Identificación, aislamiento y caracterización de progenitores fibroadipogénicos (FAP) y progenitores miogénicos (MP) en el músculo esquelético en la rata
Summary
Este protocolo describe un método para aislar progenitores fibroadipogénicos (FAP) y progenitores miogénicos (MP) del músculo esquelético de rata. La utilización de la rata en modelos de lesión muscular proporciona una mayor disponibilidad de tejido del músculo atrófico para el análisis y un repertorio más amplio de métodos validados para evaluar la fuerza muscular y la marcha en animales que se mueven libremente.
Abstract
Los progenitores fibroadiogénicos (FAP) son células intersticiales residentes en el músculo esquelético que, junto con los progenitores miogénicos (MP), desempeñan un papel clave en la homeostasis, lesión y reparación muscular. Los protocolos actuales para la identificación y el aislamiento de LOS FAP utilizan citometría de flujo/clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y los estudios que evalúan su función in vivo hasta la fecha se han realizado exclusivamente en ratones. El mayor tamaño inherente de la rata permite un análisis más exhaustivo de los FAPs en modelos de lesión del músculo esquelético, especialmente en el músculo severamente atrófico o cuando los investigadores requieren una masa de tejido sustancial para realizar múltiples ensayos aguas abajo. La rata también proporciona una selección más amplia de ensayos funcionales musculares que no requieren sedación o sacrificio animal, minimizando así la morbilidad y el uso de animales al permitir evaluaciones en serie. Los protocolos de citometría de flujo/FACS optimizados para ratones son específicos de cada especie, especialmente restringidos por las características de los anticuerpos disponibles comercialmente. No se han optimizado para separar los FAP de la rata o el músculo altamente fibrótico. Se desarrolló un protocolo de citometría de flujo/FACS para la identificación y aislamiento de FAPs y MPs de músculo esquelético de rata sano y denervado, basándose en la expresión diferencial de los marcadores de superficie CD31, CD45, Sca-1 y VCAM-1. Como los anticuerpos primarios validados por citometría de flujo específicos de ratas están severamente limitados, se realizó la conjugación interna del anticuerpo dirigido a Sca-1. Utilizando este protocolo, se confirmó la conjugación exitosa de Sca-1, y la identificación citométrica de flujo de FAPs y MPs fue validada por cultivo celular e inmunotinción de FAPs y MPs aislados de FACS. Finalmente, informamos un nuevo curso de tiempo de FAPs en un modelo prolongado (14 semanas) de denervación de ratas. Este método proporciona a los investigadores la capacidad de estudiar FAPs en un nuevo modelo animal.
Introduction
Las células progenitoras fibroadipogénicas (FAP) son una población de células progenitoras multipotentes residentes en el músculo esquelético que desempeñan un papel crítico en la homeostasis, reparación y regeneración muscular y, por el contrario, también median las respuestas patológicas a la lesión muscular. Como su nombre indica, los FAP se identificaron originalmente como una población progenitora con el potencial de diferenciarse en fibroblastos y adipocitos1 y se pretendía que fueran los mediadores clave de la infiltración fibrograsa del músculo esquelético en lesiones y enfermedades crónicas. Estudios posteriores revelaron que los FAPs son adicionalmente capaces de osteogénesis y condrogénesis2,3,4. Por lo tanto, se anotan más ampliamente en la literatura como progenitores mesenquimales o estromales3,5,6,7,8. En la lesión aguda del músculo esquelético, los FAP ayudan indirectamente en la miogénesis regenerativa al proliferar transitoriamente para proporcionar un ambiente favorable para las células satélite musculares activadas y sus contrapartes progenitoras miogénicas (MP) aguasabajo 1,9,10. En paralelo con la regeneración exitosa, los FAP sufren apoptosis, devolviendo sus números a los niveles basales1,9,10,11. En contraste, en la lesión muscular crónica, los FAP anulan las señales pro-apoptóticas, lo que resulta en su persistencia9,10,11 y reparación muscular anormal.
Los estudios in vivo que evalúan los mecanismos celulares y moleculares por los cuales las FAPs median las respuestas musculares han utilizado modelos animales murinos hasta la fecha1,7,9,10, 11,12,13,14. Si bien los ratones genéticamente modificados son herramientas poderosas para su uso en estos análisis, el pequeño tamaño del animal limita la disponibilidad de tejido para el estudio en modelos de lesiones localizadas a largo plazo donde la atrofia muscular puede ser profunda, como la denervación traumática. Además, la medición de la fuerza muscular y la función física requiere mediciones ex vivo o in situ que requieren la terminación del ratón, o métodos in vivo que requieren cirugía y / o anestesia general para permitir la evaluación del rendimiento contráctil muscular15,16,17,18,19,20 . En ratas, existen análisis funcionales musculares bien validados y utilizados a nivel mundial, además de análisis para comportamientos motores más complejos, como el análisis de la marcha (por ejemplo, índice de función ciática, análisis catwalk) y se realizan en animales despiertos y que se mueven espontáneamente21,22,23,24 . Esto también optimiza los principios de morbilidad mínima en la experimentación con animales y el número de animales de investigación utilizados. De este modo, la rata proporciona al investigador de FAPs la flexibilidad adicional de un mayor volumen muscular lesionado para análisis de proteínas y celulares y la capacidad de realizar evaluaciones en serie de la actividad y los comportamientos funcionales estáticos y dinámicos complejos musculares, en el animal alerta.
