Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Sıçandaki İskelet Kasında Fibro-Adipojenik Progenitörlerin (FAP' ler) ve Miyojenik Progenitörlerin (Milletvekilleri) Tanımlanması, İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Published: June 9, 2021 doi: 10.3791/61750
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2
1Keenan Research Center for Biomedical Science, St Michaels Hospital, Unity Health Toronto, 2Department of Medicine and Interdepartmental Division of Critical Care Medicine, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

Bu protokol, Fibro-adipojenik progenitörleri (FAP'ler) ve miyojenik progenitörleri (milletvekilleri) sıçan iskelet kasından izole etmek için bir yöntemi özetlemektedir. Sıçanın kas yaralanması modellerinde kullanılması, analiz için atrofik kastan doku mevcudiyetinin artmasını ve serbest hareket eden hayvanlarda kas gücünü ve yürüyüşlerini değerlendirmek için doğrulanmış yöntemlerden oluşan daha büyük bir repertuar sağlar.

Abstract

Fibro-adipojenik Progenitors (FAP'lar), miyojenik progenitörler (milletvekilleri) ile birlikte kas homeostazında, yaralanmada ve onarımda önemli bir rol oynayan iskelet kasında yerleşik interstisyel hücrelerdir. SSS tanımlama ve izolasyon kullanım akış sitometrisi/floresan-aktif hücre sıralama (FACS) için mevcut protokoller ve bugüne kadar in vivo işlevlerini değerlendiren çalışmalar sadece farelerde yapılmıştır. Sıçanın daha büyük doğal boyutu, iskelet kası yaralanma modellerinde, özellikle ciddi atrofik kaslarda veya araştırmacılar birden fazla aşağı akış testi yapmak için önemli doku kütlesine ihtiyaç duyarsa, FAP'lerin daha kapsamlı bir analizini sağlar. Sıçan ayrıca hayvan sedasyonu veya fedakârlık gerektirmeyen daha geniş bir kas fonksiyonel tahlil seçimi sağlar, böylece seri değerlendirmeleri etkinleştirerek morbidite ve hayvan kullanımını en aza indirir. Fareler için optimize edilen akış sitometrisi / FACS protokolleri, özellikle piyasada bulunan antikorların özellikleri ile sınırlı olan türlere özgüdür. SSS'leri sıçan veya yüksek fibrotik kastan ayırmak için optimize edilmediler. CD31, CD45, Sca-1 ve VCAM-1 yüzey belirteçlerinin diferansiyel ekspresyonlarına dayanarak, HEM sağlıklı hem de denervatlı sıçan iskelet kasından FAP'lerin ve milletvekillerinin tanımlanması ve izolasyonu için bir akış sitometrisi / FACS protokolü geliştirilmiştir. Sıçana özgü, akış sitometrisi doğrulanmış primer antikorlar ciddi şekilde sınırlı olduğundan, Sca-1'i hedefleyen antikorun şirket içi konjugasyonu yapıldı. Bu protokol kullanılarak, başarılı Sca-1 konjugasyonu onaylandı ve FAP'lerin ve milletvekillerinin akış sitometrik tanımlaması hücre kültürü ve FACS izole EDILMIŞ SSP'lerin ve milletvekillerinin immünostainasyonu ile doğrulandı. Son olarak, uzun süreli (14 haftalık) bir sıçan denervasyon modelinde yeni bir FAP zaman kursu bildiriyoruz. Bu yöntem, araştırmacılara yeni bir hayvan modelinde SSS inceleme olanağı sağlar.

Introduction

Fibro-adipojenik progenitör hücreler (FAP'ler), iskelet kasında kas homeostazında, onarımında ve yenilenmesinde kritik rol oynayan ve tersine kas yaralanmasına patolojik yanıtlara aracılık eden yerleşik çok güçlü progenitör hücrelerin bir popülasyonudur. Adından da anlaşılacağı gibi, FAP'ler başlangıçta fibroblastlara ve adipositlere1'e farklılaşma potansiyeline sahip bir ata popülasyonu olarak tanımlandı ve kronik yaralanma ve hastalıkta iskelet kasının fibro-yağlı infiltrasyonunun anahtar arabulucuları olduğu iddia edildi. Daha fazla çalışma, FAP'lerin ek olarak osteogenez ve kondrogenez2,3,4. Bu nedenle, literatürde mezenkimal veya stromal progenitors 3 ,5,6,7,8olarak daha geniş bir şekilde not edilirler. Akut iskelet kası yaralanmasında, FAP'lar, aktif kas uydu hücreleri ve aşağı akış miyojenik progenitörleri (milletvekilleri) meslektaşları1,9,10için elverişli bir ortam sağlamak için geçici olarak çoğalarak rejeneratif miyogenezde dolaylı olarak yardımcı olur. Başarılı rejenerasyona paralel olarak, FAP'lar apoptoz geçirir ve sayılarını temel düzey 1 ,9,10,11'e döndürür. Buna karşılık, kronik kas yaralanmasında, FAP'ler pro-apoptotik sinyalleri geçersiz kılar, bu dakalıcılıkları 9,10,11 ve anormal kas onarımı ile sonuçlanır.

FAP'lerin kas yanıtlarına aracılık ettiği hücresel ve moleküler mekanizmaları değerlendiren in vivo çalışmalar bugüne kadar 1,7 , 9 ,10,11,12,13,14. Genetik olarak tasarlanmış fareler bu analizlerde kullanılmak üzere güçlü araçlar olsa da, hayvanın küçük boyutu, travmatik denervasyon gibi kas atrofisinin derin olabileceği uzun süreli lokalize yaralanma modellerinde çalışmak için doku kullanılabilirliğini sınırlar. Ayrıca, kas gücü ve fiziksel fonksiyon ölçümü, farenin sonlandırılmasını gerektiren ex vivo veya yerinde ölçümler veya kas kontrtilyon performansının değerlendirilmesine izin vermek için cerrahi ve / veya genel anestezi gerektiren in vivo yöntemler gerektirir15,16,17,18,19,20 . Sıçanlarda, iyi doğrulanmış ve küresel olarak kullanılan kas fonksiyonel analizleri, yürüyüş analizi (örneğin, Siyatik Fonksiyon İndeksi, CatWalk analizi) gibi daha karmaşık motor davranışları için analizlere ek olarak mevcuttur ve uyanık ve kendiliğinden hareket eden hayvanlarda 21 ,22,23,24 . Bu ayrıca hayvan deneylerinde minimum morbidite ilkelerini ve kullanılan araştırma hayvanlarının sayısını optimize eder. Sıçan böylece FAP araştırmacısına protein ve hücresel analizler için daha fazla yaralı kas hacminin ek esnekliğini ve uyarı hayvanında kas kompleksi statik ve dinamik fonksiyonel aktivite ve davranışların seri değerlendirmelerini yapma yeteneğini sağlar.

SSS'ler öncelikle akış sitometrisi ve Floresan ile aktive hücre sıralama (FACS) kullanılarak tüm kas örneklerinden tanımlanmış ve izole edilmiştir. Bunlar, boyut, parçalılık ve hücre yüzeyi veya hücre içi belirteçlerin belirli bir kombinasyonu gibi karakteristik özelliklere göre birden fazla spesifik hücre popülasyonu tanımlayabilen lazer tabanlı tahlillerdir25. Homeostaz ve rejenerasyon çok sayıda hücre tipi tarafından koordine edilen karmaşık, çok yönlü süreçler olduğu için iskelet kası gibi bir organ sisteminin çalışmasında bu oldukça avantajlıdır. Ufuk açıcı bir çalışma, fare iskelet kasında akış sitometrik yöntemlerini kullanarak FAP'ların yanı sıra milletvekillerini tanımladı1. FAP'lerin doğada mezenkimal olduğunu gösterdiler. endotel (CD31), hematopoetik (CD45) veya miyojenik (Integrin-α7 [ITGA7]) kökenlerinden hücrelere özgü yüzey antijenlerinden yoksun oldukları için, ancak mezenkimal kök hücre işaretleyicisi Sca-1 (Kök hücre antijeni 1)1'i ifade ettiler ve kültürde fibrojenik ve adipojenik hücrelere farklılaştılar. Diğer çalışmalar, alternatif bir kök hücre belirteci, trombosit türevi büyüme faktörü reseptörü alfa (PDGFRα)2,7,8 ve daha fazla analiz ifadesine dayanarak kastaki mezenkimal progenitörlerin başarılı bir şekilde izole edildiğini göstermiştir. SP'ler artık akış sitometrisinde Sca-1 veya PDGFRα pozitif seçim işaretçisi 1 , 9,10,11,12,13,14,26, 27,28,29,30,31kullanılaraktanımlanır. . PDGFRα kullanımı insan dokusu için tercih edilir, ancak murine Sca-1'in doğrudan bir insan homologu henüz tanımlanmıştır32. Ek olarak, diğer hücre yüzey proteinleri milletvekillerinin belirteçleri olarak bildirilmiştir (örneğin, VCAM-1), SSS izolasyonu sırasında miyojenik soy hücrelerinin bir göstergesi olarak ITGA7'ye potansiyel bir alternatif sağlar33.

Akış sitometrisi/FACS iskelet kası 1 , 9 , 10,11 ,13,29'dakiFAP'lerin rolünü ve patojenik potansiyelini incelemek için güçlü bir metodoloji olsa da, teknik olarak gerekli reaktiflerinin özgüllüğü ve optimizasyonu ile sınırlıdır. Akış sitometrik tanımlaması ve SSP'lerin izolasyonu fare hayvan modelleri 1 , 9,10,11,29'da geliştirildiği ve yürütüldüğünden, bu diğer model organizmalarda SP'leri incelemek isteyen araştırmacılar için zorluklar doğurur. İşlenecek optimal doku büyüklüğü, reaktif ve/veya antikor özgüllüğü ve kullanılabilirliği gibi birçok faktör kullanılan türlere bağlı olarak farklılık gösterir.

Yeni bir hayvan modelinde SSS'lerin incelenmesinin önündeki teknik engellere ek olarak, genellikle kas içi kimyasal enjeksiyon veya kardiyotoksin yoluyla akut, toksik bir ortamda çalışılmıştır. FAP'lerin uzun vadeli dinamiklerinin değerlendirilmesi öncelikle Duchenne'in kas distrofisinde, mdx fare modeli9, 10,11kullanılarak ve omuz kas yapısında eşzamanlı tendon transeksiyonu ve denervasyonun yapıldığı masif rotator manşet yırtığı gibi kombinasyon kas yaralanması modelleri ile sınırlıdır26,27,28 . FAP'lerin, ağır sanayi, tarım ve doğum travmalarında (brakial pleksus yaralanması)34, 35,36,37'de önemli morbidite ile iş yeri kazalarında sık görülen kronik travmatik denervasyonun tek hakaretine yanıtı, genellikle kısa süreli bir zaman dilimi11,38ile sınırlı olarak karakterize edilmiştir.

Sıçandaki sağlıklı ve ciddi atrofik ve fibrotik iskelet kasından FAP'ları ve milletvekillerini tanımlamak ve izole etmek için bir yöntem tarif ediyoruz. İlk olarak, doku sindirimi ve akış sitometrisi boyama protokolü kullanılarak CD31-/CD45-/VCAM-1- SCAP'ler ve CD31-/CD45-/Sca-1-1+ milletvekillerinin tanımlanması ve daha sonra bulgularımızın doğrulanması, FACS izole edilmiş hücrelerin kültür ve immünositokimyasal lekeleme yoluyla gerçekleştirilir. Bu yöntemi kullanarak, sıçanda uzun süreli izole denervasyon yaralanması modelinde yeni bir FAP zaman kursu da bildiriyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu protokolü yürüten müfettişler yerel hayvan etik kurulu/bakım komitesinden izin almalıdır. Tüm hayvan çalışmaları St. Michael's Hospital Unity Health Toronto Hayvan Bakım Komitesi (ACC #918) tarafından onaylandı ve Kanada Hayvan Bakımı Konseyi (CCAC) tarafından belirlenen yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi. Akış sitometrisi iletişim kuralının şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Aşağı akış uygulaması FACS ve sonraki hücre kültürü ise, tüm adımlar uygun aseptik teknikle tamamlanmalıdır.

