Summary
이 프로토콜은 쥐 골격 근에서 섬유-선화 선조 (FAP) 및 근생 선조 (의원)를 격리하는 방법을 설명합니다. 근육 상해 모형에 있는 쥐의 활용은 분석을 위한 위축근에서 증가한 조직 가용성및 자유로운 움직이는 동물에 있는 근육 강도 및 걸음걸이를 평가하기 위하여 검증된 방법의 더 큰 레퍼토리를 제공합니다.
Abstract
섬유-adipogenic 전조자 (FAP) 골격 근육에 거주 성 간질 세포, myogenic 전조와 함께 (의원), 근육 항상성에 중요 한 역할을, 부상, 그리고 수리. FAP 식별 및 절연 사용에 대한 현재 프로토콜은 혈류 세포측정제/형광 활성화 세포 분류(FACS) 및 현재까지 생체내에서 의 기능을 평가하는 연구가 마우스에서만 수행되고 있다. 쥐의 더 큰 내재 크기는 골격 근육 부상 모델, 특히 가혹하게 위축성 근육또는 조사관이 여러 다운스트림 분석을 수행하기 위해 상당한 조직 질량을 필요로 할 때 FAP의 보다 포괄적 인 분석을 할 수 있습니다. 쥐는 또한 동물 진정 또는 희생을 필요로하지 않는 근육 기능적 인 연구의 더 큰 선택을 제공하므로 직렬 평가를 가능하게하여 이환율과 동물 사용을 최소화합니다. 마우스에 최적화된 유동 세포종/FACS 프로토콜은 종특이적이며, 특히 시판되는 항체의 특성에 의해 제한됩니다. 그(것)들은 쥐 또는 높게 섬유질 근육에서 FAP를 분리하기 위해 최적화되지 않았습니다. 표면 마커 CD31, CD45, Sca-1 및 VCAM-1의 차동 발현에 의존하여 건강하고 기질이 강한 쥐 골격 근육에서 FAP 및 MP의 식별 및 격리를 위한 유동 세포계/FACS 프로토콜이 개발되었다. 쥐 특이적, 유동 세포측정-검증된 1차 항체는 심각하게 제한되고, Sca-1을 표적으로 하는 항체의 사내 융합이 수행되었다. 이 프로토콜을 사용하여 성공적인 Sca-1 연상이 확인되었으며, FAP와 의원의 흐름 세포 식별은 FACS 격리 FAP 및 의원의 세포 배양 및 면역 스테인링에 의해 검증되었습니다. 마지막으로, 우리는 장기간 (14 주) 쥐 기종 모델에서 새로운 FAP 시간 과정을보고합니다. 이 방법은 조사자에게 새로운 동물 모델에서 FAP를 연구할 수 있는 기능을 제공합니다.
Introduction
섬유-adipogenic 전구 세포 (FAP)는 근육 항상성, 수리 및 재생에 중요한 역할을 하는 골격 근육에 거주하는 다능성 전구 세포의 인구이며, 반대로 근육 손상에 대한 병리학적 반응을 중재합니다. 이름에서 알 수 있듯이, FAP는 원래 섬유 아세포와 지방 세포1로 분화 할 수있는 잠재력을 가진 선조 인구로 확인되었으며 만성 상해 및 질병에 있는 골격 근육의 섬유 지방 침투의 핵심 중재자로 사칭되었습니다. 추가 연구 결과는 FAP가 골발생및 연골발생2,3,4의추가능력이 있다는 것을 밝혔다. 따라서, 그들은 더 광범위하게 중간 엽 또는 기질 선조로 문학에서 통보3,5,6,7,8. 급성 골격 근육 부상에서, FAP는 일시적으로 활성화 된 근육 위성 세포와 그들의 다운스트림 심근 선조 (의원)에 대한 유리한 환경을 제공하기 위해 일시적으로 증식하여 재생 근신생에 간접적으로 원조1,9,10. 성공적인 재생과 병행하여 FAP는 자멸을 겪으며 숫자를 기준 수준1,9,10,11로되돌린다. 대조적으로, 만성 근육 상해에서, FAP는 그들의 지속성9,10,11 및 이상한 근육 복구 결과 프로 세포 신호를 재정의합니다.
FAP가 근육 반응을 중재하는 세포 및 분자 메커니즘을 평가하는 생체 내 연구에서 현재까지뮤뇨 동물모델을1,7,9,10,11,12, 13,14로활용하였다. 유전자 조작 된 마우스는 이러한 분석에 사용하기위한 강력한 도구이지만, 동물의 작은 크기는 근육 위축이 외상성 기형과 같은 심오할 수있는 장기 국화 부상 모델에서 연구를위한 조직 가용성을 제한합니다. 더욱이, 근육강도 및 신체 기능의 측정은 마우스의 종료를 필요로 하는 전 생체 내 또는 시투 측정, 또는 수술 및/또는 전신 마취가 필요한 생체 내 측정을 필요로 하여 근육 수축 성능15,16,17,18,19,20의 평가를 허용해야합니다. . 쥐에서, 잘 검증되고 세계적으로 활용된 근육 기능 분석, 걸음걸이 분석(예를 들어, 상시 기능 지수, CatWalk 분석)과 같은 보다 복잡한 모터 행동에 대한 분석이 존재하며, 깨어 있고 자발적으로 움직이는 동물21,22,23,24에서 수행된다. . 이것은 또한 동물 실험에 있는 최소한의 이환율의 원리및 사용된 연구 동물의 수를 낙관합니다. 따라서 쥐는 FAP 조사관에게 단백질 및 세포 분석을 위한 더 큰 부상된 근육 부피의 추가된 융통성과 경보 동물에서 근육 복잡한 정적 및 동적 기능 활동 및 행동의 연쇄 평가를 착수하는 기능을 제공합니다.