Los FAP se han identificado y aislado principalmente de muestras de músculo entero utilizando citometría de flujo y clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) respectivamente. Se trata de ensayos basados en láser que son capaces de identificar múltiples poblaciones celulares específicas en función de rasgos característicos como el tamaño, la granularidad y una combinación específica de marcadores intracelulares o de superficie celular25. Esto es muy ventajoso en el estudio de un sistema de órganos como el músculo esquelético, ya que la homeostasis y la regeneración son procesos complejos y multifactoriales coordinados por una gran cantidad de tipos de células. Un estudio seminal identificó FAPs, así como MPs, utilizando métodos citométricos de flujo en el músculo esquelético de ratón1. Demostraron que los FAP son de naturaleza mesenquimal, ya que carecían de antígenos de superficie específicos para las células de origen endotelial (CD31), hematopoyético (CD45) o miogénico (Integrin-α7 [ITGA7]), pero expresaron el marcador de células madre mesenquimales Sca-1 (antígeno de células madre 1)1 y se diferenciaron en células fibrogénicas y adipogénicas en cultivo. Otros estudios demostraron el aislamiento exitoso de progenitores mesenquimales en el músculo basado en la expresión de un marcador alternativo de células madre, el receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRα)2,7,8 y un análisis posterior reveló que estos probablemente sean la misma población celular que los FAPs3. Los FAP ahora se identifican comúnmente en citometría de flujo utilizando Sca-1 o PDGFRα como un marcador de selección positivo1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31 . Sin embargo, el uso de PDGFRα es preferencial para el tejido humano, ya que aún no se ha identificado un homólogo humano directo de Sca-1 murino32. Además, otras proteínas de la superficie celular han sido reportadas como marcadores de MPs (por ejemplo, VCAM-1), proporcionando una alternativa potencial a ITGA7 como indicador de células de linaje miogénico durante el aislamiento de FAPs33.
Si bien la citometría de flujo/FACS es una metodología poderosa para estudiar el papel y el potencial patogénico de los FAPs en el músculo esquelético1,9,10,11, 13,29,está limitada técnicamente por la especificidad y optimización de sus reactivos requeridos. Dado que la identificación citométrica de flujo y el aislamiento de FAPs se ha desarrollado y llevado a cabo en modelos animalesde ratón 1,9,10, 11,29,esto plantea desafíos para los investigadores que desean estudiar FAPs en otros organismos modelo. Muchos factores, como el tamaño óptimo del tejido a procesar, así como la especificidad y disponibilidad de reactivos y / o anticuerpos, difieren según la especie utilizada.
Además de las barreras técnicas para estudiar los FAP en un nuevo modelo animal, se han estudiado en gran medida en un entorno agudo y tóxico, generalmente a través de una inyección química intramuscular o cardiotoxina. La evaluación de la dinámica a largo plazo de los FAPs se limita principalmente a la evaluación en la distrofia muscular de Duchenne, utilizando el modelo de ratón mdx9,10,11,y modelos de lesión muscular combinada como el desgarro masivo del manguito rotador donde se realiza transección y denervación concurrente del tendón en la musculatura del hombro26,27,28 . La respuesta de los FAP al único insulto de la denervación traumática crónica, una ocurrencia común en accidentes en el lugar de trabajo en la industria pesada, la agricultura y en traumas de nacimiento (lesión del plexo braquial)34,35,36,37 con morbilidad significativa, no se ha caracterizado tan bien, a menudo limitada a un marco de tiempo a corto plazo11,38.
Describimos un método para identificar y aislar FAPs y MPs de músculo esquelético sano, así como severamente atrófico y fibrótico en la rata. En primer lugar, se demuestra la identificación de CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- FAPs y CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ utilizando un protocolo de tinción de digestión tisular y citometría de flujo y posterior validación de nuestros hallazgos mediante cultivo y tinción inmunocitoquímica de células aisladas de FACS. Usando este método, también informamos un nuevo curso de tiempo de FAPs en un modelo de lesión por denervación aislada a largo plazo en la rata.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un protocolo de aislamiento de FAPs optimizado y validado para el músculo de la rata es esencial para los investigadores que desean estudiar modelos de lesiones que no son factibles en el ratón por razones biológicas o técnicas. Por ejemplo, los ratones no son un modelo animal óptimo para estudiar lesiones crónicas locales o neurodegenerativas, como la denervación a largo plazo. Biológicamente, la corta vida útil y el rápido envejecimiento de los ratones dificultan la delineación precisa de las secuaras muscul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a las instalaciones centrales de citometría de flujo de la Universidad de Ottawa y al Centro de Investigación Keenan para Ciencias Biomédicas (KRC), St Michaels Hospital Unity Health Toronto por su experiencia y orientación en la optimización del protocolo de citometría de flujo / FACS presentado en este manuscrito. Este trabajo fue financiado por Medicine by Design New Ideas 2018 Fund (MbDNI-2018-01) a JB.
Materials
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 10 cm cell culture dishes | Sarstedt | 83.3902 | |
| 12-well cell culture plate | ThermoFisher | 130185 | |
| 12 mm glass coverslips, No.2 | VWR | 89015-724 | |
| 10 mL Syringe | Beckton Dickenson | 302995 | |
| 15 mL centrifuge tubes | FroggaBio | 91014 | |
| 20 gauge needle | Beckton Dickenson | 305176 | |
| 25mL Serological pipette | Sarstedt | 86.1685.001 | |
| 40µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 50mL centrifuge tubes | FroggaBio | TB50 | |
| AbC Total Antibody Compensation Beads | ThermoFisher | A10497 | |
| Ammonium Chloride, Reagent Grade | Bioshop | AMC303.500 | |
| APC Conjugation Kit, 50-100µg | Biotium | 92307 | |
| Aquatex Aqueous Mounting Medium | Merck | 108562 | |
| Biolaminin 411 LN | Biolamina | LN411 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Bioshop | ALB001 | |
| Calcium Chloride | Bioshop | CCL444.500 | |
| Collagenase Type II | Gibco | 17101015 | |
| CountBright Plus Absolute Counting Beads | ThermoFisher | C36995 | |
| Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902 | |
| Dispase | Gibco | 17105041 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Gibco | 11995-065 | (+)4.5 g/L D-Glucose (+)L-Glutamine (+)110 mg/L Sodium Pyruvate |
| EDTA | FisherScientific | S311 | |
| FACSClean Solution | Beckton Dickenson | 340345 | |
| FACSDiva Software | Beckton Dickenson | — | |
| FACSRinse Solution | Beckton Dickenson | 340346 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F1051 | |
| Flow Cytometry Sheath Fluid | Beckton Dickenson | 342003 | |
| FlowJo Software | Beckton Dickenson | — | |
| Fluorescent Mounting Medium | Dako | S302380-2 | |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody | Invitrogen | A21424 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A11008 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody | Invitrogen | A21429 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210-064 | |
| Ham's F10 Media | ThermoFisher | 11550043 | (+) Phenol Red (+) L-Glutamine (-) HEPES |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X) | Multicell | 311-513-CL | |
| Heat Inactivated Horse Serum | Gibco | 26050-088 | |
| Hemocytometer | Reichert | N/A | |
| HEPES, minimum 99.5% titration | Sigma | H3375 | |
| Horse Serum | ThermoFisher | 16050130 | |
| Human Transforming Growth Factor β1 (hTGF-β1) | Cell Signaling | 8915LF | |
| Humulin R | Lilly | HI0210 | |
| IBMX | Millipore Sigma | I5879 | Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine |
| Isopropanol | Sigma | I9516 | Also known as 2-propanol |
| Lewis Rat, Female | Charles River Kingston | 004 (Strain Code) | 200-250 grams used |
| LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer | Beckton Dickenson | — | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | EP-5417R | |
| MoFlo XDP Cell Sorter | Beckman Coulter | — | |
| Mouse Anti-CD31::FITC Antibody | Abcam | ab33858 | Clone TLD-3A12 |
| Mouse Anti-CD45::FITC Antibody | Biolegend | 202205 | Clone OX-1 |
| Mouse Anti-CD106::PE Antibody | Biolegend | 200403 | Also known as VCAM-1 |
| Mouse Anti-MHC Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | N/A | Also known as MF20 |
| Mouse Anti-Pax7 Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | N/A | |
| Neutral Buffered Formalin, 10 % | Sigma | HT501128 | |
| Oil Red O | Millipore Sigma | O0625 | |
| PE-Cy7 Conjugation Kit | Abcam | ab102903 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X) | Gibco | 10010-023 | (-)Calcium Chloride (-)Magnesium Chloride |
| Potassium Bicarbonate, Reagent Grade | Bioshop | PBC401.250 | |
| Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody | Invitrogen | MA5-32347 | FSP-1 also known as S100A4 |
| Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody | Abcam | ab203254 | |
| Rabbit Anti-Laminin Antibody | Sigma | L9393 | |
| Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody | Abcam | ab3526 | |
| Rabbit Anti-Sca-1 Antibody | Millipore Sigma | AB4336 | |
| Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody | Abcam | ab260043 | Also known as Col1a1 |
| Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody | Abcam | ab203491 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Gibco | PHG0266 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Troglitazone | Millipore Sigma | T2573 | |
| Tween-20 | Bioshop | TWN510 |
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