1. Kas hasadı

  1. Sıçanları lokal vivarium ve hayvan etik kurulu yönergelerine göre uygun bir anestezi ve fedakarlık kullanarak uyuşturmak. Bu protokol, gastrocnemius kasını örnek olarak yetişkin dişi Lewis sıçanlarından (200-250 g) toplar. Sıçanlar% 2-3 Isoflurane kullanılarak uyuşturuldu ve T61 intrakardiyak enjeksiyonu ile kurban edildi.
  2. Hayvan kurban edildikten sonra, kasın yerini kolaylaştırmak ve hasat edilen dokunun kürk kirlenmesini en aza indirmek için tüm arkalığı tıraş edin.
  3. Steril bir neşter kullanarak, ciltte iki kesi yapın: birincisi ayak bileği ekleminin çevresi etrafında ve ikincisi ayak bileğinden kalçaya kadar arkalığın medial yönünün orta çizgisinin yukarısı.
  4. Femurun medial ve lateral kondyleslarından ve Aşil Tendonu'ndaki kesici uçlardan kaynaklanan alttaki gastrocnemius'u ortaya çıkarmak için cildi ve yüzeysel kas katmanlarını soyun.
  5. Gastrocnemius'ı çevre dokudan ayırmak için künt diseksiyon kullanın, kası sadece tendon tarafından ele alarak ezilme yaralanmasını önler.
  6. Aşil Tendonunu keskin makasla mümkün olduğunca distal olarak transeksiyon ederek gastrocnemius'u yerleştirilmesinden ayırın. Kesildikten sonra, aşil tendonunu asalarla kavrayın ve gastrocnemius'ı alttaki kemikten hafifçe soyun. Hala bir elindeps ile kas tutarak, gastrocnemius'un iki kökenleri bulun ve medial ve lateral femoral kondyles kesilmiş.
  7. Eksize gastrocnemius'u mümkün olduğunca fazla kan çıkarmak için steril bir gazlı bez parçasına karşı hafifçe lekelendir. Kası steril bir yüzeyde kırpın ve aşil tendonu kadar fazla bağ dokusunu da çıkarın.
  8. Kasları bir tartım teknesine yerleştirin ve hassas bir terazi kullanarak tartın. Bu protokol, 200-600 mg arasında değişen ıslak ağırlıkla kası sindirmek için optimize edilmiştir. Operatörler, istenirse, diğer aşağı akış tahlilleri için fazla hasat edilen dokuyu alt bölümlere katabilir.
  9. Akış sitometrisi için kullanılacak hasat edilen kası 3-4 küçük parçaya (yaklaşık 1-2 cm3)hafifçe bölün ve buz gibi 1x PBS'ye batırın. Tüm numuneler hasat edilene kadar buzda soğuk tutun.

2. Kas sindirimi

  1. PBS'den kasları çıkarın ve steril 10 cm hücre kültürü kabına yerleştirin. Parçalar yaklaşık 3-4mm3 olana kadar toparlama ile dokuyu hafifçe yırtın ve kıyın, mümkün olduğunca çok bağ dokusu çıkarın. İyice kıyıldıktan sonra, 6 mL DMEM + % 1 penisilin/ streptomisiin (P/ S) içeren steril 50 mL konik tüpe aktarın.
  2. Kollajenaz enzimini etkinleştirmek için 365 μL Kollajenaz II çözeltisine (stok konsantrasyonu 4800 U/mL) 10 μL 300 mM CaCl2 çözeltisi ekleyin. Aktif kollajenaz II çözeltisini doku bulamacı içeren 50 mL konik tüpe ekleyin. Son Kollajenaz II konsantrasyonu 250 U/mL'dir.
  3. Tüpleri 37 °C, 240 x g'da1 saat boyunca bir çalkalayıcıda kuluçkalayın, tüpün yanına yapışmış herhangi bir dokuyu yerinden çıkarmak için her 15 dakikada bir manuel olarak döndürdüyün.
  4. 1 saat sonra, tüpleri çalkalayıcıdan çıkarın ve numune başına aşağıdakileri ekleyin: 100 μL Kollajenaz II (4.800 U/mL) ve 50 μL Dispaz (4,8 U/mL).
  5. Çözelti homojen olana kadar 15-20 kez serolojik pipet kullanarak pipet örnekleri. Birden fazla numune işliyorsanız, numune çapraz kontaminasyonlarını önlemek için her numune için ayrı bir steril pipet kullanın.
  6. 37 °C ve 240 x g'da 30 dakika boyunca bir çalkalayıcıda tekrar kuluçkaya yatır. 15 dakika sonra, tüp tarafındaki yapışan dokuyu yerinden çıkarmak için örnekleri elle çalkalayın.

3. Tek hücreli süspansiyon üretimi

  1. Örnekleri 10 döngü boyunca 20 G iğne ile 10 mL şırıngadan yavaşça yamum.
    NOT: Bir döngü, kas çözeltisini şırındağa almayı ve tüpe geri enjekte etmeyi içerir. Aşırı köpürme ek hücre ölümüne neden olabileceğinden, kesmeyi yavaşça tamamlayarak kabarcıkları en aza indirdiğinizden emin olun39.
  2. Steril 50 mL konik bir tüpe 40 μm hücre süzgeci yerleştirin ve 5 mL DMEM + % 10 FBS ve% 1 P / S pipetleme ile ıslatın.
  3. Pipet Hücre süzgecinden bir seferde numunenin 1 mL'si.
  4. Tüpteki toplam hacmi 25 mL'ye çıkarmak için DMEM'i %10 FBS ve %1 P/S ile süzgeçten geçirerek hücre süzgecini yıkayın.
  5. Numunenin 25 mL'lik kısmını eşit olarak iki adet 15 mL konik tüpe ve 15 °C'de santrifüje bölün, 15 dakika boyunca 400 x g.
    NOT: Kas çözeltisinin iki adet 15 mL konik tüpe bölünmesi, santrifüjlemeden sonra tek bir tüpe kıyasla daha iyi hücre iyileşmesi sağlar.
  6. Eritrositleri ortadan kaldırmak için peletin 1 mL 1x RBC Lizis tamponunda (ek dosyayabakın) 7 dakika boyunca oda sıcaklığında aspire edin ve peletin yeniden askıya alın.
  7. 9 mL yıkama tamponu (bkz. Ek Dosya)ve 400 x g,15 °C'de 15 °C'de 15 ° C'de spin tüpleri ile hacmi 10 mL'ye getirin.
  8. 1 mL yıkama tamponunda yeniden askıya alarak süpernatantı emiş ve peletleri yeniden bire katın.
  9. Uygun miktarda hücreyi ayrı bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve trippan mavi boya ile karıştırın. Hemositometre kullanarak canlı hücreleri hafif bir mikroskopta sayın.

4. Akış sitometrisi için antikor boyama

NOT: Sca-1 antikor, üreticinin talimatlarına göre akış sitometrisi/FACS deneylerinden önce APC'ye konjuge edilmelidir. Her konjuge grubu için performans doğrulanmalıdır (Şekil 2). Son konjugasyonlar -20 °C'de 20 μL aliquots içinde saklanabilir ve üç hafta boyunca stabildir. Tam konjugasyon protokolü için Tamamlayıcı Dosya'ya bakın.

  1. Akış sitometrisi için, deneysel numune başına 1-2 x10 6 hücreyi steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Yıkama tamponu ile hacmi 1 mL'ye kadar getirin ve buza yerleştirin.
  2. Her deneme için aşağıdaki gerekli kontrolleri ayarlayın: i) canlı hücre popülasyonu için doğru bir şekilde seçmek üzere onaylanmamış ve ii) uygulanabilirlik kontrolleri; iii) CD31-/CD45 kesirleri, FAP'lar ve milletvekilleri için doğru kapılar ayarlamak için tek hücreli süspansiyonlarda floresan eksi bir (FMO) kontrolleri; ve iv) kanallar arasındaki floresan dökülmesini düzeltmek için tek lekeli kompanzasyon boncukları.
    1. Tüm hücre kontrolleri için, aliquot 5 x 105 - 1 x10 6 hücreli 1 mL yıkama tamponunda 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde ve buza yerleştirin.
    2. Boncuk kontrolleri için, etiketli her 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne1 damla pozitif kompanzasyon boncuk (damla başına ~1,5 x 10 5 boncuk) ekleyin. Denetimlerin tam tamamlayıcısı Tablo 1'de listelenmiştir.
      NOT: Deney ilk kez yapılıyorsa, hücrelerdeki pozitif lekeli popülasyonu değerlendirmek ve kompanzasyon boncuklarında gözlenen lekelenmeyi doğrulamak için tek hücreli süspansiyonlarda (lekelenmemiş, uygulanabilirlik, tek lekeli kompanzasyon boncuk ve FMO kontrollerine ek olarak) her konjuge antikor için tek lekeli kontroller çalıştırın. Kompanzasyon boncukları ve tek hücreli süspansiyonlar üzerinde tek boyama yaparak her yeni eşlenmiş Sca-1::APC hazırlığını doğrulayın. Boyama denetimlerinin tam listesi için Tablo 1'e bakın.
  3. Canlılık kontrolünü hazırlamak için, hücre hacminin yarısını "uygulanabilirlik" tüpünden yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bu tüpü "Ölü" olarak etiketle.
  4. Hücreleri öldürmek için 65 °C'de "Ölü" tüpü 2-3 dakika kuluçkaya yatırın, sonra buza yerleştirin. 2-3 dakika sonra, ölü hücreleri canlılık kontrol tüpünde kalan canlı hücrelerle yeniden birleştirin. Bu hücre popülasyonu, telafi değerlerini (gerekirse) ayarlamak ve canlılık boyası için kapıları düzgün bir şekilde ayarlamak için kullanılacaktır.
  5. Tek hücreli süspansiyonları (deneysel numuneler ve kontroller) 5 dakika boyunca 500 x g, 4 °C'de santrifüj edin.
  6. 100 μL yıkama tamponunda süpernatantı aspire edin ve hücre peletlerini yeniden askıya alın.
  7. Deneysel örneğe veya kontrole bağlı olarak antikor ekleyin. Antikor kombinasyonları ve miktarları hakkında bilgi için boyama matrisine (Tablo 2)bakın.
  8. Tam karıştırma sağlamak için her numuneyi hafifçe kaydırın ve karanlıkta 15 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yaslayın. Telafi boncukları için, 15 dakika boyunca karanlıkta oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
  9. Tek hücreli süspansiyon deneysel ve kontrol numuneleri için, 900 μL yıkama tamponu ekleyerek hacmi 1 mL'ye getirin. Kompanzasyon boncuk kontrolleri için, 900 μL 1x PBS ile hacmi 1 mL'ye getirin.
  10. 5 dakika boyunca 500 x g,4 °C'de santrifüj tek hücreli süspansiyon örnekleri. Santrifüj kompanzasyon boncuk kontrolleri 300 x g, 4 °C 5 dakika.
  11. Tüm tek hücreli süspansiyon örnekleri için, 300 μL yıkama tamponunda süpernatantı aspire edin ve atın ve hücre peletlerini yeniden askıya alın. Kompanzasyon boncuk kontrolleri için, süpernatantı aspire edin ve atın, peleti 1x PBS'nin 300 μL'sinde yeniden askıya alın, ardından 1 damla (~1,5 x10 5)negatif kompanzasyon boncuk ekleyin.
  12. Tüm tek hücreli süspansiyon örneklerini alüminyum folyo altında buz üzerinde tutun ve simetrik alım akışına devam edin. Kompanzasyon boncuk kontrolleri de ışıktan korunmalıdır, ancak oda sıcaklığında tutulabilir.
    NOT: Deneysel uç nokta akış sitometrisine göre FAP tanımlaması ise, lütfen 5.1.1-5.1.11 adımlarını izleyin. Uç nokta kültür ve boyama için FACS aracılığıyla hücre yalıtımı ise, lütfen 5.2.1-5.2.9 ve bölüm 6-7 adımlarını izleyin.