FAP는 주로 유동 세포측정및 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 전체 근육 샘플에서 각각 확인되고 격리되었습니다. 이들은 크기, 세분성 및 세포 표면 또는 세포 내마커(25)의특정 조합과 같은 특징적인 특징에 기초하여 다중 특정 세포 집단을 식별할 수 있는 레이저 기반 의 소세이다. 이것은 항상성 및 재생이 세포 모형의 과다에 의해 조정된 다자간 프로세스이기 때문에, 골격 근육과 같은 기관 시스템의 연구 결과에서 매우 유리합니다. 정액 연구는 마우스 골격 근육 1에서 유동 세포 측정 방법을 사용하여 FAP뿐만 아니라 의원을확인했습니다. 그(것)들은 내피성 (CD31), 조혈 (CD45), 또는 근생성 (Integrin-α7 [ITGA7]) 기원에서 세포에 특정표면 항원이 부족하기 때문에 FAP는 본질적으로 중간엽이다는 것을 보여주었습니다, 그러나 중간엽 줄기 세포 마커 Sca-1 (줄기 세포 항원 1분화)와섬유질1의 자궁근증 세포 마커Sca-1을 표현했습니다. 다른 연구는 대체 줄기 세포 마커의 발현에 기초하여 근육에서 중간엽 전두체의 성공적인 절연을 입증, 혈소판 유래 성장 인자 수용체 알파 (PDGFRα)2,7,8 및 추가 분석은 FAPs와 동일한 세포 집단이 될 가능성이 있음을 밝혀3. FAP는 이제 일반적으로 양성 선택 마커1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31로 Sca-1 또는 PDGFRα를 사용하여 유량 세포측정에서확인된다. . PDGFRα의 사용은 인간 조직에 우선적이지만, 뮤린 스카-1의 직접적인 인간 호모로그로 아직 확인되지 않은32. 또한, 다른 세포 표면 단백질은 FAP격리(33)에서근생 계보의 세포 지표로서 ITGA7에 대한 잠재적 대안을 제공하는 MP(예를 들어, VCAM-1)의 마커로서 보고되었다.
유동 세포측정법/FACS는 골격 근육1,9,10,11,13,29에서FAP의 역할 및 병원성 잠재력을 연구하기 위한 강력한 방법론이지만, 필요한 시약의 특이성 및 최적화에 의해 기술적으로 제한됩니다. FAP의 흐름 세포 식별 및 격리가 마우스 동물 모델1, 9,10,11,29에서개발 및 수행되었기 때문에 다른 모델 유기체에서 FAP를 연구하고자하는 연구자에게 도전이 제기됩니다. 처리될 최적의 조직 크기, 시약 및/또는 항체 특이성 및 가용성과 같은 많은 요인은 사용되는 종에 따라 다릅니다.
새로운 동물 모델에서 FAP를 연구하는 기술적 장벽 외에도, 그들은 주로 급성에서 연구되었습니다, 독성 설정 - 일반적으로 근육 화학 주입 또는 심장 독소를 통해. FAP의 장기 역학평가는 주로 듀첸의 근이영양증 에 대한 평가에 국한되어 있으며, mdx 마우스 모델9,10,11,및 동시 힘줄 트란과 기질이 어깨 근육26,27, 28, 28에서 동시 힘줄 과 기립이 수행되는 대규모 회전근 파열과 같은 조합 근육 부상의 모델 . 만성 외상성 기형의 단독 모욕에 대한 FAP의 반응, 중공업, 농업 및 출생 외상 (brachial 신경총 상해)에서 발생하는 일반적인 발생 (brachial 신경총 상해)34,35,36,37이 중요한 이환율을 가진, 종종 단기 시간 프레임11,38로제한되는 특성화되지 않았습니다.
우리는 쥐에 있는 가혹한 위축및 섬유성 골격 근뿐만 아니라 건강에서 FAP와 의원을 확인하고 격리하는 방법을 기술합니다. 첫째, 조직 소화 및 유동 세포체 염색 프로토콜을 사용하여 CD31/CD45-1+/VCAM-1-FAP 및 CD31/CD45-1-/VCAM-1+ MP의 식별이 입증되고, 분리된 세포의 배양 및 면역세포 화학적 얼룩을 통해 당사의 연구 결과의 후속 검증이 수행된다. 이 방법을 사용하여, 우리는 또한 쥐에 있는 장기 고립된 기질 상해 모형에 있는 새로운 FAP 시간 과정을 보고합니다.
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Protocol
이 프로토콜을 수행하는 조사관은 지역 동물 윤리 위원회 /관리 위원회의 허가를 받아야합니다. 모든 동물 작업은 세인트 마이클의 병원 유니티 건강 토론토 동물 관리위원회 (ACC #918)에 의해 승인되었으며 캐나다 동물 관리위원회 (CCAC)가 제시 한 지침에 따라 수행되었습니다. 플로우 세포측정 프로토콜의 회로도는 도 1에도시된다. 다운스트림 응용 프로그램이 FACS 및 후속 세포 배양인 경우 모든 단계는 적절한 무균 기술로 완료되어야 합니다.
1. 근육 수확
- 지역 생체 및 동물 윤리 위원회 지침에 따라 적절한 마취 및 희생을 사용하여 쥐를 마취합니다. 이 프로토콜은 성인 여성 루이스 쥐 (200-250 g)에서 위장 근육을 수확, 예를 들어. 쥐는 2-3%의 이소플루란을 사용하여 마취되었고 T61의 심내 주입에 의해 희생되었다.
- 동물이 희생되면 근육의 위치를 용이하게하고 수확 된 조직의 모피 오염을 최소화하기 위해 전체 뒷다리를 면도하십시오.
- 멸균 메스를 사용하여 발목 관절 의 둘레 주위와 발목에서 엉덩이까지 뒷다리의 내측 측면의 중간선까지 두 개의 절개를 합니다.
- 대퇴골의 내측 및 측면 콘딜레에서 유래하고 아킬레스 건에 삽입 기본 위장혈증을 밝히기 위해 피부와 피상적 인 근육 층을 다시 껍질.
- 무딘 해부를 사용하여 위트로테니미를 주변 조직과 분리하여 힘줄에 의해서만 근육을 처리하여 크러시 부상을 피하십시오.
