Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تحديد وعزل وتوصيف السلف الليفية الشحمية (FAPs) والذرى العضلية المنشأ (أعضاء البرلمان) في العضلات الهيكلية في الجرذ

Published: June 9, 2021 doi: 10.3791/61750
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2
1Keenan Research Center for Biomedical Science, St Michaels Hospital, Unity Health Toronto, 2Department of Medicine and Interdepartmental Division of Critical Care Medicine, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

يحدد هذا البروتوكول طريقة لعزل السلف الليفية الدهنية (FAPs) والذريات العضلية المنشأ (أعضاء البرلمان) من عضلات الهيكل العظمي للفئران. استخدام الفئران في نماذج إصابة العضلات يوفر زيادة توافر الأنسجة من العضلات الضمرة للتحليل وذخيرة أكبر من الأساليب المعتمدة لتقييم قوة العضلات ومشية في الحيوانات الحرة الحركة.

Abstract

البروبونات الدهنية الليفية (FAPs) هي خلايا الخلالي المقيم في العضلات الهيكلية التي، جنبا إلى جنب مع السلف العضلية (أعضاء البرلمان)، تلعب دورا رئيسيا في التوازن العضلي، والإصابة، وإصلاح. وقد أجريت البروتوكولات الحالية لتحديد ال FAPs وعزل استخدام قياس التدفق الخلوي / تفرز الخلايا المنشطة بالفلور (FACS) والدراسات التي تقيم وظيفتها في الجسم الحي حتى الآن حصريا في الفئران. يسمح الحجم المتأصل الأكبر للفئران بإجراء تحليل أكثر شمولا ل FAPs في نماذج إصابات العضلات الهيكلية ، خاصة في العضلات الضمورية الشديدة أو عندما يحتاج المحققون إلى كتلة أنسجة كبيرة لإجراء فحوصات متعددة في المصب. يوفر الجرذ بالإضافة إلى ذلك مجموعة أكبر من المقايسات الوظيفية العضلية التي لا تتطلب التخدير الحيواني أو التضحية ، وبالتالي تقليل المراضة واستخدام الحيوانات من خلال تمكين التقييمات التسلسلية. وبروتوكولات قياس التدفق الخلوي/مركبات الكربون الهيدروفلورية المحسنة للفئران هي أنواع محددة، يحد منها بشكل خاص خصائص الأجسام المضادة المتاحة تجاريا. لم يتم تحسينها لفصل FAPs من الفئران أو العضلات الليفية للغاية. تم تطوير بروتوكول قياس التدفق الخلوي / FACS لتحديد وعزل FAPs و أعضاء البرلمان من كل من العضلات الهيكلية للفئران الصحية وإزالة النرفع ، بالاعتماد على التعبير التفاضلي للعلامات السطحية CD31 و CD45 و Sca-1 و VCAM-1. كما الفئران محددة، تدفق الأجسام المضادة الأولية التحقق من صحة قياس الخلايا محدودة للغاية، تم إجراء اقتران في المنزل من الأجسام المضادة التي تستهدف Sca-1. وباستخدام هذا البروتوكول، تأكد نجاح اقتران Sca-1، وتم التحقق من صحة تحديد التدفق الخلوي ل FAPs و أعضاء البرلمان من خلال زراعة الخلايا والتلطخ المناعي ل FACS المعزولة من أعضاء البرلمان. وأخيرا ، فإننا تقرير رواية FAPs الوقت بالطبع في فترة طويلة (14 أسبوعا) نموذج denervation الفئران. توفر هذه الطريقة للمحققين القدرة على دراسة FAPs في نموذج حيواني جديد.

Introduction

خلايا السلف الليفية الدهنية (FAPs) هي مجموعة من الخلايا السلف المقيمة متعددة القدرات في العضلات الهيكلية التي تلعب دورا حاسما في التوازن العضلي والإصلاح والتجديد ، وعلى العكس من ذلك ، تتوسط أيضا الاستجابات المرضية لإصابة العضلات. وكما يوحي الاسم، تم تحديد FAPs في الأصل كجهاز ذري مع إمكانية التفريق إلى الخلايا الليفية والخلايا الدهنية1 وكان يزعم أنها الوسيط الرئيسي لتسلل العضلات الدهنية الليفية في الإصابات المزمنة والمرض. وكشفت دراسة أخرى أن FAPs هي بالإضافة إلى ذلك قادرة على تكوين العظام وchondrogenesis2,3,4. وهكذا ، فهي أكثر على نطاق واسع في الأدب كما mesenchymal أو السلف سترومال3،5،6،7،8. في إصابة العضلات الهيكل العظمي الحادة, FAPs المساعدات بشكل غير مباشر في تكوين عضلي التجديدية من خلال الانتشار عابر لتوفيربيئةمواتية لخلايا الأقمار الصناعية العضلات المنشطة وسلفهم المصب myogenic (أعضاء البرلمان) نظرائهم 1,9,10. بالتوازي مع التجديد الناجح ، تخضع FAPs لداء الخلايا المبرمج ، مع إعادة أعدادها إلى مستويات خط الأساس1و9و10و11. في المقابل، في إصابة العضلات المزمنة، FAPs تجاوز إشارات الموالية أبوتوبوتيك، مما يؤدي إلى استمرارها9،10،11 وإصلاح العضلات غير طبيعية.

في دراسات الجسم الحي تقييم الآليات الخلوية والجزيئية التي FAPs التوسط استجابات العضلات استخدمت نماذج مورين حتى الآن1،7،9،10،11،12،13،14. في حين أن الفئران المعدلة وراثيا هي أدوات قوية للاستخدام في هذه التحليلات ، فإن صغر حجم الحيوان يحد من توافر الأنسجة للدراسة في نماذج الإصابات المترجمة على المدى الطويل حيث يمكن أن يكون ضمور العضلات عميقا ، مثل الحرمان الرضي. وعلاوة على ذلك، يتطلب قياس قوة العضلات والوظيفة البدنية قياسات الجسم الحي السابق أو في الموقع التي تتطلب إنهاء الماوس، أو في أساليب الجسم الحي التي تتطلب عملية جراحية و / أو مخدر عام للسماح بتقييم أداء العضلات تقلص15،16،17،18،19،20 . في الفئران، والتحقق من صحة جيدا وتستخدم عالميا التحليلات الوظيفية العضلات، بالإضافة إلى تحليلات للسلوكيات الحركية أكثر تعقيدا مثل تحليل مشية (على سبيل المثال، مؤشر وظيفة الوركي، تحليل CatWalk) موجودة ويتم تنفيذها في الحيوانات مستيقظا وتتحرك تلقائيا21،22،23،24 . هذا بالإضافة إلى ذلك يحسن مبادئ الحد الأدنى من المراضة في التجارب على الحيوانات، وأعداد الحيوانات البحثية المستخدمة. وبالتالي يوفر الجرذ المحقق FAPs المرونة المضافة من حجم العضلات المصابة أكبر لتحليل البروتين والخلوية والقدرة على إجراء تقييمات تسلسلية للنشاط الوظيفي الثابت والديناميكية المعقدة العضلات والسلوكيات، في الحيوان التنبيه.

وقد تم تحديد FAPs في المقام الأول وعزلها عن عينات العضلات الكاملة باستخدام قياس التدفق الخلوي وفرز الخلايا المنشطة بالفلورسينس (FACS) على التوالي. هذه هي المقايسات المستندة إلى الليزر التي هي قادرة على تحديد مجموعات خلايا محددة متعددة على أساس ميزات مميزة مثل الحجم، والحبيبة، ومزيج معين من سطح الخلية أو علامات داخل الخلايا25. هذا مفيد للغاية في دراسة نظام الأعضاء مثل العضلات الهيكلية ، حيث أن التوازن والتجديد معقدان ، وعمليات متعددة العوامل ينسقها عدد كبير من أنواع الخلايا. حددت دراسة أساسية FAPs، فضلا عن أعضاء البرلمان، وذلك باستخدام أساليب تدفق القياسات الخلوية في العضلات الهيكل العظمي الماوس1. وأظهروا أن FAPs هي mesenchymal في الطبيعة، لأنها تفتقر إلى مستضدات سطحية خاصة بالخلايا من أصول البطانية (CD31)، والهيماتوبوليتيك (CD45)، أو الميوجينيك (Integrin-α7 [ITGA7])، ولكنها أعربت عن علامة الخلايا الجذعية المتوسطة Sca-1 (مستضد الخلايا الجذعية1) 1 وتباينت في الخلايا الليفية والخلاعية في الثقافة. وأظهرت دراسات أخرى العزلة الناجحة من السلف المتوسطة في العضلات على أساس التعبير عن علامة الخلايا الجذعية البديلة, مستقبلات عامل النمو المستمدة من الصفائح الدموية ألفا (PDGFRα)2,7,8 وكشف مزيد من التحليل هذه من المرجح أن تكون نفس مجموعة الخلايا كما FAPs3. يتم تحديد FAPs الآن بشكل شائع في قياس التدفق الخلوي باستخدام Sca-1 أو PDGFRα كعلامة اختيارإيجابية 1و9و10و11و12و13و14و26و27و28و29و30و31 . استخدام PDGFRα هو تفضيلي للأنسجة البشرية ومع ذلك، كما هواة الإنسان المباشر من مورين سكا-1 لم يتم تحديد32. وبالإضافة إلى ذلك، تم الإبلاغ عن بروتينات سطح الخلية الأخرى كعلامات لأعضاء البرلمان (على سبيل المثال، VCAM-1)، وتوفير بديل محتمل ل ITGA7 كمؤشر على خلايا النسب الميوجيني خلال عزلة FAPs33.

في حين تدفق قياس الخلايا / FACS هو منهجية قوية لدراسة دور والإمكانات المسببة للأمراض من FAPs في العضلات الهيكل العظمي1،9،10،11،13،29، فإنه يقتصر من الناحية الفنية من خلال خصوصية والتحسين من الكواشف المطلوبة. منذ تحديد تدفق الخلايا والعزلة من ال FAPs وقد وضعت وأجريت في نماذج الماوس1،9،10،11،29، وهذا يطرح تحديات للباحثين الذين يرغبون في دراسة FAPs في الكائنات الحية نموذج آخر. تختلف العديد من العوامل - مثل الحجم الأمثل للأنسجة التي سيتم معالجتها ، وكذلك خصوصية و / أو خصوصية الأجسام المضادة وتوافرها - اعتمادا على الأنواع المستخدمة.

بالإضافة إلى الحواجز التقنية لدراسة FAPs في نموذج حيواني جديد ، فقد تمت دراستها إلى حد كبير في بيئة حادة وسامة - عادة عن طريق الحقن الكيميائي العضلي أو سم القلب. يقتصر تقييم الديناميكيات طويلة الأجل ل FAPs في المقام الأول على التقييم في ضمور العضلات في دوشين ، باستخدام نموذج الماوس mdx9،10،11، ونماذج من إصابة العضلات المركبة مثل تمزق الكفة الدوارة الضخم حيث يتم إجراء تحويل الوتر المتزامن واستئصال النرجيل على عضلات الكتف26،27،28 . استجابة FAPs للإهانة الوحيدة من الحرمان من الصدمة المزمنة ، وهو أمر شائع في حوادث مكان العمل في الصناعة الثقيلة والزراعة ، وفي صدمات الولادة (إصابة الضفيرة العضدية)34،35،36،37 مع اعتلال كبير ، لم تكن مميزة بشكل جيد ، وغالبا ما تقتصر على إطار زمني قصير الأجل11،38.

نحن نصف طريقة لتحديد وعزل FAPs والنواب من العضلات الهيكلية الصحية وكذلك الضمورة والليفية بشدة في الفئران. أولا، يتم إثبات تحديد CD31-/CD45-/SCA-1+/VCAM-1- FAPs وCD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ أعضاء البرلمان باستخدام هضم الأنسجة وتدفق بروتوكول تلطيخ قياس الخلايا ويتم التحقق اللاحق من النتائج التي توصلنا إليها من خلال الثقافة والتلوين الكيميائي المناعي للخلايا المعزولة من FACS. باستخدام هذه الطريقة ، ونحن أيضا تقرير رواية FAPs الوقت بالطبع في نموذج إصابة denervation معزولة على المدى الطويل في الفئران.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يجب أن يحصل المحققون الذين يجرون هذا البروتوكول على إذن من مجلس أخلاقيات الحيوان المحلي / لجنة الرعاية. تمت الموافقة على جميع الأعمال الحيوانية من قبل لجنة رعاية الحيوان في مستشفى سانت مايكل يونيتي تورونتو (ACC # 918) وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعها المجلس الكندي لرعاية الحيوان (CCAC). يظهر مخطط بروتوكول قياس التدفق الخلوي في الشكل 1. إذا كان التطبيق المتلقى للمعلومات هو FACS وثقافة الخلية اللاحقة، يجب إكمال كافة الخطوات باستخدام تقنية aseptic المناسبة.