5. Akış sitometrisi ve floresanla aktive edilmiş hücre sıralama (FACS)

  1. Akış sitometrisi
    NOT: Bu protokol, aynı anda 10 farklı rengi ayırt edebilen 405 nm, 488 nm ve 640 nm lazerlerle donatılmış bir tezgah üstü akış sitometresi istihdam eder. Bandpass filtreleri ve bu protokolde kullanılan ilişkili florokromlar aşağıdaki gibidir: 450/50 (SYTOX Blue), 530/30 (FITC), 575/25 (PE) ve 670/30 (APC). Her dedektör için voltajlar aşağıdaki gibidir: FSC 700; SSC 475; FITC 360; PE 460; PE-Cy7 600; SYTOX Mavi 360; APC 570. Kullanmadan önce akış sitometresinin veya hücre sıralayıcısının düzgün çalışması konusunda eğitildiklerinden emin olun.
    1. Sitometrenin kullanımdan önce 10-20 dakika açık olduğundan ve her biri 30-45 sn için temiz, durulama ve kılıfa sıvı çözeltileri ile sırayla temizlenerek astarlanmış olduğundan emin olun. dH2O ile durulama ile bitirin.
    2. Faps ve milletvekillerini Şekil 3 'te belirtildiği gibi tanımlamak için gating stratejisini ayarlayın.
      NOT: SSC-A vs FSC-A (hücreleri ayırmak için ileri hücre saçılma alanına karşı ileri hücre dağılım alanı vs enkaz), ii) FSC-W vs FSC-H (ileri hücre ssc-H) FSC parametresinde singlet'ları çiftlerden ayırmak için ileri hücre dağılım yüksekliğine karşı dağılım genişliği), iii) SSC-W vs SSC-H (SSC parametresinde singlet'ları çiftlerden ayırmak için yan hücre dağılım genişliğine karşı yan hücre dağılım yüksekliği), iv) SSC-A vs SYTOX Blue (canlı ile ölü singlet'ları ayırt etmek için), v) SSC-A vs CD31/45::FITC (CD31+ ve CD45+ hücrelerini daha fazla analizden dışlamak için) ve vi) Sca-1::APC vs VCAM-1::P E CD31-/CD45- (Hat; Lin-) nüfusu (SSS ve milletvekillerinin tanımlanması). SP'ler CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- olayları ve milletvekilleri CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ olayları olarak tanımlanır.
    3. İlk olarak, kanallar arasındaki floresan dökülmesini düzeltmek için kullanılan kompanzasyon değerlerini oluşturmak için her bir tek lekeli kompanzasyon boncuk kontrolünü düşük hızda sitometreden geçirin. Her kontrolün floresan sinyalini kendi dedektöründe (örneğin, Sca-1 için SSC-A vs APC::APC tek lekeli boncuklar) ve diğer tüm dedektörleri karşılaştırarak telafiyi değerlendirin. Uygun dedektörde iki farklı popülasyon (biri negatif ve biri pozitif sinyalli) ve diğer tüm dedektörlerde sadece negatif bir popülasyon olmalıdır. Durdurma kapısını 10.000 tazminat boncuk olayına ayarlayın ve verileri kaydedin.
      NOT: Her numunenin alınması arasında, numuneden numuneye kirlenmeyi önlemek için dH2O'nun sitometreden 10-20 saniye boyunca çalıştırdığından emin olun.
    4. Daha sonra, canlı tek hücrelere düzgün bir şekilde kapı vermek için lekesiz ve canlılık kontrol örneklerini işleyin. Durdurma kapısını 10.000 singlet olaya ayarlayın ve verileri kaydedin.
      NOT: Her bir hücre süspansiyon örneğinin elde edilmeden yaklaşık 5 dakika önce, lekesiz numune hariç, her numuneye 1 μL SYTOX Mavi canlılık boyası (1 mM stok çözeltisinden seyreltilmiş 300 μM çalışma konsantrasyonu) ekleyin ve karıştırmak için hafifçe hareket ettirin (son konsantrasyon 1 μM).
    5. Ardından kalan tek hücreli süspansiyon kontrol örneklerini alın. Her FDO kontrolünü gating stratejisinde uygun çizimi ile değerlendirin (Şekil 3). Örneğin, cd31+CD45 FMO'nun FITC sinyalini değerlendirerek doğru bir CD31-/CD45 kapısı sağlayın. Şekil 3G'de en uygun örnek gösterilmiştir. Protokol ilk kez gerçekleştiriliyorsa, FDO denetimleri alınmadan önce hücreler üzerinde tek lekeli denetimler çalıştırılmalıdır.
    6. Uygun telafiyi doğrulamak için her bir tek lekeli hücre örneğinin floresan sinyalini uygun dedektöründe ve diğer tüm dedektörlerde değerlendirin. Durdurma kapısını 10.000 canlı singlet olayına ayarlayın ve yazılıma kaydedin.
    7. Tüm kontroller (tek hücreli süspansiyonlar ve boncuklar) işlendikten sonra, önce her numunenin hacmini ölçerek ve kaydederek tüm deneysel örnekleri hazırlayın. Bu ölçümler, adım 5.1.11'de açıklandığı gibi, SSP'leri ve milletvekillerini doğru bir şekilde ölçmek için kullanılacaktır. Ardından, 50 μL hassas sayım boncukları ekleyin ve 2-3 kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak hafifçe karıştırın.
    8. Sayım boncuk popülasyonunun tanımlanmasını doğrulamak için ilk deneysel örneği kısaca çalıştırın. Bu popülasyon, FSC-A vs SSC-A çiziminde(Şekil 3A, kırmızı kutu) genel hücre popülasyonundan ayrı küçük bir ayrı küme olarak görünür. Sayım boncuk popülasyonu etrafında bir kapı oluşturun. Daha sonra düşük hızda sitometreden işleyerek her deneysel örnek için veri elde edin. Durdurma kapısını 10.000 boncuk olayı ve kayıt olarak ayarlayın.
      NOT: Araştırmacılar alternatif olarak, sayım boncukları tüm dedektörlerde floresan olduğundan, SSC-A'yı dedektörlerden herhangi birine karşı değerlendiren ek bir arsa kurarak sayım boncuklarını tanımlayabilirler.
    9. Tüm numuneler işlendikten sonra, uygun protokolleri kullanarak sitometreyi temizleyin. Analiz için tüm verileri dışarı aktar.
    10. Tüm veri dosyalarını uygun bir akış sitometri analiz yazılımında açın. Gating stratejisini, adım 5.1.2'de açıklandığı gibi veri toplama için kullanıldığı şekilde ayarlayın. Gating stratejisini yeniden doğrulamak için denetimleri veri toplamadakiyle (örneğin, lekesiz, uygulanabilirlik, tek leke, ardından FMO denetimleri) aynı sırada inceleyin. FDO kontrolleri kullanılarak doğru kapılar ayarlandıktan sonra, kapıları tüm deneysel örneklere uygulayın. Ham verileri nicelleştirme için elektronik tablo olarak dışa aktarma.
    11. Sayım boncuklarını kullanarak her deneysel örnekteki SSS ve milletvekili sayısını hesaplayın:
      Equation 1
      burada, Edinilmiş Hücre Sayısı, satın alma yazılımında ilgili hücre popülasyonunun (örneğin, SSP'ler veya milletvekilleri) kaydedilen olay sayısıdır; Edinilen Boncuk Sayısı, satın alma yazılımında boncuk sayma kaydedilmiş olayların sayısıdır; Boncukların Sayısı Birimi, adım 5.1.7'de eklenen sayım boncuk çözeltisinin hacmidir; Örnek Hacim, sayım boncuklarının eklenmesinden önce her lekeli deneysel numunenin hacmidir.; Boncuk Konsantrasyonu, μL çözeltisi başına boncuk sayısıdır; bu değer ürün veri sayfası üzerinde bulunur.
  2. FACS - hücre kültürü için sıralama
    NOT: Bu protokol, aynı anda 11-14 rengi ayırt edebilen 4 lazer (UV, Menekşe, Mavi, Kırmızı) ile donatılmış bir hücre sıralayıcısı üzerinde FACS gerçekleştirir. FACS iş akışını optimize etmek için aşağıda tanımlanmış 1 ile 3 arası adımlar dışında deneysel örnek boyama (bölüm 4) ve akış sitometrisi protokolünü izleyin:
    1. FAP'ların ve milletvekillerinin sağlam verimlerini oluşturmak için 7 x 106 hücre/mL'ye sıralanacak deneysel numunelerdeki hücrelerin konsantrasyonu artırın.
    2. Hücre konsantrasyonundaki bu önemli artışı hesaba katmak için, sıralanacak deneysel örneklerdeki tüm antikor konsantrasyonlarını iki katına çıkarın.
    3. Hücre topaklanmasını azaltmak ve sıralama verimini artırmak için sıralamadan hemen önce 5 mL polistiren tüpe yapıştırılmış 40 μM hücre süzgeç kapağından son lekeli hücre örneklerini işleyin.
    4. Tek, canlı sıçan FAP'larını ve milletvekillerini doğrudan hücre sıralayıcısından 1 mL steril, %100 Fetal Sığır Serumu (FBS) içeren 5 mL polipropilen toplama tüpüne toplayın. Sıralama tamamlanana kadar hücreleri buzda tutun.
      NOT: FACS'leri saha dışında bir yerde yapıyorsanız, sıralanmış tüm hücreleri buz üzerinde ve güvenli, kapalı bir kapta aktarın.
    5. Steril bir biyogüvenlik kabininde (BSC) çalışarak, uygun büyüme ortamı (örneğin, sıralanmış FAP'lar için FAP büyüme ortamı (FAP GM) ve sıralanmış milletvekilleri için MP büyüme ortamı (MP GM) ile 7 mL'ye kadar sıralanmış hücrelerin hacmini getirin; tarifler için Ek Dosya'ya bakın) ve mümkün olduğunca fazla artık yıkama tamponu çıkarmak için 500 x g, 4 ° C'de santrifüj.
    6. Peletleri 1 mL uygun büyüme ortamına ve plakaya steril, kollajen kaplı 12 mm cam kapaklı/ kuyu içeren 12 kuyulu bir plakaya yeniden koyun (bkz. bölüm 6).
      NOT: Kollajen için immünositot entrika lekeleme ise, plaka hücreleri kollajen kaplı yerine steril, laminin kaplı 12 mm cam kapaklı / kuyu içeren 12 kuyu plakasına sıraladı. Hemen izole edilmiş progenitörlerin immünositör deneyleri gerekiyorsa, cm2 başına 15.000 hücre yoğunluğunda tohum SSS'leri ve milletvekilleri ve doğrudan 6.1 adımına geçin. Uzun vadeli kültürlerin progenitör farklılaşmasına neden olduğu için, cm2başına 5.000 hücre yoğunluğunda tohum SSS'leri ve cm başına 7.500 hücre yoğunluğunda milletvekilleri2.
    7. Hücre kültürü inkübatöründe 37 °C ve%5 CO 2'de hücreleri kuluçkaya yatır. Kültürde 72 saat sonra, medyanın yarısını değiştirin. Her 2-4 d'dan sonra medyayı tamamen değiştirin.
    8. Miyosit gelişimini teşvik etmek için, milletvekilleri kültürlerini kültürün 9. Adipozitleri teşvik etmek için, kültürün 10.
    9. Fibrogenez indük etmek için, FAP'ler kültür sırasında değişken zamanlarda fibrojenik farklılaşma (FD) ortamına geçebilir veya alternatif olarak, yalıtımdan sonra doğrudan FD ortamına tohumlanabilir (adım 5.2.6) (Tüm medya tarifleri için Ek Dosya'ya bakın).

6. Kültürlü SSS ve milletvekillerinin immünosikokimyası

  1. Hücre sıralamasını doğrulamak ve SSP'lerin ve milletvekilleri kültürlerinin saflığını göstermek için PDGFRα (FAP belirteç), Pax-7 (kas sapı [uydu] hücre işaretçisi), Fibroblast'a özgü protein (FSP-1, fibroblast belirteci), Perilipin-1 (Plin-1, adiposit belirteci), Kollajen tip 1 (Col1a1, fibrozis göstergesi), Miyosin Ağır Zinciri (MHC, olgun miyosit belirteci).
    1. Yeni sıralanmış hücrelerin immünostaining için, hücrelerin kapak kılıfı / kuyuya yapışmasını kolaylaştırmak için oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 200 x g'da 12 kuyu plakasını santrifüj edin. Bu adım uzun vadeli kültürler için gerekli değildir. Kültür medyasını kaldırın.
    2. FSP-1 ile immünostaining için, 4 °C'de 2 dakika boyunca 1 mL% 100 metanol (MeOH) ile hücreleri sabitle. PDGFRα, Plin-1, Pax7 veya Col1a1 için immünostaining ise, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 1x PBS'de 1 mL% 4 PFA ile hücre kültürlerini düzeltin. MHC immünostaining her iki fiksatif tolere eder.
      NOT: Metanol sabitli hücreler için, 6.2 adımlarını atlayın ve 6.3.
  2. %4 PFA'yı epire edin ve hücre kültürlerini 1x PBS ile 3-4 kez hızla yıkayın. 1x PBS'de 1 mL 100 mM Glisin ekleyin ve artık PFA'yı devre dışı bırakmak için oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. 1x PBS ile 1-2 kez aspire edin ve yıkayın.
    NOT: Hücreler bu aşamada 2 mL 1x PBS'de bırakılabilir, streç filme sarılabilir ve maksimum 7-10 gün boyunca 4 °C'de saklanabilir.
  3. Yıkadıktan sonra, 1x PBS'de% 0.1 Triton-X'in 1 mL'sini ekleyin ve hücre zarlarını permeabilize etmek için 20 dakika kuluçkaya yatırın.
  4. Kuyuları 1x PBS'nin 1-2 mL'si ile 2-3 kez yıkayın, ardından oda sıcaklığında 1 saat boyunca kuyu başına 1 mL 1x PBS +% 3 BSA ile hücreleri engelleyin.
  5. Pipet 80 μL primer antikor 1x PBS + %3 BSA (PDGFRα 1:100, Pax7 temiz, FSP-1 1:50, Plin-1 1:400, Col1a1 1:250, MHC 3 μg/mL) mobil konteynere bantlanmış bir parafilm parçasına. Steril ince forseps kullanarak, kapak sapını dikkatlice kuyudan kaldırın ve antikor çözeltisinin damlasına ters çevirin. Antikor çözeltisinin buharlaşmasını önlemek için kapak kapağını iki ıslak kağıt havlu ve kapak kabı ile plastik film içinde kuluçkalayın. 4 °C'de gece boyunca kuluçkaya yaslanın.
    NOT: Kuyunun içindeki lekeleme kapakları, kuyunun içindeki lekelemeden daha az antikor (~80 μL) kullanır (minimum 500 μL).
  6. 2. günde, kapakları ısınmak için oda sıcaklığında 30 dakika bekletin. Forsepsleri dikkatlice doğru kullanmak ve kapakları kendi kuyularına (yukarı bakan hücreler) geri aktarın ve mümkün olduğunca fazla birincil antikoru çıkarmak için her biri 2 dakika boyunca 1-2 mL 1x PBS ile 2-3 kez yıkayın.
  7. Birincil antikor boyama ile aynı boyama tekniğini kullanarak, MHC veya Pax-7'yi tespit etmek için FSP-1, Plin-1, Col1a1 veya PDGFRα ve keçi anti-fare Alexa Fluor 555 ikincil antikoru (1:300) tespit etmek için keçi anti-tavşan Alexa Fluor 488 ikincil antikor (1:400) ile leke hücreleri. Hücreleri oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın ve hücreleri ışıktan koruyun.
  8. Hücreleri kuyuya geri döndürün ve oda sıcaklığında 2-4 dakika boyunca Hoechst (1:10.000) ile hücreleri kuluçkaya yatırın. Fazla Hoechst'i çıkarmak için her biri 2 dakika boyunca 1x PBS ile hücreleri 2-3 kez daha yıkayın.
  9. Kapakları solmaya karşı floresan montaj ortamı kullanarak cam slaytlara monte edin ve slaytları oda sıcaklığında karanlıkta bir gecede kurumaya bırakın. Monte edilmiş kapakları karanlıkta 4 °C'de saklayın.

