Summary

Identificación, aislamiento y caracterización de progenitores fibroadipogénicos (FAP) y progenitores miogénicos (MP) en el músculo esquelético en la rata

Published: June 09, 2021
doi:

Summary

Este protocolo describe un método para aislar progenitores fibroadipogénicos (FAP) y progenitores miogénicos (MP) del músculo esquelético de rata. La utilización de la rata en modelos de lesión muscular proporciona una mayor disponibilidad de tejido del músculo atrófico para el análisis y un repertorio más amplio de métodos validados para evaluar la fuerza muscular y la marcha en animales que se mueven libremente.

Abstract

Los progenitores fibroadiogénicos (FAP) son células intersticiales residentes en el músculo esquelético que, junto con los progenitores miogénicos (MP), desempeñan un papel clave en la homeostasis, lesión y reparación muscular. Los protocolos actuales para la identificación y el aislamiento de LOS FAP utilizan citometría de flujo/clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y los estudios que evalúan su función in vivo hasta la fecha se han realizado exclusivamente en ratones. El mayor tamaño inherente de la rata permite un análisis más exhaustivo de los FAPs en modelos de lesión del músculo esquelético, especialmente en el músculo severamente atrófico o cuando los investigadores requieren una masa de tejido sustancial para realizar múltiples ensayos aguas abajo. La rata también proporciona una selección más amplia de ensayos funcionales musculares que no requieren sedación o sacrificio animal, minimizando así la morbilidad y el uso de animales al permitir evaluaciones en serie. Los protocolos de citometría de flujo/FACS optimizados para ratones son específicos de cada especie, especialmente restringidos por las características de los anticuerpos disponibles comercialmente. No se han optimizado para separar los FAP de la rata o el músculo altamente fibrótico. Se desarrolló un protocolo de citometría de flujo/FACS para la identificación y aislamiento de FAPs y MPs de músculo esquelético de rata sano y denervado, basándose en la expresión diferencial de los marcadores de superficie CD31, CD45, Sca-1 y VCAM-1. Como los anticuerpos primarios validados por citometría de flujo específicos de ratas están severamente limitados, se realizó la conjugación interna del anticuerpo dirigido a Sca-1. Utilizando este protocolo, se confirmó la conjugación exitosa de Sca-1, y la identificación citométrica de flujo de FAPs y MPs fue validada por cultivo celular e inmunotinción de FAPs y MPs aislados de FACS. Finalmente, informamos un nuevo curso de tiempo de FAPs en un modelo prolongado (14 semanas) de denervación de ratas. Este método proporciona a los investigadores la capacidad de estudiar FAPs en un nuevo modelo animal.

Introduction

Las células progenitoras fibroadipogénicas (FAP) son una población de células progenitoras multipotentes residentes en el músculo esquelético que desempeñan un papel crítico en la homeostasis, reparación y regeneración muscular y, por el contrario, también median las respuestas patológicas a la lesión muscular. Como su nombre indica, los FAP se identificaron originalmente como una población progenitora con el potencial de diferenciarse en fibroblastos y adipocitos1 y se pretendía que fueran los mediadores clave de la infiltración fibrograsa del músculo esquelético en lesiones y enfermedades crónicas. Estudios posteriores revelaron que los FAPs son adicionalmente capaces de osteogénesis y condrogénesis2,3,4. Por lo tanto, se anotan más ampliamente en la literatura como progenitores mesenquimales o estromales3,5,6,7,8. En la lesión aguda del músculo esquelético, los FAP ayudan indirectamente en la miogénesis regenerativa al proliferar transitoriamente para proporcionar un ambiente favorable para las células satélite musculares activadas y sus contrapartes progenitoras miogénicas (MP) aguasabajo 1,9,10. En paralelo con la regeneración exitosa, los FAP sufren apoptosis, devolviendo sus números a los niveles basales1,9,10,11. En contraste, en la lesión muscular crónica, los FAP anulan las señales pro-apoptóticas, lo que resulta en su persistencia9,10,11 y reparación muscular anormal.