1. حصاد العضلات

  1. تخدير الفئران باستخدام مخدر مناسب والتضحية وفقا لvivirium المحلية والمبادئ التوجيهية لمجلس أخلاقيات الحيوان. هذا البروتوكول يحصد عضلة المعدة والأمعاء من الفئران لويس الإناث البالغة (200-250 غرام)، كمثال. تم تخدير الفئران باستخدام 2-3٪ Isoflurane وتم التضحية بها عن طريق الحقن داخل القلب من T61.
  2. بمجرد التضحية بالحيوان ، حلق الجزء الخلفي بأكمله لتسهيل موقع العضلات وتقليل تلوث الفراء في الأنسجة المحصودة.
  3. باستخدام مشرط معقم، قم بعمل شقين في الجلد: الأول حول محيط مفصل الكاحل والثاني حتى خط الوسط للجانب الوسطي من المفصل الخلفي من الكاحل إلى الورك.
  4. قشر الظهر الجلد وطبقات العضلات السطحية للكشف عن gastrocnemius الكامنة، والتي تنشأ في condyles المتوسطة والظرفية من عظم الفخذ ويدخل في وتر أخيل.
  5. استخدام تشريح حاد لفصل gastrocnemius من الأنسجة المحيطة بها، والتعامل مع العضلات فقط عن طريق الوتر لتجنب إصابة سحق.
  6. فصل gastrocnemius من إدراجها عن طريق تحويل وتر أخيل كما distally ممكن مع مقص حاد. قطع مرة واحدة، وفهم وتر أخيل مع ملقط وقشر بلطف gastrocnemius قبالة العظام تحت. لا يزال عقد العضلات مع ملقط في يد واحدة، وتحديد موقع أصول gastrocnemius 'اثنين وقطع في condyles الفخذية المتوسطة والظروية.
  7. لطخة gastrocnemius المقتطعة بلطف ضد قطعة معقمة من الشاش لإزالة أكبر قدر ممكن من الدم. تقليم العضلات على سطح معقم وإزالة أي النسيج الضام الزائد، فضلا عن وتر أخيل.
  8. ضع العضلات في قارب وزن ووزن باستخدام مقياس دقيق. هذا البروتوكول هو الأمثل لهضم العضلات مع وزن الرطب تتراوح بين 200-600 ملغ. قد يقوم المشغلون تقسيم الأنسجة المحصودة الزائدة إلى أجزاء فرعية لإجراء فحوصات أخرى في المصب، إذا رغبت في ذلك.
  9. بلطف مزيد من تقسيم العضلات حصادها لاستخدامها لتدفق قياس الخلايا إلى 3-4 قطع أصغر (حوالي 1-2 سم3)وتغمر في الجليد الباردة 1x PBS. حافظ على البرودة على الجليد حتى يتم حصاد جميع العينات.

2. هضم العضلات

  1. إزالة العضلات من برنامج تلفزيوني ومكان في طبق زراعة الخلية 10 سم معقمة. المسيل للدموع بلطف والأنسجة المفروم مع ملقط حتى قطع هي ما يقرب من 3-4 ملم3،وإزالة أكبر قدر ممكن من النسيج الضام. مرة واحدة مفرومة جيدا, نقل إلى أنبوب مخروطي معقم 50 مل تحتوي على 6 مل DMEM + 1٪ البنسلين / العقدية (P / S).
  2. إضافة 10 ميكرولتر من 300 م م م CaCl2 حل إلى 365 ميكرولتر من كولاجيناز الثاني حل (تركيز المخزون 4800 U/mL) لتنشيط انزيم الكولاجينز. أضف محلول الكولاجيناز II المنشط إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على ملاط الأنسجة سعة 50 مل. تركيز كولاجيناز الثاني النهائي هو 250 U/mL.
  3. احتضان الأنابيب في شاكر ل 1 ساعة في 37 درجة مئوية، 240 × ز،مع التأكد من دوامة يدويا كل 15 دقيقة لطرد أي الأنسجة التي انضمت إلى جانب الأنبوب.
  4. بعد 1 ساعة، قم بإزالة الأنابيب من شاكر وأضف ما يلي لكل عينة: 100 ميكرولتر من كولاجيناز II (4,800 U/mL) و50 ميكرولتر من ديسباس (4.8 U/mL).
  5. عينات ماصة باستخدام ماصة المصلية 15-20 مرة حتى الحل هو متجانسة. إذا كان تجهيز عينات متعددة، استخدم ماصة معقمة منفصلة لكل عينة لتجنب التلوث العرضي للعينة.
  6. احتضان مرة أخرى في شاكر لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية و 240 × ز. بعد 15 دقيقة، يهز العينات باليد لطرد الأنسجة الملتصقة قبالة جانب الأنبوب.

3. توليد تعليق خلية واحدة

  1. قم بقص العينات ببطء من خلال حقنة 10 مل مع إبرة 20 G لمدة 10 دورات.
    ملاحظة: دورة واحدة ينطوي على تناول حل العضلات في حقنة, وحقنها مرة أخرى في أنبوب. ضمان لتقليل أي فقاعات عن طريق استكمال القص ببطء، كما زبد المفرط يمكن أن يسبب موت خلية إضافية39.
  2. ضع مصفاة خلايا 40 ميكرومتر على أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل ورطب عن طريق أنابيب 5 مل DMEM + 10٪ FBS و 1٪ P/S.
  3. ماصة 1 مل من العينة في وقت واحد من خلال مصفاة الخلية.
  4. غسل مصفاة الخلية عن طريق الأنابيب DMEM مع 10٪ FBS و 1٪ P / S من خلال مصفاة ليصل إجمالي حجم في الأنبوب إلى 25 مل.
  5. تقسيم 25 مل من العينة بالتساوي إلى أنبوبين مخروطيتين سعة كل منهما 15 مل وطارد مركزي عند درجة حرارة 15 درجة مئوية، و400 × ز لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: تقسيم حل العضلات إلى أنبوبين مخروطيين سعة كل منهما 15 مل يضمن استعادة أفضل للخلايا بعد الطرد المركزي مقارنة بأنبوب واحد.
  6. أسبيرات supernatant وإعادة تعليق بيليه في 1 مل 1x RBC Lysis العازلة (انظر ملف التكميلية)في درجة حرارة الغرفة لمدة 7 دقائق للقضاء على كريات الدم الحمراء.
  7. رفع مستوى الصوت إلى 10 مل مع 9 مل من العازلة غسل (انظر ملف التكميلية)وأنابيب تدور في 400 × ز، 15 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  8. يستنشق الكريات الفائقة والتكميل عن طريق إعادة تعليق في 1 مل غسل العازلة.
  9. نقل حجم مناسب من الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي صغير منفصل سعة 1.5 مل واخلطه مع صبغة زرقاء تريبان. عد الخلايا الحية على المجهر الخفيف باستخدام مقياس الدم.

4. تلطيخ الأجسام المضادة لتدفق قياس الخلايا

ملاحظة: يجب أن يكون الجسم المضاد SCA-1 مترافقا مع APC قبل إجراء تجارب قياس الخلايا/FACS، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يجب التحقق من صحة الأداء لكل دفعة من الموازات(الشكل 2). يمكن تخزين التوازج النهائي في 20 ميكرولتر aliquots في -20 درجة مئوية ومستقرة لمدة ثلاثة أسابيع. راجع الملف التكميلي للحصول على بروتوكول اقتران كامل.

  1. لقياس التدفق الخلوي، قم بنقل 1-2 × 106 خلايا لكل عينة تجريبية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 مل. جلب حجم يصل إلى 1 مل مع عازلة غسل ومكان على الجليد.
  2. لكل تجربة، قم بإعداد عناصر التحكم المطلوبة التالية: '1' عناصر التحكم في البقاء غير الملطخة و'2' لتحديد مجموعة الخلايا الحية بدقة؛ '2' الضوابط التي يمكن أن تكون ذات مقومات البقاء؛ '2' الضوابط التي يمكن أن تكون ذات مقومات البقاء؛ '2' الضوابط التي يمكن أن تكون على قيد الحياة؛ '2' الضوابط التي يمكن أن تكون ذات مقومات البقاء iii) الفلورسينس ناقص واحد (FMO) ضوابط على تعليق خلية واحدة لتعيين بوابات دقيقة للCD31-/CD45- كسور, FAPs, والنواب; و4) حبات تعويض واحد ملطخ لتصحيح لامتداد الفلورية بين القنوات.
    1. لجميع عناصر التحكم في الخلايا، aliquot 5 × 105 - 1 × 106 خلايا في 1 مل من العازلة غسل في أنبوب 1.5 مل جهاز الطرد المركزي الدقيق ومكان على الجليد.
    2. بالنسبة لعناصر التحكم في الخرز، أضف قطرة واحدة من حبات التعويض الإيجابية (~ 1.5 × 10حبات 5 لكل قطرة) إلى كل أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 مل. ويرد في الجدول 1كامل عناصر التحكم.
      ملاحظة: إذا كان يتم إجراء التجربة لأول مرة، قم بتشغيل عناصر تحكم ذات لون واحد لكل جهاز مضاد مترافق على تعليق خلية واحدة (بالإضافة إلى حبة التعويض غير الملطخة والجدوى وضوابط FMO) لتقييم السكان الملونين الإيجابيين في الخلايا والتحقق من صحة التلطيخ الملاحظ على حبات التعويض. التحقق من صحة كل Sca-1:: APC إعداد حديثا عن طريق تنفيذ تلطيخ واحد على حبات التعويض وتعليق خلية واحدة. راجع الجدول 1 للحصول على قائمة كاملة بعناصر التحكم في التلطيخ.
  3. لإعداد التحكم في الجدوى، قم بنقل نصف حجم الخلايا من أنبوب "البقاء" إلى أنبوب طرد مركزي صغير جديد سعة 1.5 مل. تسمية هذا الأنبوب "الميت".
  4. احتضان "الميت" أنبوب في 65 درجة مئوية لمدة 2-3 دقائق لقتل الخلايا، ثم وضعها على الجليد. بعد 2-3 دقائق، إعادة الجمع بين الخلايا الميتة مع الخلايا الحية المتبقية في أنبوب التحكم في الجدوى. سيتم استخدام هذه المجموعة من الخلايا لتعيين قيم التعويض (إذا لزم الأمر) وتعيين بوابات لصبغة الجدوى بشكل صحيح.
  5. الطرد المركزي تعليق خلية واحدة (عينات تجريبية والضوابط) في 500 × ز، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  6. يستنشق الكريات الخلية الفائقة وإعادة تعليق في 100 ميكرولتر غسل العازلة.
  7. إضافة أجسام مضادة، اعتمادا على عينة تجريبية أو السيطرة. راجع مصفوفة التلطيخ(الجدول 2)للحصول على معلومات حول تركيبات الأجسام المضادة ومبالغها.
  8. نفض الغبار بلطف كل عينة لضمان الاختلاط الكامل واحتضان على الجليد في الظلام لمدة 15 دقيقة. للحصول على تعويض الخرز، واحتضان في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 15 دقيقة.
  9. بالنسبة للعينات التجريبية وعينات التحكم في تعليق الخلية الواحدة، قم بإحضار الحجم إلى 1 مل بإضافة مخزن مؤقت للغسيل سعة 900 ميكرولتر. للحصول على عناصر تحكم حبة التعويض، رفع مستوى الصوت إلى 1 مل مع 900 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1x.
  10. أجهزة الطرد المركزي عينات تعليق خلية واحدة في 500 × ز، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. مراقبة حبة تعويض الطرد المركزي عند 300 × ز، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
  11. لجميع عينات تعليق الخلية الواحدة، يستنشق ويتخلص من الكريات الخلوية الفائقة وإعادة تعليقها في مخزن غسيل 300 ميكرولتر. للحصول على تعويض الخرز الضوابط، أسبيرات والتخلص من supernatant، وإعادة تعليق بيليه في 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1x، ثم إضافة 1 قطرة (~ 1.5 × 105) من الخرز التعويض السلبي.
  12. الحفاظ على جميع عينات تعليق خلية واحدة على الجليد تحت رقائق الألومنيوم والمضي قدما في تدفق اكتساب القياسات الخلوية. يجب أيضا حماية ضوابط حبة التعويض من الضوء ولكن يمكن الاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: إذا كانت نقطة النهاية التجريبية هي تعريف FAPs بواسطة قياس التدفق الخلوي، يرجى اتباع الخطوات 5.1.1-5.1.11. إذا كانت نقطة النهاية عزل الخلية عبر FACS للثقافة والتلوين، يرجى اتباع الخطوات 5.2.1-5.2.9 والأقسام 6-7.

5. تدفق قياس الخلايا وفلورسينس تنشيط فرز الخلايا (FACS)