7. Kültürlü FAP'ların ve milletvekillerinin Yağ Kırmızısı O (ORO) lekesi

  1. Hücre zarının permeabilizasyonu adipojenik olmayan hücre tiplerinin spesifik olmayan/istenmeyen lekelenmesine neden olabileceğinden, permeabilize olmayan hücreler üzerinde ORO boyama gerçekleştirin. Boyamaya başlamadan önce, bir ORO çalışma stoğu hazırlayın (tarif için Ek Dosyaya Bakın) ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın.
  2. 20 dakika sonra, çözülmemiş agregaları çıkarmak için çözeltiyi 0,2 μm filtre kullanarak filtreleyin.
  3. Medyayı iyiden epire edin ve %10 Nötr Arabelleğe Alınmış Formalin'in (%10 NBF) 1 mL'sini ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatır.
    NOT: Hücre konflüjisi kuyudan/kapaklardan kaldırılmasına neden olabilir. Çözümleri aspirasyon yaparken/eklerken dikkatli olun.
  4. 1 mL taze %10 NBF'yi epire edin ve ekleyin ve oda sıcaklığında en az 1 saat kuluçkaya yatırın.
    NOT: Hücreler bir gecede %10 NBF'de bırakılabildiği için protokol bu noktada durdurulabilir.
  5. Kuyuları bir kez 1 mL% 60 izopropanol ile yıkayın, ardından aspire edin ve kuyuların tamamen kurumasını bekleyin (yaklaşık 2 dk).
  6. Kuyu başına 400 μL Yağ Kırmızı O çalışma stoğu ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırarak plakanın duvarlarında herhangi bir ORO borulamayı önlediğinizden emin olun.
  7. Tüm Oil Red O'nun tamamını çıkarın ve kuyuyu dH 2 O ile4kez hızlı bir şekilde yıkayın.
    NOT: Lekeli kuyular kapak kılıfı içeriyorsa, adım 6.9'da açıklandığı gibi aynı tekniği kullanarak monte edin.
  8. Görüntü ya monte kapaklar ya da parlak alan mikroskobu kullanarak lekeli kuyu.

8. Kontralateral ve denervated sıçan gastrocnemius bölümlerinin doku lekesi

  1. Picrosirius Kırmızı (PSR)
    1. Daha önceaçıklandığıgibi 5 μm kalınlığında, formalin sabit parafin gömülü (FFPE) sıçan gastrocnemius histolojik bölümlerde PSR boyama gerçekleştirin.
  2. Yağ Kırmızı O (ORO)
    1. 5 μm kalınlığında izopentan donmuş sıçan gastroknemius histolojik bölümlerini 10 dakika boyunca% 4 PFA'da sabitleyin, 1 dakika boyunca% 60 izopropil alkolde kuluçkaya yatır.
    2. 12 dakika boyunca ORO çalışma stoğu ile leke. % 60 izopropil alkolde 1 dakika kuluçkaya yaslanın, dH2O'da 10 dakika yıkayın.
  3. Sca-1 ve laminin doku floresan immünhistokimya (IHC)
    1. 5 μm kalınlığında izopentan donmuş sıçan gastroknemius histolojik kesitlerinde floresan IHC gerçekleştirin.
    2. Örnekleri 1x PBS'de 5 dakika boyunca nemlendirin, 10 dakika boyunca% 4 PFA'da sabitlenin, ardından 90 dakika boyunca doku IF blokaj çözeltisinde örnekleri kuluçkaya yatırın (ek dosyayabakın).
    3. Bir gecede 4 °C'de 1x PBS + %0,05 Ara ile seyreltilmiş anti-Sca-1 primer antikor (1:500) ile kuluçkaya yaslanın.
    4. 2. Günde, her biri 5 dakika boyunca 1x PBS +% 0.05 Ara üç kez yıkayın, ardından keçi anti-tavşan Alexa Fluor 555'te (1:500) 1 saat kuluçkaya yatırın.
    5. Tekrar yıkayın (daha önce olduğu gibi), 1 saat boyunca blokaj çözeltisi ile kuluçkaya yatın, ardından 1x PBS + 0.05% Ara 1 saat boyunca seyreltilmiş anti-laminin primer antikoru (1:500) ekleyin.
    6. Tekrar yıkayın (daha önce olduğu gibi), daha sonra keçi anti-tavşan Alexa Fluor 488'de (1:500) 1 saat (laminin için) kuluçkaya yatın.
    7. Tekrar yıkayın (daha önce olduğu gibi) ardından 4 dakika boyunca DAPI'da (1:10.000) kuluçkaya yatırın. Solmaya karşı montaj ortamı kullanarak kapak örtülerini yıkayın ve monte edin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sca-1 ve VCAM-1 dahil olmak üzere yeni bir antikor paneli kullanarak akış sitometrisi yoluyla FAP'ları ve milletvekillerini tanımlama
Sıçan kasındaKI FAP'ları tanımlamak için gating stratejisi, CD31 (endotel) ve CD45 (hematopoetik) pozitif hücrelere (soy [Lin] olarak adlandırılan) kapı olan fare29'dakiakış sitometri protokollerine dayanır ve Sca-1 ve milletvekillerinin linage-negatif (Lin-) popülasyonundan ITGA7 işaretleyicisinin floresan profilini inceler. Sıçan Sca-1 ve ITGA7 için ticari olarak mevcut, florofor-konjuge ve akış sitometrisi onaylı antikorların yokluğunda, bir sıçan Sca-1::APC antikoru kendi kendine eşlenerek milletvekillerini tanımlamak için alternatif bir strateji belirledik. VCAM-1'in son zamanlarda33 sıçan milletvekillerinin izolasyonu için etkili bir tek pozitif seçim işareti olduğu ve VCAM-1'i hedefleyen sıçana özgü, konjuge, akış sitometrisi onaylı bir antikor mevcut olduğu için, ITGA7'nin aksine milletvekillerini tanımlamak için VCAM-1'i kullandık.

Sca-1:APC antikorunun başarılı konjugasyonunu ve performansını, sağlıklı sıçan gastrocnemius'tan üretilen kompanzasyon boncuklarının ve hücre süspansiyonlarının tek boyama ile doğruladık (Şekil 2A, B). Optimum konsantrasyonları belirlemek için protokolde kullanılan diğer tüm antikorlara (CD31::FITC, CD45::FITC, VCAM-1:PE) ek olarak Sca-1::APC (Şekil 2C)beşnoktalı titrasyon yapıldı. Bu yeni panel tasarımını kullanarak, putatif SSP'ler ve milletvekilleri aynı anda sağlıklı gastrocnemius'tan(Şekil 3)tanımlanmıştır, böylece Sca-1 (Lin-/Sca-1+/VCAM-1-) için tek pozitif hücreler FAP'ler (kırmızı kutu) ve VCAM-1 (Lin-/Sca-1-/VCAM-1+) için tek pozitif hücreler milletvekilleri (mavi kutu) olarak belirlenmiştir. Ayrıca Sca-1 ve VCAM-1 (Lin-/Sca-1+/VCAM-1+) için çift pozitif hücre popülasyonu belirledik (Şekil 3F; sağ üst kadran).

SSS'lerin ve milletvekillerinin SSS ve hücre kültürü tarafından tanımlanmasının doğrulanması
Sıçan iskelet kasındaKI FAP'ların ve milletvekillerinin akış sitometrik tanımlaması için sunulan protokolü doğrulamak için, canlı hücreleri kültür in vitroiçin izole etmeye çalıştık. FACS kullanılarak, uygulanabilir FAP'ler ve milletvekilleri akış sitometrik analizinde olduğu gibi aynı gating stratejisi kullanılarak izole edildi. 230 g'lık bir sıçandan tek bir gastrocnemius kasından hücre kültürü için yaklaşık 20.000-40.000 FAP ve 30.000-50.000 milletvekili toplandı.

Her popülasyonun saflığını doğrulamak için PDGFRα ve Pax7 için yeni sıralanmış SSCB'leri ve milletvekillerini birlikte bağışıklık sistemine göre sıraladık. PDGFRα, Sca-1'in yanı sıra, 2,7,8FAP'ları tanımlamak için yaygın olarak kullanılan ikinci mezenkimal progenitör belirtecidir. Pax-7, kas uydusu (kök) hücrelerinin iyi tanınan ve yaygın olarak kullanılan bir belirtecidir41. Sıralanmış SSS popülasyonu, PAX7 pozitif hücreleri tarafından kontaminasyon olmadan PDGFRα için pozitif boyama gösterdi(Şekil 4A; üst sıra). Tersine, sıralanmış milletvekili nüfusu PAX7 için PDGFRα pozitif hücrelerinin yokluğuyla pozitif olarak lekelendi (Şekil 4A; alt sıra), Sırasıyla PP'lerin ve milletvekillerinin saf popülasyonlarını izole etmek için Lin-/ Sca-1 + / VCAM-1 - ve Lin- / Sca-1 - / VCAM-1 + hücre yüzey antijen profillerinin yeteneğini doğruladı.

Daha sonra Adipojenik, fibrojenik ve miyojenik farklılaşmayı teşvik etmek için 10-12 günlük bir zaman diliminde SSS'leri ve milletvekillerini sıraladık. 12. güne gelindiğinde, adipojenik koşullara maruz kalan FAP kültürleri, fibroblast benzeri bir morfolojiye veya yağ damlacıklı beyaz pre-adipositlere benzer çok damarlı bir morfolojiye sahip hücreler içeriyordu (veriler gösterilmedi). Fibroblast spesifik protein-1 (FSP-1) için immünostaining fibroblast farklılaşmasını doğrularken, Plin-1 (Perilipin-1; bir adiposit belirteci)42 ve Yağ kırmızısı O için lekelenme sırasıyla adipositlerin farklılığını ve nötr trigliserit ve lipitlerin varlığını doğruladı (Şekil 4B). FAP kültürlerinde miyojenik bir soydan kontamine hücrelerin bulunmaması, farklılaştırılmış miyositlerin bir belirteci olan miyosin ağır zinciri (MHC) için birlikte immünostain ile doğrulandı. Fibrojenik farklılaşmaya (FD) maruz kalan FAP kültürleri, ana FAP'lardan türetilmiş kollajenlerden biri olan Kollajen tip 1 (Col1a1) ekspresyasyonu için değerlendirildi8. 11. Günde Col1a1 ve MHC için birlikte immünostaining, kirletici MHC pozitif hücreleri olmayan sağlam Kollajen tip 1 ekspresyonunun ortaya çıktı (Şekil 4B). SSS nüfusunun saflığının nihai teyidi, herhangi bir kirletici milletvekilinin büyümesini teşvik etmek için miyojenik medyada FAP'ların kült edilmesiyle gerçekleştirildi. MHC pozitif hücre gözlenmedi(Ek Şekil 2A).