Los estudios in vivo que evalúan los mecanismos celulares y moleculares por los cuales las FAPs median las respuestas musculares han utilizado modelos animales murinos hasta la fecha1,7,9,10, 11,12,13,14. Si bien los ratones genéticamente modificados son herramientas poderosas para su uso en estos análisis, el pequeño tamaño del animal limita la disponibilidad de tejido para el estudio en modelos de lesiones localizadas a largo plazo donde la atrofia muscular puede ser profunda, como la denervación traumática. Además, la medición de la fuerza muscular y la función física requiere mediciones ex vivo o in situ que requieren la terminación del ratón, o métodos in vivo que requieren cirugía y / o anestesia general para permitir la evaluación del rendimiento contráctil muscular15,16,17,18,19,20 . En ratas, existen análisis funcionales musculares bien validados y utilizados a nivel mundial, además de análisis para comportamientos motores más complejos, como el análisis de la marcha (por ejemplo, índice de función ciática, análisis catwalk) y se realizan en animales despiertos y que se mueven espontáneamente21,22,23,24 . Esto también optimiza los principios de morbilidad mínima en la experimentación con animales y el número de animales de investigación utilizados. De este modo, la rata proporciona al investigador de FAPs la flexibilidad adicional de un mayor volumen muscular lesionado para análisis de proteínas y celulares y la capacidad de realizar evaluaciones en serie de la actividad y los comportamientos funcionales estáticos y dinámicos complejos musculares, en el animal alerta.

Los FAP se han identificado y aislado principalmente de muestras de músculo entero utilizando citometría de flujo y clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) respectivamente. Se trata de ensayos basados en láser que son capaces de identificar múltiples poblaciones celulares específicas en función de rasgos característicos como el tamaño, la granularidad y una combinación específica de marcadores intracelulares o de superficie celular25. Esto es muy ventajoso en el estudio de un sistema de órganos como el músculo esquelético, ya que la homeostasis y la regeneración son procesos complejos y multifactoriales coordinados por una gran cantidad de tipos de células. Un estudio seminal identificó FAPs, así como MPs, utilizando métodos citométricos de flujo en el músculo esquelético de ratón1. Demostraron que los FAP son de naturaleza mesenquimal, ya que carecían de antígenos de superficie específicos para las células de origen endotelial (CD31), hematopoyético (CD45) o miogénico (Integrin-α7 [ITGA7]), pero expresaron el marcador de células madre mesenquimales Sca-1 (antígeno de células madre 1)1 y se diferenciaron en células fibrogénicas y adipogénicas en cultivo. Otros estudios demostraron el aislamiento exitoso de progenitores mesenquimales en el músculo basado en la expresión de un marcador alternativo de células madre, el receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRα)2,7,8 y un análisis posterior reveló que estos probablemente sean la misma población celular que los FAPs3. Los FAP ahora se identifican comúnmente en citometría de flujo utilizando Sca-1 o PDGFRα como un marcador de selección positivo1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31 . Sin embargo, el uso de PDGFRα es preferencial para el tejido humano, ya que aún no se ha identificado un homólogo humano directo de Sca-1 murino32. Además, otras proteínas de la superficie celular han sido reportadas como marcadores de MPs (por ejemplo, VCAM-1), proporcionando una alternativa potencial a ITGA7 como indicador de células de linaje miogénico durante el aislamiento de FAPs33.

Si bien la citometría de flujo/FACS es una metodología poderosa para estudiar el papel y el potencial patogénico de los FAPs en el músculo esquelético1,9,10,11, 13,29,está limitada técnicamente por la especificidad y optimización de sus reactivos requeridos. Dado que la identificación citométrica de flujo y el aislamiento de FAPs se ha desarrollado y llevado a cabo en modelos animalesde ratón 1,9,10, 11,29,esto plantea desafíos para los investigadores que desean estudiar FAPs en otros organismos modelo. Muchos factores, como el tamaño óptimo del tejido a procesar, así como la especificidad y disponibilidad de reactivos y / o anticuerpos, difieren según la especie utilizada.