- 날카로운 가위로 가능한 한 탈모한 아킬레스 건을 분리하여 위트로네미에 대한 삽입을 분리하십시오. 절단되면, 집게로 아킬레스 건을 잡고 부드럽게 밑줄 뼈떨어져 위트로네미를 껍질. 여전히 한 손에 집게와 근육을 잡고, 위장혈증의 두 기원을 찾아 내측과 측면 대퇴 추도에서 잘라.
- 가능한 한 많은 혈액을 제거하기 위해 살균 된 거즈 조각에 대해 절제 된 위장혈을 부드럽게 얼룩. 멸균 표면에 근육을 손질하고 아킬레스 건뿐만 아니라 과도한 결합 조직을 제거합니다.
- 계량 보트에 근육을 놓고 정밀 한 스케일을 사용하여 무게. 이 프로토콜은 200-600 mg에 이르는 젖은 무게로 근육을 소화하도록 최적화되어 있습니다. 작업자는 원하는 경우 다른 다운스트림 분해를 위해 과도한 수확 조직을 세분화할 수 있습니다.
- 수확된 근육을 유동 세포측정에 사용하는 근육을 3-4개의 작은 조각(약 1-2cm3)으로부드럽게 나누고 얼음냉이 1배 PBS에 침수합니다. 모든 샘플을 수확 할 때까지 얼음에 차가운 유지.
2. 근육 소화
- PBS에서 근육을 제거하고 멸균 10cm 세포 배양 접시에 배치합니다. 조각이 약 3-4mm3이될 때까지 부드럽게 찢어지고 조직을 양포로 다진, 가능한 한 많은 결합 조직을 제거. 일단 철저하게 다진, 6 mL DMEM + 1 % 페니실린 / 연쇄 절제술 (P / S)를 포함하는 멸균 50 mL 원문 튜브로 전송합니다.
- 콜라게나제 II 용액 365 μL(재고 농도 4800 U/mL)에 300mM CaCl2 용액의 10μL을 추가하여 콜라게나제 효소를 활성화합니다. 활성 콜라게나아제 II 용액을 조직 슬러리를 포함하는 50mL 원문 튜브에 추가합니다. 최종 콜라게나아제 II 농도는 250 U/mL입니다.
- 37°C, 240 x g에서1시간 동안 셰이커에 튜브를 인큐베이션하여 15분마다 수동으로 소용돌이어 튜브 측면에 부착된 조직을 제거합니다.
- 1 시간 후 셰이커에서 튜브를 제거하고 샘플 당 다음을 추가하십시오 : 콜라게나세 II의 100 μL (4,800 U /mL) 및 디스파스 (4.8 U /mL)의 50 μL.
- 피펫 샘플은 용액이 균일할 때까지 15-20배의 혈청피펫을 사용한다. 여러 샘플을 처리하는 경우 각 샘플에 대해 별도의 멸균 파이펫을 사용하여 시료 교차 오염을 방지하십시오.
- 37°C 및 240 x g에서30분 동안 셰이커로 다시 배양합니다. 15 분 후, 튜브의 측면에서 부착 조직을 제거하기 위해 손으로 샘플을 흔들어.
3. 단일 셀 서스펜션생성
- 10 사이클 동안 20 G 바늘로 10mL 주사기를 통해 천천히 전단시.
참고: 한 주기 주사기에 근육 솔루션을 복용 포함, 튜브에 다시 주입. 과도한 거품이 추가 세포 사망을 일으킬 수 있으므로 천천히 전단을 완료하여 거품을 최소화해야합니다(39). - 멸균 50mL 원판 튜브에 40 μm 셀 스트레이너를 놓고 5mL DMEM + 10 % FBS 및 1 % P / S를 피펫팅하여 적시십시오.
- 피펫 1 mL 샘플은 세포 스트레이너를 통해 한 번에.
- DMEM을 10% FBS, 1% P/S로 스트레이너를 통해 전지 스트레이너를 세척하여 튜브의 총 부피를 25mL로 가져옵니다.
- 시료의 25mL를 15°C에서 15mL 원심형 튜브와 원심분리기, 15분 동안 400 x g로 균등하게 분할합니다.
참고: 근육 용액을 15mL 원문 튜브 2개로 분할하면 단일 튜브에 비해 원심분리 후 세포 회복이 개선됩니다. - 상류체를 흡습하고 1mL 1x RBC 리시스 버퍼(보충 파일참조)에서 7분 동안 적혈구를 제거한다.
- 9mL의 워시 버퍼(보충 파일참조)로 10mL로 볼륨을 들고 400 x g,15 °C에서 15 분 동안 튜브를 회전하십시오.
- 1 mL 세척 버퍼에서 다시 일시 중단하여 슈퍼 네티얼을 흡인하고 펠릿을 재결합하십시오.
- 별도의 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브로 적절한 양의 세포를 옮기고 트라이판 블루 염료와 섞는다. 혈전계를 사용하여 가벼운 현미경으로 살아있는 세포를 계산합니다.
4. 유동 세포측정을 위한 항체 염색
참고: Sca-1 항체는 제조업체의 지침에 따라 세포측정/FACS 실험을 하기 전에 APC에 공해져야 합니다. 각 컨쥬게이트배치(그림 2)에대해 성능이 유효성을 검사해야 합니다. 최종 컨쥬게이션은 -20°C에서 20 μL 알리쿼트에 저장될 수 있으며 3주 동안 안정적입니다. 전체 컨쥬게이션 프로토콜은 보충 파일을 참조하십시오.
- 유동 세포측정을 위해 실험 샘플당 1-2 x 106 세포를 멸균 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브로 이송한다. 세척 버퍼로 최대 1mL의 부피를 가져와 얼음 위에 놓습니다.
- 각 실험에 대해, 다음과 같은 필수 컨트롤을 설정: i) 스테인드 및 ii) 생존 능력 컨트롤은 라이브 셀 집단을 정확하게 선택; iii) 형광은 단일 셀 서스펜션에 대한 1개의 (FMO) 제어를 뺀 값CD31-/CD45-분획, FAP 및 의원에 대한 정확한 게이트를 설정합니다. 및 iv) 단일 스테인드 보상 구슬은 채널 간의 형광 유출을 수정합니다.
- 모든 셀 컨트롤의 경우, 알리쿼트 5 x 105 - 1 x 106 셀 1 mL의 세척 버퍼에서 1.5 mL 마이크로 센심 분리기 튜브와 얼음에 배치합니다.
- 비드 컨트롤의 경우, 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브에 1방울의 양수 보상 구슬(~1.5 x 105 비드)을 추가합니다. 컨트롤의 전체 보완은 표 1에나열됩니다.
참고: 실험이 처음으로 수행되는 경우, 단일 세포 현탁액에 대한 각 공자 항체에 대한 단일 스테인드 컨트롤을 실행 (얼룩지지 않은, 생존가능성, 단일 염색 보상 비드 및 FMO 컨트롤 이외에) 세포에서 양성 얼룩진 인구를 평가하고 보상 비드에 관찰 된 염색을 검증하십시오. 보상 구슬 및 단일 셀 현탁액에 단 하나 염색을 수행하여 모든 갓 컨쥬게이션된 Sca-1:APC 준비를 검증합니다. 염색 컨트롤의 전체 목록은 표 1을 참조하십시오.
- 생존력 조절을 준비하려면 세포의 부피의 절반을 "생존가능성" 튜브에서 새로운 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브로 이송한다. 이 튜브를 "죽은"이라고 표시합니다.
- 세포를 죽이기 위해 65 °C에서 "죽은"튜브를 인큐베이션 한 다음 얼음위에 놓습니다. 2-3 분 후, 생존 제어 튜브에 남아있는 살아있는 세포와 죽은 세포를 다시 결합합니다. 이 셀 모집단은 보상 값(필요한 경우)을 설정하고 생존 가능성 염료에 대한 게이트를 적절하게 설정하는 데 사용됩니다.
- 원심분리기는 500 x g,4°C에서 5분 동안 단일 세포 서스펜션(실험 샘플 및 대조군)을 원심분리합니다.
- 100 μL 세척 버퍼에서 슈퍼네티드를 흡인하고 셀 펠릿을 다시 중단합니다.
- 실험용 시료 또는 대조에 따라 항체를 추가합니다. 항체 조합 및 양에 대한 정보는 염색 매트릭스(표2)를참조하십시오.
- 각 샘플을 부드럽게 쓸어서 15분 동안 어둠 속에서 얼음에 완벽하게 혼합하고 배양합니다. 보상 구슬의 경우, 어둠 속에서 실온에서 15 분 동안 배양하십시오.
- 단일 셀 서스펜션 실험 및 제어 샘플의 경우 900 μL 세척 버퍼를 추가하여 부피를 1mL로 끌어올수 있습니다. 보상 비드 컨트롤의 경우 1x PBS의 900 μL로 부피를 1mL로 끌어올수 있습니다.
- 원심분리기 단일 세포 현탁액 샘플은 500 x g,5 분 동안 4 °C. 원심분리기 보상 비드는 300 x g,5 분 동안 4 °C에서 제어합니다.
- 모든 단일 세포 현탁액 샘플의 경우, 흡인 및 300 μL 세척 버퍼에서 셀 펠릿을 다시 중단하십시오. 보상 비드 컨트롤, 흡인 및 슈퍼 나들을 폐기하려면 1x PBS의 300 μL에서 펠릿을 다시 중단한 다음 음의 보상 구슬 1 방울 (~1.5 x 105)을추가합니다.
- 모든 단일 셀 서스펜션 샘플을 알루미늄 호일 아래 얼음에 보관하고 세포 측정 획득을 진행합니다. 보상 구단 컨트롤도 빛으로부터 보호해야 하지만 실온에서 보관할 수 있습니다.
참고: 실험적 종점이 유동 세포측정에 의한 FAP 식별인 경우 5.1.1-5.11단계를 따르십시오. 종점은 배양 및 염색을 위해 FACS를 통한 세포 격리인 경우 5.2.1-5.2.9 단계 및 섹션 6-7을 따르십시오.
5. 유동 세포 측정 및 형광 활성화 세포 분류 (FACS)
- 유동 세포측정
참고: 이 프로토콜은 405nm, 488nm 및 640 nm 레이저가 장착된 벤치탑 유동 사이토미터를 사용하여 10가지 색상을 동시에 구별할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 밴드패스 필터 및 관련 플루오로크롬은 다음과 같습니다: 450/50(SYTOX 블루), 530/30(FITC), 575/25(PE), 670/30(APC). 각 검출기에 대한 전압은 다음과 같습니다 : FSC 700; SSC 475; FITC 360; PE 460; PE-Cy7 600; SYTOX 블루 360; APC 570. 사용하기 전에 유동 사이토미터 또는 셀 선별기의 적절한 작동에 대해 교육을 받을 수 있습니다.- 세포계가 사용하기 전에 10-20분 동안 켜져 있는지 확인하고 각각 30-45s의 깨끗한 헹구기 및 칼집 유체 용액으로 순차적으로 세척하여 준비되었는지 확인합니다. dH2O.로 헹구면 적절한 양의 칼집 유체가 저장 용기에 첨가되어 획득 전반에 걸쳐 적절한 샘플 흐름을 유지합니다.
- 그림 3에서설명된 FAP 및 의원을 식별하기 위한 게이팅 전략을 설정합니다.