Miyojenik koşullara maruz kalan MP kültürleri MHC ekspresyon olgun miyositleri ve çok çekirdekli miyotütleri kaplamadan 12 gün sonra göstermiştir (Şekil 4C). MP kültürlerinin FSP-1 ve Plin-1 ile birlikte immünosit edilmesi, sırasıyla kirletici fibroblastların veya adipositlerin yokluğunu göstermiştir. Benzer şekilde, ORO lekeleme lipit kontaminasyonu göstermedi (Şek. 4C). Fibroblastlar tarafından oldukça ifade edilen Col1a1'in, literatürde bu konuda çelişkili veriler olmasına rağmen miyojenik öncüller ve mioblastlar tarafından daha az üretildiği bildirilmiştir8,43,44. Milletvekillerinin Col1a1 ve MHC ile birlikte immünositasyonu MP kültürümüzün miyosit farklılaşmasına neden olurken, Col1a1 immünosititesi bulgusunun bulunmadığına dair bir kanıt bulunmuştur (Şekil 4C). Nüfusun saflığını daha da doğrulamak için, MP kültürleri adipozitlerin ve fibroblastların büyümesini teşvik etmek için adipojenik veya fibrojenik koşullara maruz kalmıştır (Ek Şekil 2B). SSS soyundan herhangi bir kontamine hücre gözlenmedi.

Sıçan kasından saf SP ve milletvekili popülasyonlarını belirleme ve sıralama yeteneğini göstermiş olsak da, daha sonra Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ (çift pozitif) hücrelerin kimliğini belirlemeye çalıştık. Sca-1 ekspresyonu sağlıklı kas45 ve benzer şekilde az SAYıDA FAP'ta (yaklaşık% 3) çok küçük bir milletvekili oranı (yaklaşık% 3) üzerinde bildirilmiştir. 4%) sağlıklı kas 10 VCAM-1 ifade bildirilmiştir, pdgfrα ve Pax7 için taze sıralanmış Lin-/Sca-1 +/VCAM-1+ hücrelerinin immünostaining myojenik, adipojenik, ve sırasıyla miyogenez, adipogenez ve fibrogenez indükleyen fibrojenik durumlar. Çift pozitif hücrelerin, PDGFRα veya Pax7(Ek Şekil 3A)için pozitif olan ve olgun miyositlere, adipositlere veya fibroblastlara (Ek Şekil 3B,C)farklılaşan kültürlü hücreler ile birlikte karışık bir milletvekili ve FAP popülasyonu olduğubulunmuştur.

ITGA7 vs VCAM-1 akış sitometrik FAP tanımlaması sırasında milletvekillerini tanımlamak için
Sırasıyla Sca-1 ve VCAM-1 kullanan sıçan FAP'ların ve milletvekillerinin akış sitometrik tanımlaması için başarılı bir protokol belirlenirken, farede standart olduğu gibi VCAM-1 yerine milletvekillerini tanımlamak için kendi kendine eşleştirilmiş bir ITGA7 antikorunun benzer şekilde kullanılıp kullanılamayacağını belirlemeye çalıştık. Sıçana özgü bir ITGA7 antikoru PE-Cy7'ye konjuge edildi (bkz. Ek Dosya)ve antikorun performansı, sıçan gastrocnemius'tan üretilen ticari kompanzasyon boncukları ve tek hücreli süspansiyonlar üzerinde doğrulandı(Ek Şekil 4A-C). ITGA7::P E-Cy7 antikoru tek boyama ve FMO deneylerinde yeterli performans gösterdi (Ek Şekil 4D). Bununla birlikte, CD31::FITC, CD45:FITC, Sca-1::APC ve ITGA7::P E-Cy7 ile gastrocnemius hücre süspansiyonlarını tam olarak boyarken, Sca-1::APC ve ITGA7::P E-Cy-7 antikorları arasında bir etkileşim belirginleşti. Her iki FACS'in sonraki kültürü Lin-/Sca-1+/ITGA7- hücrelerini (sözde SSP'ler) ve Lin/Sca-1-/IGTA7+ hücrelerini (sözde milletvekilleri) sıraladı (Ek Şekil 4E) ağırlıklı olarak SCA-1::APC ve ITGA7::P E-Cy-7 antikorları arasındaki etkileşimi gösteren birkaç milletvekili(Ek Şekil 4F)ile hücre tanımlama özgüllüğünü olumsuz yönde etkiledi.

Uzun süreli denervated iskelet kasında yeni bir FAP zaman kursu
FAP dinamikleri kısa süreli travmatik denervasyon bağlamında değerlendirildiği için, murine modellerinde11,38, hem sağlıklı hem de ciddi atrofik, fibrotik kastan SSS izolasyonu için yöntemimizin performansını doğrulamaya çalıştık. Sıçanlar, denervated uzuv ve kontrallateral innervated uzuvdan (iç kontrol görevi görmek için) denervasyon sonrası 14 hafta boyunca dört seri zaman noktasında hasat edilen gastrocnemius kası ile iyi doğrulanmış tek taraflı tibial sinir transeksiyon modeli46 kullanılarak travmatik uzun süreli denervasyon yaralanmasına maruz kaldı. Daha önce bildirildiği gibi, denervated kas progresif atrofi gösterdi (Şekil 5A, B), zamanla artan fibrozis ve yağ birikimi ( Şekil5C-F)ile 47.

Protokolümüz, 12 ve 14 haftalık denervated gastrocnemius yaklaşık 0.2-0.3 g (ilgili kontrallateral kontrol kasının% 15-20'si) ağırlığında olmasına rağmen akış sitometrik analizi için yeterli sayıda hücre üretti (Şekil 5B). Denervated gastrocnemius kasında, deney 14 haftalık süre boyunca tutulan içsel kontralateral kontrol kasına kıyasla FAP'ların yukarı regülasyonunu gözlemledik (Şekil 6A, B), progresif kas fibrozisi ve yağ birikimi ile uyumlu. Kas histolojik kesitlerinin sca-1 immünostainasyonu, sağlıklı kastaki miyofiberler arasındaki interstiyumda taban çizgisi ifadesine ek olarak, Sca-1 ekspresyon hücrelerinin 14 haftalık denervated kasta fibro-yağ değişimi alanlarına lokalizasyonunu doğruladı (Şekil 5G). Sca-1 sinyalinde güçlü bir artış (Sca-1 yüksek; Şekil 6A, kırmızı kutu) akış sitometrik analizinde, FAP'ler bazal Sca-1 ifadesine kıyasla (Sca-1 Med/Düşük; Şekil 6A, yeşil kutu). Bu alt nüfusların nicelleştirilmesi zaman içinde diferansiyel dinamikleri ortaya çıkardı; Sca-1 Yüksek SP'ler, toplam SSS popülasyonunun yaklaşık yarısını oluşturan 12 ve 14 haftalık denervasyon sonrası(Şekil 6B)önemli ölçüde artmıştır (Şekil 6C). Buna karşılık, Sca-1 Med/Low FAP'lar denervasyon sonrası 2 ve 5 haftalık baskın alt nüfustur (Şekil 6C) ve sadece denervasyon sonrası seviyelerde geçici bir artış göstermiştir (Şekil 6B).

Uzun süreli denervatlı kaslarda SSP'lerin sürekli varlığının aksine, milletvekilleri denervasyona beklenen bifazik tepkiyi gösterdiler. Başlangıçta milletvekilleri, kontrol uzuvlarında görülenin üzerindeki denervated kaslarında artış gösterdi, ancak denervasyon sonrası 5 haftada nüfus azalmaya başladı (Şekil 6D). Uzun süreli denervated kas47kas uydu hücre popülasyonunun iyi bilinen tükenmesi ile uyumlu olarak , 12 hafta ile milletvekilleri tibial sinir transeksiyon sonrası taban çizgisi seviyelerinde veya altındaydı.

Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ popülasyonunun dinamiklerini de analiz ettik (Ek Şekil 3D-E). Lin popülasyonuna göre çift pozitif hücre sıklığı zamanla denervated kasta giderek azalırken, mutlak hücre sayısı gram kas başına belirlendiğinde, denervasyon sonrası 14 hafta taban çizgisi seviyelerine veya altına düşmeden önce çift pozitif popülasyonda geçici bir artış gözlendi.

Figure 1
Şekil 1: SSP'lerin ve milletvekillerinin tanımlanması, izolasyonu ve kültürü için grafik şematik: Sıçan gastrocnemius'tan FAP'ları ve milletvekillerinin tanımlamasını gösteren grafik şematik. Numuneler, iki sıralı enzimmatik sindirimden geçmeden önce toplanır ve mekanik olarak kıyılır. Doku preparatları daha sonra tek bir hücre süspansiyonu oluşturmak için işlenir ve filtrelenir. Her numuneye floresan konjuge antikorlardan oluşan bir kokteyl eklenir ve daha sonra SSS'leri ve milletvekillerini tanımlamak veya izole etmek için bir akış sitometresi veya hücre sıralayıcısı aracılığıyla çalıştırılır.

