Идентификация, выделение и характеристика фибро-адипогенных предшественников (ФАП) и миогенных прародителей (МП) в скелетных мышцах крыс

Summary

Этот протокол описывает метод выделения фибро-адипогенных предшественников (FAP) и миогенных предшественников (MP) из скелетных мышц крыс. Использование крысы в моделях мышечных травм обеспечивает повышенную доступность тканей из атрофических мышц для анализа и более широкий репертуар проверенных методов для оценки мышечной силы и походки у свободно движущихся животных.

Abstract

Фибро-адипогенные предшественники (FAP) являются резидентными интерстициальными клетками в скелетных мышцах, которые вместе с миогенными предшественниками (MP) играют ключевую роль в гомеостазе мышц, травмах и восстановлении. Современные протоколы идентификации и изоляции FAP используют проточную цитометрию / флуоресцентно-активированную сортировку клеток (FACS), а исследования, оценивающие их функцию in vivo, на сегодняшний день были проведены исключительно на мышах. Больший размер, присущий крысе, позволяет проводить более полный анализ FAP в моделях травм скелетных мышц, особенно в сильно атрофированных мышцах или когда исследователям требуется значительная масса тканей для проведения нескольких анализов вниз по течению. Крыса дополнительно предоставляет больший выбор мышечных функциональных анализов, которые не требуют седации или жертвоприношения животных, тем самым сводя к минимуму заболеваемость и использование животными, позволяя проводить серийные оценки. Протоколы проточной цитометрии / FACS, оптимизированные для мышей, являются видоспецифичными, в частности, ограниченными характеристиками коммерчески доступных антител. Они не были оптимизированы для отделения ФАПов от крыс или сильно фиброзных мышц. Был разработан протокол проточной цитометрии /FACS для идентификации и изоляции FAP и MPs как из здоровых, так и из денервированных скелетных мышц крыс, основанный на дифференциальной экспрессии поверхностных маркеров CD31, CD45, Sca-1 и VCAM-1. Поскольку специфические для крыс первичные антитела, подтвержденные проточной цитометрией, сильно ограничены, была выполнена внутренняя конъюгация антитела, нацеленного на Sca-1. С помощью этого протокола была подтверждена успешная конъюгация Sca-1, а проточная цитометрическая идентификация FAP и MP была подтверждена клеточной культурой и иммуноокрашиванием FACS-изолированных FAP и MP. Наконец, мы сообщаем о новом временном курсе FAPs в пролонгированной (14 недель) модели денервации крыс. Этот метод предоставляет исследователям возможность изучать FAP в новой модели животных.

Introduction

Фибро-адипогенные клетки-предшественники (FAP) представляют собой популяцию резидентных мультипотентных клеток-предшественников в скелетных мышцах, которые играют решающую роль в гомеостазе мышц, восстановлении и регенерации и, наоборот, также опосредуют патологические реакции на повреждение мышц. Как следует из названия, FAP были первоначально идентифицированы как популяция-прародитель с потенциалом дифференцироваться в фибробласты и адипоциты¹ и претендовали на то, чтобы быть ключевыми медиаторами фиброзно-жировой инфильтрации скелетных мышц при хронических травмах и заболеваниях. Дальнейшие исследования показали, что ФАП дополнительно способны к остеогенезу и хондрогенезу^2,3,4. Таким образом, они более широко обозначены в литературе как мезенхимальные или стромальные прародители^3,5,6,7,8. При остром повреждении скелетных мышц ФАП косвенно помогают в регенеративном миогенезе, временно размножаясь, чтобы обеспечить благоприятную среду для активированных мышечных клеток-сателлитов и их последующих миогенных предшественников^{(МП) 1,9,10.} Параллельно с успешной регенерацией ФАП подвергаются апоптозу, возвращая их количество к исходным уровням^1,9,10,11. Напротив, при хронической мышечной травме ФАП перекрывают проапоптотические сигналы, что приводит к их стойкости^9,10,11 и аномальному восстановлению мышц.

В исследованиях in vivo, оценивающих клеточные и молекулярные механизмы, с помощью которых FAP опосредуют мышечные реакции, использовались мышиные животные модели на сегодняшний день^{1,7,9,10,11, 12,13,14.} В то время как генетически модифицированные мыши являются мощными инструментами для использования в этих анализах, небольшой размер животного ограничивает доступность тканей для изучения в долгосрочных локализованных моделях травм, где атрофия мышц может быть глубокой, такой как травматическая денервация. Кроме того, измерение мышечной силы и физической функции требует измерений ex vivo или in situ, которые требуют прекращения работы мыши, или методов in vivo, которые требуют хирургического вмешательства и/ или общей анестезии для оценки сократительной производительности мышц^{15,16,17,18,19,20} . У крыс существуют хорошо проверенные и глобально используемые мышечные функциональные анализы, в дополнение к анализу более сложного двигательного поведения, такого как анализ походки (например, индекс седалищной функции, анализ подиума), которые выполняются у бодрствующих и спонтанно движущихся животных^21,22,23,24 . Это дополнительно оптимизирует принципы минимальной заболеваемости в экспериментах на животных и количество используемых исследовательских животных. Таким образом, крыса предоставляет исследователю FAPs дополнительную гибкость большего поврежденного мышечного объема для белкового и клеточного анализа и возможность проводить серийные оценки статической и динамической функциональной активности и поведения мышечного комплекса у бдительного животного.

FAP в основном были идентифицированы и выделены из целых мышечных образцов с использованием проточной цитометрии и флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) соответственно. Это лазерные анализы, которые способны идентифицировать несколько специфических клеточных популяций на основе характерных признаков, таких как размер, гранулярность и конкретная комбинация клеточной поверхности или внутриклеточных маркеров^25. Это очень выгодно при изучении системы органов, такой как скелетные мышцы, поскольку гомеостаз и регенерация являются сложными, многофакторными процессами, координируемыми множеством типов клеток. Основополагающее исследование идентифицировало FAP, а также MP, используя методы проточной цитометрии в скелетных мышцах мышей^1. Они продемонстрировали, что FAP являются мезенхимальными по своей природе, поскольку в них отсутствовали поверхностные антигены, специфичные для клеток эндотелиального (CD31), кроветворного (CD45) или миогенного (Integrin-α7 [ITGA7]) происхождения, но экспрессировали маркер мезенхимальных стволовых клеток Sca-1 (Stem cell antigen 1)¹ и дифференцировали в фиброгенные и адипогенные клетки в культуре. Другие исследования продемонстрировали успешную изоляцию мезенхимальных предшественников в мышцах на основе экспрессии альтернативного маркера стволовых клеток, рецептора фактора роста тромбоцитов альфа (PDGFRα)^2,7,8, и дальнейший анализ^{показал,}что они, вероятно, являются той же клеточной популяцией, что и FAPs^3. ФАП в настоящее время обычно идентифицируются в проточной цитометрии с использованием Sca-1 или PDGFRα в качестве положительного маркера отбора^{1,9,10,11, 12,13,14,26,27,28,29,30,31} . Однако использование PDGFRα является предпочтительным для тканей человека, поскольку прямой человеческий гомолог мышиного Sca-1 еще не идентифицирован^32. Кроме того, сообщалось о других белках клеточной поверхности в качестве маркеров МП (например, VCAM-1), обеспечивая потенциальную альтернативу ITGA7 в качестве индикатора клеток миогенной линии во время выделения FAPs^33.

Хотя проточная цитометрия/FACS является мощной методологией изучения роли и патогенного потенциала ФАП в скелетных мышцах^{1,9,10,11, 13,29,}она технически ограничена специфичностью и оптимизацией необходимых ей реагентов. Поскольку проточная цитометрическая идентификация и выделение FAP были разработаны и проведены на мышиных животных моделях^{1,9,10,11,29,}это создает проблемы для исследователей, которые хотят изучать FAP в других модельных организмах. Многие факторы, такие как оптимальный размер обрабатываемой ткани, а также специфичность и доступность реагентов и/или антител, различаются в зависимости от используемого вида.

В дополнение к техническим барьерам для изучения ФАП на новой модели животных, они в значительной степени изучались в острых, токсичных условиях - обычно с помощью внутримышечной химической инъекции или кардиотоксина. Оценка долгосрочной динамики ФАП ограничивается главным образом оценкой мышечной дистрофии Дюшенна с использованием mdx мышиноймодели^{9,10, 11}и моделей комбинированной мышечной травмы, такой как массивный разрыв вращательной манжеты, где одновременная трансекция сухожилия и денервация выполняются на мускулатуре плеча^26,27,28 . Реакция ФАПов на единственное оскорбление хронической травматической денервацией, распространенной при несчастных случаях на производстве в тяжелой промышленности, сельском хозяйстве и при родовых травмах (травма плечевого сплетения)^34,35,36,37 со значительной заболеваемостью, не была так хорошо охарактеризована, часто ограничена краткосрочными временными рамками^11,38.

Мы описываем метод выявления и изоляции ФАПов и депутатов от здоровых, а также сильно атрофических и фиброзных скелетных мышц у крыс. Во-первых, продемонстрирована идентификация CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1-FAPs и CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ MPs с использованием протокола окрашивания тканевой сбраживания и проточной цитометрии, а последующая валидация наших результатов осуществляется с помощью культуры и иммуноцитохимического окрашивания клеток, выделенных FACS. Используя этот метод, мы также сообщаем о новом временном курсе FAPs в долгосрочной изолированной модели травмы денервации у крыс.

Protocol

Следователи, проводящие этот протокол, должны получить разрешение от своего местного совета по этике животных / комитета по уходу за ними. Все работы с животными были одобрены Комитетом по уходу за животными больницы Святого Михаила Unity Health Toronto (ACC #918) и проводились в соответствии с руководящими принципами, установленными Канадским советом по уходу за животными (CCAC). Схема протокола проточной цитометрии показана на рисунке 1. Если последующим применением является FACS и последующая клеточная культура, все шаги должны быть выполнены с помощью надлежащей асептической техники.

1. Сбор мышечной массы

1. Обезболивайте крыс, используя соответствующий анестетик и жертвоприношение в соответствии с местными руководящими принципами совета по этике животных. Этот протокол собирает икроножную мышцу у взрослых самок крыс Льюиса (200-250 г), в качестве примера. Крыс анестезировали с использованием 2-3% изофлурана и приносили в жертву внутрисердечной инъекцией Т61.
2. После того, как животное было принесено в жертву, побрейте всю заднюю конечность, чтобы облегчить расположение мышцы и свести к минимуму загрязнение меха собранной ткани.
3. Используя стерильный скальпель, сделайте два разреза на коже: первый по окружности голеностопного сустава и второй вверх по средней линии медиального аспекта задней конечности от лодыжки до бедра.
4. Очистите кожу и поверхностные мышечные слои, чтобы выявить подлежащую икроножную мышцу, которая берет свое начало в медиальных и боковых мыщелках бедренной кости и вставляется в ахиллово сухожилие.
5. Используйте тупое рассечение, чтобы отделить икроножную мышцу от окружающих тканей, обрабатывая мышцу только сухожилием, чтобы избежать травмы.
6. Отделите икроножную мышцу от ее введения, перемежая ахиллово сухожилие как можно более дистально острыми ножницами. После разрезания обхватите ахиллово сухожилие щипцами и аккуратно снимите икроножную мышцу с подстилающей кости. Все еще удерживая мышцу с щипцами в одной руке, найдите два происхождения икроножной мышцы и разрезайте медиальный и боковой мыщелки бедренной кости.
7. Осторожно промокните иссеченную икроножную мышцу о стерильный кусок марли, чтобы удалить как можно больше крови. Обрежьте мышцу на стерильной поверхности и удалите излишки соединительной ткани, а также ахиллова сухожилия.
8. Поместите мышцу в весовую лодку и взвешивайте с помощью прецизионных весов. Этот протокол оптимизирован для переваривания мышц с влажным весом в пределах 200-600 мг. При желании операторы могут подразделять избыток собранной ткани на другие последующие анализы.
9. Осторожно далее разделите собранные мышцы, которые будут использоваться для проточной цитометрии, на 3-4 более мелких кусочка (примерно^{1-2 см3)}и погрузитесь в ледяной 1x PBS. Держите холодным на льду до тех пор, пока все образцы не будут собраны.

2. Мышечное пищеварение

1. Извлеките мышцу из PBS и поместите в стерильную чашку для культивирования клеток размером 10 см. Аккуратно порвать и измельчить ткань щипцами до тех пор, пока кусочки не составят примерно 3-4^мм3,удалив как можно больше соединительной ткани. После тщательного измельчения переводят в стерильную коническую трубку объемом 50 мл, содержащую 6 мл DMEM + 1% пенициллина/стрептомицина (P/S).
2. Добавьте 10 мкл 300 мМ раствора CaCl₂ к 365 мкл раствора коллагеназы II (концентрация запаса 4800 Ед/мл) для активации фермента коллагеназы. Добавьте активированный раствор коллагеназы II в коническую трубку объемом 50 мл, содержащую тканевую суспензию. Конечная концентрация коллагеназы II составляет 250 Ед/мл.
3. Инкубируйте трубки в шейкере в течение 1 ч при 37 °C, 240 х г,обязательно вручную закручивая каждые 15 минут, чтобы выбить любую ткань, которая прилипла к боковой части трубки.
4. Через 1 ч извлекают пробирки из шейкера и добавляют следующее на образец: 100 мкл коллагеназы II (4 800 Ед/мл) и 50 мкл диспазы (4,8 Ед/мл).
5. Пипетки пробуют с помощью серологической пипетки 15-20 раз, пока раствор не станет однородным. При обработке нескольких образцов используйте отдельную стерильную пипетку для каждого образца, чтобы избежать перекрестного загрязнения образца.
6. Снова инкубировать в шейкере в течение 30 мин при 37 °C и 240 х г. Через 15 мин встряхните образцы вручную, чтобы выбить адгезивную ткань со стороны трубки.

3. Генерация одноклеточной суспензии

1. Медленно срезайте образцы через шприц объемом 10 мл с иглой 20 Г в течение 10 циклов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Один цикл включает в себя взятие мышечного раствора в шприц и введение его обратно в трубку. Обеспечьте минимизацию любых пузырьков, медленно завершая стрижку, так как чрезмерное вспенивание может привести к дополнительной гибели клеток^39.
2. Поместите клеточный сетчатый фильтр 40 мкм на стерильную коническую трубку объемом 50 мл и смочите ее, пипеткой 5 мл DMEM + 10% FBS и 1% P / S.
3. Пипетка 1 мл образца за один раз через клеточный ситечко.
4. Промывайте клеточный сетчатый фильтр путем пипетки DMEM с 10% FBS и 1% P/S через сетчатый фильтр, чтобы довести общий объем в трубке до 25 мл.
5. Разделите 25 мл образца поровну на две конические трубки по 15 мл и центрифугу при 15 °C, 400 х г в течение 15 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Расщепление мышечного раствора на две конические трубки объемом 15 мл обеспечивает лучшее восстановление клеток после центрифугирования по сравнению с одной трубкой.
6. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать гранулу в буфере лизиса 1 мл 1x RBC (см. Дополнительный файл)при комнатной температуре в течение 7 мин для устранения эритроцитов.
7. Доведите объем до 10 мл с помощью 9 мл промывочного буфера (см. Дополнительный файл)и отжимных трубок при 400 х г,15 °C в течение 15 мин.
8. Аспирировать супернатант и рекомбинированные гранулы путем повторной суспендации в буфере промывки 1 мл.
9. Переложите соответствующий объем клеток в отдельную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл и смешайте с красителем трипанового синего цвета. Подсчитывайте живые клетки на световом микроскопе с помощью гемоцитометра.

4. Окрашивание антител для проточной цитометрии

ПРИМЕЧАНИЕ: Антитело Sca-1 должно быть конъюгировано с APC перед экспериментами по проточной цитометрии/FACS в соответствии с инструкциями производителя. Производительность должна быть проверена для каждой партии сопряжений(рисунок 2). Конечные спряжения могут храниться в аликвотах 20 мкл при -20 °C и стабильны в течение трех недель. Обратитесь к дополнительному файлу для получения полного протокола сопряжения.

1. Для проточной цитометрии перенесите 1-2 х 10⁶ клеток на экспериментальный образец в стерильную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Доведите объем до 1 мл с помощью промывочного буфера и поместите на лед.
2. Для каждого эксперимента настройте следующие необходимые элементы управления: i) незапятнанные и ii) средства контроля жизнеспособности для точного отбора популяции живых клеток; iii) флуоресцентные минус один (FMO) контроль на одноэлементных суспензиях для установки точных затворов для CD31-/CD45-фракций, FAP и MP; и iv) компенсационные шарики с одним окрашиванием для коррекции флуоресцентного перелива между каналами.
   1. Для всех элементов управления ячейками аликвота 5 х 10⁵ - 1 х 10⁶ ячеек в 1 мл промывочного буфера в трубке микроцентрифуги 1,5 мл и поместите на лед.
   2. Для контроля бусин добавьте 1 каплю шариков с положительной компенсацией (~1,5 x 10⁵ бусин на каплю) в каждую маркированную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Полный набор элементов управления приведен в таблице 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если эксперимент проводится впервые, запустите контроль с одним окрашиванием для каждого конъюгированного антитела на одноклеточных суспензиях (в дополнение к неокрашенным, жизнеспособным, одноокрашенным компенсационным шарикам и контролем FMO), чтобы оценить положительную окрашенную популяцию в клетках и подтвердить окрашивание, наблюдаемое на компенсационных шариках. Проверяйте каждую свежесопряженную подготовку Sca-1::APC, выполняя однократное окрашивание компенсационных шариков и одноклеточных суспензий. Полный список элементов управления окрашиванием приведен в таблице 1.
3. Чтобы подготовить контроль жизнеспособности, перенесите половину объема клеток из «жизнеспособной» трубки в новую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Назовите эту трубку «Мертвой».
4. Инкубировать «мертвую» трубку при 65 °C в течение 2-3 мин, чтобы убить клетки, затем поместить на лед. Через 2-3 мин повторно объединяют мертвые клетки с живыми клетками, оставшимися в контрольной трубке жизнеспособности. Эта популяция клеток будет использоваться для установки значений компенсации (при необходимости) и правильной установки ворот для красителя жизнеспособности.
5. Центрифугировать одноклеточные суспензии (экспериментальные образцы и контрольные) при 500 х г,4 °C в течение 5 мин.
6. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать клеточные гранулы в буфере промывки 100 мкл.
7. Добавляют антитела, в зависимости от экспериментального образца или контроля. Обратитесь к матрице окрашивания(таблица 2)для получения информации о комбинациях и количествах антител.
8. Осторожно проведите пальцем по каждому образцу, чтобы обеспечить полное перемешивание, и инкубируйте на льду в темноте в течение 15 минут. Для компенсации бусины инкубируют при комнатной температуре в темноте в течение 15 мин.
9. Для экспериментальных и контрольных образцов одноклеточной суспензии доведите объем до 1 мл, добавив буфер промывки 900 мкл. Для управления компенсационным шариком доведите объем до 1 мл с 900 мкл 1x PBS.
10. Центрифуга одноклеточных образцов суспензии при 500 х г,4 °C в течение 5 мин. Центрифужные компенсационные шарики контролируют при 300 х г,4 °C в течение 5 мин.
11. Для всех образцов одноклеточной суспензии аспирировать и выбрасывать супернатант и повторно суспендировать гранулы клеток в буфере промывки 300 мкл. Для компенсационного контроля шарика аспирируйте и выбросьте супернатант, повторно приостановите гранулу в 300 мкл 1x PBS, затем добавьте 1 каплю (~1,5 x 10⁵⁾шариков отрицательной компенсации.
12. Храните все образцы одноэлементной суспензии на льду под алюминиевой фольгой и приступайте к проточному цитометрическому сбору. Компенсационные шариковые элементы управления также должны быть защищены от света, но могут храниться при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если экспериментальной конечной точкой является идентификация ФАП с помощью проточной цитометрии, выполните действия 5.1.1-5.1.11. Если конечной точкой является изоляция клеток с помощью FACS для культивирования и окрашивания, выполните шаги 5.2.1-5.2.9 и разделы 6-7.

5. Проточная цитометрия и флуоресцентно-активированная сортировка клеток (FACS)

1. Проточная цитометрия
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используется настольный проточный цитометр, оснащенный лазерами 405 нм, 488 нм и 640 нм, которые способны одновременно различать 10 различных цветов. Полосовые фильтры и связанные с ними фторхромы, используемые в этом протоколе, следующие: 450/50 (SYTOX Blue), 530/30 (FITC), 575/25 (PE) и 670/30 (APC). Напряжения для каждого детектора следующие: FSC 700; SSC 475; ФИТК 360; ПЭ 460; ПЭ-Ци7 600; SYTOX Синий 360; БТР 570. Убедитесь, что вы обучены правильной работе проточного цитометра или сортировщика клеток перед использованием.
   1. Убедитесь, что цитометр был включен в течение 10-20 минут перед использованием и был загрунтован последовательной очисткой с чистыми, промывными и оболочкой жидкими растворами в течение 30-45 с каждый. Закончите промывкой с dH₂O. Убедитесь, что в контейнер для хранения был добавлен достаточный объем жидкости для хранения для поддержания надлежащего потока проб на протяжении всего сбора.
   2. Настройте стратегию захвата для идентификации ФАПов и депутатов, как показано на рисунке 3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: FAP и MP идентифицируются следующей иерархической стратегией гатинга: i) SSC-A против FSC-A (область рассеяния боковых ячеек против области рассеяния прямых ячеек для разделения ячеек против мусора), ii) FSC-W против FSC-H (ширина рассеяния прямой ячейки против высоты рассеяния прямой ячейки для различения синглетов от дублетов в параметре FSC), iii) SSC-W против SSC-H (ширина рассеяния боковых ячеек против высоты рассеяния боковых ячеек для различения синглетов от дублетов в параметре SSC), iii) SSC-W против SSC-H (ширина рассеяния боковых ячеек против высоты рассеяния боковых ячеек для различения синглетов от дублетов в параметре SSC), iv) SSC-A vs SYTOX Blue (для различения живых и мертвых синглетов), v) SSC-A vs CD31/45::FITC (для исключения клеток CD31+ и CD45+ из дальнейшего анализа) и vi) Sca-1::APC vs VCAM-1::P E из CD31-/CD45- (Lineage; Линь-) население (идентификация ФАПов и депутатов). FAP идентифицируются как события CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1-, а депутаты - как cd31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+.
   3. Сначала запустите каждый одноокрашенный компенсационный шарик управления через цитометр на низкой скорости, чтобы получить значения компенсации, используемые для коррекции любого флуоресцентного перелива между каналами. Оцените компенсацию, сравнив флуоресцентный сигнал каждого элемента управления в своем собственном детекторе (например, SSC-A против APC для одноокрашенных шариков Sca-1::APC), а также всех других детекторов. В соответствующем детекторе должно быть две различные популяции (одна с отрицательным и одна с положительным сигналом) и только отрицательная популяция во всех других детекторах. Установите для остановочного затвора значение 10 000 событий компенсационных шариков и запишите данные.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Между получением каждого образца обязательно пропустите dH₂O через цитометр в течение 10-20 секунд, чтобы избежать загрязнения образца в образец.
   4. Затем обработайте незапятнанные и жизнеспособные контрольные образцы, чтобы правильно защитить живые одиночные клетки. Установите для остановочного затвора значение 10 000 синглетных событий и запишите данные.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительно за 5 мин до получения каждого образца клеточной суспензии, за исключением неокрашенного образца, добавляют 1 мкл красителя жизнеспособности SYTOX Blue (рабочая концентрация 300 мкМ, разбавленная из 1 мМ запасного раствора) к каждому образцу и осторожно перемешивают (конечная концентрация 1 мкМ).
   5. Затем приобретите оставшиеся контрольные образцы одноклеточной суспензии. Оцените каждый элемент управления FMO с его соответствующим графиком в стратегии гатинга(рисунок 3). Например, оцените сигнал FITC CD31+CD45 FMO для обеспечения точного CD31-/CD45-затвора. Оптимальный пример показан на рисунке 3G. Если протокол выполняется впервые, до приобретения элементов управления FMO следует запустить элементы управления с одним окрашиванием на ячейках.
   6. Оцените флуоресцентный сигнал каждого образца клеток с одним окрашиванием в соответствующем детекторе, а также во всех других детекторах для проверки надлежащей компенсации. Установите стоп-шлюз на 10 000 живых синглетных событий и записывайте в программное обеспечение.
   7. После того, как все элементы управления (одноклеточные суспензии и шарики) были обработаны, подготовьте все экспериментальные образцы, предварительно измерив и записав объем каждого образца. Эти измерения будут использоваться для точной количественной оценки ФАП и депутатов, как описано в шаге 5.1.11. Затем добавьте 50 мкл прецизионных счетных шариков и аккуратно перемешайте, пипеткой вверх и вниз 2-3 раза.
   8. Кратко запустите первый экспериментальный образец, чтобы подтвердить идентификацию популяции счетных шариков. Эта популяция выглядит как небольшой отдельный кластер, отдельный от общей клеточной популяции на графике FSC-A против SSC-A(рисунок 3A,красная рамка). Создайте ворота вокруг подсчета популяции бусин. Затем получают данные для каждого экспериментального образца путем обработки через цитометр на низкой скорости. Установите для остановочного затвора значение 10 000 событий подсчета бусин и записи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исследователи могут в качестве альтернативы идентифицировать счетные шарики, установив дополнительный график оценки SSC-A по сравнению с любым из детекторов, поскольку счетные шарики флуоресцентны во всех детекторах.
   9. После того, как все образцы были обработаны, очистите цитометр, используя соответствующие протоколы. Экспортируйте все данные для анализа.
   10. Откройте все файлы данных в соответствующем программном обеспечении для анализа проточной цитометрии. Установите стратегию сбора данных, используемую для сбора данных, как описано в шаге 5.1.2. Изучите элементы управления в том же порядке, что и при сборе данных (например, незапятнанные, жизнеспособность, одно пятно, а затем элементы управления FMO), чтобы повторно проверить стратегию захвата. После того, как точные затворы были установлены с помощью элементов управления FMO, примените затворы ко всем экспериментальным образцам. Экспортируйте необработанные данные в виде электронной таблицы для количественной оценки.
   11. Рассчитайте количество ФАПов и депутатов в каждом экспериментальном образце, используя счетные шарики:
       
       где Число приобретенных клеток - это количество зарегистрированных событий соответствующей клеточной популяции (например, FAP или MP) на программном обеспечении приобретения; Приобретенный bead Count - это количество записанных событий подсчета бусин на программном обеспечении для приобретения; Объем счетных бусин - объем раствора для подсчета бусин, добавленный на шаге 5.1.7; Объем образца - объем каждого окрашенного экспериментального образца до добавления счетных шариков; Концентрация бусин - количество шариков на мкл раствора; это значение указано в техническом описании продукта.
2. FACS - сортировка по клеточной культуре
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол выполняет FACS на сортировщике ячеек, оснащенном 4 лазерами (УФ, Фиолетовый, Синий, Красный), который способен одновременно различать 11-14 цветов. Следуйте протоколу экспериментального окрашивания образцов (раздел 4) и проточной цитометрии, за исключением шагов 1-3, описанных ниже, для оптимизации рабочего процесса FACS:
   1. Увеличьте концентрацию клеток в экспериментальных образцах, которые должны быть отсортированы, до 7^{х 10 6} клеток / мл для получения надежных выходов FAP и MP.
   2. Чтобы объяснить это значительное увеличение концентрации клеток, удвойте все концентрации антител в экспериментальных образцах, подлежащих сортировке.
   3. Обработайте окончательные окрашенные образцы клеток через крышку сетчатого фильтра 40 мкМ, прикрепленную к полистирольной трубке объемом 5 мл непосредственно перед сортировкой, чтобы уменьшить слипание клеток и увеличить выход сортировки.
   4. Собирайте одиночные, живые крысиные ФАПы и МП непосредственно из клеточного сортировщика в 5 мл полипропиленовой сборной трубки, содержащей 1 мл стерильной, 100% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Держите ячейки на льду до завершения сортировки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При проведении СУИМ за пределами площадки переложить все отсортированные ячейки на лед и в защищенный, крытый контейнер.
   5. Работая в стерильном шкафу биобезопасности (BSC), доведите объем отсортированных клеток до 7 мл с соответствующими питательными средами (например, средой роста FAP (FAP GM) для отсортированных FAP и средой роста MP (MP GM) для отсортированных МП; см. Дополнительный файл для рецептов) и центрифугой при 500 x g, 4 ° C в течение 7 минут, чтобы удалить как можно больше остаточного буфера промывки.
   6. Повторно суспендировать гранулы в 1 мл соответствующей питательной среды и пластины в 12-луночную пластину, содержащую стерильную стеклянную крышку/лунку с коллагеновым покрытием 12 мм для последующего иммуноокрашивания (см. раздел 6).
      ПРИМЕЧАНИЕ: При иммуноцитохимическом окрашивании коллагена пластинчатые клетки сортируются в 12-луночную пластину, содержащую стерильную стеклянную крышку/лунку с ламининовой оболочкой 12 мм вместо коллагенового покрытия. Если требуются иммуноцитохимические эксперименты с немедленно выделенными предшественниками, засевают ФАП и МП плотностью 15 000 клеток на^см2 и переходят непосредственно к шагу 6.1. Для того, чтобы долгосрочные культуры индуцировали дифференцировку предшественника, семенные FAP при плотности 5000 клеток на^см2,а MPs при плотности 7 500 клеток на^см2.
   7. Инкубировать клетки при 37 °C и 5% CO₂ в инкубаторе клеточной культуры. После 72 ч в культуре меняют половину СМИ. Меняйте носитель полностью каждые 2-4 d после.
   8. Чтобы вызвать развитие миоцитов, переключите культуры депутатов на среду дифференциации МП (МД) на 9-й день культуры. Чтобы индуцировать адипоциты, переключите культуры FAP на среду адипогенной дифференцировки FAP (AD) на 10-й день культуры.
   9. Чтобы индуцировать фиброгенез, ФАП могут быть переведены на фиброгенную дифференцированную (FD) среду в переменное время во время культивирования или, альтернативно, могут быть посеяны непосредственно в среду FD после изоляции (этап 5.2.6) (см. Дополнительный файл для всех рецептов носителей).

6. Иммуноцитохимия культивируемых ФАПов и депутатов

1. Для проверки сортировки клеток и демонстрации чистоты культур FAP и MPs, иммуноокрашивание специфическими маркерами клеточного типа, включая PDGFRα (маркер FAPs), Pax-7 (маркер клеток мышечного ствола [спутника]), фибробласт-специфический белок (FSP-1, маркер фибробластов), перилипин-1 (Plin-1, маркер адипоцитов), коллаген типа 1 (Col1a1, индикатор фиброза), тяжелая цепь миозина (MHC, зрелый маркер миоцитов).
   1. Для иммуноокрашения свежеотсортированных клеток центрифугируют 12-луночную пластину при 200 х г в течение 3 мин при комнатной температуре, чтобы облегчить прилипание клеток к крышке/лунке. Этот шаг не является необходимым для долгосрочных культур. Удалите носитель языка и региональных параметров.
   2. Для иммуноокрашения ФСП-1 фиксируют клетки 1 мл 100% метанола (MeOH) в течение 2 мин при 4 °C. При иммуноокрашивании PDGFRα, Plin-1, Pax7 или Col1a1 фиксируют клеточные культуры с 1 мл 4% PFA в 1x PBS в течение 15 мин при комнатной температуре. Иммуноокрашающий MHC хорошо переносит либо фиксаторы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для клеток, фиксированных метанолом, пропустите этап 6.2 и перейдите к этапу 6.3.
2. Аспирировать 4% PFA и быстро промыть клеточные культуры 3-4 раза с 1x PBS. Добавьте 1 мл 100 мМ глицина в 1x PBS и инкубируйте в течение 10 мин при комнатной температуре для инактивации остаточной PFA. Аспирировать и промыть 1-2 раза 1x PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки можно оставить на этом этапе в 2 мл 1x PBS, обернуть в пищевую пленку и хранить при 4 °C в течение 7-10 дней максимум.
3. После промывки добавляют 1 мл 0,1% Тритона-Х в 1x PBS и инкубируют в течение 20 мин для пронизывания клеточных мембран.
4. Промывайте лунки 2-3 раза с 1-2 мл 1x PBS, затем блокируют ячейки с 1 мл 1x PBS + 3% BSA на скважину в течение 1 ч при комнатной температуре.
5. Пипетку 80 мкл первичного антитела разводят в 1x PBS + 3% BSA (PDGFRα 1:100, Pax7 аккуратно, FSP-1 1:50, Plin-1 1:400, Col1a1 1:250, MHC 3 мкг/мл) на кусок парапленки, приклеенный к подвижному контейнеру. Используя стерильные тонкие щипцы, осторожно вытащите крышку из лунки и переверните каплю раствора антител. Инкубируйте крышку с двумя влажными кусочками бумажного полотенца и накройте контейнер пластиковой пленкой, чтобы избежать испарения раствора антител. Инкубировать в течение ночи при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание покровных пластинок из скважины использует меньше антител (~80 мкл), чем окрашивание внутри скважины (минимум 500 мкл).
6. На 2-й день оставьте покровные листы комнатной температуры на 30 мин, чтобы согреть. Используя щипцы осторожно вправо и перенесите крышки обратно в соответствующие колодцы (клетки, обращенные вверх) и промыть 2-3 раза 1-2 мл 1x PBS в течение 2 минут каждый, чтобы удалить как можно больше первичных антител.
7. Используя ту же технику окрашивания, что и при первичном окрашивании антителом, окрашивают клетки вторичным антителом против кролика козы Alexa Fluor 488 (1:400) для обнаружения FSP-1, Plin-1, Col1a1 или PDGFRα и вторичным антителом Alexa Fluor 555 против козы (1:300) для обнаружения MHC или Pax-7. Инкубируйте клетки в течение 1 ч при комнатной температуре и держите клетки защищенными от света.
8. Вернуть клетки в лунку и инкубировать клетки с Hoechst (1:10 000) в течение 2-4 мин при комнатной температуре. Промыть клетки еще 2-3 раза с 1x PBS в течение 2 мин каждая, чтобы удалить лишнее Hoechst.
9. Установите крышки на стеклянные слайды с помощью флуоресцентной монтажной среды против выцветания и оставьте слайды сушиться на ночь в темноте при комнатной температуре. Храните установленные крышки при температуре 4 °C в темноте.

7. Окрашивание маслом Red O (ORO) культивируемых ФАПов и депутатов

1. Выполняют окрашивание ORO на непроницаемых клетках, так как пермеабилизация клеточной мембраны может привести к неспецифическому/нежелательному окрашиванию неадипогенных типов клеток. Перед началом окрашивания подготовьте рабочий материал ORO (рецепт см. в дополнительном файле) и инкубируйте при комнатной температуре в течение 20 минут.
2. Через 20 мин отфильтруйте раствор с помощью фильтра 0,2 мкм, чтобы удалить любые нерастворенные агрегаты.
3. Аспирировать среду из скважины и добавить 1 мл 10% нейтрального буферизованного формалина (10% NBF). Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Слияние клеток может привести к подъему из колодца/крышки. Будьте осторожны при аспирации/добавлении решений.
4. Аспирировать и добавлять 1 мл свежего 10% НБФ и инкубировать в течение не менее 1 ч при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть остановлен в этот момент, так как ячейки могут быть оставлены в 10% NBF на ночь.
5. Быстро промыть скважины один раз 1 мл 60% изопропанола, затем аспирировать и дать скважинам полностью высохнуть (примерно 2 мин).
6. Добавьте 400 мкл рабочего материала Oil Red O на скважину и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре, избегая пипетки любого ORO на стенках пластины.
7. Удалите все масло Red O и быстро промыть лунку 4 раза с dH₂O.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если окрашенные колодцы содержат крышки, монтируют с использованием того же метода, который описан на этапе 6.9.
8. Изображение либо смонтировано на крышках, либо окрашено хорошо с помощью ярко-полевого микроскопа.

8. Окрашивание тканей контралатерального и денервированного икроножных отделов крыс

1. Пикрозириус Красный (PSR)
   1. Выполните окрашивание PSR на 5 мкм толщиной, формалин-фиксированный парафин (FFPE) икроножных гистологических срезов крыс, как описано^{ранее 40.}
2. Масло Красное O (ORO)
   1. Зафиксируйте гистологические срезы икроножной железы 5 мкм толщиной 5 мкм в 4% PFA в течение 10 мин, инкубируйте в 60% изопропиловом спирте в течение 1 мин.
   2. Окрашивание с рабочим материалом ORO в течение 12 мин. Инкубировать в 60% изопропиловом спирте в течение 1 мин, промывать в течение 10 мин в dH_2O.Монтировать на крышки с помощью водорастворимой монтажной среды.
3. Sca-1 и флуоресцентная иммуногистохимия ткани ламинина (IHC)
   1. Выполняют флуоресцентный IHC на гистологических срезах икроножной железы икроножных желез толщиной 5 мкм.
   2. Образцы гидратов в 1x PBS в течение 5 мин, фиксируют в 4% PFA в течение 10 мин, а затем инкубируют образцы в тканевом растворе, блокирующем ПЧ (см. Дополнительный файл)в течение 90 мин.
   3. Инкубировать с первичным антителом против Sca-1 (1:500), разведенным в 1x PBS + 0,05% Tween при 4 °C в течение ночи.
   4. На 2-й день промыть три раза в 1x PBS + 0,05% Tween в течение 5 мин каждый, затем инкубировать в козьем анти-кролике Alexa Fluor 555 (1:500) в течение 1 ч.
   5. Снова промыть (как и раньше), инкубировать блокирующим раствором в течение 1 ч, затем добавить антиламининовое первичное антитело (1:500), разведенное в 1x PBS + 0,05% Tween в течение 1 ч.
   6. Снова промыть (как и раньше), затем инкубировать в козьем анти-кролике Alexa Fluor 488 (1:500) в течение 1 ч (для ламинина).
   7. Снова промыть (как и раньше), затем инкубировать в DAPI (1:10 000) в течение 4 мин. Мойте и монтируйте на крышки с помощью анти-выцветающей монтажной среды.

Representative Results

Идентификация FAP и MP с помощью проточной цитометрии с использованием новой панели антител, включая Sca-1 и VCAM-1
Стратегия определения ФАПов в мышцах крыс основана на протоколах проточной цитометрии у мыши^29,которая распространяется на CD31 (эндотелиальный) и CD45 (кроветворный) положительные клетки (называемые линией [Lin]) и исследует флуоресцентный профиль маркера FAPs Sca-1 и маркера MP ITGA7 из популяции linage-negative (Lin-). В отсутствие коммерчески доступных, флуорофорно-конъюгированных и проточных цитометрических антител для крыс Sca-1 и ITGA7 мы самоконъюгировали антитела к крысиному Sca-1::APC и предприняли альтернативную стратегию для идентификации депутатов. Поскольку недавно было показано, что VCAM-1 является эффективным единственным положительным маркером отбора для выделения крыс MPs³³ и доступно специфическое для крыс, конъюгированное, проверенное проточной цитометрией антитело, нацеленное на VCAM-1, мы использовали VCAM-1 для идентификации MP, в отличие от ITGA7.

Мы подтвердили успешную конъюгацию и производительность антитела Sca-1:APC с однократным окрашиванием компенсационных шариков и клеточных суспензий, полученных из здоровой икроножной мышцы крыс(Рисунок 2A,B). Пятиточечное титрование Sca-1::APC(Рисунок 2C)проводили в дополнение ко всем другим антителам (CD31::FITC, CD45::FITC, VCAM-1:PE), используемым впротоколе (Дополнительный рисунок 1),для определения оптимальных концентраций. Используя этот новый дизайн панели, предполагаемые FAP и MP были одновременно идентифицированы из здорового икроножного кишечника(рисунок 3),в результате чего клетки одноположительные для Sca-1 (Lin-/Sca-1+/VCAM-1-) были обозначены FAP (красная коробка), а клетки одноположительными для VCAM-1 (Lin-/Sca-1-/VCAM-1+) были обозначены MPs (синяя коробка). Мы также идентифицировали популяцию клеток, дважды положительных для Sca-1 и VCAM-1 (Lin-/Sca-1+/VCAM-1+)(рисунок 3F;верхний правый квадрант).

Валидация идентификации ФАПов и депутатов с помощью FACS и клеточной культуры
Чтобы проверить протокол, представленный для проточной цитометрической идентификации FAP и MP в скелетных мышцах крыс, мы стремились изолировать живые клетки для культуры in vitro. Используя FACS, жизнеспособные FAP и депутаты были изолированы с использованием той же стратегии гатинга, что и в проточном цитометрическом анализе. Приблизительно 20 000-40 000 FAP и 30 000-50 000 MP были собраны для клеточной культуры из одной икроножной мышцы у крысы весом 230 г.

Чтобы подтвердить чистоту каждой популяции, мы совместно иммуноиммунтировали свежеотсортированные FAP и MP для PDGFRα и Pax7. PDGFRα является вторым мезенхимальным маркером-прародителем, помимо Sca-1, обычно используемым для идентификации FAPs^2,7,8. Pax-7 является хорошо признанным и широко используемым маркером мышечных сателлитных (стволовых) клеток^41. Отсортированная популяция FAP показала положительное окрашивание pdgfRα без загрязнения положительными клетками Pax7(рисунок 4A;верхний ряд). И наоборот, отсортированная популяция депутатов окрашивалась положительно для Pax7 с отсутствием PDGFRα-положительных клеток(рисунок 4A;нижний ряд), подтверждая способность Lin-/Sca-1+/VCAM-1- и Lin-/Sca-1-/VCAM-1+ профилей антигена клеточной поверхности изолировать чистые популяции FAP и MP соответственно.

Затем мы культивировали отсортированные ФАП и депутатов в течение 10-12 дней в условиях, чтобы вызвать адипогенную, фиброгенную и миогенную дифференцировку. К 12-му дню культуры ФАПов, подвергшиеся адипогенным условиям, содержали клетки либо с фибробластоподобной морфологией, либо с мультилокулярной морфологией, аналогичной морфологии белых предадипоцитов с жировыми каплями (данные не показаны). Иммуноокрашивание для фибробласт-специфического белка-1 (FSP-1) подтвердило дифференцировку фибробластов, в то время как окрашивание для Plin-1 (Perilipin-1; маркер адипоцитов)⁴² и Oil red O подтвердило дифференцировку адипоцитов и наличие нейтральных триглицеридов и липидов соответственно(Рисунок 4B). Отсутствие загрязняющих клеток из миогенной линии в культурах FAPs было подтверждено совместным иммуноокрашиванием тяжелой цепи миозина (MHC), маркера дифференцированных миоцитов. Культуры FAPs, подвергшиеся фиброгенной дифференцировке (FD), оценивали на экспрессию коллагена типа 1 (Col1a1), одного из основных коллагенов, полученных из FAP^8. Совместное иммуноаммуноразведение col1a1 и MHC на 11-й день показало надежную экспрессию коллагена типа 1 без загрязнения MHC-положительных клеток(рисунок 4B). Окончательное подтверждение чистоты популяции ФАП было предпринято путем культивирования ФАПов в миогенных средах, чтобы стимулировать рост любых загрязняющих депутатов. Никаких MHC-положительных клеток не наблюдалось(дополнительный рисунок 2A).

Культуры МП, подвергшиеся миогенным условиям, продемонстрировали MHC-экспрессирующие зрелые миоциты и многоядерные миотрубы через 12 дней после покрытия(рисунок 4C). Коиммуноразведение культур МП с FSP-1 и Plin-1 продемонстрировало отсутствие загрязняющих фибробластов или адипоцитов соответственно. Аналогичным образом, окрашивание ORO не продемонстрировало липидного загрязнения (рис. 4С). Col1a1, который высоко экспрессируется фибробластами, также, как сообщается, продуцируется в меньшей степени миогенными предшественниками и миобластами, хотя в литературе есть противоречивые данные в этом отношении^8,43,44. В то время как совместное иммуноокрашивание МП с Col1a1 и MHC выявило дифференцировку миоцитов нашей культуры МП, не было обнаружено никаких доказательств иммунопозитивности Col1a1(рисунок 4C). Чтобы еще больше подтвердить чистоту популяции, культуры МП подвергали адипогенным или фиброгенным состояниям для стимулирования роста адипоцитов и фибробластов(Дополнительный рисунок 2В). Никаких загрязняющих клеток из линии FAPs не наблюдалось.

В то время как мы продемонстрировали способность идентифицировать и сортировать чистые популяции FAP и MP из крысиных мышц, мы затем попытались определить идентичность lin-/Sca-1+/VCAM-1+ (двойных положительных) клеток. Поскольку экспрессия Sca-1 была зарегистрирована у очень небольшой доли МП (примерно 3%) в здоровых мышцах⁴⁵ и аналогично мало ФАПов (около 4%), как сообщалось, экспрессировали VCAM-1 в здоровых мышцах^10,иммуноокрашение свежеотсортированных клеток Lin-/ Sca-1+/VCAM-1+ проводилось для PDGFRα и Pax7 наряду с культивированием их в миогенные, адипогенные, и фиброгенные состояния, индуцирующие миогенез, адипогенез и фиброгенез соответственно. Было обнаружено, что двойные положительные клетки представляли собой смешанную популяцию МП и ФАПов, причем свежеотсортированные клетки иммуностимно поражали либо PDGFRα, либо Pax7(дополнительный рисунок 3А),а культивируемые клетки дифференцировались в зрелые миоциты, адипоциты или фибробласты(дополнительный рисунок 3B, C).

ITGA7 против VCAM-1 для идентификации МП при проточной цитометрической идентификации ФАПов
В то время как был создан успешный протокол для проточной цитометрической идентификации крысиных FAP и MP с использованием Sca-1 и VCAM-1 соответственно, мы стремились определить, может ли самоконъюгированное антитело ITGA7 аналогичным образом использоваться для идентификации MPs вместо VCAM-1, как это стандартно у мыши. Специфическое для крысы антитело ITGA7 конъюгировали с PE-Cy7 (см. Дополнительный файл),и эффективность антитела была подтверждена на коммерческих компенсационных шариках и одноклеточных суспензиях, полученных из икроножной мышцы крыс(дополнительный рисунок 4A-C). Антитело ITGA7::P E-Cy7 адекватно работало на экспериментах с одиночным окрашиванием и FMO(дополнительный рисунок 4D). Однако при полном окрашивании суспензий икроножных клеток CD31::FITC, CD45::FITC, Sca-1::APC и ITGA7::P E-Cy7 стало очевидным взаимодействие между антителами Sca-1::APC и ITGA7::P E-Cy-7. Последующая культура как отсортированных FACS Lin-/Sca-1+/ITGA7-клеток (предполагаемые FAP), так и Lin-/Sca-1-/IGTA7+ клеток (предполагаемые MP)(дополнительный рисунок 4E)дала преимущественно FAP и с небольшим количеством MP(Дополнительный рисунок 4F),что указывает на взаимодействие между антителами Sca-1::APC и ITGA7::P E-Cy-7 негативно повлияло на специфичность идентификации клеток.

Новый временной курс FAPs в долгосрочных денервированных скелетных мышцах
Поскольку динамика ФАП оценивалась в контексте кратковременной травматической денервации, в мышиных моделях^11,38мы стремились проверить эффективность нашего метода для выделения ФАПов как из здоровых, так и из сильно атрофированных, фиброзных мышц. Крыс подвергали травматическому долговременному повреждению денервации с использованием хорошо подтвержденной односторонней трансекции большеберцового нерва модели⁴⁶ с икроножной мышцей, собранной в четырех последовательных временных точках в течение 14 недель после денервации из денервированной конечности и контралатеральной иннервированной конечности (для использования в качестве внутреннего контроля). Как сообщалось ранее, денервированная мышца продемонстрировала прогрессирующую атрофию(Рисунок 5A,B),с увеличением фиброза и отложением жира(Рисунок 5C-F)с течением^{времени 47.}

Наш протокол генерировал достаточное количество клеток для проточного цитометрического анализа, хотя 12 и 14 недель денервированной икроножной мышцы весили примерно 0,2-0,3 г (15-20% соответствующей контралатеральной контрольной мышцы)(рисунок 5B). Мы наблюдали повышение регуляции ФАП в денервированной икроножной мышце по сравнению с иннервированной контралатеральной контрольной мышцей, поддерживаемой в течение 14 недель эксперимента(Рисунок 6А,В),в соответствии с прогрессирующим мышечным фиброзом и отложением жира. Иммуноокрашивание Sca-1 мышечных гистологических поперечных сечений подтвердило локализацию Sca-1 экспрессирующих клеток в областях фиброзно-жирового изменения в 14-недельной денервированной мышце(рисунок 5G),в дополнение к исходной экспрессии в интерстиции между миофибрами в здоровой мышце. Отдельное подмножество клеток появилось в популяции FAP с течением времени после денервации, характеризующейся устойчивым увеличением сигнала Sca-1 (Sca-1 high; Рисунок 6А,красная рамка) по проточному цитометрическому анализу, в сравнении с базальной экспрессией ФАП Sca-1 (Sca-1 Med/Low; Рисунок 6А,зеленое поле). Количественная оценка этих субпопуляций выявила дифференциальную динамику с течением времени; Sca-1 Высокие FAP значительно увеличились через 12 и 14 недель после денервации(рисунок 6B),что составляет примерно половину общей популяции FAP(рисунок 6C). Напротив, Sca-1 Med/Low FAPs были доминирующей субпопуляцией через 2 и 5 недель после денервации(рисунок 6C)и показали только преходящее увеличение уровней ранней постденервации(рисунок 6B).

В отличие от устойчивого присутствия FAP в долгосрочных денервированных мышцах, депутаты продемонстрировали ожидаемую двухфазную реакцию на денервацию. Первоначально у депутатов увеличилась денервированная мышца выше той, что наблюдается в контрольной конечности, но через 5 недель после денервации популяция начала сокращаться(рисунок 6D). В соответствии с хорошо известным истощением популяции мышечных клеток-сателлитов в долгосрочной денервированной мышце^47,к 12 неделям депутаты были либо на исходных уровнях, либо ниже исходных уровней после трансекции большеберцового нерва.

Мы также проанализировали динамику популяции Lin-/Sca-1+/VCAM-1+(дополнительный рисунок 3D-E). В то время как частота двойных положительных клеток по отношению к lin-популяции постепенно уменьшалась в денервированных мышцах с течением времени, когда определялось абсолютное количество клеток на грамм мышцы, наблюдалось временное увеличение двойной положительной популяции до падения до или ниже исходных уровней через 14 недель после денервации.

Рисунок 1:Графическая схема идентификации, изоляции и культуры ФАПов и депутатов: Графическая схема, изображающая идентификацию ФАПов и депутатов от икроножной крысы. Образцы собирают и механически измельчают перед прохождением двух последовательных ферментативных сбраживаний. Затем тканевые препараты обрабатывают и фильтруют для получения одноклеточной суспензии. Коктейль флуоресцентно-конъюгированных антител добавляется к каждому образцу, который затем пропускается через проточный цитометр или сортировщик клеток, чтобы соответственно идентифицировать или изолировать FAP и MP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2:Sca-1::APC самоконъюгированная проверка и титрование антител. Валидация конъюгации антител Sca-1::APC путем однократного окрашивания на коммерческих компенсационных шариках(A)и одноклеточных суспензиях, полученных из здоровой икроножной мышцы крысы(B). Различные популяции как меченых шариков Sca-1, так и клеток очевидны (черные ящики). Титрование антител проводили путем тестирования пяти различных концентраций Sca-1::APC на одноклеточных суспензиях(C); оптимальная концентрация была выбрана на основе наибольшей интенсивности флуоресценции с минимальным фоновым окрашиванием и оказалась зависимой от партии. Репрезентативное титрование показано с конкретной оптимальной концентрацией партии, указанной красным прямоугольником. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3:Идентификация проточной цитометрии ФАПов и МП у икроножной мышцы крыс. (А-Ф) Стратегия захвата для проточного цитометрического анализа ФАПов и депутатов. (A) Образцы сначала закрыты для исключения мусора (черный ящик), а также для ворот для подсчета бусин (красный ящик). Затем ячейки закрываются для исключения дублетов как по характеристикам фронтального рассеяния (FSC)(B),так и по характеристикам бокового рассеяния (SSC)(C). Жизнеспособность полученных одиночных клеток оценивается окрашиванием SYTOX Blue(D). Затем отрицательные (живые) синглеты SYTOX Blue оцениваются на сигнал FITC, идентифицирующий CD31 и CD45 (Lineage; Lin) для исключения фракций Lin+ из дальнейшего анализа (черный ящик Lin-cells)(E). Затем популяция Lin- оценивается для сигнала Sca-1::APC по сравнению с сигналом VCAM-1::P E(F). FAP идентифицируются как Lin-/Sca-1+/VCAM-1- (F; красный прямоугольник), в то время как депутаты идентифицируются как события Lin-/Sca-1-/VCAM-1+ (F; синий прямоугольник). Также очевидна двойная положительная популяция Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ (верхний правый квадрант). (G)Элементы управления FMO (флуоресценция минус один) для CD31::FITC и CD45::FITC демонстрируют надлежащую компенсацию и разрыв для Lin-клеток. (H-I) Sca-1::APC против VCAM-1::P E графики элементов управления FMO демонстрируют надлежащую компенсацию и блокировку для FAP (Sca-1 FMO) и депутатов (VCAM-1 FMO). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4:Отсортированные FAP и MPs клеточная культура и иммуноокрашивание. (A)Коиммуноразрушение pdgfRα (зеленый) и Pax7 (красный) на свежеотсортированных FAP (верхний ряд) и депутатов (нижний ряд). Ядра окрашиваются в синий цвет с DAPI. FAP экспрессируют только PDGFRα и отсутствие положительных клеток Pax7 очевидны, в то время как MP исключительно экспрессируют Pax7 без PDGFRα-положительного клеточного загрязнения, демонстрируя чистоту обеих отсортированных популяций. (B)ФАПы на 12-й день в адипогенных дифференцировочных средах (AD) окрашивание положительно для фибробласт-специфического белка 1 (FSP-1; зеленый) и перилипина-1 (Plin-1; зеленый), демонстрируя дифференцированные фибробласты и адипоциты соответственно. Ядра окрашиваются DAPI (синим цветом). Окрашивание маслом Red O (ORO) (красным) указывает на наличие нейтральных триглицеридов и липидов, возникающих из зрелых адипоцитов к 12-му дню. FAP, подвергшиеся фиброгенным дифференцировочным средам (FD), демонстрируют экспрессию коллагена типа 1 (Col1a1; зеленый). ФАП, культивируемые в адипогенных или фиброгенных средах, не коиммунтизируют тяжелую цепь миозина (MHC, красный), что указывает на отсутствие загрязняющих миоцитов. (C)Депутаты, выращенные в миогенных дифференцировочных средах (MD) на 12-й день, демонстрируют MHC-положительное (красное) окрашивание, демонстрирующее наличие зрелых миоцитов и слитых многоядерных миотрубок. Ядра окрашиваются DAPI (синим цветом). Культуры МП были свободны от загрязнения фибробластами и адипоцитами, о чем свидетельствует отсутствие коиммуноразрашивания для окрашивания FSP-1 (зеленый), Plin-1 (зеленый) и ORO. Депутаты, выращенные на ламинине для адаптации к иммуноокрашиванию Co1a1, не демонстрируют такую же степень слияния миотруб к 12-му дню, как это происходит на коллагене. Col1a1 (зеленый) отсутствует в культурах MP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5:Атрофия, фиброз и жировая инфильтрация длительно денервированных мышц. (A) Репрезентативные икроножные мышцы в четырех последовательных временных точках после денервации. Икроножная мышца, обозначаемая CONTRA, является репрезентативным образцом контралатеральной конечности от двухнедельного денервированного животного. (B)Количественная оценка мышечной атрофии после денервации, выраженная как отношение денервированной (DEN) икроножной мышцы wet weight к соотношению контралатеральной (CONTRA) конечности. (C)Окрашенные гистологические срезы икроножной мышцы Picrosirius Red (PSR), собранные через 2 или 14 недель после денервации, демонстрируют прогрессирующий фиброз. Мышечные пятна желтые, коллагеновые пятна красные. (D)Фиброз количественно определяется путем определения площади PSR-положительной ткани относительно общей площади ткани. (E)Окрашенные маслом Red O (ORO) поперечные срезы икроножной крупы, собранные через 2 или 14 недель после денервации, окрашенные гематоксилином. Липиды окрашиваются в красный цвет. (F) Жировая инфильтрация, количественно определяемая путем определения площади окрашенной ткани ORO относительно общей площади ткани. (G) Гистологические срезы Gastrocnemius, собранные через 2 или 14 недель после денервации, иммуноокрашенные для ламинина (зеленый) и Sca-1 (красный). Ламинин положительно окрашивает базальную пластинку, которая окружает отдельные миофибры. Sca-1 идентифицирует несколько типов клеток-предшественников. Ядра окрашиваются DAPI (синим цветом). Вставка показывает локализацию клеток Sca-1+ вне базальной пластинки в здоровой мышце; желтые стрелки обозначают наличие клеток Sca-1+ в фиброзных областях. (Данные являются средними +/- S.D; n=3 для 2 и 14 недельных временных точек. Данные в панели B анализируются односторонним ANOVA, данные в панелях D и F анализируются двусторонней ANOVA. Пост-специальный тест Сидака выполнен для исправления для нескольких сравнений. * = P<0,05 между CONTRA и DEN; # = P<0.05 между примерами) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6:Динамика ФАПов и депутатов при длительной денервированной икроножной железе крысы. (A) Репрезентативные Sca-1::APC против VCAM-1::P E панелей популяции Lin- (CD31-/CD45-) из образцов мышц, собранных через 2, 5, 12 или 14 недель после денервации. Верхний ряд показывает участки из денервированного (DEN) икроножного кишечника, в то время как нижний ряд показывает участки из контралатеральной, неоперированной (CONTRA) икроножной мышцы. Lin-/Sca-1+/VCAM-1- FAPs (Total) подразделяются на фракции Sca-1 High (красная коробка) и Sca-1 Med/Low (зеленая коробка), в то время как Lin-/Sca-1-/VCAM-1+ MPS показаны в синем поле. (B)Количественная оценка FAP (Total, Sca-1 High, Sca-1 Med/Low) в каждой точке времени после денервации, сообщаемая как частота (%) lin-клеток (верхний ряд) и количество клеток на граммовую мышцу (нижний ряд), нормализованных до контралатерального контроля икроножной кожной кожности. (C)Относительные доли субпопуляций Sca-1 High и Sca-1 Med/Low в общей популяции FAPs. (D)Количественная оценка МП в каждой точке времени после денервации сообщается как частота (%) lin-клеток (левый график) и как количество клеток на граммовую мышцу (правый график), нормализованное для контралатерального контроля. (Данные являются средними +/- S.D; n=4 для 2 и 12 недельных временных точек; n=5 для 5-недельной временной точки; n=2 для 14-недельной временной точки. Данные анализируются односторонней ANOVA; Тест пост-hoc Sidak для исправления нескольких сравнений. # = П<0,05.) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1:Валидация и титрование антител. Валидация CD31::FITC (A-C), CD45::FITC (D-F) и VCAM-1::P E (G-I) коммерчески конъюгированных антител на компенсационных шариках (A,D,G) и одноклеточных суспензиях из здоровой икроножной мышцы крыс (B,E,H). Каждое антитело титровали в 5 различных концентрациях (C,F,I). Оптимальная концентрация была выбрана исходя из наибольшей интенсивности флуоресценции с минимальным фоновым окрашиванием (красные коробки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2:Отсортированные ФАП и депутаты в условиях культуры обратной дифференциации. (A)FAP, культивируемые в миогенных дифференцировочных средах (MD) на 12-й день, коиммуноразвитые для FSP-1 (зеленый), Plin-1 (зеленый) или Col1a1 (зеленый) и MHC (красный), не демонстрируют загрязнения миоцитов. Положительное окрашивание FSP-1 и Col1a1 выявляет дифференцировку FAP с фибробластами. Окрашивание ORO (красное) показывает выработку липидов, хотя положительные адипоциты Plin-1 не видны. Ядра окрашены DAPI (синий). (Б)Умерли депутаты, подвергшиеся адипогенной дифференциации сми. МП, культивируемые в FAP Growth Media (FAP GM) в течение 12 дней и совместно иммунопитанные для FSP-1 (зеленый) или Plin-1 (зеленый) и MHC (красный), демонстрируют дифференцированные миоциты и миотрубы с отсутствием положительных клеток FSP-1 или Plin-1. Отсутствие окрашивания ORO еще раз подтверждает отсутствие адипогенных клеток в культуре. МП, выращенные в фиброгенных дифференцировочных средах (ФД) и коиммуноразвитые для Col1a1 и MHC, показывают зрелые миоциты и отсутствие положительных клеток Col1a1. Депутаты, выращенные на ламинине для адаптации к иммуноокрашиванию Col1a1, не демонстрируют такую же степень слияния с миотрубами через 12 дней в культуре, как это происходит на коллагене. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 3:Lin-/Sca-1+/VCAM-1+клетки представляют собой смешанную популяцию FAP и MP. (A)PDGFRα и Pax7 коиммуноражающие свежеизолированные клетки Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ показывают смешанную популяцию PDGFRα одиночных положительных (белые стрелки) и Pax7 одиночных положительных (желтая стрелка) клеток, идентифицирующих FAP и MP, соответственно. (B)Культуры Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ на 12-й день, выращенные в миогенных дифференцировальных средах (MD), содержат как одиночные положительные (зеленые), так и одиночные положительные (красные) клетки MHC, идентифицирующие фибробласты и миоциты/трубки, соответственно. Отсутствие окрашивания Plin-1 (зеленый) и ORO (красный) свидетельствуют об отсутствии зрелых адипоцитов. Коиммуноразрушающие средства для Col1a1 (зеленый) и MHC (красный) показывают зрелые миоциты и фибробласты. (C)Клетки Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ на 12-й день, выращенные в адипогенных дифференцировальных средах (AD), аналогичным образом показывают смесь FSP-1 (зеленых) одиночных положительных и MHC (красных) одиночных положительных клеток, а также с одиночными положительными клетками Plin-1 (зелеными) и присутствующим окрашиванием ORO, подтверждая дифференцировку фибробластов, миоцитов и адипоцитов. Культуры, выращенные в фиброгенных дифференцировочных средах (FD), показывают зрелые миоциты и одиночные положительные клетки Col1a1 (фибробласты). (D)Репрезентативные Sca-1::APC против VCAM-1::P E-групп популяции Lin- (CD31-/CD45-) из денервированных мышечных образцов, собранных через 2-, 5-, 12- или 14-недельный период после денервации; Популяция Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ указана в фиолетовом поле. (E)Количественная оценка Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ клеток в четырех последовательных временных точках после денервации, сообщаемая как частота Lin-клеток (левый график) и клеток на граммовую мышцу (правый граф), нормализованных до контралатеральной икроножной мышцы. (Данные являются средними +/- S.D; n=4 для 2 и 12 недельных временных точек; n=5 для 5-недельной временной точки; n=2 для 14-недельной временной точки. Данные были проанализированы односторонней ANOVA; пост-специальный тест Сидака для исправления нескольких сравнений; # = П<0,05.) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 4:ITGA7 как маркер миогенных клеток в проточной цитометрии скелетных мышц крыс. Валидация конъюгации антител ITGA7::P E-Cy7 путем однократного окрашивания на коммерческих компенсационных шариках(A)и одноклеточных суспензиях, полученных из здоровой икроножной мышцы крысы(B). Популяции как меченых ITGA7 шариков, так и клеток очевидны (черные ящики)(C)Титрование антител проводилось путем тестирования пяти различных концентраций на одноклеточных суспензиях. Красная рамка указывает на идеальную концентрацию. (D)Графики флуоресценции минус один (FMO) контроля демонстрируют отсутствие флуоресцентного распространения через конъюгаты антител, но полное окрашивание клеточных суспензий показывает неспецифическое взаимодействие между Sca-1::APC и ITGA7::P E-Cy7 (зеленый прямоугольник). Gating(E)для разделения Lin-/Sca-1+/ITGA7-клеток (предполагаемые "FAP") и Lin-/Sca-1-/IGTA7+ ячеек (предполагаемые "MPs"). (F)Совместное иммуноиммунтирование клеточных культур, отсортированных FACS, через 12 дней после покрытия Перилипином-1 (зеленый) и MHC (красный) демонстрирует, что обе группы отсортированных клеток созрели преимущественно в адипоциты с небольшим количеством присутствующих миоцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

1. Незапятнанный

2. Контроль жизнеспособности

3. CD31 + CD45 FMO

4. Ска-1 ФМО

5. ВЧАМ-1 ФМО

6. CD31 + CD45 Одно пятно (Бусины)

7. CD31 + CD45 Одно окрашивание (клетки)

8. Sca-1 Одно пятно (Бусины)

9. Sca-1 Одно окрашивание (клетки)

10. VCAM-1 Одно пятно (Бусины)

11. VCAM-1 Одно окрашивание (клетки)

Таблица 1:Контроль окрашивания антител проточной цитометрией. Полный набор средств контроля окрашивания антителами. Если эксперимент проводится впервые, одноокрашенные элементы управления должны быть запущены как на компенсационных шариках, так и на одноклеточных суспензиях. Для всех последующих экспериментов одиночные окрашенные элементы управления нужно запускать только на компенсационных шариках.

	CD31::FITC (мкг)	CD45::FITC (мкг)	Sca-1::БТР (мкг)*	VCAM-1::P E (мкг)	СИТОКС Синий (мкМ; Конечная концентрация)
Незапятнанный контроль
	--	--	--	--	--
Элементы управления с одним окрашиванием
SYTOX Blue (Контроль жизнеспособности)	--	--	--	--	1
CD31 & CD45	0.5	0.25	--	--	1
Ска-1	--	--	0.25	--	1
ВЧАМ-1	--	--	--	0.25	1
Флуоресценция минус один (FMO)
CD31 & CD45	--	--	0.25	0.25	1
Ска-1	0.5	0.25	--	0.25	1
ВЧАМ-1	0.5	0.25	0.25	--	1
Экспериментальные образцы
Полное пятно	0.5	0.25	0.25	0.25	1

Таблица 2:Проточная цитометрия антител окрашивания матрицы. Показано количество антител для окрашивания экспериментальных и контрольных образцов для проточной цитометрии. Все окрашивание выполняется в общем объеме 100 мкл промывочного буфера. *Оптимальное количество самоконъюгированных антител Sca-1::APC может варьироваться в зависимости от используемой партии. Все свежесопряженные партии Sca-1::APC должны быть сначала проверены путем однократного окрашивания как компенсационных шариков, так и одноклеточных суспензий.

Дополнительный файл: Рецепты реагентов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Оптимизированный, проверенный протокол изоляции FAPs для мышц крыс имеет важное значение для исследователей, которые хотят изучить модели травм, которые неосуществимы у мыши по биологическим или техническим причинам. Например, мыши не являются оптимальной животной моделью для изучения хронических местных или нейродегенеративных травм, таких как долгосрочная денервация. Биологически, короткая продолжительность жизни и быстрое старение мышей затрудняют точное разграничение мышечных секвал из-за денервации от смешанного фактора старения. С технической точки зрения резкое снижение мышечной массы из-за тяжелой атрофии было бы недостаточным для эффективного проточного цитометрического анализа. Фактически, протоколы изоляции мышечных FAP предлагают группировать здоровые мышцы вместе, чтобы лучше увеличить выход отсортированных FAP^29. Хотя это решает технический барьер получения адекватной мышечной ткани для анализа, оно одновременно ограничивает исследователей от оценки FAP на мышечном уровне. Поскольку конкретные группы мышц по своей природе различаются по составу типа волокна, степени васкуляризации и, например, митохондриальным числам^47, объединение нескольких различных мышц для проточного цитометрического анализа предотвращает характеристику фапов, специфичных для мышц. Напротив, мы показываем, что как здоровые, так и долгосрочные денервированные, атрофические и фиброзные икроножные крысы обеспечивают достаточное количество исходного материала для эффективной проточной цитометрии. Кроме того, в здоровых образцах избыток мышц может быть дополнительно подразделен для нескольких последующих анализов, что позволяет исследователям одновременно анализировать клеточные, молекулярные и гистологические особенности одной и той же ткани. Наконец, для экспериментов, манипулирующих FAP в моделях травм с помощью терапевтических средств, доступны хорошо проверенные анализы физической функции и походки у бдительных и активных крыс^{21,22, 23,24,}что позволяет проводить серийную оценку мышечной функции без необходимости прекращения действия животного.

Ключевым препятствием в создании оптимизированного протокола изоляции FAPs для крысы была доступность антител. Наш первоначальный подход был направлен на копирование протоколов панели антител и стратегии захвата, широко используемых в мыши^{1,7,8,9,10,11,12,13,14.} В то время как коммерчески доступные, конъюгированные, протестированные проточной цитометрией и проверенные антитела, которые распознают крыс, были доступны для маркеров линии CD31 и CD45, не существовало ни одного для положительных FAP, идентифицирующих маркеры Sca-1 или PDGFRα, а также для отрицательного маркера отбора ITGA7. Неконъюгированные первичные антитела, специфичные для этих маркеров и предположительно эффективные в проточной цитометрии, были доступны, но из маркеров FAPs Sca-1 и PDGFRα только антитело Sca-1 было подтверждено в опубликованной литературе в проточном цитометрическом анализе клеток крыс^48. Поэтому мы выбрали Sca-1 в качестве положительного маркера отбора для FAP. Перспектива использования вторичных антител для очерчивания маркеров Sca-1 и ITGA7 была невозможна по нескольким причинам, но в первую очередь потому, что единственные крысиные специфические антитела для Sca-1 и ITGA7, проверенные для проточной цитометрии, были получены у одного и того же вида-хозяина. Поэтому оставшимся вариантом была самосопряжение обоих антител с использованием коммерчески доступных наборов.

Процесс выбора оптимального набора для конъюгации антител был обширным, так как многие наборы полностью или частично нетерпимы к различным разбавителям буфера (например, глицину, глицерину, BSA, азиду натрия), присутствующим в первичных антителах. Кроме того, предоставленный флуорофор должен быть совместим с лазерами, установленными в проточном цитометре/сортировщике клеток, доступном исследователю, и не излучать на длине волны, аналогичной другим флуорофорам, используемым для идентификации других типов клеток в образце. Наличие разбавляющих компонентов в специфических для крыс первичных антителах PDGFRα, которые были плохо совместимы с конъюгационными наборами, было дополнительным соображением при выборе Sca-1 в качестве положительного маркера выбора FAP в этом протоколе. Хотя эти результаты показывают, что конъюгации Sca-1::APC и ITGA7::P E-Cy7 привели к идентификации различных популяций с положительным окрашиванием как на компенсационных шариках, так и на клетках, было обнаружено, что первые проявляют распад флуоресценции раньше, чем рекламировалось производителем. Настоятельно рекомендуется, чтобы исследователи конъюгировали Sca-1::APC в соответствии с инструкциями производителя непосредственно перед первым использованием (например, за день до эксперимента) для обеспечения надежного сигнала, планировали эксперименты соответствующим образом таким образом, чтобы одна партия конъюгированных антител могла быть использована в окне эффективности антитела, и подтверждали каждую партию с помощью одноокрашенных компенсационных шариков и титрования на одноклеточных суспензиях. Однако, что еще более важно, критическое взаимодействие, отмеченное между Sca-1::APC и ITGA7::P E-Cy7, препятствовало точному разграничению популяций FAP против депутатов, что потребовало использования альтернативной стратегии.

Boscolo Sesillo et al. недавно продемонстрировали успешную проточную цитометрическую изоляцию стволовых клеток мышц крыс с использованием VCAM-1 в качестве одного положительного маркера отбора³³ в CD31, CD45 и CD11b отрицательных клетках. С VCAM-1 в качестве маркера выбора MP мы использовали новую панель антител для идентификации FAP (Lin-/Sca-1+/VCAM-1-) и MPs (Lin-/Sca-1-/VCAM-1+) и подтвердили подход с культурой in vitro отсортированных клеток FACS из здоровой икроножной мышцы. Свежеизолированные ФАП и депутаты с ослаблением иммунитета исключительно для их соответствующих альтернативных маркеров PDGFRα и Pax7. Культивируемые FAP дифференцируются в популяции зрелых фибробластов и адипоцитов, а MPs в зрелые миоциты / миотрубы. Никакого перекрестного загрязнения ФАПов и депутатов внутри культур не произошло. Иммуноокрашивание гистологических поперечных сечений подтвердило инфильтрацию участков фиброзно-жировой деградации в денервированных мышцах sca-1 положительными клетками.

В то время как мы проводили проточный цитометрический анализ долговременных денервированных мышц для проверки нашего протокола в сильно атрофированных, фиброзных и инфильтрированных жирами мышцах, мы случайно наблюдали появление субпопуляции FAPs с повышенным сигналом Sca-1 (обозначенным Sca-1 High) по сравнению с исходной экспрессией Sca-1 (обозначенной Sca-1 Med / Low) с течением времени. Sca-1 High FAP значительно увеличился после денервации (12 недель плюс), в то время как Sca-1 Med / Low FAPs достиг пика рано через 5 недель, прежде чем снизиться до базовых уровней. Сообщалось о гетерогенности фенотипа ФАП^10,30. Было показано, что ФАПы с более высокой экспрессией Sca-1 легче дифференцируются в адипоциты, а при воздействии фиброгенной стимуляции увеличивают экспрессию Col1a1^30,49. Наблюдаемая здесь динамика субпопуляций ФАП, по-видимому, соответствует временному ходу денервационных последствий и регенеративной способности мышц⁴⁷ и, таким образом, может характеризовать субпопуляции ФАП с различными клеточными программами. Sca-1 High FAP становятся повышенными в поздние моменты времени, что связано с фиброзно-жировой инфильтрацией и снижением регенеративного потенциала, в то время как Sca-1 Med / Low FAPs регулируются во время регенеративного окна мышц и могут помочь в эффективном регенеративном миогенезе. Протокол изоляции FAPs, представленный здесь, предоставляет исследователям возможность идентифицировать и изолировать эти различные популяции для будущего исследования.

Мы идентифицировали популяцию клеток, окрашивающихся положительно как для Sca-1, так и для VCAM-1 (Lin-/Sca-1+/VCAM-1+) и установили, что эта двойная положительная популяция представляет собой смесь FAP и MP. Разделение этой популяции с использованием третьего маркера - ITGA7 - было невозможно из-за взаимодействия между первичными антителами Sca-1 и ITGA7. Малекова и его коллеги сообщили о субпопуляции VCAM-1, экспрессирующих ФАПы, которые почти отсутствуют в здоровых мышцах, временно увеличиваются при остром воспалении, а их персистенция у мышей MDX (модель мышечной дистрофии) была связана с хроническим воспалением мышц и фиброзом^10. Напротив, и хотя это не чистая популяция FAPs, мы обнаружили, что популяция Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ снизилась до или ниже исходных уровней с хроническим мышечным фиброзом через 12 и 14 недель после денервации. Денервация не вызывает ту же воспалительную реакцию и циклические попытки регенерации, которые испытывают мыши MDX, что может объяснить различия в наших результатах. Наша идентификация депутатов в клеточной популяции Lin-/Sca-1+/ VCAM-1+ соответствует отчету о экспрессии Sca-1 на очень небольшой доле депутатов в здоровых мышцах, с преходящим увеличением после травмы во время пролиферации миобластов и последующим выводом из клеточного цикла^45. Таким образом, в то время как наша стратегия маркировки антител и фильтрации FACS успешно изолирует чистые популяции FAP и MP для изучения, эксперименты, требующие количественной оценки этих популяций на основе проточной цитометрии, могут немного занижать их количество из-за небольшого процента клеток в обеих линиях предшественников, которые совместно экспрессируют Sca-1 и VCAM-1. Несмотря на это, нынешний протокол ясно демонстрирует классическую двухфазную реакцию депутатов на травму денервации с краткосрочным повышением регуляции и последующим истощением популяции в долгосрочной денервации мышц. Аналогичным образом, увеличение FAP, о котором сообщалось при изолированном краткосрочном повреждении денервацией, резюмируется здесь и, как показано, в дальнейшем поддерживается с использованием долгосрочной модели трансекции большеберцового нерва.

Таким образом, этот протокол предоставляет исследователям ранее неисследованное животное, крысу, у которой можно использовать методы проточной цитометрии для одновременного изучения ФАПов и МП. Эксперименты на мышах, ограниченных количеством скелетных мышц, и частой необходимостью проводить терминальные эксперименты для оценки мышечной силы и функции, могут быть легко проведены на более крупной крысе и с более широким спектром нелетальных методов силы и функциональной оценки. В целом, исследования FAPs на крысах могут выявить новые роли этой ключевой популяции предшественников в острых и хронических мышечных и периферических нервных травмах и заболеваниях, что впоследствии увеличивает потенциал для разработки клеточно-специфических методов лечения.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube	Falcon	352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap	Falcon	352235
10 cm cell culture dishes	Sarstedt	83.3902
12-well cell culture plate	ThermoFisher	130185
12 mm glass coverslips, No.2	VWR	89015-724
10 mL Syringe	Beckton Dickenson	302995
15 mL centrifuge tubes	FroggaBio	91014
20 gauge needle	Beckton Dickenson	305176
25mL Serological pipette	Sarstedt	86.1685.001
40µm cell strainer	Fisher Scientific	22363547
50mL centrifuge tubes	FroggaBio	TB50
AbC Total Antibody Compensation Beads	ThermoFisher	A10497
Ammonium Chloride, Reagent Grade	Bioshop	AMC303.500
APC Conjugation Kit, 50-100µg	Biotium	92307
Aquatex Aqueous Mounting Medium	Merck	108562
Biolaminin 411 LN	Biolamina	LN411
Bovine Serum Albumin (BSA)	Bioshop	ALB001
Calcium Chloride	Bioshop	CCL444.500
Collagenase Type II	Gibco	17101015
CountBright Plus Absolute Counting Beads	ThermoFisher	C36995
Dexamethasone	Millipore Sigma	D4902
Dispase	Gibco	17105041
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)	Gibco	11995-065	(+)4.5 g/L D-Glucose (+)L-Glutamine (+)110 mg/L Sodium Pyruvate
EDTA	FisherScientific	S311
FACSClean Solution	Beckton Dickenson	340345
FACSDiva Software	Beckton Dickenson	--
FACSRinse Solution	Beckton Dickenson	340346
Fetal Bovine Serum	Sigma	F1051
Flow Cytometry Sheath Fluid	Beckton Dickenson	342003
FlowJo Software	Beckton Dickenson	--
Fluorescent Mounting Medium	Dako	S302380-2
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody	Invitrogen	A21424
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody	Invitrogen	A11008
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody	Invitrogen	A21429
Goat Serum	Gibco	16210-064
Ham's F10 Media	ThermoFisher	11550043	(+) Phenol Red (+) L-Glutamine (-) HEPES
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X)	Multicell	311-513-CL
Heat Inactivated Horse Serum	Gibco	26050-088
Hemocytometer	Reichert	N/A
HEPES, minimum 99.5% titration	Sigma	H3375
Horse Serum	ThermoFisher	16050130
Human Transforming Growth Factor β1 (hTGF-β1)	Cell Signaling	8915LF
Humulin R	Lilly	HI0210
IBMX	Millipore Sigma	I5879	Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine
Isopropanol	Sigma	I9516	Also known as 2-propanol
Lewis Rat, Female	Charles River Kingston	004 (Strain Code)	200-250 grams used
LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer	Beckton Dickenson	--
Microcentrifuge	Eppendorf	EP-5417R
MoFlo XDP Cell Sorter	Beckman Coulter	--
Mouse Anti-CD31::FITC Antibody	Abcam	ab33858	Clone TLD-3A12
Mouse Anti-CD45::FITC Antibody	Biolegend	202205	Clone OX-1
Mouse Anti-CD106::PE Antibody	Biolegend	200403	Also known as VCAM-1
Mouse Anti-MHC Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	N/A	Also known as MF20
Mouse Anti-Pax7 Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	N/A
Neutral Buffered Formalin, 10 %	Sigma	HT501128
Oil Red O	Millipore Sigma	O0625
PE-Cy7 Conjugation Kit	Abcam	ab102903
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X)	Gibco	10010-023	(-)Calcium Chloride (-)Magnesium Chloride
Potassium Bicarbonate, Reagent Grade	Bioshop	PBC401.250
Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody	Invitrogen	MA5-32347	FSP-1 also known as S100A4
Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody	Abcam	ab203254
Rabbit Anti-Laminin Antibody	Sigma	L9393
Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody	Abcam	ab3526
Rabbit Anti-Sca-1 Antibody	Millipore Sigma	AB4336
Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody	Abcam	ab260043	Also known as Col1a1
Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody	Abcam	ab203491
Recombinant Human FGF-basic	Gibco	PHG0266
Sodium Azide	Sigma	S2002
Triton-X-100	Fisher Scientific	BP151
Troglitazone	Millipore Sigma	T2573
Tween-20	Bioshop	TWN510