Además de las barreras técnicas para estudiar los FAP en un nuevo modelo animal, se han estudiado en gran medida en un entorno agudo y tóxico, generalmente a través de una inyección química intramuscular o cardiotoxina. La evaluación de la dinámica a largo plazo de los FAPs se limita principalmente a la evaluación en la distrofia muscular de Duchenne, utilizando el modelo de ratón mdx9,10,11,y modelos de lesión muscular combinada como el desgarro masivo del manguito rotador donde se realiza transección y denervación concurrente del tendón en la musculatura del hombro26,27,28 . La respuesta de los FAP al único insulto de la denervación traumática crónica, una ocurrencia común en accidentes en el lugar de trabajo en la industria pesada, la agricultura y en traumas de nacimiento (lesión del plexo braquial)34,35,36,37 con morbilidad significativa, no se ha caracterizado tan bien, a menudo limitada a un marco de tiempo a corto plazo11,38.

Describimos un método para identificar y aislar FAPs y MPs de músculo esquelético sano, así como severamente atrófico y fibrótico en la rata. En primer lugar, se demuestra la identificación de CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- FAPs y CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ utilizando un protocolo de tinción de digestión tisular y citometría de flujo y posterior validación de nuestros hallazgos mediante cultivo y tinción inmunocitoquímica de células aisladas de FACS. Usando este método, también informamos un nuevo curso de tiempo de FAPs en un modelo de lesión por denervación aislada a largo plazo en la rata.

Protocol

Los investigadores que llevan a cabo este protocolo deben recibir el permiso de su junta local de ética animal / comité de cuidado. Todo el trabajo con animales fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de St. Michael’s Hospital Unity Health Toronto (ACC # 918) y se llevó a cabo de acuerdo con las pautas establecidas por el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales (CCAC). Un esquema del protocolo de citometría de flujo se muestra en la Figura 1. Si la aplicación posterior es F…

Representative Results

Identificación de FAPs y MPs a través de citometría de flujo utilizando un nuevo panel de anticuerpos que incluye Sca-1 y VCAM-1La estrategia de gating para identificar FAPs en músculo de rata se basa en protocolos de citometría de flujo en elratón 29, que se acercan a las células positivas CD31 (endotelial) y CD45 (hematopoyéticas) (denominadas linaje [Lin]) y examina el perfil fluorescente del marcador FAPs Sca-1 y …

Discussion

Un protocolo de aislamiento de FAPs optimizado y validado para el músculo de la rata es esencial para los investigadores que desean estudiar modelos de lesiones que no son factibles en el ratón por razones biológicas o técnicas. Por ejemplo, los ratones no son un modelo animal óptimo para estudiar lesiones crónicas locales o neurodegenerativas, como la denervación a largo plazo. Biológicamente, la corta vida útil y el rápido envejecimiento de los ratones dificultan la delineación precisa de las secuaras muscul…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría agradecer a las instalaciones centrales de citometría de flujo de la Universidad de Ottawa y al Centro de Investigación Keenan para Ciencias Biomédicas (KRC), St Michaels Hospital Unity Health Toronto por su experiencia y orientación en la optimización del protocolo de citometría de flujo / FACS presentado en este manuscrito. Este trabajo fue financiado por Medicine by Design New Ideas 2018 Fund (MbDNI-2018-01) a JB.

Materials

5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Falcon 352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap Falcon 352235
10 cm cell culture dishes Sarstedt 83.3902
12-well cell culture plate ThermoFisher 130185
12 mm glass coverslips, No.2 VWR 89015-724
10 mL Syringe Beckton Dickenson 302995
15 mL centrifuge tubes FroggaBio 91014
20 gauge needle Beckton Dickenson 305176
25mL Serological pipette Sarstedt 86.1685.001
40µm cell strainer Fisher Scientific 22363547
50mL centrifuge tubes FroggaBio TB50
AbC Total Antibody Compensation Beads  ThermoFisher A10497
Ammonium Chloride, Reagent Grade Bioshop AMC303.500
APC Conjugation Kit, 50-100µg Biotium 92307
Aquatex Aqueous Mounting Medium Merck 108562
Biolaminin 411 LN Biolamina LN411
Bovine Serum Albumin (BSA) Bioshop ALB001
Calcium Chloride Bioshop CCL444.500
Collagenase Type II Gibco 17101015
CountBright Plus Absolute Counting Beads ThermoFisher C36995
Dexamethasone Millipore Sigma D4902
Dispase Gibco 17105041
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) Gibco 11995-065 (+)4.5 g/L D-Glucose
(+)L-Glutamine
(+)110 mg/L Sodium Pyruvate
EDTA FisherScientific S311
FACSClean Solution Beckton Dickenson 340345
FACSDiva Software Beckton Dickenson
FACSRinse Solution Beckton Dickenson 340346
Fetal Bovine Serum Sigma F1051
Flow Cytometry Sheath Fluid Beckton Dickenson 342003
FlowJo Software Beckton Dickenson
Fluorescent Mounting Medium Dako S302380-2
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody Invitrogen A21424
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody Invitrogen A11008
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody Invitrogen A21429
Goat Serum Gibco 16210-064
Ham's F10 Media ThermoFisher  11550043 (+) Phenol Red
(+) L-Glutamine
(-) HEPES
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X) Multicell 311-513-CL
Heat Inactivated Horse Serum Gibco 26050-088
Hemocytometer Reichert N/A
HEPES, minimum 99.5% titration Sigma H3375
Horse Serum ThermoFisher 16050130
Human Transforming Growth Factor β1 (hTGF-β1) Cell Signaling 8915LF
Humulin R Lilly HI0210
IBMX Millipore Sigma I5879 Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine
Isopropanol Sigma I9516 Also known as 2-propanol
Lewis Rat, Female Charles River Kingston 004 (Strain Code) 200-250 grams used
LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer Beckton Dickenson
Microcentrifuge Eppendorf EP-5417R
MoFlo XDP Cell Sorter Beckman Coulter
Mouse Anti-CD31::FITC Antibody Abcam ab33858 Clone TLD-3A12
Mouse Anti-CD45::FITC Antibody Biolegend 202205 Clone OX-1
Mouse Anti-CD106::PE Antibody Biolegend 200403 Also known as VCAM-1
Mouse Anti-MHC Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) N/A Also known as MF20
Mouse Anti-Pax7 Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) N/A
Neutral Buffered Formalin, 10 % Sigma HT501128
Oil Red O Millipore Sigma O0625
PE-Cy7 Conjugation Kit Abcam ab102903
Penicillin-Streptomycin Sigma  P4333
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X) Gibco 10010-023 (-)Calcium Chloride
(-)Magnesium Chloride
Potassium Bicarbonate, Reagent Grade Bioshop PBC401.250
Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody Invitrogen MA5-32347 FSP-1 also known as S100A4
Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody Abcam ab203254
Rabbit Anti-Laminin Antibody Sigma L9393
Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody Abcam ab3526
Rabbit Anti-Sca-1 Antibody Millipore Sigma AB4336
Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody Abcam ab260043 Also known as Col1a1
Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody Abcam ab203491
Recombinant Human FGF-basic Gibco PHG0266
Sodium Azide Sigma S2002
Triton-X-100 Fisher Scientific BP151
Troglitazone Millipore Sigma T2573
Tween-20 Bioshop TWN510

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Te, L. J. I., Doherty, C., Correa, J., Batt, J. Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat. J. Vis. Exp. (172), e61750, doi:10.3791/61750 (2021).

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