Figure 2
Şekil 2: Sca-1::APC kendi kendine konjuge antikor doğrulama ve titrasyon. Sca-1::APC antikor konjugasyonunun ticari kompanzasyon boncukları (A) ve sağlıklı sıçan gastrocnemius kasından(B)üretilen tek hücreli süspansiyonlar üzerinde tek boyama ile doğrulanması. Hem Sca-1 etiketli boncukların hem de hücrelerin farklı popülasyonları belirgindir (kara kutular). Antikor titrasyonu, tek hücreli süspansiyonlarda (C) beş farklı Sca-1::APC konsantrasyonu test ederek gerçekleştirildi; optimum konsantrasyon, minimum arka plan boyama ile en büyük floresan yoğunluğuna göre seçildi ve toplu bağımlı olarak bulundu. Kırmızı kutu tarafından belirtilen toplu işleme özgü optimum konsantrasyon ile temsili bir titrasyon gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Sıçan gastroknemiusunda FAP'ların ve milletvekillerinin akış sitometrisi tanımlaması. (A-F) FAP'ların ve milletvekillerinin akış sitometrik analizi için gating stratejisi. (A) Örnekler ilk olarak enkazı (kara kutu) dışlamak ve boncukları (kırmızı kutu) saymak için kapıya kapılır. Hücreler daha sonra hem ön dağılım (FSC) (B) hem de yan dağılım (SSC) özellikleri (C) ile çiftleri dışlamak için kapılır. Elde edilen tek hücrelerin canlılığı SYTOX Blue (D)ile boyanarak değerlendirilir. SYTOX Mavi negatif (canlı) singlet'lar daha sonra CD31 ve CD45'i tanımlayan FITC sinyali için değerlendirilir (Soy; Lin) Lin+ fraksiyonlarını daha fazla analizden dışlamak için (kara kutu Lin hücreleri) (E). Lin popülasyonu daha sonra Sca-1::APC ve VCAM-1::P E sinyali (F) için değerlendirilir. FAP'ler Lin-/Sca-1+/VCAM-1- (F; kırmızı kutu), milletvekilleri ise Lin-/Sca-1-/VCAM-1+ olayları (F; mavi kutu) olarak tanımlanır. Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ çift pozitif popülasyon da belirgindir (sağ üst kadran). (G) CD31 için FMO (Floresan Eksi Bir) kontrolleri::FITC ve CD45::FITC, Lin hücreleri için uygun telafi ve gating gösterir. (H-I) Sca-1::APC ve VCAM-1::P E FMO denetimlerinin çizimleri, SSP'ler (Sca-1 FMO) ve milletvekilleri (VCAM-1 FMO) için uygun telafiyi ve gating'i göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Sıralanmış FAP'ler ve milletvekilleri hücre kültürü ve immünostaining. (A) PDGFRα (yeşil) ve Pax7 (kırmızı) için yeni sıralanmış FAP'lar (üst sıra) ve milletvekilleri (alt sıra) üzerinde birlikte immünostaining. Dapi ile çekirdek leke mavisi. FAP'ler yalnızca PDGFRα'yı ifade eder ve Pax7 pozitif hücresi belirgin değildir, milletvekilleri ise Pax7'yi yalnızca PDGFRα pozitif hücre kontaminasyonu olmadan ifade eder ve her iki sıralı popülasyonun saflığını gösterir. (B) Adipojenik farklılaşma medyasında (AD) 12. günde SSP'ler sırasıyla fibroblast spesifik Protein 1 (FSP-1; yeşil) ve Perilipin-1 (Plin-1; yeşil) için pozitiftir ve sırasıyla farklılaşmış fibroblastlar ve adipositler gösterir. Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyanmıştır. Yağ Kırmızı O (ORO) lekeleme (kırmızı), 12. Fibrojen farklılaşma ortamına (FD) maruz kalan FAP'lar, FAP'lardan türetilmiş Kollajen tip 1'in (Col1a1; yeşil) ekspresyonunu gösterir. Adipojenik veya fibrojenik ortamda kültürlenen FAP'ler miyosin ağır zinciri (MHC, kırmızı) için birlikte immünostain yapmaz ve bu da miyositlerin kirlenmediğini gösterir. (C) 12. günde miyojenik farklılaşma medyasında (MD) yetişen milletvekilleri, olgun miyositlerin ve kaynaşmış çok fonksiyonlu miyotütlerin varlığını gösteren MHC pozitif (kırmızı) lekelenmeyi gösterir. Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyanmıştır. MP kültürleri, FSP-1 (yeşil), Plin-1 (yeşil) ve ORO lekeleme için birlikte immünostainingin olmamasından dolayı fibroblast ve adiposit kontaminasyonundan temizlendi. Co1a1 immünostaining'e uyum sağlamak için laminin üzerinde yetişen milletvekilleri, kollajende olduğu gibi 12. Col1a1 (yeşil) MP kültürlerinde yoktur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Atrofi, fibrozis ve uzun süreli denervated kasın yağlı infiltronu. (A) Temsilci, denervasyon sonrası dört seri zaman noktasında gastrocnemius kaslarını hasat etti. Gastrocnemius denoted CONTRA, iki haftalık denervated bir hayvandan alınan temsili bir kontralteral uzuv örneğidir. (B) Denervated (DEN) gastrocnemius ıslak ağırlığının kontrallateral (CONTRA) uzuv oranı olarak ifade edilen kas atrofisi sonrası denervasyonun nicelemesi. (C) Picrosirius Red (PSR) denervasyon sonrası 2 veya 14 hafta hasat edilen gastrocnemius'un histolojik kesitleri ilerleyici fibrozis gösterir. Kas lekeleri sarı, kollajen lekeler kırmızı. (D) Fibrozis, PSR pozitif dokusunun toplam doku alanına göre belirlenmesi ile ölçüldü. (E) Gastrocnemius'un Yağlı Kırmızı O (ORO) lekeli kesitleri, hematoksilin ile karşı lekeli, denervasyon sonrası 2 veya 14 hafta hasat edildi. Lipitler kırmızıya boyanır. (F) Yağ infiltrasyonu, oro lekeli dokunun toplam doku alanına göre belirlenmesi ile ölçülür. (G) Gastrocnemius histolojik kesitler 2 veya 14 haftalık denervasyon sonrası hasat edildi, laminin (yeşil) ve Sca-1 (kırmızı) için immünostainlendi. Laminin, bireysel miyofiberleri çevreleyen bazal laminayı pozitif olarak lekeler. Sca-1 birden çok progenitör hücre tiplerini tanımlar. Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyanmıştır. Inset, sağlıklı kaslarda bazal lamina dışındaki Sca-1+ hücrelerinin lokalizasyonunu gösterir; sarı oklar fibrotik alanlarda Sca-1+ hücrelerinin varlığını gösterir. (Veriler ortalama +/- S.D; 2 ve 14 haftalık zaman noktaları için n=3'tir. B panellerindeki veriler tek yönlü ANOVA tarafından, D ve F panellerindeki veriler iki yönlü ANOVA tarafından analiz edilir. Post-hoc Sidak'ın testi birden fazla karşılaştırma için düzeltildi. * = CONTRA ve DEN arasında P<0.05; # = Örnekler arasında P<0.05) Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Uzun sürelidenervated sıçan gastrocnemius FAP'ler ve milletvekilleri dinamikleri. (A) Temsilci Sca-1::APC VCAM-1::P E panelleri Lin- (CD31-/CD45-) popülasyonunun kas örneklerinden elde edilen 2,5,12 veya 14 haftalık denervasyon sonrası hasat edilir. Üst sıra denervated (DEN) gastrocnemius'tan arsaları gösterirken, alt sıra kontralatör, ameliyat edilmemiş (CONTRA) gastrocnemius'tan olanları gösterir. Lin-/Sca-1+/VCAM-1- FAP'lar (Toplam) Sca-1 High (kırmızı kutu) ve Sca-1 Med/Low (yeşil kutu) fraksiyonlarına bölünürken, Lin-/Sca-1-/VCAM-1+ milletvekilleri mavi kutuda gösterilir. (B) FaP'lerin nicelemesi (Toplam, Sca-1 Yüksek, Sca-1 Med/Düşük) her zaman noktasında denervasyon sonrası, Lin hücrelerinin sıklığı (%) (üst sıra) ve gram kas başına hücre sayısı (alt sıra) kontralateral kontrol gastrocnemius normalleştirilmiş olarak bildirilir. (C) Toplam SSS popülasyonunun Sca-1 Yüksek ve Sca-1 Med/Düşük alt popülasyonlarının göreli oranları. (D) Milletvekillerinin her zaman noktasındaki ölçülmesi, Lin hücrelerinin sıklığı (%) (sol grafik) ve gram kas başına hücre sayısı (sağ grafik) kontralteral kontrole normalleştirildi. (Veriler ortalama +/- S.D; 2 ve 12 haftalık zaman noktaları için n=4; 5 haftalık zaman dilimi için n=5; 14 haftalık zaman dilimi için n=2'dir. Tek yönlü ANOVA tarafından analiz edilen veriler; Birden fazla karşılaştırma için düzeltmek için post-hoc Sidak testi. # = P<0.05.) Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Antikor doğrulama ve titrasyon. CD31::FITC (A-C), CD45::FITC (D-F) ve VCAM-1::P E (G-I) tazminat boncukları (A,D,G) ve sağlıklı sıçan gastrocnemius kasından (B,E,H) tek hücreli süspansiyonlar üzerinde ticari olarak konjuge antikorların doğrulanması. Her antikor 5 farklı konsantrasyonda titrize edildi (C,F,I). Optimum konsantrasyon, minimum arka plan boyama (kırmızı kutular) ile en büyük floresan yoğunluğuna göre seçildi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 2:SK'lar ve milletvekilleri ters farklılaşma kültürü koşullarında sıralanmıştır. (A)FSP-1 (yeşil), Plin-1 (yeşil) veya Col1a1 (yeşil) ve MHC (kırmızı) için ortaklaşa 12. Pozitif FSP-1 ve Col1a1 boyama, FAP'lerin fibroblastlara farklılaşmasını ortaya koymaktadır. ORO boyama (kırmızı), Plin-1 pozitif adipositler kolayca görünmese de lipid üretimini ortaya koymaktadır. ÇekirdekLER DAPI (mavi) ile boyanmıştır. (B) Adipojenik farklılaşma medyasına maruz kalan milletvekilleri öldü. 12 gün boyunca FAP Growth Media'da (FAP GM) kültüre sahip olan ve FSP-1 (yeşil) veya Plin-1 (yeşil) ve MHC (kırmızı) için ortaklaşa bağışıklık sistemi bulunan milletvekilleri, FSP-1 veya Plin-1 pozitif hücrelerinin yokluğuyla farklılaştırılmış miyositler ve miyotütler göstermektedir. ORO lekelemesinin olmaması, kültürde adipojenik hücrelerin eksikliğini daha da doğrulamaz. Fibrojenik farklılaşma medyasında (FD) yetişen ve Col1a1 ve MHC için ortaklaşa bağışıklık sistemi kurulan milletvekilleri olgun miyositler ve Col1a1 pozitif hücrelerinin yokluğunu göstermektedir. Col1a1 immünostaining'e uyum sağlamak için laminin üzerinde yetişen milletvekilleri, kollajende olduğu gibi kültürde 12 günde miyotüplere aynı derecede füzyon göstermezler. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 3: Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ hücrelerFAP ve milletvekillerinin karışık bir popülasyonudur. (A) PDGFRα ve Pax7 yeni izole edilmiş Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ hücrelerinin birlikte immünostaining sırasıyla PP'leri ve milletvekillerini tanımlayan PDGFRα tek pozitif (beyaz oklar) ve Pax7 tek pozitif (sarı ok) hücrelerinin karışık popülasyonu gösterir. (B) Miyojenik farklılaşma medyasında (MD) yetişen Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ kültürleri sırasıyla fibroblastları ve miyositleri/tüpleri tanımlayan FSP-1 tek pozitif (yeşil) ve MHC tek pozitif (kırmızı) hücreleri içerir. Plin-1 (yeşil) ve ORO (kırmızı) lekelerinin olmaması olgun adipositlerin yokluğunu gösterir. Col1a1 (yeşil) ve MHC (kırmızı) için birlikte immünostaining olgun miyositler ve fibroblastlar gösterir. (C) Adipojenik farklılaşma medyasında (AD) yetişen 12. günde Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ hücreleri benzer şekilde FSP-1 (yeşil) tek pozitif ve MHC (kırmızı) tek pozitif hücrelerin bir karışımını gösterir, ama aynı zamanda Plin-1 (yeşil) tek pozitif hücreler ve ORO boyama mevcut, fibroblastlar, miyositler ve adipositlerin farklılığını doğrulayan. Fibrojenik farklılaşma medyasında (FD) yetişen kültürler olgun miyositler ve Col1a1 tek pozitif hücreler (fibroblastlar) gösterir. (D) Temsilci Sca-1::APC VCAM-1::P E panelleri Lin- (CD31-/CD45-) popülasyonu denervated kas örneklerinden hasat 2- 5- 12- veya 14 haftalık denervasyon sonrası; Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ popülasyonu mor kutuda belirtilmiştir. (E) Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ hücrelerinin denervasyon sonrası dört seri zaman noktasında nicelleştirilmesi, Lin hücrelerinin sıklığı (sol grafik) ve gram kas başına hücrelerin sıklığı olarak rapor edilir (sağ grafik) kontrallateral gastrocnemius'a normalleştirilir. (Veriler ortalama +/- S.D; 2 ve 12 haftalık zaman noktaları için n=4; 5 haftalık zaman dilimi için n=5; 14 haftalık zaman dilimi için n=2'dir. Veriler tek yönlü ANOVA tarafından analiz edildi; birden fazla karşılaştırma için düzeltmek için geçici Sidak testi sonrası; # = P<0.05.) Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 4: Sıçan iskelet kasının akış sitometrisinde miyojenik hücrelerin bir belirteci olarak ITGA7. ItGA7::P E-Cy7 antikor konjugasyonunun ticari kompanzasyon boncukları (A) ve sağlıklı sıçan gastrocnemius kasından(B)üretilen tek hücreli süspansiyonlar üzerinde tek boyama ile doğrulanması. Hem ITGA7 etiketli boncukların hem de hücrelerin popülasyonları belirgindir (kara kutular) (C) Antikor titrasyonu tek hücreli süspansiyonlarda beş farklı konsantrasyon test edilerek gerçekleştirildi. Kırmızı kutu ideal konsantrasyonu gösterir. (D) Floresan Eksi Bir (FMO) kontrollerinin çizimleri, antikor konjugelerinde floresan dökülmesinin olmadığını gösterir, ancak hücre süspansiyonlarının tam lekesi Sca-1::APC ve ITGA7::P E-Cy7 (yeşil kutu) arasında spesifik olmayan bir etkileşimi ortaya koymaktadır. Gating (E) Lin-/Sca-1+/ITGA7- hücrelerini (sözde "FAP") ve Lin-/Sca-1-/IGTA7+ hücrelerini (sözde "milletvekilleri") ayırmak için. (F) Perilipin-1 (yeşil) ve MHC (kırmızı) ile kaplamadan sonra 12 gün sonra FACS sıralı hücre kültürlerinin birlikte immünositasyon, her iki sıralanmış hücre grubunun da ağırlıklı olarak az sayıda miyosit bulunan adipositlere olgunlaştığını göstermektedir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

1. Lekesiz
2. Canlılık Kontrolü
3. CD31 + CD45 FMO
4. Sca-1 FMO
5. VCAM-1 FMO
6. CD31 + CD45 Tek Leke (Boncuklar)
7. CD31 + CD45 Tek Leke (Hücreler)
8. Sca-1 Tek Leke (Boncuklar)
9. Sca-1 Tek Leke (Hücreler)
10. VCAM-1 Tek Leke (Boncuklar)
11. VCAM-1 Tek Leke (Hücreler)

Tablo 1: Akış sitometrisi antikor boyama kontrolleri. Antikor boyama kontrollerinin tam tamamlayıcısı. Deney ilk kez yapılıyorsa, hem kompanzasyon boncukları hem de tek hücreli süspansiyonlar üzerinde tek lekeli kontroller çalıştırılmalıdır. Sonraki tüm deneyler için, tek lekeli kontrollerin yalnızca kompanzasyon boncukları üzerinde çalıştırılması gerekir.

CD31::FITC (μg) CD45::FITC (μg) Sca-1::APC (μg)* VCAM-1::P E (μg) SYTOX Mavi
(μM; Son Konsantrasyon)
Elde Edilmeyen Denetim
-- -- -- -- --
Tek Lekeli Kontroller
SYTOX Mavi (Canlılık Kontrolü) -- -- -- -- 1
CD31 ve CD45 0.5 0.25 -- -- 1
Sca-1 -- -- 0.25 -- 1
VCAM-1 -- -- -- 0.25 1
Floresan Eksi Bir (FMO)
CD31 ve CD45 -- -- 0.25 0.25 1
Sca-1 0.5 0.25 -- 0.25 1
VCAM-1 0.5 0.25 0.25 -- 1
Deneysel Örnekler
Tam Leke 0.5 0.25 0.25 0.25 1

Tablo 2: Akış sitometri antikor boyama matrisi. Akış sitometrisi için deneysel ve kontrol örneklerinin boyanması için antikor miktarı gösterilmiştir. Tüm boyamalar toplam 100 μL yıkama tamponu hacminde gerçekleştirilir. *Kendi kendine eşleştirilmiş Sca-1::APC antikorunun optimum miktarı kullanılan partiye bağlı olarak değişebilir. Tüm yeni eşlenmiş Sca-1::APC partileri önce hem kompanzasyon boncukları hem de tek hücreli süspansiyonlar tek boyama ile doğrulanmalıdır.

Ek dosya: Reaktif tarifleri. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sıçan kası için optimize edilmiş, onaylanmış bir SSS izolasyon protokolü, biyolojik veya teknik nedenlerle farede mümkün olmayan yaralanma modellerini incelemek isteyen araştırmacılar için gereklidir. Örneğin, fareler kronik lokal veya uzun süreli denervasyon gibi nörodejeneratif yaralanmaları incelemek için en uygun hayvan modeli değildir. Biyolojik olarak, farelerin kısa ömrü ve hızlı yaşlanması, yaşlanmanın şaşırtıcı faktöründen denervasyon nedeniyle kas sequalae'yi doğru bir şekilde tanımlamayı zorlaştırır. Teknik açıdan, şiddetli atrofiye bağlı olarak büyük ölçüde azaltılmış kas kütlesi etkili akış sitometrik analizi için yetersiz kalacaktır. Aslında, fare FAP'ları izolasyon protokolleri, sıralanmış SSB'lerin verimini daha iyi artırmak için sağlıklı kasların birlikte gruplandırılmasını önerir29. Bu, analiz için yeterli kas dokusu elde etmenin teknik engelini çözerken, aynı zamanda araştırmacıların FAP'leri kaslara özgü bir düzeyde değerlendirmelerini sınırlar. Belirli kas grupları lif tipi bileşimlerinde, vaskülarizasyon derecesinde ve mitokondriyalsayılarında doğal olarak değiştiğinden, akış sitometrik analizi için birden fazla farklı kasın birleştirilmesi kaslara özgü SSS karakterizasyonunu önler. Buna karşılık, hem sağlıklı hem de uzun süreli denervated, atrofik ve fibrotik sıçan gastrocnemius'un etkili akış sitometrisi için yeterli miktarda başlangıç malzemesi sağladığını gösteriyoruz. Ayrıca, sağlıklı örneklerde, kas fazlası birden fazla aşağı akış tahlilleri için daha da alta bölünebilir ve araştırmacıların aynı dokunun hücresel, moleküler ve histolojik özelliklerini birlikte analiz etmelerini sağlar. Son olarak, terapötiklerle yaralanma modellerinde SSS'leri manipüle eden deneyler için, uyarı ve aktif sıçanlarda fiziksel fonksiyon ve yürüyüşün iyi doğrulanmış analizleri mevcuttur21,22,23,24, hayvanın sonlandırılmasına gerek kalmadan kas fonksiyonunun seri olarak değerlendirilmesini sağlar.

Sıçan için optimize edilmiş bir FAP izolasyon protokolü oluşturmada önemli bir engel antikor kullanılabilirliğiydi. İlk yaklaşımımız, fare 1 , 7 , 8, 9 , 10,11,12,13,14'te yaygın olarak kullanılan antikor paneli ve gating strateji protokollerinikopyalamayaçalıştı. CD31 ve CD45 soy belirteçleri için sıçanı tanıyan ticari olarak mevcut, konjuge edilmiş, akış sitometrisi test edilmiş ve doğrulanmış antikorlar mevcut olsa da, Sca-1 veya PDGFRα işaretleyicilerini tanımlayan pozitif SP'ler ve negatif seçim işaretleyici ITGA7 için hiçbiri mevcut değildi. Bu belirteçlere özgü ve akış sitometrisinde etkili olduğu iddia edilen, yargısız, primer antikorlar mevcuttu, ancak Sca-1 ve PDGFRα FAP belirteçlerinden, yayınlanan literatürde sıçan hücrelerinin akış sitometrik analizinde sadece Sca-1 antikoru doğrulanmıştır48. Bu nedenle, Sca-1'i SP'ler için pozitif seçim işaretçisi olarak seçtik. Sca-1 ve ITGA7 belirteçlerini tanımlamak için ikincil antikor kullanma olasılığı birkaç nedenden dolayı mümkün değildi, ancak öncelikle akış sitometrisi için doğrulanan Sca-1 ve ITGA7 için sıçana özgü tek antikorlar aynı konak türde üretildiği için mümkün değildi. Bu nedenle, kalan seçenek, her iki antikorun da piyasada bulunan kitler kullanılarak kendi kendine konjugasyonuydu.

Antikor konjugasyonu için en uygun kitin seçilmesi süreci kapsamlıydı, çünkü birçok kit primer antikorlarda bulunan çeşitli tampon seyrelticilere (örneğin Glisin, Gliserol, BSA, Sodyum Azide) tamamen veya kısmen hoşgörüsüzdü. Ek olarak, sağlanan florofor, araştırmacının kullanabileceği akış sitometresi / hücre sıralayıcısı içinde donatılmış lazerlerle uyumlu olmalı ve numunedeki diğer hücre tiplerini tanımlamak için kullanılan diğer floroforlara benzer bir dalga boyunda yaymamalıdır. Sıçana özgü PDGFRα primer antikorlarında konjugasyon kitleriyle iyi olmayan seyreltici bileşenlerin varlığı, bu protokoldeki pozitif SSP'ler seçim işaretçisi olarak Sca-1 seçiminde ek bir husustu. Bu sonuçlar hem Sca-1::APC hem de ITGA7::P E-Cy7 konjugasyonlarının hem kompanzasyon boncuklarında hem de hücrelerde belirgin pozitif lekeli popülasyonların tanımlanmasıyla sonuçlandığını gösterirken, birincisinin floresanlarda üretici tarafından reklamı yapılandan daha erken çürüme gösterdiği bulunmuştur. Araştırmacıların Sca-1::APC'yi üreticinin talimatlarına göre, sağlam sinyali sağlamak için ilk kullanımdan hemen önce (örneğin, deneyden bir gün önce), antikorun etkinlik penceresinde tek bir konjuge antikor grubu kullanılabilecek şekilde deneyler planlamaları ve her partiyi tek hücreli süspansiyonlarda tek boyama telafi boncukları ve titrating ile doğrulamaları şiddetle tavsiye edilir. Bununla birlikte, daha da önemlisi, Sca-1::APC ve ITGA7::P E-Cy7 arasındaki kritik etkileşim, FAP'ların ve milletvekillerinin popülasyonlarının doğru bir şekilde tanımlamasını önleyerek alternatif bir stratejinin istihdam edilmesi gerekti.

Boscolo Sesillo ve ark. son zamanlarda CD31, CD45 ve CD11b negatif hücrelerde tek bir pozitif seçimişaretleyicisi 33 olarak VCAM-1 kullanılarak sıçan kası kök hücrelerinin başarılı akış sitometrik izolasyonu gösterilmiştir. MP seçim işaretleyicisi olarak VCAM-1 ile, FAP'leri (Lin-/Sca-1+/VCAM-1-) ve milletvekillerini (Lin-/Sca-1-/VCAM-1+) tanımlamak için yeni bir antikor paneli kullandık ve yaklaşımı SAĞLıKLı gastroknemius kasından hücreleri sıralayan FACS'in in vitro kültürü ile doğruladık. Yeni izole edilmiş SSCB'ler ve milletvekilleri sadece kendi alternatif belirteçleri PDGFRα ve Pax7 için immünositize edildi. Kültürlü FAP'lar olgun fibroblast ve adiposit popülasyonlarına, milletvekilleri ise olgun miyositlere/miyotubelara farklılaştı. Kültürler içinde SSS'lerin ve milletvekillerinin çapraz kontaminasyonu meydana gelmedi. Histolojik kesitlerin immünostaining Sca-1 pozitif hücreler ile denervated kas fibro-yağlı bozulma alanlarının infiltrasyon doğruladı.

Protokolümüzü ciddi şekilde atrofik, fibrotik ve yağa sızmış kaslarda doğrulamak için uzun süreli denervated kasın akış sitometrik analizini yaparken, tesadüfen Sca-1 sinyalinin artmasıyla (Sca-1 High'ı gösteren) bir SCA-1 ekspresyonunun (Sca-1 Med/Low olarak belirtilen) ortaya çıktığını gözlemledik. Sca-1 Yüksek FAP'ler denervasyon sonrası önemli ölçüde artarken (12 hafta artı), Sca-1 Med/Low FAP'lar taban çizgisi seviyelerine gerilemeden önce 5 hafta erken zirve yaptı. FAP'larda heterojenlik fenotip bildirilmiştir10,30. Daha yüksek Sca-1 ekspresyonuna sahip FAP'lerin adipositlere daha kolay farklılaştıkları ve fibrojenik stimülasyona maruz kaldıklarında Col1a130,49 ekspresyonunu arttırtığıgösterilmiştir. Burada gözlenen FAP alt popülasyonlarının dinamikleri, denervasyona bağlı sekel ve kasın rejeneratif kapasitesi47'nin zaman seyri ile uyumlu görünmektedir ve bu nedenle FAP alt popülasyonlarını farklı hücresel programlarla karakterize edebilir. Sca-1 Yüksek FAP'ler geç zaman noktalarında fibro/yağlı infiltrasyon ve rejeneratif potansiyelde bir düşüş ile birlikte yukarı düzenlenirken, Sca-1 Med/Low FAP'lar kasların rejeneratif penceresi sırasında yukarı doğru düzenlenir ve etkili rejeneratif miyogenezde yardımcı olabilir. Burada sunulan SSS izolasyon protokolü, araştırmacılara gelecekteki çalışma için bu çeşitli popülasyonları tanımlama ve izole etme olanağı sağlar.

Hem Sca-1 hem de VCAM-1 (Lin-/Sca-1+/VCAM-1+) için pozitif olan bir hücre popülasyonu belirledik ve bu çift pozitif popülasyonun SP'ler ve milletvekillerinin bir karışımı olduğunu belirledik. Malecova ve meslektaşları, sağlıklı kaslarda neredeyse bulunmayan, akut iltihaplanma ile geçici olarak artan ve mdx farelerindeki (kas distrofisi modeli) kalıcılıkları kronik kas iltihabı ve fibrozis10ile ilişkili olan SSS'leri ifade eden bir VCAM-1 alt popülasyonu bildirdiler. Buna karşılık, saf bir SP popülasyonu olmasa da, Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ popülasyonunun denervasyon sonrası 12 ve 14 haftalık kronik kas fibrozisi ile taban çizgisi düzeylerine veya altına düştüğünü gördük. Denervasyon, mdx farelerinin yaşadığı aynı enflamatuar reaksiyon ve bisiklet rejenerasyon girişimlerini teşvik etmez, bu da sonuçlarımızdaki farklılıkları açıklayabilir. Lin-/Sca-1+/ VCAM-1+ hücre popülasyonundaki milletvekillerini tanımlamamız, sağlıklı kaslardaki milletvekillerinin çok küçük bir oranına ilişkin Sca-1 ifadesinin raporuna uygun dir, mioblast çoğalması sırasında yaralanma ve daha sonra hücre döngüsünden çekilme sırasında geçici bir artış45. Bu nedenle, antikor etiketleme ve FACS gating stratejimiz, çalışma için SAF SP'ler ve milletvekilleri popülasyonlarını başarıyla izole ederken, bu popülasyonların akış sitometri tabanlı nicelemesini gerektiren deneyler, Sca-1 ve VCAM-1'i birlikte ifade eden her iki soy çizgisindeki hücrelerin küçük yüzdesi nedeniyle sayılarını biraz hafife alabilir. Ne olursa olsun, mevcut protokol, milletvekillerinin denervasyon yaralanmasına klasik bifazik tepkisini, kısa süreli yükselme ve daha sonra uzun süreli denervated kaslarda nüfusun tükenmesi ile açıkça göstermektedir. Benzer şekilde, izole edilmiş daha kısa süreli denervasyon yaralanmasında bildirilen FAP'lerdeki artış burada yeniden özetlenmiştir ve uzun süreli tibial sinir transeksiyon modeli kullanılarak daha da sürdürüldüğü gösterilmiştir.

Özetle, bu protokol araştırmacılara daha önce keşfedilmemiş bir hayvan olan ve FAP'ları ve milletvekillerini aynı anda incelemek için akış sitometrik yöntemlerinin kullanılacağı sıçan sağlar. Genel olarak, sıçandaki SSS çalışmaları akut ve kronik kas ve periferik sinir travması ve hastalığında bu anahtar ata popülasyonunun yeni rollerini ortaya çıkarabilir ve daha sonra hücreye özgü tedaviler geliştirme potansiyelini artırabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir ihtilafı yoktur.

Acknowledgments

Ottawa Üniversitesi'ndeki Flow sitotmetri Çekirdek Tesisleri'ne ve Keenan Biyomedikal Bilimler Araştırma Merkezi (KRC), St Michaels Hospital Unity Health Toronto'ya bu yazıda sunulan akış sitometrisi/FACS protokolünün optimizasyonundaki uzmanlıkları ve rehberliği için teşekkür ederiz. Bu çalışma Medicine tarafından Design New Ideas 2018 Fund (MbDNI-2018-01) tarafından JB'ye finanse edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Falcon 352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap Falcon 352235
10 cm cell culture dishes Sarstedt 83.3902
12-well cell culture plate ThermoFisher 130185
12 mm glass coverslips, No.2 VWR 89015-724
10 mL Syringe Beckton Dickenson 302995
15 mL centrifuge tubes FroggaBio 91014
20 gauge needle Beckton Dickenson 305176
25mL Serological pipette Sarstedt 86.1685.001
40µm cell strainer Fisher Scientific 22363547
50mL centrifuge tubes FroggaBio TB50
AbC Total Antibody Compensation Beads  ThermoFisher A10497
Ammonium Chloride, Reagent Grade Bioshop AMC303.500
APC Conjugation Kit, 50-100µg Biotium 92307
Aquatex Aqueous Mounting Medium Merck 108562
Biolaminin 411 LN Biolamina LN411
Bovine Serum Albumin (BSA) Bioshop ALB001
Calcium Chloride Bioshop CCL444.500
Collagenase Type II Gibco 17101015
CountBright Plus Absolute Counting Beads ThermoFisher C36995
Dexamethasone Millipore Sigma D4902
Dispase Gibco 17105041
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) Gibco 11995-065 (+)4.5 g/L D-Glucose
(+)L-Glutamine
(+)110 mg/L Sodium Pyruvate
EDTA FisherScientific S311
FACSClean Solution Beckton Dickenson 340345
FACSDiva Software Beckton Dickenson --
FACSRinse Solution Beckton Dickenson 340346
Fetal Bovine Serum Sigma F1051
Flow Cytometry Sheath Fluid Beckton Dickenson 342003
FlowJo Software Beckton Dickenson --
Fluorescent Mounting Medium Dako S302380-2
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody Invitrogen A21424
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody Invitrogen A11008
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody Invitrogen A21429
Goat Serum Gibco 16210-064
Ham's F10 Media ThermoFisher  11550043 (+) Phenol Red
(+) L-Glutamine
(-) HEPES
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X) Multicell 311-513-CL
Heat Inactivated Horse Serum Gibco 26050-088
Hemocytometer Reichert N/A
HEPES, minimum 99.5% titration Sigma H3375
Horse Serum ThermoFisher 16050130
Human Transforming Growth Factor β1 (hTGF-β1) Cell Signaling 8915LF
Humulin R Lilly HI0210
IBMX Millipore Sigma I5879 Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine
Isopropanol Sigma I9516 Also known as 2-propanol
Lewis Rat, Female Charles River Kingston 004 (Strain Code) 200-250 grams used
LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer Beckton Dickenson --
Microcentrifuge Eppendorf EP-5417R
MoFlo XDP Cell Sorter Beckman Coulter --
Mouse Anti-CD31::FITC Antibody Abcam ab33858 Clone TLD-3A12
Mouse Anti-CD45::FITC Antibody Biolegend 202205 Clone OX-1
Mouse Anti-CD106::PE Antibody Biolegend 200403 Also known as VCAM-1
Mouse Anti-MHC Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) N/A Also known as MF20
Mouse Anti-Pax7 Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) N/A
Neutral Buffered Formalin, 10 % Sigma HT501128
Oil Red O Millipore Sigma O0625
PE-Cy7 Conjugation Kit Abcam ab102903
Penicillin-Streptomycin Sigma  P4333
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X) Gibco 10010-023 (-)Calcium Chloride
(-)Magnesium Chloride
Potassium Bicarbonate, Reagent Grade Bioshop PBC401.250
Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody Invitrogen MA5-32347 FSP-1 also known as S100A4
Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody Abcam ab203254
Rabbit Anti-Laminin Antibody Sigma L9393
Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody Abcam ab3526
Rabbit Anti-Sca-1 Antibody Millipore Sigma AB4336
Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody Abcam ab260043 Also known as Col1a1
Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody Abcam ab203491
Recombinant Human FGF-basic Gibco PHG0266
Sodium Azide Sigma S2002
Triton-X-100 Fisher Scientific BP151
Troglitazone Millipore Sigma T2573
Tween-20 Bioshop TWN510

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12, 153-163 (2010).
  2. Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).
  3. Uezumi, A., Ikemoto-Uezumi, M., Tsuchida, K. Roles of nonmyogenic mesenchymal progenitors in pathogenesis and regeneration of skeletal muscle. Frontiers in Physiology. 5, 1-11 (2014).
  4. Biswas, A. A., Goldhamer, D. J. FACS fractionation and differentiation of skeletal-muscle resident multipotent Tie2+ progenitors. Methods in Molecular Biology. 1460, 255-267 (2016).
  5. Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network. Frontiers in Physiology. 10, 1-10 (2019).
  6. Wosczyna, M. N., Rando, T. A. A muscle stem cell support group: Coordinated cellular responses in muscle regeneration. Developmental Cell. 46 (2), 135-143 (2018).
  7. Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
  8. Uezumi, A., et al. Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle. Journal of Cell Science. 124 (21), 3654-3664 (2011).
  9. Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
  10. Malecova, B., et al. Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  11. Madaro, L., et al. Denervation-activated STAT3-IL-6 signalling in fibro-adipogenic progenitors promotes myofibres atrophy and fibrosis. Nature Cell Biology. 20 (8), 917-927 (2018).
  12. Heredia, J. E., et al. Type 2 innate signals stimulate fibro/adipogenic progenitors to facilitate muscle regeneration. Cell. 153 (2), 376-388 (2013).
  13. Fiore, D., et al. Pharmacological blockage of fibro/adipogenic progenitor expansion and suppression of regenerative fibrogenesis is associated with impaired skeletal muscle regeneration. Stem Cell Research. 17 (1), 161-169 (2016).
  14. Kang, X., et al. Interleukin-15 facilitates muscle regeneration through modulation of fibro/adipogenic progenitors. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 1-11 (2018).
  15. Lovering, R. M., Roche, J. A., Goodall, M. H., Clark, B. B., Mcmillan, A. An in vivo rodent model of contraction-induced injury and non-invasive monitoring of recovery. Journal of Visualized Experiments. (51), e2782 (2011).
  16. Iyer, S. R., Valencia, A. P., Hernández-Ochoa, E. O., Lovering, R. M. In vivo assessment of muscle contractility in animal studies. Methods in Molecular Biology. 1460, 293-307 (2016).
  17. Mintz, E. L., Passipieri, J. A., Lovell, D. Y., Christ, G. J. Applications of in vivo functional testing of the rat tibialis anterior for evaluating tissue engineered skeletal muscle repair. Journal of Visualized Experiments. (116), e54487 (2016).
  18. Hakim, C. H., Wasala, N. B., Duan, D. Evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice. Journal of Visualized Experiments. (72), e50183 (2013).
  19. Moorwood, C., Liu, M., Tian, Z., Barton, E. R. Isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies. Journal of Visualized Experiments. (71), e50036 (2013).
  20. Gerlinger-Romero, F., et al. Non-invasive assessment of dorsiflexor muscle function in mice. Journal of Visualized Experiments. (143), e58696 (2019).
  21. Iohom, G., et al. Long-term evaluation of motor function following intraneural injection of ropivacaine using walking track analysis in rats. British Journal of Anaesthesia. 94 (4), 524-529 (2005).
  22. Brown, C. J., et al. Self-evaluation of walking-track measurement using a sciatic function index. Microsurgery. 10 (3), 226-235 (1989).
  23. Bozkurt, A., et al. CatWalk gait analysis in assessment of functional recovery after sciatic nerve injury. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 91-98 (2008).
  24. Deumens, R., Jaken, R. J. P., Marcus, M. A. E., Joosten, E. A. J. The CatWalk gait analysis in assessment of both dynamic and static gait changes after adult rat sciatic nerve resection. Journal of Neuroscience Methods. 164 (1), 120-130 (2007).
  25. McKinnon, K. M. Flow cytometry: An overview. Current Protocols in Immunology. 2018, 1-11 (2018).
  26. Jensen, A. R., et al. Neer Award 2018: Platelet-derived growth factor receptor α co-expression typifies a subset of platelet-derived growth factor receptor β-positive progenitor cells that contribute to fatty degeneration and fibrosis of the murine rotator cuff. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 27 (7), 1149-1161 (2018).
  27. Mosich, G. M., et al. Non-fibro-adipogenic pericytes from human embryonic stem cells attenuate degeneration of the chronically injured mouse muscle. JCI Insight. 4 (24), (2019).
  28. Lee, D., et al. HMGB2 is a novel adipogenic factor that regulates ectopic fat infiltration in skeletal muscles. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
  29. Low, M., Eisner, C., Rossi, F. Fibro/Adipogenic Progenitors (FAPs): Isolation by FACS and Culture. Muscle Stem Cells: Methods and Protocols. , 179-189 (2017).
  30. Giuliani, G., et al. SCA-1 micro-heterogeneity in the fate decision of dystrophic fibro/adipogenic progenitors. Cell Death and Disease. 12 (1), 1-24 (2021).
  31. Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
  32. Upadhyay, G. Emerging role of lymphocyte antigen-6 family of genes in cancer and immune cells. Frontiers in Immunology. 10, 819 (2019).
  33. Boscolo Sesillo, F., Wong, M., Cortez, A., Alperin, M. Isolation of muscle stem cells from rat skeletal muscles. Stem Cell Research. 43, 101684 (2020).
  34. Ciaramitaro, P., et al. Traumatic peripheral nerve injuries: Epidemiological findings, neuropathic pain and quality of life in 158 patients. Journal of the Peripheral Nervous System. 15 (2), 120-127 (2010).
  35. Noble, J., Munro, C. A., Prasad, V. S. S. V., Midha, R. Analysis of upper and lower extremity peripheral nerve injuries in a population of patients with multiple injuries. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 45 (1), (1998).
  36. Malik, S. Traumatic peripheral neuropraxias in neonates: A case series. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 8 (10), 10-12 (2014).
  37. Smith, B. W., Daunter, A. K., Yang, L. J. S., Wilson, T. J. An update on the management of neonatal brachial plexus palsy-replacing old paradigms a review. JAMA Pediatrics. 172 (6), 585-591 (2018).
  38. Rebolledo, D. L., et al. Denervation-induced skeletal muscle fibrosis is mediated by CTGF/CCN2 independently of TGF-β. Matrix Biology. 82, 20-37 (2019).
  39. Walls, P. L. L., McRae, O., Natarajan, V., Johnson, C., Antoniou, C., Bird, J. C. Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
  40. Yuen, D. A., et al. Culture-modified bone marrow cells attenuate cardiac and renal injury in a chronic kidney disease rat model via a novel antifibrotic mechanism. PLOS One. 5 (3), 9543 (2010).
  41. Fukada, S. I. The roles of muscle stem cells in muscle injury, atrophy and hypertrophy. Journal of Biochemistry. 163 (5), 353-358 (2018).
  42. Itabe, H., Yamaguchi, T., Nimura, S., Sasabe, N. Perilipins: A diversity of intracellular lipid droplet proteins. Lipids in Health and Disease. 16 (1), 1-11 (2017).
  43. Chapman, M. A., Mukund, K., Subramaniam, S., Brenner, D., Lieber, R. L. Three distinct cell populations express extracellular matrix proteins and increase in number during skeletal muscle fibrosis. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 312 (2), 131-143 (2016).
  44. Hillege, M., Galli Caro, R., Offringa, C., de Wit, G., Jaspers, R., Hoogaars, W. TGF-β regulates Collagen Type I expression in myoblasts and myotubes via transient Ctgf and Fgf-2 Expression. Cells. 9 (2), 375 (2020).
  45. Kafadar, K. A., Yi, L., Ahmad, Y., So, L., Rossi, F., Pavlath, G. K. Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration. Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).
  46. Batt, J. A. E., Bain, J. R. Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. Journal of Visualized Experiments. (81), e50657 (2013).
  47. Carlson, B. M. The biology of long-term denervated skeletal muscle. European Journal of Translational Myology. 24 (1), (2014).
  48. Kennedy, E., et al. Embryonic rat vascular smooth muscle cells revisited - A model for neonatal, neointimal SMC or differentiated vascular stem cells. Vascular Cell. 6 (1), 1-13 (2014).
  49. Pannérec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials. Development (Cambridge). 140 (14), 2879-2891 (2013).

Tags

Biyoloji Sayı 172 mezenkimal progenitörler fibro-adipojenik progenitörler miyojenik progenitörler akış sitometrisi floresanla aktive hücre sıralama FACS iskelet kası kronik travmatik denervasyon sıçan kas atrofisi fibrozis
Sıçandaki İskelet Kasında Fibro-Adipojenik Progenitörlerin (FAP' ler) ve Miyojenik Progenitörlerin (Milletvekilleri) Tanımlanması, İzolasyonu ve Karakterizasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Te, L. J. I., Doherty, C., Correa,… More

Te, L. J. I., Doherty, C., Correa, J., Batt, J. Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat. J. Vis. Exp. (172), e61750, doi:10.3791/61750 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter