Identificação, Isolamento e Caracterização de Progenitores Fibro-Adipogênicos (FAPs) e Progenitores Miogênicos (MPs) em Músculo Esquelético no Rato
Summary
Este protocolo descreve um método para isolar progenitores fibro-adipogênicos (FAPs) e progenitores miogênicos (MPs) do músculo esquelético de rato. A utilização do rato em modelos de lesão muscular proporciona maior disponibilidade tecidual do músculo atroférico para a análise e um repertório maior de métodos validados para avaliar a força muscular e a marcha em animais em movimento livre.
Abstract
Progenitores fibro-adipogênicos (FAPs) são células intersticiciais residentes no músculo esquelético que, juntamente com progenitores miogênicos (MPs), desempenham um papel fundamental na homeostase muscular, lesão e reparo. Os protocolos atuais para identificação e isolamento de FAPs utilizam citometria/fluorescência ativada de triagem celular (FACS) e estudos que avaliam sua função in vivo até o momento foram realizados exclusivamente em camundongos. O maior tamanho inerente do rato permite uma análise mais abrangente das FAPs em modelos de lesão muscular esquelética, especialmente em músculos severamente atroféricos ou quando os pesquisadores requerem massa tecidual substancial para realizar múltiplos ensaios a jusante. O rato também fornece uma seleção maior de ensaios funcionais musculares que não requerem sedação ou sacrifício animal, minimizando assim a morbidade e o uso animal, permitindo avaliações seriais. Os protocolos de citometria/FACS de fluxo otimizados para camundongos são espécies específicas, notadamente restritas pelas características dos anticorpos disponíveis comercialmente. Eles não foram otimizados para separar FAPs de músculos ratos ou altamente fibrosos. Desenvolveu-se um protocolo de citometria/FACS de fluxo para identificação e isolamento de FAPs e MPs de músculo esquelético de rato saudável e denervado, contando com a expressão diferencial dos marcadores de superfície CD31, CD45, Sca-1 e VCAM-1. Como os anticorpos primários específicos do fluxo, validados pela citometria de fluxo, são severamente limitados, a conjugação interna do anticorpo que tem como alvo o Sca-1 foi realizada. Por meio deste protocolo, foi confirmada a conjugação Sca-1 bem sucedida, e a identificação citométrica de fluxo de FAPs e MPs foi validada pela cultura celular e imunossaturação de FAPs e MPs isolados pelo FACS. Finalmente, relatamos um novo curso de tempo faps em um modelo prolongado (14 semanas) de denervação de ratos. Este método fornece aos pesquisadores a capacidade de estudar FAPs em um novo modelo animal.
Introduction
As células progenitoras fibro-adipogênicas (FAPs) são uma população de células progenitoras multipotentes residentes no músculo esquelético que desempenham um papel crítico na homeostase muscular, reparação e regeneração, e, por outro lado, também mediam respostas patológicas à lesão muscular. Como o nome sugere, as FAPs foram originalmente identificadas como uma população progenitora com potencial para diferenciar-se em fibroblastos e adipócitos1 e foram supostamente os principais mediadores da infiltração fibro-gordurosa do músculo esquelético em lesões crônicas e doenças. Estudo suplementar revelou que as FAPs são adicionalmente capazes de osteogênese e condrogênese2,3,4. Assim, são mais amplamente notados na literatura como progenitores mesenquimais ou estrogonais3,5,6,7,8. Em lesão muscular esquelética aguda, os FAPs ajudam indiretamente na miogênese regenerativa, proliferando transitoriamente para fornecer um ambiente favorável para células de satélite musculares ativadas e seus progenitores miogênicos a jusante (MPs)contrapartes 1,9,10. Paralelamente à regeneração bem sucedida, os FAPs passam por apoptose, devolvendo seus números aos níveis de linha de base1,9,10,11. Em contraste, na lesão muscular crônica, as FAPs substituem sinais pró-apoptóticos, o que resulta em sua persistência9,10,11 e reparação muscular anormal.
Estudos in vivo que avaliam os mecanismos celulares e moleculares pelos quais as FAPs mediam as respostas musculares utilizaram modelos de animais murinos até o momento1,7,9,10,11,12,13,14. Embora camundongos geneticamente modificados sejam ferramentas poderosas para uso nessas análises, o pequeno tamanho do animal limita a disponibilidade de tecidos para estudo em modelos localizados de lesão a longo prazo onde a atrofia muscular pode ser profunda, como a denervação traumática. Além disso, a medição da força muscular e da função física requer medidas ex vivo ou in situ que requerem a terminação do camundongo, ou métodos in vivo que requerem cirurgia e/ou um anestésico geral para permitir a avaliação do desempenho contratil muscular15,16,17,18,19,20 . Em ratos, existem análises funcionais musculares bem validadas e utilizadas globalmente, além de análises para comportamentos motores mais complexos, como análise de marcha (por exemplo, Índice de Função Ciática, Análise de CatWalk) e são realizadas em animais acordados e em movimentos espontaneamente21,22,23,24 . Isso otimiza, ainda, os princípios de morbidade mínima na experimentação animal e o número de animais de pesquisa utilizados. O rato fornece ao pesquisador das FAPs a flexibilidade adicional de maior volume muscular ferido para análises proteicas e celulares e a capacidade de realizar avaliações seriais de atividades e comportamentos funcionais complexos musculares e dinâmicos, no animal de alerta.
As FAPs foram principalmente identificadas e isoladas de amostras musculares inteiras usando citometria de fluxo e triagem celular ativada por Fluorescência (FACS), respectivamente. Estes são ensaios baseados em laser que são capazes de identificar múltiplas populações celulares específicas com base em características características como tamanho, granularidade e uma combinação específica de superfície celular ou marcadores intracelulares25. Isso é altamente vantajoso no estudo de um sistema de órgãos como o músculo esquelético, pois a homeostase e a regeneração são processos complexos e multifatoriais coordenados por uma infinidade de tipos celulares. Estudo seminal identificou FAPs, bem como MPs, utilizando métodos citométricos de fluxo no músculo esquelético do camundongo1. Eles demonstraram que os FAPs são mesenquimais na natureza, por falta de antígenos superficiais específicos para células de origens endoteliais (CD31), hematopoiéticas (CD45), ou miogênicas (Integrin-α7 [ITGA7]), mas expressaram o marcador de células-tronco mesenquimal Sca-1 (antígeno de células-tronco 1)1 e diferenciado em células fibrogênicas e adipogênicas na cultura. Outros estudos demonstraram o isolamento bem-sucedido de progenitores mesenquimais em músculos com base na expressão de um marcador de células-tronco alternativo, o receptor de fator de crescimento alfa derivado de plaquetas (PDGFRα)2,7,8 e análises posteriores revelaram que estes provavelmente são a mesma população celular que as FAPs3. Os FAPs são agora comumente identificados na citometria de fluxo usando sca-1 ou PDGFRα como um marcador de seleção positivo1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31 . O uso de PDGFRα é preferencial para o tecido humano, no entanto, como um homólogo humano direto do Murine Sca-1 ainda não foi identificado32. Além disso, outras proteínas de superfície celular têm sido relatadas como marcadores de MPs (por exemplo, VCAM-1), fornecendo uma alternativa potencial ao ITGA7 como um indicador de células de linhagem miogênica durante o isolamentofaps 33.
Enquanto a citometria de fluxo/FACS é uma metodologia poderosa para estudar o papel e o potencial patogênico das FAPs no músculo esquelético1,9,10,11,13,29, é limitada tecnicamente pela especificidade e otimização de seus reagentes necessários. Uma vez que a identificação citométrica do fluxo e o isolamento das FAPs tem sido desenvolvido e conduzido nos modelos de animais de camundongos1,9,10,11,29, isso coloca desafios para os pesquisadores que desejam estudar FAPs em outros organismos modelo. Muitos fatores – como o tamanho ideal do tecido a ser processado, bem como a especificidade e disponibilidade de reagentes e/ou anticorpos – diferem dependendo das espécies utilizadas.
Além das barreiras técnicas para estudar FAPs em um novo modelo animal, eles têm sido em grande parte estudados em um ambiente agudo e tóxico – geralmente através de injeção química intramuscular ou cardiotoxina. A avaliação da dinâmica de longo prazo dos FAPs limita-se principalmente à avaliação na distrofia muscular de Duchenne, utilizando o modelo de camundongo mdx9,10,11, e modelos de lesão muscular combinada, como ruptura maciça do manguito rotador, onde a transposição e denervação do tendão simultâneo é realizada na musculatura do ombro26,27,28 . A resposta dos FAPs ao único insulto da denervação traumática crônica, ocorrência comum em acidentes de trabalho na indústria pesada, agricultura e em traumas de nascimento (lesão por plexo braquial)34,35,36,37 com morbidade significativa, não tem sido tão bem caracterizada, muitas vezes limitada a um período de curto prazo11,38.
Descrevemos um método para identificar e isolar FAPs e MPs de músculo esquelético severamente atroférico e fibroso no rato. Primeiro, a identificação de MPs CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- FAPs e CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ utilizando um protocolo de coloração de digestão e citometria de fluxo de tecido é demonstrada e a validação subsequente de nossos achados é realizada através da cultura e coloração imunocitológica de células isoladas do FACS. Usando este método, também relatamos um novo curso de tempo faps em um modelo de lesão de denervação isolada de longo prazo no rato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um protocolo de isolamento otimizado e validado de FAPs para músculos de ratos é essencial para pesquisadores que desejam estudar modelos de lesões que não são viáveis no camundongo por razões biológicas ou técnicas. Por exemplo, os camundongos não são um modelo animal ideal para estudar lesões crônicas locais ou neurodegenerativas, como a denervação a longo prazo. Biologicamente, a vida útil curta e o envelhecimento rápido dos camundongos dificultam o delineamento preciso do músculo sequalae devido à …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer às Instalações do Núcleo de Citometria de Fluxo da Universidade de Ottawa e do Keenan Research Centre for Biomedical Sciences (KRC), St Michaels Hospital Unity Health Toronto por sua expertise e orientação na otimização do protocolo de citometria de fluxo/FACS apresentado neste manuscrito. Este trabalho foi financiado pela Medicine by Design New Ideas 2018 Fund (MbDNI-2018-01) para jb.
Materials
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 10 cm cell culture dishes | Sarstedt | 83.3902 | |
| 12-well cell culture plate | ThermoFisher | 130185 | |
| 12 mm glass coverslips, No.2 | VWR | 89015-724 | |
| 10 mL Syringe | Beckton Dickenson | 302995 | |
| 15 mL centrifuge tubes | FroggaBio | 91014 | |
| 20 gauge needle | Beckton Dickenson | 305176 | |
| 25mL Serological pipette | Sarstedt | 86.1685.001 | |
| 40µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 50mL centrifuge tubes | FroggaBio | TB50 | |
| AbC Total Antibody Compensation Beads | ThermoFisher | A10497 | |
| Ammonium Chloride, Reagent Grade | Bioshop | AMC303.500 | |
| APC Conjugation Kit, 50-100µg | Biotium | 92307 | |
| Aquatex Aqueous Mounting Medium | Merck | 108562 | |
| Biolaminin 411 LN | Biolamina | LN411 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Bioshop | ALB001 | |
| Calcium Chloride | Bioshop | CCL444.500 | |
| Collagenase Type II | Gibco | 17101015 | |
| CountBright Plus Absolute Counting Beads | ThermoFisher | C36995 | |
| Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902 | |
| Dispase | Gibco | 17105041 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Gibco | 11995-065 | (+)4.5 g/L D-Glucose (+)L-Glutamine (+)110 mg/L Sodium Pyruvate |
| EDTA | FisherScientific | S311 | |
| FACSClean Solution | Beckton Dickenson | 340345 | |
| FACSDiva Software | Beckton Dickenson | — | |
| FACSRinse Solution | Beckton Dickenson | 340346 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F1051 | |
| Flow Cytometry Sheath Fluid | Beckton Dickenson | 342003 | |
| FlowJo Software | Beckton Dickenson | — | |
| Fluorescent Mounting Medium | Dako | S302380-2 | |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody | Invitrogen | A21424 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A11008 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody | Invitrogen | A21429 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210-064 | |
| Ham's F10 Media | ThermoFisher | 11550043 | (+) Phenol Red (+) L-Glutamine (-) HEPES |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X) | Multicell | 311-513-CL | |
| Heat Inactivated Horse Serum | Gibco | 26050-088 | |
| Hemocytometer | Reichert | N/A | |
| HEPES, minimum 99.5% titration | Sigma | H3375 | |
| Horse Serum | ThermoFisher | 16050130 | |
| Human Transforming Growth Factor β1 (hTGF-β1) | Cell Signaling | 8915LF | |
| Humulin R | Lilly | HI0210 | |
| IBMX | Millipore Sigma | I5879 | Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine |
| Isopropanol | Sigma | I9516 | Also known as 2-propanol |
| Lewis Rat, Female | Charles River Kingston | 004 (Strain Code) | 200-250 grams used |
| LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer | Beckton Dickenson | — | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | EP-5417R | |
| MoFlo XDP Cell Sorter | Beckman Coulter | — | |
| Mouse Anti-CD31::FITC Antibody | Abcam | ab33858 | Clone TLD-3A12 |
| Mouse Anti-CD45::FITC Antibody | Biolegend | 202205 | Clone OX-1 |
| Mouse Anti-CD106::PE Antibody | Biolegend | 200403 | Also known as VCAM-1 |
| Mouse Anti-MHC Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | N/A | Also known as MF20 |
| Mouse Anti-Pax7 Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | N/A | |
| Neutral Buffered Formalin, 10 % | Sigma | HT501128 | |
| Oil Red O | Millipore Sigma | O0625 | |
| PE-Cy7 Conjugation Kit | Abcam | ab102903 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X) | Gibco | 10010-023 | (-)Calcium Chloride (-)Magnesium Chloride |
| Potassium Bicarbonate, Reagent Grade | Bioshop | PBC401.250 | |
| Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody | Invitrogen | MA5-32347 | FSP-1 also known as S100A4 |
| Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody | Abcam | ab203254 | |
| Rabbit Anti-Laminin Antibody | Sigma | L9393 | |
| Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody | Abcam | ab3526 | |
| Rabbit Anti-Sca-1 Antibody | Millipore Sigma | AB4336 | |
| Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody | Abcam | ab260043 | Also known as Col1a1 |
| Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody | Abcam | ab203491 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Gibco | PHG0266 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Troglitazone | Millipore Sigma | T2573 | |
| Tween-20 | Bioshop | TWN510 |
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