  1. قياس التدفق الخلوي
    ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول مقياس تدفق الخلايا على سطح المقعد مجهزا بأشعة ليزر 405 نانومتر و488 نانومتر و640 نانومتر قادرة على تمييز 10 ألوان مختلفة في نفس الوقت. مرشحات باندباس والفلوروشرومات المرتبطة بها المستخدمة في هذا البروتوكول هي على النحو التالي: 450/50 (SYTOX Blue)، 530/30 (FITC)، 575/25 (PE)، و 670/30 (APC). الفولتية لكل كاشف هي على النحو التالي: FSC 700; SSC 475; FITC 360; PE 460; PE-Cy7 600; SYTOX الأزرق 360; APC 570. تأكد من تدريبك على التشغيل السليم لقياس التدفق الخلوي أو فرز الخلايا قبل الاستخدام.
    1. تأكد من تشغيل مقياس الخلايا لمدة 10-20 دقيقة قبل الاستخدام وتم تجهيزه بالتنظيف بالتسلسل باستخدام حلول سائل التنظيف والشطف والغماد لمدة 30-45 ق لكل منهما. الانتهاء مع شطف مع DH2O. تأكد من أن تم إضافة كمية كافية من السائل غمد إلى حاوية التخزين للحفاظ على تدفق العينة المناسبة في جميع أنحاء الاستحواذ.
    2. وضع استراتيجية الصياغة لتحديد أعضاء البرلمان والنواب على النحو المحدد في الشكل 3.
      ملاحظة: يتم تحديد أعضاء البرلمان والشخصيات من خلال استراتيجية التنغيز الهرمية التالية: '1' SSC-A مقابل FSC-A (منطقة مبعثر الخلية الجانبية مقابل منطقة مبعثر الخلية الأمامية لفصل الخلايا مقابل الحطام)، '2' FSC-W vs FSC-H (عرض مبعثر الخلية الأمامية مقابل ارتفاع مبعثر الخلية الأمامية للتمييز بين المفردات من doublets في معلمة FSC)، iii) SSC-W مقابل SSC-H (عرض مبعثر الخلية الجانبية مقابل ارتفاع مبعثر الخلية الجانبية للتمييز بين المفردات من doublets في معلمة SSC)، 4) SSC-A مقابل SYTOX الأزرق (للتمييز بين العيش مقابل الميت الفردي)، v) SSC-A مقابل CD31/45::FITC (لاستبعاد خلايا CD31+ و CD45+ من مزيد من التحليل)، و السادس) SCA-1::APC مقابل VCAM-1::P E من CD31-/CD45- (النسب؛ Lin-) السكان (تحديد هوية أعضاء البرلمان والنواب). يتم تعريف FAPs ك أحداث CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- ويتم تحديد أعضاء البرلمان على أنهم أحداث CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ .
    3. تشغيل أولا كل حبة تعويض ملطخة واحدة التحكم من خلال السيتومتر على سرعة منخفضة لتوليد قيم التعويض المستخدمة لتصحيح أي امتداد مضان بين القنوات. تقييم التعويض عن طريق مقارنة إشارة الفلورسنت لكل عنصر تحكم في جهاز الكشف الخاص به (على سبيل المثال، SSC-A مقابل APC لSCA-1::APC حبات واحدة ملطخة) وكذلك جميع أجهزة الكشف الأخرى. وينبغي أن يكون هناك مجموعتان متميزتان (واحدة مع سلبية وواحدة مع إشارة إيجابية) في الكاشف المناسب وسوى مجموعة سلبية في جميع أجهزة الكشف الأخرى. تعيين بوابة الإيقاف إلى أحداث حبة التعويض 10,000 وتسجيل البيانات.
      ملاحظة: بين الحصول على كل عينة، تأكد من تشغيل dH2O من خلال السيتومتر لمدة 10-20 ثانية لتجنب التلوث عينة إلى عينة.
    4. العملية التالية عينات التحكم غير الملطخة وقابلية البقاء لبوابة بشكل صحيح على الخلايا الفردية الحية. تعيين بوابة إيقاف إلى أحداث مفردة 10,000 وتسجيل البيانات.
      ملاحظة: ما يقرب من 5 دقائق قبل الحصول على كل عينة تعليق خلية واحدة باستثناء العينة غير الملطخة، إضافة 1 ميكرولتر من صبغة قابلية البقاء الأزرق SYTOX (تركيز العمل 300 ميكرومتر المخفف من محلول مخزون 1 mM) إلى كل عينة ونفض الغبار بلطف لخلط (التركيز النهائي 1 ميكرومتر).
    5. ثم الحصول على عينات التحكم تعليق خلية واحدة المتبقية. تقييم كل مراقبة FMO مع مؤامرة المناسبة في استراتيجية gating (الشكل 3). على سبيل المثال، قم بتقييم إشارة FITC لبوابة CD31+CD45 FMO لضمان بوابة CD31-/CD45 دقيقة. يظهر مثال الأمثل في الشكل 3G. إذا كان البروتوكول يتم تنفيذه لأول مرة، يجب تشغيل عناصر تحكم ذات لون واحد على الخلايا قبل الحصول على عناصر تحكم FMO.
    6. تقييم إشارة الفلورسنت لكل عينة خلية واحدة ملطخة في كاشفها المناسب وكذلك في جميع أجهزة الكشف الأخرى للتحقق من التعويض المناسب. تعيين بوابة التوقف إلى 10،000 الأحداث الفردية الحية وسجل على البرنامج.
    7. وبمجرد تجهيز جميع عناصر التحكم (تعليق الخلايا الواحدة والخرز)، أعد جميع العينات التجريبية عن طريق قياس وتسجيل حجم كل عينة أولا. وستستخدم هذه القياسات لتحديد عدد أعضاء البرلمان ونوابه بدقة، على النحو المبين في الخطوة 5-1-11. ثم، إضافة 50 ميكرولتر من الخرز العد الدقيق ومزيج بلطف عن طريق pipetting صعودا وهبوطا 2-3 مرات.
    8. قم بتشغيل العينة التجريبية الأولى لفترة وجيزة للتحقق من صحة تحديد مجموعة حبات العد. يظهر هذا السكان ككتلة صغيرة منفصلة عن مجموعة الخلايا العامة على مؤامرة FSC-A مقابل SSC-A(الشكل 3A، المربع الأحمر). إنشاء بوابة حول السكان حبة العد. ثم الحصول على بيانات لكل عينة تجريبية عن طريق المعالجة من خلال السيتومتر على سرعة منخفضة. تعيين بوابة التوقف إلى 10،000 عد أحداث حبة وسجل.
      ملاحظة: يمكن للمحققين بدلا من ذلك تحديد الخرز العد عن طريق إعداد مؤامرة إضافية تقييم SSC-A مقابل أي من أجهزة الكشف، والخرز العد هي الفلورسنت في جميع أجهزة الكشف.
    9. بعد أن تتم معالجة جميع العينات، قم بتنظيف مقياس الخلايا باستخدام البروتوكولات المناسبة. تصدير كافة البيانات للتحليل.
    10. افتح كافة ملفات البيانات على برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي المناسب. تعيين استراتيجية gating كما هو مستخدم للحصول على البيانات كما هو موضح في الخطوة 5.1.2. فحص عناصر التحكم بنفس الترتيب كما هو الحال في الحصول على البيانات (على سبيل المثال، غير ملطخة، وقابلية البقاء، وصمة عار واحدة، ثم ضوابط FMO) لإعادة التحقق من صحة استراتيجية gating. بمجرد تعيين بوابات دقيقة باستخدام ضوابط FMO ، وتطبيق البوابات على جميع العينات التجريبية. تصدير البيانات الأولية كجداول بيانات للقياس الكمي.
    11. حساب عدد أعضاء البرلمان والنواب في كل عينة تجريبية باستخدام الخرز العد:
      Equation 1
      حيث، عدد الخلايا المكتسبة هو عدد الأحداث المسجلة من السكان الخلية ذات الصلة (مثل FAPs أو أعضاء البرلمان) على البرمجيات اقتناء؛ عدد الخرز المكتسب هو عدد الأحداث المسجلة لحساب الخرز على برنامج الاستحواذ؛ يعد حجم الخرز هو حجم حل حبة العد المضاف في الخطوة 5.1.7؛ حجم العينة هو حجم كل عينة تجريبية ملطخة قبل إضافة الخرز العد.; تركيز الخرز هو عدد الخرز لكل محلول ميكرولتر؛ تم العثور على هذه القيمة في ورقة بيانات المنتج.
  2. FACS - الفرز لثقافة الخلية
    ملاحظة: ينفذ هذا البروتوكول FACS على فرز الخلايا مجهزة 4 أشعة الليزر (الأشعة فوق البنفسجية، البنفسجي، الأزرق، الأحمر) التي هي قادرة على التمييز في وقت واحد 11-14 لونا. اتبع تلطيخ العينة التجريبية (القسم 4) وبروتوكول قياس التدفق الخلوي، باستثناء الخطوات من 1 إلى 3 المحددة أدناه، لتحسين سير عمل FACS:
    1. زيادة تركيز الخلايا في العينات التجريبية ليتم فرزها إلى 7 × 106 خلايا / مل لتوليد غلة قوية من FAPs والنواب.
    2. ولحصر هذه الزيادة الكبيرة في تركيز الخلية، تضاعف تركيزات الأجسام المضادة في العينات التجريبية التي سيتم فرزها.
    3. معالجة عينات الخلية الملونة النهائية من خلال 40 ميكرومتر خلية مصفاة سقف الملصقة على أنبوب البوليسترين 5 مل مباشرة قبل الفرز للحد من تكتل الخلية وزيادة غلة الفرز.
    4. جمع واحد، ويعيش FAPs الفئران والنواب مباشرة من مفرز الخلية في أنبوب جمع البولي بروبلين 5 مل تحتوي على 1 مل من المصل البقري الجنيني المعقمة، 100٪ (FBS). إبقاء الخلايا على الجليد حتى اكتمال الفرز.
      ملاحظة: إذا كان إجراء FACS في موقع خارج الموقع، نقل جميع الخلايا المفرزة على الجليد وفي حاوية آمنة مغطاة.
    5. العمل في خزانة السلامة البيولوجية العقيمة (BSC) ، وجلب حجم الخلايا المفرزة تصل إلى 7 مل مع وسائل الإعلام النمو المناسبة (على سبيل المثال ، وسائل الإعلام نمو FAP (FAP GM) ل FAPs فرزها ، ووسائط نمو MP (MP GM) لأعضاء البرلمان فرزها ؛ انظر الملف التكميلي لوصفات) والطرد المركزي في 500 × ز ، 4 درجة مئوية لمدة 7 دقائق لإزالة أكبر قدر ممكن من المخزن المؤقت المتبقية غسل ممكن.
    6. الكريات ريسوسبند في 1 مل من وسائل الإعلام النمو المناسبة ولوحة في لوحة 12 جيدا تحتوي على معقمة، المغلفة بالكولاجين 12 مم الزجاج coverslip / جيدا لstaining المناعية اللاحقة (انظر القسم 6).
      ملاحظة: إذا تلطيخ الكيمياء المناعية للكولاجين، لوحة فرز الخلايا إلى لوحة بئر 12 تحتوي على معقمة، مغلفة بالليمينين 12 مم الزجاج coverslip / جيدا، بدلا من الكولاجين المغلفة. إذا كانت هناك حاجة لتجارب الكيمياء المناعية للذريين المعزولين على الفور ، فإن أعضاء البرلمان والبذور بكثافة 15000 خلية لكل سم2 والمضي قدما مباشرة إلى الخطوة 6.1. بالنسبة للثقافات طويلة الأجل للحث على تمايز السلف ، فإن البذور FAPs بكثافة 5000 خلية لكل سم2، والنواب بكثافة 7500 خلية لكل سم2.
    7. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في حاضنة زراعة الخلايا. بعد 72 ساعة في الثقافة، تغيير نصف وسائل الإعلام. تغيير الوسائط بالكامل كل 2-4 d بعد.
    8. للحث على تطوير الخلايا العضلية ، وتحويل ثقافات أعضاء البرلمان إلى النائب التمايز (MD) المتوسطة في اليوم 9 من الثقافة. للحث على الخلايا الدهنية، قم بتبديل ثقافات FAPs إلى وسيط التمايز الدهني FAP (AD) في اليوم العاشر من الثقافة.
    9. للحث على تكوين ليفي، يمكن تحويل FAPs إلى وسائط التمايز الليفي (FD) في أوقات متغيرة أثناء الثقافة، أو بدلا من ذلك، يمكن زرعها مباشرة في وسائط FD بعد العزل (الخطوة 5.2.6) (انظر الملف التكميلي لجميع وصفات الوسائط).

6. الكيمياء المناعية لأعضاء البرلمان والشخصيات المثقفة

  1. للتحقق من صحة فرز الخلايا وإظهار نقاء ثقافات أعضاء البرلمان والنواب، immunostain مع علامات محددة من نوع الخلية بما في ذلك PDGFRα (علامة FAPs) ، باكس - 7 (جذع العضلات [الأقمار الصناعية] علامة الخلية) ، البروتين الليفي محددة (FSP - 1 ، علامة الخلايا الليفية) ، Perilipin - 1 (Plin - 1 ، علامة الخلايا الدهنية) ، نوع الكولاجين 1 (Col1a1 ، مؤشر التليف) ، سلسلة ميوزين الثقيلة (MHC ، علامة الخلايا الصباغية الناضجة).
    1. لاحتواء المناعة من الخلايا الطازجة فرزها، والطرد المركزي لوحة 12 جيدا في 200 × ز لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتسهيل الالتزام الخلايا إلى coverslip / جيدا. هذه الخطوة ليست ضرورية للثقافات طويلة الأجل. إزالة الوسائط الثقافية.
    2. لاحتواء المناعة باستخدام FSP-1، قم بإصلاح الخلايا باستخدام الميثانول 1 مل 100٪ (MeOH) لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. إذا كان مناعة لPDGFRα، بلين-1، Pax7 أو Col1a1، إصلاح ثقافات الخلايا مع 1 مل 4٪ PFA في برنامج تلفزيوني 1x لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تتسامح التثبيط المناعي MHC مع أي من المثبتات.
      ملاحظة: بالنسبة للخلايا الثابتة الميثانول تخطي الخطوة 6.2 ثم انتقل إلى الخطوة 6.3.
  2. اسبيرات 4٪ PFA وغسل بسرعة ثقافات الخلايا 3-4 مرات مع برنامج تلفزيوني 1x. إضافة 1 مل من 100 مل الجليسين في برنامج تلفزيوني 1x واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتثبيط PFA المتبقية. أسبيرات وغسل 1-2 مرات مع برنامج تلفزيوني 1x.
    ملاحظة: يمكن ترك الخلايا في هذه المرحلة في 2 مل من برنامج تلفزيوني 1x، ملفوفة في فيلم التشبث وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة 7-10 أيام كحد أقصى.
  3. بعد الغسيل، إضافة 1 مل من 0.1٪ تريتون-X في برنامج تلفزيوني 1x واحتضان لمدة 20 دقيقة لبيرمابيليز أغشية الخلايا.
  4. غسل الآبار 2-3 مرات مع 1-2 مل من 1x PBS ثم كتلة الخلايا مع 1 مل من 1x PBS + 3٪ BSA لكل بئر لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  5. ماصة 80 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخففة في 1x PBS + 3٪ BSA (PDGFRα 1:100، Pax7 أنيق، FSP-1 1:50، بلين-1 1:400، Col1a1 1:250، MHC 3 ميكروغرام / مل) على قطعة من البارافيلم مسجلة على حاوية متنقلة. باستخدام ملقط غرامة معقمة، ورفع بعناية coverslip من البئر وعكس على قطرة من محلول الأجسام المضادة. احتضان غطاء مع قطعتين مبللتين من منشفة ورقية وحاوية تغطية في فيلم بلاستيكي لتجنب تبخر محلول الأجسام المضادة. حضانة بين عشية وضحاها في 4 °C.
    ملاحظة: تلطيخ الأغطية من البئر يستخدم الأجسام المضادة أقل (~ 80 ميكرولتر) من تلطيخ داخل البئر (500 ميكرولتر الحد الأدنى).
  6. في اليوم الثاني، اترك الأغطية في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة حتى تدفئ. باستخدام ملقط الحق بعناية ونقل coverlips العودة إلى الآبار الخاصة بهم (الخلايا التي تواجه) وغسل 2-3 مرات مع 1-2 مل من برنامج تلفزيوني 1x لمدة 2 دقيقة لكل لإزالة أكبر قدر ممكن من الأجسام المضادة الأولية.
  7. باستخدام نفس تقنية تلطيخ كما هو الحال مع تلطيخ الأجسام المضادة الأولية ، وصمة عار الخلايا مع الماعز المضادة للأرانب اليكسا فلور 488 الأجسام المضادة الثانوية (1:400) للكشف عن FSP - 1 ، بلين - 1 ، Col1a1 ، أو PDGFRα والماعز المضادة للفأرة اليكسا فلور 555 الأجسام المضادة الثانوية (1:300) للكشف عن MHC أو باكس - 7. احتضان الخلايا لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة والحفاظ على الخلايا المحمية من الضوء.
  8. عودة الخلايا إلى البئر واحتضان الخلايا مع Hoechst (1:10،000) لمدة 2-4 دقائق في درجة حرارة الغرفة. غسل الخلايا مرة أخرى 2-3 مع برنامج تلفزيوني 1x لمدة 2 دقيقة لكل لإزالة Hoechst الزائدة.
  9. جبل coverlips على الشرائح الزجاجية باستخدام المتوسطة تصاعد الفلورسنت المضادة للتلاشي وترك الشرائح لتجف بين عشية وضحاها في الظلام في درجة حرارة الغرفة. مخزن الأغطية التي شنت في 4 درجة مئوية في الظلام.

7. النفط الأحمر O (ORO) تلطيخ من نواب الثقافات ونواب

  1. إجراء تلطيخ ORO على الخلايا غير permeabilized، كما permeabilization من غشاء الخلية يمكن أن يؤدي إلى تلطيخ غير محددة / غير مرغوب فيها من أنواع الخلايا غير الدهنية. قبل البدء في تلطيخ، وإعداد مخزون العمل ORO (انظر الملف التكميلي للوصفة) واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
  2. بعد 20 دقيقة، قم بتصفية الحل باستخدام فلتر 0.2 ميكرومتر لإزالة أي مجاميع غير محلولة.
  3. أسبيرات وسائل الإعلام من جيدا وإضافة 1 مل من 10٪ محايدة العازلة الفورمالين (10٪ NBF). حضانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يمكن أن يؤدي التقاء الخلايا إلى الرفع من البئر/الغطاء. الحرص عند القرصنة / إضافة الحلول.
  4. أسبيرات وإضافة 1 مل من الطازجة 10٪ NBF واحتضان لمدة 1 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول عند هذه النقطة، كما يمكن ترك الخلايا في 10٪ NBF بين عشية وضحاها.
  5. غسل الآبار بسرعة مرة واحدة مع 1 مل من 60٪ isopropanol، ثم يستنشق والسماح لل آبار لتجف تماما (حوالي 2 دقيقة).
  6. إضافة 400 ميكرولتر النفط الأحمر O المخزون العامل لكل بئر واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، مع التأكد من تجنب الأنابيب أي ORO على جدران لوحة.
  7. إزالة كل من النفط الأحمر O وغسل الآبار بسرعة 4 مرات مع DH2O.
    ملاحظة: إذا كانت الآبار الملطخة تحتوي على أغطية، قم بتركيبها باستخدام نفس التقنية كما هو موضح في الخطوة 6.9.
  8. صورة إما الأغطية التي شنت أو البئر الملطخة باستخدام المجهر brightfield.

8. تلطيخ الأنسجة من المقاطع المعدية الجرذ المزيلة والغذاء

  1. بيكروسيريوس الأحمر (PSR)
    1. أداء PSR تلطيخ على 5 ميكرومتر سميكة، البارافين الفورمولين الثابتة جزءا لا يتجزأ (FFPE) الفئران أقسام المعدة والأمعاء كما هو موضح سابقا40.
  2. O الأحمر النفط (ORO)
    1. إصلاح 5 ميكرومتر سميكة isopentane المجمدة الجرذ أقسام المعدة والهلوسة في 4٪ PFA لمدة 10 دقيقة، واحتضان في الكحول isopropyl 60٪ لمدة 1 دقيقة.
    2. وصمة عار مع الأسهم العاملة ORO لمدة 12 دقيقة. احتضان الكحول isopropyl 60٪ لمدة دقيقة واحدة، وغسل لمدة 10 دقيقة في DH2O. جبل على coverlips باستخدام وسائل الإعلام تصاعد للذوبان في الماء.
  3. Sca-1 والأنسجة اللامينين الكيمياء المناعية الفلورية (IHC)
    1. إجراء IHC الفلورسنت على 5 ميكرومتر سميكة isopentane المجمدة الجرذ أقسام المعدة والهلوسة الفئران.
    2. عينات هيدرات في برنامج تلفزيوني 1x لمدة 5 دقائق، وإصلاح في 4٪ PFA لمدة 10 دقيقة ثم احتضان العينات في محلول حجب الأنسجة IF (انظر الملف التكميلي)لمدة 90 دقيقة.
    3. احتضان مع المضادة للSCA-1 الأجسام المضادة الأولية (1:500) المخفف في برنامج تلفزيوني 1x + 0.05٪ توين في 4 °C بين عشية وضحاها.
    4. في اليوم 2، يغسل ثلاث مرات في 1x PBS + 0.05٪ توين لمدة 5 دقائق لكل منهما، ثم احتضان في الماعز المضادة للأرنب اليكسا فلور 555 (1:500) لمدة 1 ساعة.
    5. غسل مرة أخرى (كما كان من قبل)، واحتضان مع حل حجب ل1 ساعة، ثم إضافة الأجسام المضادة لللامينين الأولية (1:500) المخفف في برنامج تلفزيوني 1x + 0.05٪ توين لمدة 1 ساعة.
    6. يغسل مرة أخرى (كما كان من قبل)، ثم احتضان في الماعز المضادة للأرنب اليكسا فلور 488 (1:500) لمدة 1 ساعة (لللحنين).
    7. يغسل مرة أخرى (كما كان من قبل) ثم احتضان في DAPI (1:10،000) لمدة 4 دقائق. غسل وجبل على coverlips باستخدام المضادة تتلاشى تصاعد المتوسطة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تحديد FAPs والنواب عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام لوحة الأجسام المضادة الجديدة بما في ذلك Sca-1 و VCAM-1
وتستند استراتيجية gating لتحديد FAPs في عضلة الفئران على بروتوكولات قياس التدفق الخلوي في الماوس29، والتي بوابة على CD31 (البطانية) وCD45 (الهيماتوبوليتيك) الخلايا الإيجابية (يطلق عليها النسب [لين]) ويدرس الملف الفلوري لعلامة FAPs Sca-1 والنواب علامة ITGA7 من السكان ليناج سلبية (لين) السكان. في غياب الأجسام المضادة المتاحة تجاريا، والمترافقة بالفلوروفوري، والتدفق المعتمدة لقياس الخلايا للفئران Sca-1 و ITGA7، قمنا بتقتران جسم مضاد للفئران Sca-1::APC، واضطلعنا باستراتيجية بديلة لتحديد أعضاء البرلمان. كما VCAM-1 تبين مؤخرا أن تكون فعالة علامة اختيار إيجابية واحدة لعزل أعضاء البرلمان الفئران33 والجرذان محددة، مترافقة، تدفق الأجسام المضادة التحقق من صحة قياس الخلايا التي تستهدف VCAM-1 متاح، ونحن استخدم VCAM-1 لتحديد أعضاء البرلمان، بدلا من ITGA7.

أكدنا نجاح اقتران وأداء الأجسام المضادة SCA-1:APC مع تلطيخ واحد من حبات التعويض وتعليق الخلايا المتولدة من gastrocnemius الفئران صحية (الشكل 2A, B). تم إجراء المعايرة من خمس نقاط من SCA-1::APC (الشكل 2C) بالإضافة إلى جميع الأجسامالمضادة الأخرى (CD31::FITC، CD45::FITC، VCAM-1:PE) المستخدمة في البروتوكول (الشكل التكميلي 1)،لتحديد التركيزات المثلى. باستخدام هذا التصميم لوحة الرواية، تم تحديد FAPs المفترضة والنواب في وقت واحد من gastrocnemius صحية(الشكل 3)،حيث تم تعيين خلايا واحدة إيجابية لSCA-1 (لين/سكا-1+/VCAM-1-) FAPs (مربع أحمر) والخلايا إيجابية واحدة لVCAM-1 (لين/SCA-1-/VCAM-1+) تم تعيين أعضاء البرلمان (مربع أزرق). حددنا أيضا مجموعة من الخلايا إيجابية مزدوجة لSCA-1 و VCAM-1 (لين/سكا-1+/VCAM-1+)(الشكل 3F; الربع الأيمن العلوي).

التحقق من تحديد هوية أعضاء البرلمان والشخصيات من قبل FACS وثقافة الخلية
للتحقق من صحة البروتوكول المقدم لتحديد تدفق الخلايا من FAPs والنواب في عضلات الهيكل العظمي للفئران، سعينا لعزل الخلايا الحية للثقافة في المختبر. وباستخدام نظام المركبات الهيدروفلورية، تم عزل أعضاء البرلمان والنواب القادرين على البقاء باستخدام نفس استراتيجية اللغات كما هو الحال في تحليل التدفق الخلوي. تم جمع ما يقرب من 20،000-40،000 FAPs و 30،000-50،000 أعضاء البرلمان لثقافة الخلية من عضلة واحدة من المعدة والأمعاء من الفئران 230 غرام.

لتأكيد نقاء كل مجموعة سكانية، نحن مشتركون في المناعة مناونة FAPs و أعضاء البرلمان الذين تم فرزهم حديثا ل PDGFRα و Pax7. PDGFRα هو علامة السلف mesenchymal الثاني، إلى جانب Sca-1، وتستخدم عادة لتحديد FAPs2،7،8. Pax-7 هو علامة معروفة جيدا وتستخدم على نطاق واسع من الخلايا الساتلية العضلات (الجذعية)41. السكان فرزها من FAPs عرض تلطيخ إيجابية لPDGFRα مع عدم وجود تلوث من قبل الخلايا الإيجابية Pax7(الشكل 4A؛ الصف العلوي). على العكس من ذلك ، فإن السكان فرزها من أعضاء البرلمان ملطخة إيجابية لPac7 مع عدم وجود خلايا إيجابية PDGFRα(الشكل 4A؛ الصف السفلي) ، والتحقق من قدرة لين / SCA - 1 + / VCAM - 1 - ولين / SCA - 1 - / VCAM - 1 + ملامح مستضد سطح الخلية لعزل السكان نقية من أعضاء البرلمان والنواب على التوالي.

نحن المقبل مثقف فرز FAPs والنواب على مدى فترة زمنية من 10-12 يوما في ظروف للحث على التمايز adipogenic، ليفية، والميوجينية. بحلول اليوم 12 ، كانت ثقافات FAPs التي تتعرض لظروف الدهون تحتوي على خلايا إما مع مورفولوجيا تشبه الخلايا الليفية أو مورفولوجيا متعددة الخلايا مماثلة لتلك الموجودة في الخلايا الدهنية البيضاء قبل الدهون مع قطرات الدهون (البيانات غير المعروضة). وأكد التلطخ المناعي للبروتين محددة الخلايا الليفية-1 (FSP-1) التمايز الخلايا الليفية, في حين تلطيخ لبلين-1 (Perilipin-1; علامة adipocyte)42 والنفط الأحمر O أكد تمايز الخلايا الدهنية ووجود الدهون الثلاثية محايدة والدهون, على التوالي (الشكل 4B). تم تأكيد عدم وجود خلايا ملوثة من سلالة ميوجينية في ثقافات FAPs عن طريق التخبو مناعي مشترك لسلسلة الميوزين الثقيلة (MHC) ، وهي علامة على الخلايا العضلية المتمايزة. تم تقييم ثقافات FAPs التي تتعرض للتمايز الليفي (FD) للتعبير عن نوع الكولاجين 1 (Col1a1) ، وهو واحد من الكولاجين الرئيسي المشتق من FAPs8. كشفت الاحتواء المناعي المشترك ل Col1a1 و MHC في اليوم 11 عن تعبير قوي من نوع الكولاجين 1 مع عدم وجود خلايا إيجابية MHC ملوثة(الشكل 4B). تم التأكيد النهائي على نقاء السكان FAPs من خلال زراعة FAPs في وسائل الإعلام myogenic، لتشجيع نمو أي أعضاء البرلمان الملوثة. لم تلاحظ خلايا إيجابية MHC(الشكل التكميلي 2A).

أظهرت ثقافات MP التي تعرضت لظروف الميوجينية خلايا الخلايا العضلية الناضجة المعبرة عن MHC وميوتوبات متعددة النوى 12 يوما بعد الطلاء(الشكل 4C). أظهر الاحتواء المناعي المشترك لثقافات MP مع FSP-1 و Plin-1 عدم وجود الخلايا الليفية الملوثة أو الخلايا الدهنية على التوالي. وبالمثل، لم يثبت تلطيخ أورو تلوث الدهون (الشكل 4C). Col1a1، التي تعبر عنها الخلايا الليفية، كما أفيد أن تنتج إلى حد أقل من السلائف الميوجينية وميوبلاستس، على الرغم من أن هناك بيانات متناقضة في الأدب في هذا الصدد8،43،44. في حين أن المشاركة في المناعة من أعضاء البرلمان مع Col1a1 وMHC كشفت التمايز myocyte من ثقافتنا النائب، لم يتم العثور على أي دليل على Col1a1 المناعية (الشكل 4C). لمزيد من التأكيد على نقاء السكان ، تعرضت ثقافات MP لظروف اديبونية أو ليفية لتشجيع نمو الخلايا الدهنية والخلاياالليفية (الشكل التكميلي 2B). ولم تلاحظ أي خلايا ملوثة من نسب ال FAPs.

في حين أننا أظهرنا القدرة على تحديد وفرز مجموعات نقية من أعضاء البرلمان والنواب من عضلات الفئران ، سعينا بعد ذلك لتحديد هوية الخلايا لين / سكا - 1 + / VCAM - 1 + (إيجابية مزدوجة). منذ تم الإبلاغ عن التعبير Sca-1 على نسبة صغيرة جدا من أعضاء البرلمان (حوالي 3٪) في العضلات السليمة45 وبالمثل عدد قليل من FAPs (تقريبا. 4٪) وقد أفيد للتعبير عن VCAM-1 في العضلات السليمة10,تم إجراء التثليث المناعي من لين/Sca-1+/VCAM-1+ خلايا لPDGFRα و Pax7 جنبا إلى جنب مع زراعة لهم في الميوجينية, adipogenic, والظروف الليفية للحث على تكوين الميوجينيسيس، تولد الدهون و فيبروميجينيسيس على التوالي. ووجد أن الخلايا الإيجابية المزدوجة كانت مجموعة مختلطة من أعضاء البرلمان وFAPs ، مع خلايا مفروزة حديثا إيجابية إما PDGFRα أو Pax7(الشكل التكميلي 3A)والخلايا المستزرعة التي تختلف إلى خلايا صغيرة ناضجة ، أو خلايا الدهون أو الخلاياالليفية ( الشكل التكميلي 3B ، C).

ITGA7 مقابل VCAM-1 لتحديد أعضاء البرلمان أثناء تحديد تدفق FAPs القياسات الخلوية
في حين تم إنشاء بروتوكول ناجح لتحديد التدفق الخلوي ل FAPs الفئران والنواب باستخدام Sca-1 و VCAM-1 على التوالي ، سعينا إلى تحديد ما إذا كان يمكن استخدام الأجسام المضادة ITGA7 المترافقة ذاتيا بالمثل لتحديد أعضاء البرلمان بدلا من VCAM-1 ، كما هو قياسي في الماوس. تم اقتران الأجسام المضادة ITGA7 الخاصة بالجرذان ب PE-Cy7 (انظر الملف التكميلي)وتم التحقق من أداء الجسم المضاد على حبات التعويض التجاري وتعليق الخلايا المفردة الناتجة عن الجهاز الهضمي للفئران(الشكل التكميلي 4A-C). الأجسام المضادة ITGA7::P E-Cy7 أداء كاف على تلطيخ واحد والتجارب FMO (الشكل التكميلي 4D). ومع ذلك، عندما تلطيخ كامل gastrocnemius تعليق الخلية مع CD31::FITC، CD45::FITC، SCA-1::APC، و ITGA7::P E-Cy7، أصبح التفاعل واضحا بين SCA-1::APC و ITGA7::P E-Cy-7 الأجسام المضادة. الثقافة اللاحقة لكل من FACS فرز لين /Sca-1 +/ITGA7- الخلايا (FAPs المزعومة) ولين/Sca-1-/IGTA7+ خلايا (أعضاء البرلمان المزعومين) (الشكل التكميلي 4E) أسفرت الغالبة FAPs قليلة مع أعضاء البرلمان (الشكل التكميلي 4F)، مما يشير إلى التفاعل بين Sca-1::APC و ITGA7::P E-Cy-7 الأجسام المضادة أثرت سلبا على خصوصية تحديد الخلية.

رواية FAPs الوقت بالطبع في العضلات الهيكلية denervated على المدى الطويل
كما تم تقييم ديناميات FAPs في سياق denervation الصدمة على المدى القصير, في نماذج مورين11,38, سعينا للتحقق من صحة أداء طريقتنا لعزل ال FAPs من كل من صحية والضمور الشديد, العضلات الليفية. تعرضت الفئران لإصابة الحرمان على المدى الطويل المؤلمة باستخدام نموذج تنظير الأعصاب الظنبوبي الأحادي الجانب46 الذي تم التحقق من صحته بشكل جيد مع حصاد عضلة الجهاز الهضمي في أربع نقاط زمنية متسلسلة على مدى 14 أسبوعا بعد التنحية من الطرف المهترئ والطرف الداخلي العكسي (ليكون بمثابة جهاز تحكم داخلي). كما سبق أن ذكرت, أظهرت العضلات denervated ضمور التدريجي (الشكل 5A, ب), مع زيادة التليف وترسب الدهون ( الشكل5C-F) على مدى الوقت47.

لدينا بروتوكول ولدت عددا كافيا من الخلايا لتحليل تدفق الخلايا, على الرغم من 12 و 14 أسبوع denervated gastrocnemius وزنها ما يقرب من 0.2-0.3 غرام (15-20٪ من عضلات التحكم العكسية كل منهما) (الشكل 5B). لاحظنا ما يصل تنظيم FAPs في العضلة المعدية المعوية denervated مقارنة مع عضلات التحكم الكونترالاتية الداخلية, الحفاظ على لمدة 14 أسبوعا من التجربة (الشكل 6A, B), توافق مع تليف العضلات التدريجي وترسب الدهون. وأكد Sca-1 المناعية من المقاطع العرضية النسيجية العضلات توطين Sca-1 التعبير عن الخلايا إلى مناطق التغير الليفي الدهني في 14 أسبوع denervated العضلات (الشكل 5G), بالإضافة إلى التعبير الأساسي في الإنترستيتيوم بين الألياف العضلية في العضلات السليمة. وظهرت مجموعة فرعية متميزة من الخلايا في السكان ال FAPs مع مرور الوقت بعد denervation تتميز بزيادة قوية في إشارة Sca-1 (Sca-1 عالية; الشكل 6A، المربع الأحمر) على تحليل تدفق القياسات الخلوية ، مقارنة مع FAPs التعبير Sca-1 القاعدية (Sca-1 ميد / منخفضة ؛ الشكل 6A، المربع الأخضر). وكشف القياس الكمي لهذه الملوثات الفرعية عن وجود ديناميات تفاضلية مع مرور الوقت؛ Sca-1 ارتفاع FAPs زيادة كبيرة في 12- و 14 أسابيع بعد denervation (الشكل 6B), تشكل ما يقرب من نصف مجموع السكان FAPs (الشكل 6C). وعلى النقيض من ذلك، كانت Sca-1 Med/Low FAPs هي السكان الفرعيين المهيمنين في الأسبوعين التاليين للإزالة(الشكل 6C)وأظهرت فقط زيادة عابرة في المستويات في وقت مبكر بعد إزالة النرفر(الشكل 6B).

وعلى النقيض من الوجود المستمر ل FAPs في العضلات المنهمكة على المدى الطويل، أظهر أعضاء البرلمان استجابة ثنائية المراحل متوقعة للحرمان. في البداية زاد أعضاء البرلمان في العضلات denervated أعلاه أن ينظر في الطرف التحكم، ولكن في 5 أسابيع بعد denervation بدأ السكان في الانخفاض (الشكل 6D). تمشيا مع استنفاد معروفة من السكان الخلايا الفضائية العضلات في العضلات denervated على المدى الطويل47, من قبل 12 أسابيع كان أعضاء البرلمان إما في أو أقل من مستويات خط الأساس بعد شفط الأعصاب الظنبوبية.

كما قمنا بتحليل ديناميات السكان لين /سكا-1+/VCAM-1+(الشكل التكميلي 3D-E). في حين أن وتيرة الخلايا الإيجابية المزدوجة بالنسبة للسكان لين انخفضت تدريجيا في العضلات denervated مع مرور الوقت، عندما تم تحديد عدد الخلايا المطلقة لكل غرام من العضلات لوحظت زيادة مؤقتة في السكان إيجابية مزدوجة، قبل أن ينخفض إلى أو تحت مستويات خط الأساس من قبل 14 أسبوعا بعد denervation.

Figure 1
الشكل 1: التخطيطي الرسومية ل FAPs والنواب تحديد وعزلة والثقافة: التخطيطي الرسومية التي تصور FAPs والنواب تحديد من gastrocnemius الفئران. يتم حصاد العينات وصقلها ميكانيكيا قبل الخضوع لهضمين أنزيميتين متتاليتين. ثم تتم معالجة مستحضرات الأنسجة وتصفيتها لتوليد تعليق خلية واحدة. يتم إضافة مزيج من الأجسام المضادة المترافقة الفلورية إلى كل عينة يتم تشغيلها بعد ذلك من خلال مقياس التدفق الخلوي أو فرز الخلايا لتحديد أو عزل أعضاء البرلمان وFAPs على التوالي.

Figure 2
الشكل 2: Sca-1:: APC الذاتي اقتران التحقق من صحة الأجسام المضادة والتحقق من صحة. التحقق من صحة SCA-1:: APC الأجسام المضادة اقتران واحد تلطيخ على حبات التعويض التجاري(A)وتعليق خلية واحدة ولدت من عضلة المعدة والأمعاء الفئران صحية (ب). مجموعات سكانية متميزة من كل من الخرز والخلايا المسماة Sca-1 واضحة (الصناديق السوداء). تم إجراء المعايرة الأجسام المضادة عن طريق اختبار خمسة تركيزات مختلفة من SCA-1::APC على تعليق خلية واحدة(C); تم اختيار التركيز الأمثل على أساس كثافة الفلورسينس أكبر مع تلطيخ الخلفية الحد الأدنى ووجد أن تعتمد دفعة. يظهر المعايرة التمثيلية مع التركيز الأمثل المحدد للدفعة المشار إليه بالصندوق الأحمر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3:تحديد تدفق قياس الخلايا من FAPs والنواب في gastrocnemius الفئران. (A-F) Gating استراتيجية لتحليل تدفق القياسات الخلوية من FAPs والنواب. (أ) يتم أولا بوابات عينات لاستبعاد الحطام (الصندوق الأسود) وكذلك إلى بوابة لعد الخرز (مربع أحمر). ثم يتم بوابات الخلايا لاستبعاد doublets على حد سواء عن طريق التشتت الأمامي (FSC) (B) وخصائص مبعثر الجانب (SSC) (C). يتم تقييم صلاحية الخلايا المفردة الناتجة عن طريق تلطيخ مع SYTOX الأزرق (D). ثم يتم تقييم SYTOX الأزرق السلبية (العيش) المفردات لإشارة FITC تحديد CD31 و CD45 (النسب; لين) من أجل استبعاد لين + كسور من مزيد من التحليل (مربع أسود لين الخلايا) (ه). ثم يتم تقييم السكان لين لSCA-1::APC مقابل VCAM-1::P إشارة(F). يتم تعريف FAPs على أنها لين/سكا-1+/VCAM-1- (F; الصندوق الأحمر) في حين يتم تعريف أعضاء البرلمان على أنهم أحداث لين/سكا-1-/VCAM-1+ (F; الصندوق الأزرق). وهناك Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ السكان إيجابية مزدوجة واضح أيضا (الربع الأيمن العلوي). (G) FMO (فلورسينس ناقص واحد) ضوابط لCD31::FITC وCD45::FITC إظهار التعويض المناسب وgating للخلايا لين. (H-I) Sca-1:: APC مقابل VCAM-1::P E المؤامرات من ضوابط FMO تثبت التعويض المناسب وgating لFAPs (Sca-1 FMO) والنواب (VCAM-1 FMO). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4:فرز FAPs وPsPs ثقافة الخلية و immunostaining. (أ) المشاركة في الحصول على المناعة ل PDGFRα (أخضر) و Pax7 (أحمر) على FAPs مفروزة حديثا (الصف العلوي) والنواب (الصف السفلي). Nuclei وصمة عار زرقاء مع DAPI. FAPs تعبر فقط PDGFRα وليس الخلايا الإيجابية Pax7 واضحة، في حين أن أعضاء البرلمان التعبير حصرا Pax7 مع عدم وجود تلوث الخلايا الإيجابية PDGFRα، مما يدل على نقاء كل من السكان فرزها. (ب)FAPs في اليوم 12 في وسائل الإعلام التمايز الشحمية (AD) وصمة عار إيجابية للبروتين فيبرومبلاست محددة 1 (FSP-1; الأخضر) وبيريليبين-1 (بلين-1; الأخضر), مما يدل على الخلايا الليفية المتباينة والخلايا الدهنية, على التوالي. النوى ملطخة DAPI (الأزرق). النفط الأحمر O (ORO) تلطيخ (أحمر) يشير إلى وجود الدهون الثلاثية محايدة والدهون الناشئة عن الخلايا الدهنية ناضجة بحلول اليوم 12. تظهر ال FAPs التي تتعرض لوسائط التمايز الليفي (FD) التعبير عن نوع الكولاجين 1 (Col1a1؛ الأخضر) المشتقة من FAPs. FAPs المستزرعة في وسائل الإعلام إما adipogenic أو ليفية لا تشارك في المناعة لسلسلة الميوزين الثقيلة (MHC، الأحمر)، مما يشير إلى عدم وجود خلايا الخلايا العضلية الملوثة. (ج) أعضاء البرلمان نمت في وسائل الإعلام التمايز myogenic (MD) في اليوم 12 عرض MHC إيجابية (الأحمر) تلطيخ مما يدل على وجود myocytes ناضجة وانصهرت myotubes متعددة النوى. النوى ملطخة DAPI (الأزرق). كانت ثقافات MP واضحة من تلوث الخلايا الليفية والخلايا الدهنية كما يتضح من عدم وجود تلطيخ مشترك للمناعة ل FSP-1 (الأخضر) وPlin-1 (الأخضر) وتلطيخ ORO. أعضاء البرلمان نمت على اللامينين لاستيعاب Co1a1 المناعة لا تظهر نفس الدرجة من الانصهار الميوتوب بحلول اليوم 12 كما يحدث على الكولاجين. Col1a1 (الأخضر) غائب عن ثقافات MP. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: ضمور, تليف, والتسلل الدهنية من العضلات denervated على المدى الطويل. (أ) ممثل حصاد عضلات المعدة والأمعاء في أربع نقاط زمنية المسلسل بعد denervation. Gastrocnemius المشار إليها CONTRA هو عينة طرف مضاد ممثل من denervated لمدة أسبوعين. (ب)القياس الكمي لضمور العضلات بعد denervation أعرب عن نسبة denervated (DEN) الوزن الرطب المعدة إلى أن من طرف contralateral (CONTRA). (ج) Picrosirius الأحمر (PSR) الملون الهلوسة المقاطع العرضية من gastrocnemius حصادها 2 أو 14 أسابيع بعد denervation تثبت التليف التدريجي. بقع العضلات صفراء، الكولاجين البقع الحمراء. (د) التليف الكمي من خلال تحديد منطقة الأنسجة الإيجابية PSR بالنسبة إلى إجمالي مساحة الأنسجة. (ه) النفط الأحمر O (ORO) الملون المقاطع العرضية من gastrocnemius حصادها 2- أو 14 أسابيع بعد denervation, مضادة ملطخة hematoxylin. الدهون وصمة عار حمراء. (F) الترشيح الدهنية كميا من خلال تحديد منطقة من الأنسجة الملطخة ORO بالنسبة إلى إجمالي مساحة الأنسجة. (G) Gastrocnemius الهلوسة المقاطع العرضية حصادها 2- أو 14 أسابيع بعد denervation, مناعة ملطخة للرقمينين (الأخضر) وSca-1 (أحمر). لامينين البقع إيجابيا الصفيحة القاعدية التي تحيط الألياف العضلية الفردية. Sca-1 يحدد أنواع خلايا السلف متعددة. النوى ملطخة DAPI (الأزرق). Inset يظهر توطين SCA-1 + الخلايا خارج الصفيحة القاعدية في العضلات السليمة; تشير الأسهم الصفراء إلى وجود خلايا Sca-1+ داخل المناطق الليفية. (البيانات تعني +/- S.D; n= 3 لنقاط زمنية 2 و 14 أسبوعا. البيانات في لوحة B تحليلها من قبل ANOVA في اتجاه واحد، والبيانات في لوحات D و F تحليلها من قبل ANOVA في اتجاهين. اختبار Sidak اللاحق تم إجراؤه لتصحيح مقارنات متعددة. * = P<0.05 بين كونترا ودن؛ # = P<0.05 بين العينات) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: FAPs والنواب ديناميات في المدى الطويل denervated الفئران gastrocnemius. (أ) ممثل Sca-1::APC مقابل VCAM-1::P E لوحات من لين- (CD31-/CD45-) السكان من عينات العضلات حصادها 2-, 5-, 12-, أو 14 أسابيع بعد denervation. الصف العلوي يظهر المؤامرات من denervated (DEN) gastrocnemius، في حين أن الصف السفلي يظهر تلك من contralateral، unoperated (CONTRA) gastrocnemius. لين/سكا-1+/VCAM-1- تنقسم ال FAPs (المجموع) إلى كسور Sca-1 High (الصندوق الأحمر) وSCA-1 Med/Low (الصندوق الأخضر)، في حين يظهر أعضاء البرلمان لين/سكا-1-/VCAM-1+ في المربع الأزرق. (ب)تحديد كمي من FAPs (المجموع، SCA-1 عالية، Sca-1 ميد / منخفض) في كل نقطة زمنية بعد denervation، وذكرت كما تردد (٪) من لين الخلايا (الصف العلوي) وعدد الخلايا لكل غرام العضلات (الصف السفلي) تطبيعها إلى الجهاز الهضمي السيطرة العكسية. (ج)النسب النسبية للفئات الفرعية من السكان الفرعيين من إجمالي السكان من السكان المدنيين المدنيين من الدرجة الحادية عشرة إلى المستوى المرتفع وSca-1. (د)تم الإبلاغ عن تحديد كمي لأعضاء البرلمان في كل نقطة زمنية بعد إزالة النرجيل على أنه تردد (٪) لخلايا لين (الرسم البياني الأيسر) وكعدد الخلايا لكل غرام من العضلات (الرسم البياني الأيمن) الذي تم تطبيعه إلى التحكم العكسي. (البيانات تعني +/- S.D; n=4 لنقاط زمنية 2 و 12 أسبوعا؛ n= 5 لنقطة زمنية 5 أسابيع؛ n=2 لنقطة زمنية 14 أسبوعا. البيانات التي تم تحليلها من قبل ANOVA أحادية الاتجاه؛ اختبار Sidak اللاحق لتصحيح المقارنات المتعددة. # = P<0.05.) يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1:التحقق من صحة الأجسام المضادة والتحقق من صحتها. التحقق من صحة CD31::FITC (A-C), CD45::FITC (D-F), وVCAM-1::P E (G-I) الأجسام المضادة المترافقة تجاريا على حبات التعويض (A, D, G) وتعليق خلية واحدة من عضلة المعدة والأمعاء الفئران صحية (B, E, H). تم ثدي كل الأجسام المضادة في 5 تركيزات مختلفة (C، F، I). تم اختيار التركيز الأمثل على أساس أكبر كثافة مضان مع الحد الأدنى من تلطيخ الخلفية (المربعات الحمراء). الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2:فرز أعضاء البرلمان والنواب في ظروف ثقافة التمايز العكسي. (أ)FAPs المستزرعة في وسائط التمايز العضلي (MD) في اليوم 12 المشتركة المناعة الملطخة لFSP-1 (الأخضر)، Plin-1 (الأخضر) أو Col1a1 (الأخضر) وMHC (الأحمر) لا تثبت التلوث myocyte. إيجابي FSP-1، وتلطيخ Col1a1 تكشف عن تمايز FAPs إلى الخلايا الليفية. أورو تلطيخ (أحمر) يكشف إنتاج الدهون على الرغم من Plin-1 الخلايا الدهنية الإيجابية ليست مرئية بسهولة. Nuclei ملطخة DAPI (الأزرق). (ب)توفي أعضاء البرلمان الذين تعرضوا لوسائل التمايز الدهنية. النواب مثقف في وسائل الإعلام نمو FAP (FAP GM) لمدة 12 يوما والملطخة بالمناعة المشتركة لFSP-1 (الأخضر) أو Plin-1 (الأخضر) وMHC (الأحمر) إظهار myocytes المتمايزة وميوتوب مع عدم وجود خلايا إيجابية FSP-1 أو Plin-1. غياب تلطيخ ORO يؤكد كذلك عدم وجود خلايا الدهون في الثقافة. أعضاء البرلمان نمت في وسائل الإعلام التمايز الليفي (FD) والملطخة بالمناعة المشتركة لCol1a1 وMHC تظهر الخلايا العضلية ناضجة وغياب الخلايا الإيجابية Col1a1. أعضاء البرلمان نمت على اللامينين لاستيعاب Col1a1 المناعة لا تظهر نفس الدرجة من الانصهار إلى myotubes في 12 يوما في الثقافة كما يحدث على الكولاجين. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: لين/سكا-1+/VCAM-1+الخلايا هي مجموعة مختلطة من أعضاء البرلمان والنواب. (أ) PDGFRα و Pax7 co-immunostaining من معزولة حديثا لين/Sca-1+/VCAM-1+ الخلايا تظهر مجموعة مختلطة من PDGFRα إيجابية واحدة (الأسهم البيضاء) وPac7 واحد إيجابي (السهم الأصفر) الخلايا تحديد FAPs والنواب، على التوالي. (ب) لين/Sca-1+/VCAM-1+ الثقافات في اليوم 12 نمت في وسائط التمايز العضلي (MD) تحتوي على كل من FSP-1 إيجابية واحدة (الأخضر) وMHC واحدة إيجابية (الأحمر) الخلايا تحديد الخلايا الليفية و myocytes / أنابيب، على التوالي. غياب Plin-1 (الأخضر) و ORO (أحمر) تلطيخ تشير إلى عدم وجود adipocytes ناضجة. تظهر الخلايا العضلية الناضجة والخلايا الليفية co-immunostaining ل Col1a1 (الأخضر) و MHC (الأحمر). (C) لين/Sca-1+/VCAM-1+ الخلايا في اليوم 12 نمت في وسائل الإعلام التمايز adipogenic (AD) تظهر بالمثل مزيجا من FSP-1 (الأخضر) إيجابية واحدة وMHC (الأحمر) خلايا إيجابية واحدة، ولكن أيضا مع Plin-1 (الأخضر) خلايا إيجابية واحدة وOO تلطيخ الحاضر، مما يؤكد تمايز الخلايا الليفية، الخلايا العضلية وخلايا الشحم. الثقافات التي تزرع في وسائل الإعلام التمايز الليفي (FD) تظهر الخلايا العضلية ناضجة وCol1a1 خلايا إيجابية واحدة (الخلايا الليفية). (D) ممثل Sca-1::APC مقابل VCAM-1::P E لوحات لين- (CD31-/CD45-) السكان من عينات العضلات denervated حصادها 2-, 5-, 12-, أو 14 أسابيع بعد denervation; يتم الإشارة إلى Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ في المربع الأرجواني. (ه) تحديد كمي للين/سكا-1+/VCAM-1+ خلايا عبر أربع نقاط زمنية تسلسلية بعد denervation، وذكرت كتردد لين الخلايا (الرسم البياني الأيسر) والخلايا لكل غرام العضلات (الرسم البياني الأيمن) تطبيع إلى gastrocnemius contralateral. (البيانات تعني +/- S.D; n=4 لنقاط زمنية 2 و 12 أسبوعا؛ n= 5 لنقطة زمنية 5 أسابيع؛ n=2 لنقطة زمنية 14 أسبوعا. تم تحليل البيانات من قبل ANOVA أحادية الاتجاه؛ اختبار سيداك اللاحق لتصحيح المقارنات المتعددة؛ # = P<0.05.) الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 4: ITGA7 كعلامة على الخلايا العضلية في قياس تدفق الخلايا من العضلات الهيكل العظمي للفئران. التحقق من صحة ITGA7::P E-Cy7 اقتران الأجسام المضادة عن طريق تلطيخ واحد على حبات التعويض التجاري (A) وتعليق خلية واحدة ولدت من عضلة المعدة والأمعاء الفئران صحية (ب). مجموعات من كل من ITGA7 وصفت الخرز والخلايا واضحة (صناديق سوداء)(C)تم إجراء المعايرة الأجسام المضادة عن طريق اختبار خمسة تركيزات مختلفة على تعليق خلية واحدة. مربع أحمر يشير إلى تركيز مثالي. (د)مؤامرات من الضوابط الفلورية ناقص واحد (FMO) تثبت عدم وجود امتداد مضان عبر الأجسام المضادة المصاحبة، ولكن وصمة عار كاملة من تعليق الخلية يكشف عن تفاعل غير محدد بين SCA-1::APC و ITGA7::P E-Cy7 (الصندوق الأخضر). Gating (E) لفصل لين / سكا - 1 + / ITGA7 - الخلايا (المزعومة "FAPs") ولين / سكا - 1 - / IGTA7 + الخلايا (المزعومة "أعضاء البرلمان"). (F) co-immunostaining من الثقافات الخلايا فرزها FACS في 12 يوما بعد الطلاء مع Perilipin-1 (الأخضر) وMHC (الأحمر) يوضح كل من مجموعات من الخلايا فرزها نضجت في الغالب إلى adipocytes مع عدد قليل من myocytes الحاضر. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

1. غير ملطخة
2. التحكم في الجدوى
3. CD31 + CD45 FMO
4. SCA-1 FMO
5. VCAM-1 FMO
6. CD31 + CD45 وصمة عار واحدة (الخرز)
7. CD31 + CD45 وصمة عار واحدة (خلايا)
8. SCA-1 وصمة عار واحدة (الخرز)
9. SCA-1 وصمة عار واحدة (خلايا)
10. VCAM-1 وصمة عار واحدة (الخرز)
11. VCAM-1 وصمة عار واحدة (خلايا)

الجدول 1:تدفق الأجسام المضادة قياس الخلايا تلطيخ الضوابط. مجموعة كاملة من عناصر التحكم في تلطيخ الأجسام المضادة. إذا كان يتم إجراء التجربة لأول مرة، يجب تشغيل عناصر تحكم ملونة واحدة على كل من حبات التعويض وتعليق الخلية الواحدة. لجميع التجارب اللاحقة، وضوابط ملون واحد تحتاج فقط ليتم تشغيلها على حبات التعويض.

CD31::FITC (ميكروغرام) CD45::FITC (ميكروغرام) Sca-1::APC (ميكروغرام)* VCAM-1::P E (ميكروغرام) SYTOX الأزرق
(ميكرومتر؛ التركيز النهائي)
التحكم غير الملطخ
-- -- -- -- --
عناصر تحكم ذات لون واحد
SYTOX الأزرق (التحكم في الجدوى) -- -- -- -- 1
CD31 و CD45 0.5 0.25 -- -- 1
سكا-1 -- -- 0.25 -- 1
VCAM-1 -- -- -- 0.25 1
مضان ناقص واحد (FMO)
CD31 و CD45 -- -- 0.25 0.25 1
سكا-1 0.5 0.25 -- 0.25 1
VCAM-1 0.5 0.25 0.25 -- 1
عينات تجريبية
وصمة عار كاملة 0.5 0.25 0.25 0.25 1

الجدول 2:تدفق مصفوفة تلطيخ الأجسام المضادة لقياس الخلايا. يتم عرض كمية الأجسام المضادة لتلطيخ العينات التجريبية والتحكم في قياس التدفق الخلوي. يتم تنفيذ جميع تلطيخ في حجم إجمالي قدره 100 ميكرولتر من العازلة غسل. *قد يختلف المقدار الأمثل من Sca-1::APC المضادة حسب الدفعة المستخدمة. يجب التحقق من صحة جميع دفعات Sca-1::APC المترافقة حديثا أولا عن طريق تلطيخ كل من حبات التعويض وتعليق الخلايا المفردة.

ملف تكميلي: وصفات كاشف. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يعد بروتوكول عزل FAPs الأمثل والمعتمد لعضلات الفئران ضروريا للباحثين الذين يرغبون في دراسة نماذج الإصابات غير الممكنة في الماوس لأسباب بيولوجية أو تقنية. على سبيل المثال، الفئران ليست نموذجا حيوانيا أمثل لدراسة الإصابات المحلية المزمنة، أو العصبية مثل إزالة النرجيل على المدى الطويل. بيولوجيا، والعمر القصير والشيخوخة السريعة للفئران تجعل من الصعب تحديد بدقة sequalae العضلات بسبب denervation من عامل الخلط من الشيخوخة. من وجهة نظر تقنية، فإن كتلة العضلات المنخفضة بشكل كبير بسبب ضمور شديد تكون غير كافية لتحليل التدفق الخلوي الفعال. في الواقع، تشير بروتوكولات عزل ال FAPs الماوس تجميع العضلات السليمة معا لزيادة أفضل في العائد من FAPsفرزها 29. في حين أن هذا يحل الحاجز التقني للحصول على أنسجة العضلات الكافية للتحليل ، فإنه يحد في وقت واحد الباحثين من تقييم FAPs على مستوى العضلات المحددة. منذ مجموعات العضلات محددة تختلف بطبيعتها في تكوينها نوع الألياف، ودرجة الأوعية الدموية، وأرقام الميتوكوندريا47 على سبيل المثال، والجمع بين عضلات مختلفة متعددة لتحليل تدفق الخلايا يمنع توصيف FAPs العضلات محددة. في المقابل، نظهر أن كلا من صحية وطويلة الأجل denervated، أتروفيك وفيبروتيك الجرذ gastrocnemius توفير كمية كافية من المواد بدءا لقياس التدفق الفعال للخلايا. وعلاوة على ذلك، في عينات صحية، يمكن تقسيم فائض العضلات إلى قسمين إضافيين لإجراء فحوصات متعددة في المصب، مما يسمح للباحثين بتحليل السمات الخلوية والجزيئية والأنسجة لنفس النسيج. وأخيرا، للتجارب التلاعب FAPs في نماذج الإصابات مع العلاجات، وتحليلات التحقق من صحة جيدة من الوظيفة البدنية ومشية في حالة تأهب والجرذان النشطة متوفرة21،22،23،24، مما يتيح التقييم التسلسلي لوظيفة العضلات دون الحاجة إلى إنهاء الحيوان.

كانت هناك عقبة رئيسية في إنشاء بروتوكول عزل FAPs محسن للجرذ هي توافر الأجسام المضادة. سعينا نهجنا الأولي لنسخ لوحة الأجسام المضادة وبروتوكولات استراتيجية gating المستخدمة على نطاق واسع في الماوس1،7،8،9،10،11،12،13،14. في حين أن الأجسام المضادة المتاحة تجاريا والمترافقة والتدفق اختبارها، والتحقق من صحة الفئران التي تعترف الفئران كانت متاحة لعلامات النسب CD31 و CD45، لم يكن هناك أي لFAPs إيجابية تحديد علامات Sca-1 أو PDGFRα، وكذلك لعلامة الاختيار السلبي ITGA7. غير مترافق, الأجسام المضادة الأولية محددة لهذه العلامات ويزعم أن تكون فعالة في تدفق قياس الخلايا كانت متاحة, ولكن من علامات FAPs Sca-1 و PDGFRα, فقط الأجسام المضادة SCA-1 قد تم التحقق من صحتها في الأدب المنشور في تحليل تدفق الخلايا الخلوية من خلايا الفئران48. لذلك، اخترنا Sca-1 كعلامة اختيار إيجابية ل FAPs. ولم يكن احتمال استخدام الأجسام المضادة الثانوية لتحديد علامات Sca-1 و ITGA7 ممكنا لعدة أسباب، ولكن يرجع ذلك في المقام الأول إلى أن الأجسام المضادة الوحيدة الخاصة بالجرذان ل Sca-1 و ITGA7 التي تم التحقق من صحتها لقياس التدفق الخلوي تم إنشاؤها في نفس النوع المضيف. ولذلك، فإن الخيار المتبقي هو اقتران ذاتي لكلا الجسمين المضادين باستخدام مجموعات متاحة تجاريا.

كانت عملية اختيار مجموعة مثالية لتقزيم الأجسام المضادة واسعة النطاق ، حيث أن العديد من المجموعات غير متسامحة تماما أو جزئيا مع الفواصل العازلة المختلفة (على سبيل المثال ، الجليسين ، الجلسرين ، BSA ، Sodium Azide) الموجودة في الأجسام المضادة الأولية. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن يكون الفلوروفور المقدم متوافقا مع الليزر المجهز داخل مقياس التدفق الخلوي/مفرز الخلايا المتاح للمحقق، وألا ينبعث منه طول موجي مماثل للفلوروفوريس الأخرى المستخدمة لتحديد أنواع الخلايا الأخرى في العينة. وكان وجود مكونات ثنائية في الأجسام المضادة الأولية PDGFRα الخاصة بالجرذان التي كانت غير متوافقة بشكل جيد مع مجموعات التوازم، اعتبارا إضافيا في اختيار Sca-1 كعلامة اختيار FAPs إيجابية في هذا البروتوكول. في حين أن هذه النتائج تثبت أن كل من Sca-1::APC و ITGA7::P E-Cy7 أدت إلى تحديد مجموعات سكانية متميزة ملطخة بالإيجابية على كل من حبات التعويض والخلايا ، تم العثور على الأول لإظهار الاضمحلال في الفلورسينس في وقت أقرب مما تم الإعلان عنه من قبل الشركة المصنعة. من المستحسن للغاية أن يترافق الباحثون مع Sca-1::APC وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، مباشرة قبل الاستخدام لأول مرة (على سبيل المثال ، في اليوم السابق للتجربة) لضمان إشارة قوية ، وتخطيط التجارب وفقا لذلك بحيث يمكن استخدام دفعة واحدة من الأجسام المضادة المترافقة داخل نافذة فعالية الجسم المضاد ، والتحقق من صحة كل دفعة عن طريق حبات التعويض ذات التلطيخ الواحد والتعيين على تعليق خلية واحدة. ولكن الأهم من ذلك أن التفاعل الحاسم الذي لوحظ بين Sca-1::APC و ITGA7::P E-Cy7 حال دون التحديد الدقيق لفئات السكان من أعضاء البرلمان مقابل أعضاء البرلمان، مما استلزم استخدام استراتيجية بديلة.

Boscolo Sesillo وآخرون أظهرت مؤخرا نجاح تدفق العزل الخلوي للخلايا الجذعية عضلة الفئران باستخدام VCAM-1 كعلامة اختيار إيجابية واحدة33 في CD31, CD45 وCD11b الخلايا السلبية. مع VCAM-1 كعلامة اختيار MP، استخدمنا لوحة الأجسام المضادة جديدة لتحديد FAPs (لين/سكا-1+/VCAM-1-) والنواب (لين/سكا-1-/VCAM-1+) والتحقق من صحة النهج مع الثقافة المختبرية من FACS فرز الخلايا من عضلة المعدة والأمعاء صحية. FAPs معزولة حديثا والنواب مناعة ملطخة فقط لعلامات بديلة كل منهما PDGFRα و Pax7. تمايزت ال FAPs المثقفة في مجموعات من الخلايا الليفية الناضجة والخلايا الدهنية ، والنواب في الخلايا العضلية الناضجة / myotubes. ولم يحدث أي تلوث متقاطع بين أعضاء البرلمان والنواب داخل الثقافات. أكد التأني المناعي للشرائح العرضية النسيجية تسلل مناطق التدهور الدهني الليفي في العضلات المتحللة مع الخلايا الإيجابية Sca-1.

في حين أجرينا تحليل التدفق الخلوي للعضلات denervated على المدى الطويل للتحقق من صحة بروتوكولنا في العضلات الضمروفية والليفية والدهون تسللت بشدة، لاحظنا بالمناسبة ظهور السكان الفرعية FAPs مع زيادة SCA-1 إشارة (المشار إليها SCA-1 عالية) بالمقارنة مع التعبير SCA-1 خط الأساس (المشار إليها SCA-1 ميد / منخفض) مع مرور الوقت. وزادت المستويات العالية لل FAPs Sca-1 بشكل ملحوظ في وقت متأخر بعد إلغاء النرجيل (12 أسبوعا زائدا)، في حين بلغت ال FAPs Sca-1 Med/Low ذروتها في وقت مبكر عند 5 أسابيع قبل أن تتراجع مرة أخرى إلى مستويات خط الأساس. تم الإبلاغ عن عدم التجانس في النمط الظاهري FAPs10،30. FAPs مع أعلى SCA-1 التعبير أظهرت للتمييز بسهولة أكبر في adipocytes, وعندما تتعرض لتحفيز ليفي زيادة التعبير عن Col1a130,49. ويبدو أن ديناميات المجموعات الفرعية من برامج العمل المتعلقة بالإنعاش التي لوحظت هنا تتماشى مع المسار الزمني للتتمة الناجمة عن إزالة النرفر وقدرة العضلات على التجدد47، وبالتالي قد تميز المجموعات الفرعية من ال FAPs ببرامج خلوية مختلفة. Sca-1 FAPs عالية تصبح ما يصل تنظيمها في وقت متأخر من الوقت نقاط المصاحبة مع تسلل ليفي / الدهنية وانخفاض في الإمكانات التجديدية، في حين أن Sca-1 ميد / منخفضة FAPs تصبح منظمة خلال نافذة العضلات التجديدية، ويمكن أن تساعد في تكوين عضلي تجديدي فعال. ويوفر بروتوكول العزل الخاص بال FAPs المعروض هنا للمحققين القدرة على تحديد وعزل هذه المجموعات السكانية المختلفة للدراسة في المستقبل.

حددنا مجموعة من الخلايا تلطيخ إيجابية لكل من Sca-1 و VCAM-1 (لين/سكا-1+/VCAM-1+) وتأكدنا من أن هذه المجموعة الإيجابية المزدوجة هي مزيج من FAPs والنواب. Malecova وزملاؤه ذكرت السكان الفرعية من VCAM-1 التعبير عن FAPs التي هي غائبة تقريبا في العضلات السليمة, زيادة عابرة مع التهاب حاد, وارتبط استمرارها في الفئران MDX (نموذج ضمور العضلات) مع التهاب العضلات المزمن والتليف10. في المقابل ، وعلى الرغم من عدم وجود سكان FAPs نقية ، وجدنا أن لين / سكا - 1 + / VCAM - 1 + السكان انخفض إلى أو أقل من مستويات خط الأساس مع تليف العضلات المزمن في 12 و 14 أسبوعا بعد denervation. لا يؤدي التحلل إلى نفس التفاعل الالتهابي ومحاولات تجديد الدراجات التي تعاني منها فئران mdx ، مما قد يفسر الاختلافات في نتائجنا. تحديد نا من أعضاء البرلمان في لين/SCA-1+/ VCAM-1+ السكان الخلية يتماشى مع تقرير التعبير Sca-1 على نسبة صغيرة جدا من أعضاء البرلمان في العضلات السليمة, مع زيادة عابرة بعد الإصابة خلال انتشار منطقة الميوبلاست والانسحاب اللاحق من دورة الخلية45. وهكذا ، في حين أن لدينا وضع العلامات على الأجسام المضادة واستراتيجية FACS gating بنجاح يعزل السكان النقي من FAPs والنواب للدراسة ، والتجارب التي تتطلب تدفق القياس الخلوي القائم على القياس الكمي لهذه المجموعات السكانية قد يقلل قليلا من أعدادهم بسبب النسبة المئوية الصغيرة من الخلايا في كل من خطوط السلف التي تشارك في التعبير عن SCA -1 و VCAM-1. وبغض النظر عن ذلك، فإن البروتوكول الحالي يوضح بوضوح الاستجابة التقليدية ثنائية المراحل من جانب أعضاء البرلمان لإصابة إزالة النرجس، مع التنظيم التنظيمي على المدى القصير وما يلاحق من استنفاد السكان في العضلات المنضبة على المدى الطويل. وبالمثل، فإن الزيادة في برامج العمل التكميلية المبلغ عنها في إصابة معزولة على المدى القصير في إزالة النرجيل يتم تلخيصها هنا، ويظهر أنها مستمرة بشكل أكبر باستخدام نموذج تقبيل الأعصاب الظنبوبي على المدى الطويل.

وباختصار، يوفر هذا البروتوكول للباحثين حيوانا لم يتم استكشافه من قبل، وهو الجرذ، لاستخدام أساليب التدفق الخلوي لدراسة FAPs وPs. ويمكن إجراء التجارب في الفئران المحدودة بكمية العضلات الهيكلية في وقت واحد، والحاجة المتكررة لإجراء تجارب نهائية لتقييم قوة العضلات ووظيفتها، بسهولة في الفئران الأكبر حجما وبطائفة أوسع من القوة غير المميتة وأساليب التقييم الوظيفي. وعموما، قد تكشف دراسات FAPs في الفئران عن أدوار جديدة لهذه الفئات السلف الرئيسية في العضلات الحادة والمزمنة والصدمات العصبية الطرفية والمرض، مما يزيد في وقت لاحق من إمكانية تطوير علاجات خاصة بالخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ أي تضارب في الكشف عن المعلومات.

Acknowledgments

نود أن نشكر المرافق الأساسية لقياس التدفق الخلوي في جامعة أوتاوا ومركز كينان للأبحاث للعلوم الطبية الحيوية (KRC) ومستشفى سانت مايكلز يونيتي هيلث تورونتو على خبرتهم وتوجيهاتهم في تحسين بروتوكول قياس التدفق الخلوي / FACS المقدم في هذه المخطوطة. تم تمويل هذا العمل من قبل صندوق الأدوية من قبل صندوق تصميم الأفكار الجديدة 2018 (MbDNI-2018-01) إلى JB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Falcon 352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap Falcon 352235
10 cm cell culture dishes Sarstedt 83.3902
12-well cell culture plate ThermoFisher 130185
12 mm glass coverslips, No.2 VWR 89015-724
10 mL Syringe Beckton Dickenson 302995
15 mL centrifuge tubes FroggaBio 91014
20 gauge needle Beckton Dickenson 305176
25mL Serological pipette Sarstedt 86.1685.001
40µm cell strainer Fisher Scientific 22363547
50mL centrifuge tubes FroggaBio TB50
AbC Total Antibody Compensation Beads  ThermoFisher A10497
Ammonium Chloride, Reagent Grade Bioshop AMC303.500
APC Conjugation Kit, 50-100µg Biotium 92307
Aquatex Aqueous Mounting Medium Merck 108562
Biolaminin 411 LN Biolamina LN411
Bovine Serum Albumin (BSA) Bioshop ALB001
Calcium Chloride Bioshop CCL444.500
Collagenase Type II Gibco 17101015
CountBright Plus Absolute Counting Beads ThermoFisher C36995
Dexamethasone Millipore Sigma D4902
Dispase Gibco 17105041
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) Gibco 11995-065 (+)4.5 g/L D-Glucose
(+)L-Glutamine
(+)110 mg/L Sodium Pyruvate
EDTA FisherScientific S311
FACSClean Solution Beckton Dickenson 340345
FACSDiva Software Beckton Dickenson --
FACSRinse Solution Beckton Dickenson 340346
Fetal Bovine Serum Sigma F1051
Flow Cytometry Sheath Fluid Beckton Dickenson 342003
FlowJo Software Beckton Dickenson --
Fluorescent Mounting Medium Dako S302380-2
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody Invitrogen A21424
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody Invitrogen A11008
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody Invitrogen A21429
Goat Serum Gibco 16210-064
Ham's F10 Media ThermoFisher  11550043 (+) Phenol Red
(+) L-Glutamine
(-) HEPES
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X) Multicell 311-513-CL
Heat Inactivated Horse Serum Gibco 26050-088
Hemocytometer Reichert N/A
HEPES, minimum 99.5% titration Sigma H3375
Horse Serum ThermoFisher 16050130
Human Transforming Growth Factor β1 (hTGF-β1) Cell Signaling 8915LF
Humulin R Lilly HI0210
IBMX Millipore Sigma I5879 Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine
Isopropanol Sigma I9516 Also known as 2-propanol
Lewis Rat, Female Charles River Kingston 004 (Strain Code) 200-250 grams used
LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer Beckton Dickenson --
Microcentrifuge Eppendorf EP-5417R
MoFlo XDP Cell Sorter Beckman Coulter --
Mouse Anti-CD31::FITC Antibody Abcam ab33858 Clone TLD-3A12
Mouse Anti-CD45::FITC Antibody Biolegend 202205 Clone OX-1
Mouse Anti-CD106::PE Antibody Biolegend 200403 Also known as VCAM-1
Mouse Anti-MHC Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) N/A Also known as MF20
Mouse Anti-Pax7 Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) N/A
Neutral Buffered Formalin, 10 % Sigma HT501128
Oil Red O Millipore Sigma O0625
PE-Cy7 Conjugation Kit Abcam ab102903
Penicillin-Streptomycin Sigma  P4333
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X) Gibco 10010-023 (-)Calcium Chloride
(-)Magnesium Chloride
Potassium Bicarbonate, Reagent Grade Bioshop PBC401.250
Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody Invitrogen MA5-32347 FSP-1 also known as S100A4
Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody Abcam ab203254
Rabbit Anti-Laminin Antibody Sigma L9393
Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody Abcam ab3526
Rabbit Anti-Sca-1 Antibody Millipore Sigma AB4336
Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody Abcam ab260043 Also known as Col1a1
Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody Abcam ab203491
Recombinant Human FGF-basic Gibco PHG0266
Sodium Azide Sigma S2002
Triton-X-100 Fisher Scientific BP151
Troglitazone Millipore Sigma T2573
Tween-20 Bioshop TWN510

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12, 153-163 (2010).
  2. Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).
  3. Uezumi, A., Ikemoto-Uezumi, M., Tsuchida, K. Roles of nonmyogenic mesenchymal progenitors in pathogenesis and regeneration of skeletal muscle. Frontiers in Physiology. 5, 1-11 (2014).
  4. Biswas, A. A., Goldhamer, D. J. FACS fractionation and differentiation of skeletal-muscle resident multipotent Tie2+ progenitors. Methods in Molecular Biology. 1460, 255-267 (2016).
  5. Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network. Frontiers in Physiology. 10, 1-10 (2019).
  6. Wosczyna, M. N., Rando, T. A. A muscle stem cell support group: Coordinated cellular responses in muscle regeneration. Developmental Cell. 46 (2), 135-143 (2018).
  7. Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
  8. Uezumi, A., et al. Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle. Journal of Cell Science. 124 (21), 3654-3664 (2011).
  9. Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
  10. Malecova, B., et al. Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  11. Madaro, L., et al. Denervation-activated STAT3-IL-6 signalling in fibro-adipogenic progenitors promotes myofibres atrophy and fibrosis. Nature Cell Biology. 20 (8), 917-927 (2018).
  12. Heredia, J. E., et al. Type 2 innate signals stimulate fibro/adipogenic progenitors to facilitate muscle regeneration. Cell. 153 (2), 376-388 (2013).
  13. Fiore, D., et al. Pharmacological blockage of fibro/adipogenic progenitor expansion and suppression of regenerative fibrogenesis is associated with impaired skeletal muscle regeneration. Stem Cell Research. 17 (1), 161-169 (2016).
  14. Kang, X., et al. Interleukin-15 facilitates muscle regeneration through modulation of fibro/adipogenic progenitors. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 1-11 (2018).
  15. Lovering, R. M., Roche, J. A., Goodall, M. H., Clark, B. B., Mcmillan, A. An in vivo rodent model of contraction-induced injury and non-invasive monitoring of recovery. Journal of Visualized Experiments. (51), e2782 (2011).
  16. Iyer, S. R., Valencia, A. P., Hernández-Ochoa, E. O., Lovering, R. M. In vivo assessment of muscle contractility in animal studies. Methods in Molecular Biology. 1460, 293-307 (2016).
  17. Mintz, E. L., Passipieri, J. A., Lovell, D. Y., Christ, G. J. Applications of in vivo functional testing of the rat tibialis anterior for evaluating tissue engineered skeletal muscle repair. Journal of Visualized Experiments. (116), e54487 (2016).
  18. Hakim, C. H., Wasala, N. B., Duan, D. Evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice. Journal of Visualized Experiments. (72), e50183 (2013).
  19. Moorwood, C., Liu, M., Tian, Z., Barton, E. R. Isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies. Journal of Visualized Experiments. (71), e50036 (2013).
  20. Gerlinger-Romero, F., et al. Non-invasive assessment of dorsiflexor muscle function in mice. Journal of Visualized Experiments. (143), e58696 (2019).
  21. Iohom, G., et al. Long-term evaluation of motor function following intraneural injection of ropivacaine using walking track analysis in rats. British Journal of Anaesthesia. 94 (4), 524-529 (2005).
  22. Brown, C. J., et al. Self-evaluation of walking-track measurement using a sciatic function index. Microsurgery. 10 (3), 226-235 (1989).
  23. Bozkurt, A., et al. CatWalk gait analysis in assessment of functional recovery after sciatic nerve injury. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 91-98 (2008).
  24. Deumens, R., Jaken, R. J. P., Marcus, M. A. E., Joosten, E. A. J. The CatWalk gait analysis in assessment of both dynamic and static gait changes after adult rat sciatic nerve resection. Journal of Neuroscience Methods. 164 (1), 120-130 (2007).
  25. McKinnon, K. M. Flow cytometry: An overview. Current Protocols in Immunology. 2018, 1-11 (2018).
  26. Jensen, A. R., et al. Neer Award 2018: Platelet-derived growth factor receptor α co-expression typifies a subset of platelet-derived growth factor receptor β-positive progenitor cells that contribute to fatty degeneration and fibrosis of the murine rotator cuff. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 27 (7), 1149-1161 (2018).
  27. Mosich, G. M., et al. Non-fibro-adipogenic pericytes from human embryonic stem cells attenuate degeneration of the chronically injured mouse muscle. JCI Insight. 4 (24), (2019).
  28. Lee, D., et al. HMGB2 is a novel adipogenic factor that regulates ectopic fat infiltration in skeletal muscles. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
  29. Low, M., Eisner, C., Rossi, F. Fibro/Adipogenic Progenitors (FAPs): Isolation by FACS and Culture. Muscle Stem Cells: Methods and Protocols. , 179-189 (2017).
  30. Giuliani, G., et al. SCA-1 micro-heterogeneity in the fate decision of dystrophic fibro/adipogenic progenitors. Cell Death and Disease. 12 (1), 1-24 (2021).
  31. Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
  32. Upadhyay, G. Emerging role of lymphocyte antigen-6 family of genes in cancer and immune cells. Frontiers in Immunology. 10, 819 (2019).
  33. Boscolo Sesillo, F., Wong, M., Cortez, A., Alperin, M. Isolation of muscle stem cells from rat skeletal muscles. Stem Cell Research. 43, 101684 (2020).
  34. Ciaramitaro, P., et al. Traumatic peripheral nerve injuries: Epidemiological findings, neuropathic pain and quality of life in 158 patients. Journal of the Peripheral Nervous System. 15 (2), 120-127 (2010).
  35. Noble, J., Munro, C. A., Prasad, V. S. S. V., Midha, R. Analysis of upper and lower extremity peripheral nerve injuries in a population of patients with multiple injuries. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 45 (1), (1998).
  36. Malik, S. Traumatic peripheral neuropraxias in neonates: A case series. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 8 (10), 10-12 (2014).
  37. Smith, B. W., Daunter, A. K., Yang, L. J. S., Wilson, T. J. An update on the management of neonatal brachial plexus palsy-replacing old paradigms a review. JAMA Pediatrics. 172 (6), 585-591 (2018).
  38. Rebolledo, D. L., et al. Denervation-induced skeletal muscle fibrosis is mediated by CTGF/CCN2 independently of TGF-β. Matrix Biology. 82, 20-37 (2019).
  39. Walls, P. L. L., McRae, O., Natarajan, V., Johnson, C., Antoniou, C., Bird, J. C. Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
  40. Yuen, D. A., et al. Culture-modified bone marrow cells attenuate cardiac and renal injury in a chronic kidney disease rat model via a novel antifibrotic mechanism. PLOS One. 5 (3), 9543 (2010).
  41. Fukada, S. I. The roles of muscle stem cells in muscle injury, atrophy and hypertrophy. Journal of Biochemistry. 163 (5), 353-358 (2018).
  42. Itabe, H., Yamaguchi, T., Nimura, S., Sasabe, N. Perilipins: A diversity of intracellular lipid droplet proteins. Lipids in Health and Disease. 16 (1), 1-11 (2017).
  43. Chapman, M. A., Mukund, K., Subramaniam, S., Brenner, D., Lieber, R. L. Three distinct cell populations express extracellular matrix proteins and increase in number during skeletal muscle fibrosis. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 312 (2), 131-143 (2016).
  44. Hillege, M., Galli Caro, R., Offringa, C., de Wit, G., Jaspers, R., Hoogaars, W. TGF-β regulates Collagen Type I expression in myoblasts and myotubes via transient Ctgf and Fgf-2 Expression. Cells. 9 (2), 375 (2020).
  45. Kafadar, K. A., Yi, L., Ahmad, Y., So, L., Rossi, F., Pavlath, G. K. Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration. Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).
  46. Batt, J. A. E., Bain, J. R. Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. Journal of Visualized Experiments. (81), e50657 (2013).
  47. Carlson, B. M. The biology of long-term denervated skeletal muscle. European Journal of Translational Myology. 24 (1), (2014).
  48. Kennedy, E., et al. Embryonic rat vascular smooth muscle cells revisited - A model for neonatal, neointimal SMC or differentiated vascular stem cells. Vascular Cell. 6 (1), 1-13 (2014).
  49. Pannérec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials. Development (Cambridge). 140 (14), 2879-2891 (2013).

Tags

علم الأحياء، العدد 172، السلف المتوسطة، السلف الليفية الدهنية، السلف العضلي المنشأ، قياس التدفق الخلوي، فرز الخلايا المنشطة بالفلور، FACS، العضلات الهيكلية، التحلل الرضي المزمن، الفئران، ضمور العضلات، التليف
تحديد وعزل وتوصيف السلف الليفية الشحمية (FAPs) والذرى العضلية المنشأ (أعضاء البرلمان) في العضلات الهيكلية في الجرذ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Te, L. J. I., Doherty, C., Correa,… More

Te, L. J. I., Doherty, C., Correa, J., Batt, J. Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat. J. Vis. Exp. (172), e61750, doi:10.3791/61750 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter