extração de DNA de um único tubo tem o potencial de se tornar um passo limitante na geração de dados ecológicos. No entanto, novos métodos em extrações de DNA de alto rendimento prometem processar grandes quantidades de amostras ambientais com maior eficiência do que já foi possívelanteriormente 2. Esses métodos geralmente envolvem o uso de placas de 96 poços em vez de tubos únicos, aumentando assim o possível número de extrações que podem ocorrer simultaneamente. Assim, a praticidade e eficiência dos métodos de extração de alto rendimento são evidentes e foram implementadas para o processamento de amostras ambientais que vão desde o solo3,,4 e tecidos vegetais3,,5 até a matéria fecal humana2.
Embora esses métodos possam acelerar drasticamente ao longo do processamento de amostras e extração de DNA, a etapa inicial de carregar o solo e outras amostras ecológicas em placas de 96 poços é suscetível à contaminação de amostras cruzadas. Esse tipo de contaminação bem-a-poço pode ocorrer durante as extrações de DNA6,,7,,8, e os poços são particularmente vulneráveis nesta primeira etapa antes que as amostras sejam suspensas em uma solução tampão. McPherson et al.9 demonstram um método para carregar solos de rizosfera em placas de 96 poços usando funis e tampas de tiras PCR de 8 poços, mas embora seu método seja uma abordagem mais controlada para carregar placas, ainda fornece ampla oportunidade para contaminação de poços vizinhos ao carregar cada amostra. Além disso, os poços abertos permitem a chance de um pesquisador distraído colocar uma amostra no poço incorreto ou adicionar uma amostra em um poço que já foi carregado. Além disso, uma variedade de tipos de amostra se mostram inadequados para o carregamento com este método; amostras molhadas muitas vezes grudam nos funis e amostras secas ‘saltam’ entre poços devido à eletricidade estática.
Para reduzir as oportunidades de contaminação entre os poços na primeira etapa de extrações de DNA de alto rendimento, desenvolvemos uma nova abordagem para carregar amostras de solo em placas de 96 poços. Nossos métodos protegem os poços da exposição ambiental e nos impedem de carregar acidentalmente várias amostras em um poço (carregamento duplo). Acreditamos que o método relatado abaixo oferece a promessa de reduzir o potencial de contaminação e, como tal, fornece um meio mais controlado para carregar placas de 96 poços para extração subsequente de DNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este método reduz as oportunidades de contaminação cruzada bem–a-bem ao carregar placas de extração de amostras de alto rendimento e oferece um meio mais controlado para carregar placas de 96 poços além das estratégias de carregamento de placas existentes9,,10. A contaminação entre poços pode ser mais difundida em extrações de placas de 96 poços do que em extrações de tubo único, especialmente quando automatizada6,,<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pela Microbial Ecology Collaborative com financiamento do prêmio NSF #EPS-1655726.
Materials
| 18 oz WhirlPak | Nasco | B01065 | |
| 2 mL centrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 200 µL micro-PCR tubes | Thermo Scientific | AB 2000 | |
| 96-well PowerSoil DNA extraction kit | Qiagen | 12955-4 | We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work. |
| Ice block for 2 mL centrifuge tubes | Any | Any | Any ice block made for 2 mL tubes will work |
| Ice block for 200 µL micro-PCR tubes | Any | Any | Any ice block made for 200 µL tubes will work |
| Micro scoopula | Any | Any | |
| Precut Pierceable Sealing Film | Excel Scientific | XPS25 | |
| Spatula | Any | Any | |
| Surgical scissors | Any | Any |
References
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