참고 : FAP와 의원은 다음과 같은 계층 게이팅 전략에 의해 식별됩니다 : i) SSC-A 대 FSC-A (사이드 셀 산란 영역 대 전방 세포 분산 영역 대 파편 을 분리), ii) FSC-W vs FSC-H (앞으로 세포 분산 폭 대 전방 세포 분산 높이는 FSC 매개 변수에서 더블에서 싱글을 구별하기 위해, iii) SSC-W 대 SSC-H (측면 셀 분산 폭 대 측면 셀 분산 높이 대 SSC 매개 변수에서 더블에서 싱글을 구별하는) iv) SSC-A vs SYTOX 블루 (죽은 싱글을 구별하기 위해), v) SSC-A vs CD31/45:FITC (CD31+ 및 CD45+ 세포를 추가 분석에서 제외), vi) Sca-1:aPC vs VCAM-1::P E CD31-/CD45- 라인 린-) 인구 (FAP 및 의원의 식별). FAP는 CD31/CD45-/Sca-1+/VCAM-1-이벤트로 식별되며, 의원은 CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ 이벤트로 식별됩니다. - 먼저 각 단일 스테인드 보상 비드 컨트롤을 저속의 사이토미터를 통해 실행하여 채널 간의 형광 유출을 보정하는 데 사용되는 보상 값을 생성합니다. 자체 검출기(예: SSC-A vs Sca-1:APC 단일 염색 구슬)와 다른 모든 검출기에서 각 제어의 형광 신호를 비교하여 보상을 평가합니다. 적절한 검출기에는 두 개의 별개의 인구(음수와 양수 신호가 있는 인구)가 있어야 하며 다른 모든 검출기에는 부정적인 집단만 있어야 합니다. 정지 게이트를 10,000개의 보상 비드 이벤트로 설정하고 데이터를 기록합니다.
참고: 각 샘플을 획득하는 동안 시료 간 오염을 피하기 위해 10-20초 동안 사이토미터를 통해 dH2O를 실행해야 합니다. - 다음으로 스테인드 및 생존 능력 제어 샘플을 처리하여 살아있는 단일 셀에 올바르게 게이트합니다. 정지 게이트를 10,000개의 단일 이벤트로 설정하고 데이터를 기록합니다.
참고: 스테인드 되지 않은 시료를 제외한 각 단일 셀 서스펜션 시료를 획득하기 약 5분 전, SYTOX 블루 생존성 염료 1μL(1mM 스톡 용액에서 희석된 300μM 작업 농도)을 각 샘플에 추가하고 부드럽게 섞어 둡니다(최종 농도 1 μM). - 그런 다음 나머지 단일 세포 서스펜션 제어 샘플을 획득합니다. 게이팅전략(그림 3)에서적절한 플롯으로 각 FMO 제어를 평가합니다. 예를 들어 CD31+CD45 FMO의 FITC 신호를 평가하여 정확한 CD31/CD45 게이트를 보장합니다. 최적의 예는 도 3G에표시됩니다. 프로토콜이 처음으로 수행되는 경우 FMO 컨트롤을 획득하기 전에 셀에 대한 단일 스테인드 컨트롤을 실행해야 합니다.
- 적절한 검출기뿐만 아니라 다른 모든 검출기에서 각 단일 스테인드 셀 샘플의 형광 신호를 평가하여 적절한 보상을 검증합니다. 정지 게이트를 10,000개의 라이브 싱글 이벤트로 설정하고 소프트웨어에 기록합니다.
- 모든 컨트롤(단일 세포 서스펜션 및 구슬)이 처리되면 먼저 각 샘플의 부피를 측정하고 기록하여 모든 실험 샘플을 준비합니다. 이러한 측정은 5.1.11 단계에서 설명된 바와 같이 FAP와 의원을 정확하게 정량화하는 데 사용됩니다. 그런 다음 50 μL의 정밀 계산 구슬을 넣고 2-3번 위아래로 파이프를 통해 부드럽게 섞습니다.
- 첫 번째 실험 샘플을 간략하게 실행하여 계수 비드 집단의 식별을 확인합니다. 이 인구는 FSC-A 대 SSC-A플롯(그림 3A,적색 상자)의 일반 세포 집단과 는 별개의 작은 클러스터로 나타납니다. 계산 구비드 인구 주위에 게이트를 만듭니다. 그런 다음 저속으로 사이토미터를 통해 처리하여 각 실험 샘플에 대한 데이터를 수집합니다. 정지 게이트를 10,000개의 카운트 비드 이벤트로 설정하고 기록합니다.
참고: 구슬계산은 모든 검출기에서 형광이기 때문에 SSC-A와 검출기를 평가하는 추가 플롯을 설정하여 구슬 계산을 식별할 수 있습니다. - 모든 샘플이 처리된 후 적절한 프로토콜을 사용하여 사이토미터를 청소하십시오. 분석을 위해 모든 데이터를 내보냅니다.
- 적절한 흐름 세포 분석 소프트웨어에서 모든 데이터 파일을 엽니다. 5.1.2 단계에서 설명한 대로 데이터 수집에 사용되는 게이팅 전략을 설정합니다. 데이터 수집(예: 스테디에이징, 생존 가능성, 단일 얼룩, FMO 컨트롤)과 동일한 순서로 컨트롤을 검사하여 게이팅 전략을 다시 검증합니다. FMO 컨트롤을 사용하여 정확한 게이트를 설정하면 모든 실험 샘플에 게이트를 적용합니다. 원시 데이터를 정량화를 위한 스프레드시트로 내보냅니다.
- 계산 구슬을 사용하여 각 실험 샘플에서 FAP 및 MP 수를 계산합니다.
여기서, 획득된 셀 카운트는 취득 소프트웨어에 관련 세포 집단(예: FAP 또는 의원)의 기록된 이벤트의 수입니다; 획득한 비드 카운트는 획득 소프트웨어에서 구슬을 계산하는 기록된 이벤트 수입니다. 구슬 볼륨 계산은 5.1.7 단계에 추가된 비드 솔루션 계산의 양입니다. 샘플 볼륨은 구슬 을 계는 첨가하기 전에 각 염색 된 실험 샘플의 부피입니다.; 비드 농도는 μL 용액당 구슬의 수입니다. 이 값은 제품 데이터 시트에서 찾을 수 있습니다.
- FACS - 세포 배양을 위한 선별
참고: 이 프로토콜은 11-14색을 동시에 구별할 수 있는 4개의 레이저(UV, 바이올렛, 블루, 레드)가 장착된 세포 선별기에서 FACS를 수행합니다. 실험용 샘플 스테인링(섹션 4) 및 유동 세포측정 프로토콜을 따르면 아래 설명된 1단계에서 3단계를 제외하고 FACS 워크플로우를 최적화하십시오.- 실험 샘플에서 세포의 농도를 7 x 106 세포/mL로 정렬하여 FAP 및 MP의 견고한 수율을 생성합니다.
- 세포 농도가 현저한 증가를 설명하기 위해, 실험 샘플에서 모든 항체 농도를 두 배로 정렬한다.
- 최종 스테인드 셀 샘플을 40 μM 셀 스트레이너 캡을 5mL 폴리스티렌 튜브에 부착하여 세포 응집량을 줄이고 정렬 수율을 증가시면 바로 정렬합니다.
- 세포 선별기에서 직접 단일, 라이브 래트 FAP 및 의원을 수집하여 멸균 1mL, 100% 태아 소 혈청(FBS)을 포함하는 5mL 폴리프로필렌 수집 튜브로 수집합니다. 정렬이 완료될 때까지 셀을 얼음 위에 보관하십시오.
참고: 오프사이트 위치에서 FACS를 수행하는 경우 정렬된 모든 셀을 얼음과 고정된 지붕으로 전송합니다. - 멸균 생물 안전 캐비닛 (BSC)에서 작업, 적절한 성장 매체 (예를 들어, FAP 성장 미디어 (FAP GM) 정렬 FAP, 그리고 MP 성장 매체 (MP GM) 정렬 된 의원을위한, 그리고 원심 분리기 500 x g, 4 °C에서 7 min을 제거 가능한 7 min.
- 적절한 성장 매체와 플레이트의 1mL에서 펠릿을 멸균, 콜라겐 코팅 12mm 유리 커버슬립/후속 면역스테인링에 대한 잘 함유된 12웰 플레이트로 재장판한다(섹션 6 참조).
참고: 콜라겐에 대한 면역 세포화학 염색이 있는 경우, 플레이트는 콜라겐 코팅 대신 멸균, 라미닌 코팅 12mm 유리 커버슬립/웰을 포함하는 12개의 웰 플레이트로 세포를 분류하였다. 즉시 분리된 전조자의 면역 세포화학 실험이 필요한 경우, 종자 FAP와 의원은 cm2당 15,000개의 세포밀도로 6.1단계로 직접 진행한다. 종전배의 경우 전구 분화를 유도하기 위해, cm2당5,000개의 세포밀도에서 종자 FAP, 그리고 CM2당7,500세포의 밀도로 의원을 종자 FAP한다. - 세포 배양인에서 세포를 37°C 및 5%CO2에서 배양한다. 문화에서 72 h 후, 미디어의 절반을 변경합니다. 이후 2-4d마다 미디어를 완전히 변경합니다.
- 심낭개발을 유도하기 위해 9일째에 MP 분화(MD) 배지로 국회의원 배양을 전환한다. 지방세포를 유도하기 위해, FAP 배양을 10일째에 FAP 성 분화(AD) 배지로 전환한다.
- 섬유신생을 유도하기 위해, FAP는 배양 중 가변시간에 섬유생성 분화(FD) 배지로 전환될 수 있거나, 또는 대안적으로, 격리 후 FD 미디어로 직접 시드될 수 있다(단계 5.2.6) (모든 미디어 레시피에 대한 보충 파일 참조).
6. 배양 된 FAP 및 의원의 면역 세포 화학
- 세포 정렬의 유효성을 검사하고 FAP 및 MP 배양의 순도를 입증하려면 PDGFRα (FAP 마커), Pax-7 (근육 줄기 [위성] 세포 마커), 섬유 아스트론 특정 단백질 (FSP-1, 섬유 아세포 마커), 페리핀-1 (플린-1, 아디포티마커), 콜라겐 타입 1 (Col1a1, 섬유증의 지표), 마이오스 헤비 체인 (MHC 성숙)을 포함하는 세포 형 특정 마커를 가진 면역 스테인.
- 갓 선별된 세포의 면역 염색을 위해 실온에서 3분 동안 200 x g의 12웰 플레이트원심분리기를 하여 커버슬립/웰에 세포를 쉽게 준수합니다. 이 단계는 장기 문화에 필요하지 않습니다. 문화 매체를 제거합니다.
- FSP-1을 가진 면역 염색을 위해, 4°C에서 2 분 동안 1 mL 100% 메탄올 (MeOH)로 세포를 고정합니다. PDGFRα, 플린-1, Pax7 또는 Col1a1에 대한 면역 염색시, 실온에서 15분 동안 1x PBS에서 1mL 4% PFA로 세포 배양을 수정한다. MHC 면역 염색은 어느 고정도를 용인합니다.
참고: 메탄올 고정 셀의 경우 6.2단계를 건너뛰고 6.3단계로 진행합니다.
- 4% PFA를 흡인하고 1배 PBS로 세포 배양을 3-4회 빠르게 세척합니다. 1x PBS에 1mM 글리신을 넣고 실온에서 10분 동안 배양하여 잔류 PFA를 비활성화합니다. 1x PBS로 1-2회 흡입및 세척합니다.
참고: 세포는 1x PBS의 2mL에 이 단계에서 방치할 수 있으며, 집착 필름으로 싸서 최대 7-10일 동안 4°C로 보관할 수 있다. - 세척 후, 1x PBS에 0.1% Triton-X의 1mL를 추가하고 세포막을 충혈하기 위해 20 분 동안 배양하십시오.
- 1x PBS의 1-2 mL로 우물을 2-3 번 씻은 다음 실온에서 1 시간 동안 1 x PBS + 3 % BSA의 1 mL로 세포를 차단합니다.
- 1x PBS + 3% BSA(PDGFRα 1:100, 팍스7 깔끔한, FSP-1 1:50, 플린-1 1:400, Col1a1 1:250, MHC 3 μg/mL)로 희석된 1차 항체의 파이펫 80 μL이 파라필름 을 탭하여 이동식 컨테이너에 테이프로 붙인다. 멸균 미세 포셉을 사용하여 커버슬립을 우물 밖으로 조심스럽게 들어 올리고 항체 용액의 방울에 반전시면 됩니다. 항체 용액의 증발을 피하기 위해 플라스틱 필름에 젖은 두 개의 종이 타월과 커버 용기로 커버 슬립을 인큐베이션하십시오. 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
참고: 염색 커버는 우물 내부에 염색하는 것보다 항체(~80 μL)를 적게 활용합니다(최소 500μL). - 2일째에는 실온에서 30분 동안 커버립을 그대로 둡니다. 집게를 신중하게 바르고 커버를 각각 의 우물(세포를 위로 향하게 하는 세포)로 다시 2-3회 세척하고, 1x PBS1-2mL로 2-3회 세척하여 가능한 한 많은 1차 항체를 제거한다.
- 1차 항체 염색과 동일한 염색 기술을 사용하여, 염소 안티래빗 알렉사 플루어 488 이차 항체(1:400)를 가진 얼룩 세포는 FSP-1, 플린-1, Col1a1, 또는 PDGFRα 및 염소 항마우스 알렉사 플루어 555 이차 항체(1:300)를 검출한다. 실온에서 1시간 동안 세포를 배양하고 세포가 빛으로부터 보호됩니다.
- 실온에서 2-4 분 동안 Hoechst (1:10,000)를 사용하여 우물로 세포를 반환하고 세포를 배양하십시오. 여분의 Hoechst를 제거하기 위하여 2 분 마다 1x PBS로 또 다른 2-3 시간을 세척합니다.
- 마운트 커버립을 유리 슬라이드에 마운트커버리핑을 사용하여 페이드 형광 장착 매체를 사용하고 실온에서 밤새 건조슬라이드를 남깁니다. 어두운 4 °C에 장착 된 커버립을 저장합니다.
7. 오일 레드 O (ORO) 배양 FAP및 의원의 염색
- 세포막의 투과화로 비특이적/바람직하지 않은 비-비 염색 귀착될 수 있기 때문에 비-투과성 세포에 ORO 염색을 수행. 염색을 하기 전에 ORO 작업 재고를 준비하고(레시피에 대한 보충 파일 참조) 실온에서 20분 동안 배양하십시오.
- 20분 후, 용해되지 않은 골재를 제거하기 위해 0.2 μm 필터를 사용하여 용액을 필터링합니다.
- 잘에서 미디어를 흡인하고 10 % 중립 버퍼 포머린 (10 % NBF)의 1 mL을 추가합니다. 실온에서 5분 동안 배양하십시오.
참고: 세포 합류로 인해 웰/커버슬립에서 해제될 수 있습니다. 솔루션을 흡입/추가할 때 주의하십시오. - 흡인 및 신선한 10 % NBF의 1 mL을 추가하고 실온에서 적어도 1 h에 대한 인큐베이션.
참고: 세포가 하룻밤 사이에 10% NBF에 남을 수 있기 때문에 프로토콜은 이 시점에서 중지될 수 있습니다. - 60%의 이소프로판올 1mL로 한 번 빠르게 씻은 다음, 흡인을 하고 우물이 완전히 건조(약 2분)되도록 합니다.
- 우물당 400 μL 오일 Red O 작업 재고를 추가하고 실온에서 10 분 동안 배양하여 플레이트 벽에 ORO를 피하십시오.
- 오일 레드 O를 모두 제거하고 dH2O로 4 회 빠르게 씻어 내보겠습니다.
참고: 스테인드 웰에 커버립이 포함되어 있는 경우 6.9단계에서 설명된 것과 동일한 기술을 사용하여 마운트합니다. - 이미지는 밝은 필드 현미경을 사용하여 커버립 또는 잘 염색 된 커버립을 장착.
8. 모순과 기재 쥐 위장 혈증 섹션의 조직 염색
-
피그리리우스 레드 (PSR)
- PSR 염색을 수행 5 μm 두께, 포르말린 고정 파라핀 임베디드 (FFPE) 쥐 위트종양 히스토로지학적 섹션은 이전에 설명된 바와 같이40.
-
오일 레드 O (ORO)
- 5 μm 두께의 고정된 5μm-냉동 쥐 위장술 학적 섹션은 10 분 동안 PFA 4 % PFA로, 1 분 동안 60 % 이소 프로필 알코올로 배양하십시오.
- 12 분 동안 ORO 작업 재고와 얼룩. 60% 이소프로필 알코올을 1분 동안 인큐베이션하고, 다용성 마운팅 미디어를 사용하여 커버립에 dH2O. 마운트에서 10분 간 세척합니다.
-
Sca-1 및 라미닌 조직 형광 면역 조직 화학 (IHC)
- 5 μm 두께의 이조판-냉동 쥐 위트로테미혈증 연성 섹션에서 형광 IHC를 수행합니다.
- 5 분 동안 1 x PBS에서 샘플을 수분, 10 분 동안 4 % PFA에 수정 한 다음 조직 IF 차단 솔루션 (보충 파일참조)에서 샘플을 90 분 동안 배양하십시오.
- 1x PBS + 0.05% Tween에서 하룻밤 사이에 희석된 항-Sca-1 1 차성 항체(1:500)를 가진 배양.
- 2일째에는 1x PBS + 0.05% 트웬에서 각각 5분 동안 3회 세척한 다음 염소 안티래빗 알렉사 플루어 555(1:500)에서 1시간 동안 인큐베이션을 합니다.
- 다시 씻어 (이전과 같이), 1 h에 대한 차단 용액으로 인큐베이션 한 다음 1 x PBS + 0.05 % Tween에서 희석 된 안티 라미닌 원차 항체 (1:500)를 1 h에 추가하십시오.
- 다시 씻어 (이전과 같이), 다음 염소 안티 토끼 알렉사 플루어 488 (1:500)에서 배양 1 시간 (라미닌).
- 다시 씻은 다음 DAPI(1:10,000)에서 4분 동안 배양합니다. 페이드 방지 마운팅 매체를 사용하여 커버립에 세척하고 장착하십시오.
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Representative Results
Sca-1 및 VCAM-1을 포함한 새로운 항체 패널을 사용하여 유동 세포측정을 통해 FAP 및 의원을 식별
쥐 근육에서 FAP를 식별하기위한 게이팅 전략은 CD31 (내피) 및 CD45 (혈토포이틱)의 게이트가 있는 마우스29의흐름 세포 측정 프로토콜을 기반으로하고 FAPs 마커 Sca-1 및 MpPs 마커 ITGA7의 형광 프로파일을 검사합니다. 쥐 Sca-1 및 ITGA7에 대한 시판, 불소- 컨쥬게이트 및 유동 세포측정 항체가 없는 경우, 우리는 쥐 Sca-1:APC 항체를 자체 수렴하고 의원을 식별하기 위한 대안 전략을 착수했습니다. VCAM-1은 최근 쥐의원(33)의 격리를 위한 효율적인 단일 양성 선택 마커로 나타났으며, VCAM-1을 대상으로 쥐 특이적, 공주, 유동 세포측정 검증 항체를 사용할 수 있게 됨에 따라, 우리는 VCAM-1을 활용하여 ITGA7과 는 반대로 의원을 식별하였다.
건강한 쥐 위트로테뉴(그림2A,B)로부터생성된 보상 구슬 및 세포 현탁액의 단일 염색을 통해 Sca-1:APC 항체의 성공적인 컨쥬게이션 및 성능을 확인했습니다. Sca-1:APC(도2C)의5점 적정은프로토콜(보충 도 1)에사용되는 다른 모든 항체(CD31:FITC, CD45::FITC, VCAM-1:PE)에 추가하여 수행되었다. 이 새로운 패널 디자인을 사용하여, 퍼티드 FAP와 의원은 건강한 위장혈증(그림3)에서동시에 확인되었으며, Sca-1(Lin-/Sca-1+/VCAM-1-1-)에 대한 세포 단일 양성은 FaP(레드 박스)로 지정되었고 VCAM-1(Lin-Sca-1-1-1-VCAM-1+)에 대한 세포 단일 양성으로 지정된 것으로 지정되었습니다(Lin-/Sca-1-1-1+1+). 우리는 또한 Sca-1 및 VCAM-1 (Lin-/Sca-1+/VCAM-1+)에 대해 두 배 양성 세포의 인구를 확인했습니다(그림 3F;오른쪽 상단 사분면).
FACS 및 세포 배양에 의한 FAP 및 의원 식별 검증
쥐 골격 근육에서 FAP와 의원의 흐름 세포 측정 식별을 위해 제시 된 프로토콜을 검증하기 위해, 우리는 시험관 내배양에 대한 살아있는 세포를 분리하기 위해 노력했다. FACS를 사용하여 실행 가능한 FAP와 의원은 흐름 사이토메트릭 분석과 동일한 게이팅 전략을 사용하여 격리되었습니다. 약 20,000-40,000 Faps 및 30,000-50,000의원은 230 g 쥐에서 단 하나 위장 근육에서 세포 배양을 위해 수집되었다.
각 집단의 순도를 확인하기 위해 PDGFRα 및 Pax7에 대해 새로 분류된 FAP 및 의원을 공동 면역화했습니다. PDGFRα는 Sca-1 외에 두 번째 중간엽 전구 마커이며, 일반적으로 FAP2,7,8을식별하는 데 사용된다. Pax-7은 근육 위성(stem) 세포의 잘 인식되고 널리 사용되는마커(41)이다. FAP의 정렬된 인구는 Pax7 양성 세포에 의한 오염 없이 PDGFRα에 대한 양수 염색을 표시하였다(도4A;상단 행). 반대로, PS의 정렬된 인구는 PDGFRα 양성세포(그림 4A;하단 행)의 부재로 Pax7에 대해 양성으로 염색되어, 린/Sca-1+/VCAM-1-및 린/Sca-1/VCAM-1+ 세포 표면 항원 프로파일의 능력을 검증하여 FAP와 MPs의 순수 인구를 분리하였다.
우리는 다음 에 걸쳐 정렬 FAP와 의원을 배양 10-12 조건에서 adipogenic, 섬유질, 그리고 근생 분화를 유도. 12일까지, FAPs 배양은 섬유아세포와 같은 형태 또는 지방 방울을 가진 백색 사전 분화세포의 것과 유사한 다중 구체 형태를 가진 세포를 포함했습니다 (데이터는 도시되지 않음). 섬유아세포 특이단백질-1(FSP-1)에 대한 면역염색은 섬유아세포 분화를 확인하였고, 플린-1(페리리핀-1; 사이포사이클 마커)42 및 오일 레드 O에 대해 염색하면서 각각 염중 트리글리세라이드및 지질의 분화를확인했다(그림 4B). FAP 배양에서 근생계보로부터 세포를 오염시키는 부재는 분화된 심근세포의 마커인 미신 중형체인(MHC)에 대한 공동 면역스테인링에 의해 확인되었다. 섬유질 분화(FD)를 실시하는 FAPs 배양은 콜라겐 타입 1(Col1a1) 발현, 주요 FAP 유래 콜라겐8중 하나에 대해 평가되었다. 11일째에 Col1a1 및 MHC를 위한 공동 면역스테인링은 MHC 양성세포(도 4B)를오염하지 않는 견고한 콜라겐 타입 1 발현을 드러냈다. FAP 인구의 순도의 최종 확인은 근생 매체에서 FAP를 배양하여 오염된 의원의 성장을 장려하기 위해 수행되었습니다. 어떤 MHC 양성 세포가 관찰되지 않았다(보충 도 2A).
근생질환을 앓고 있는 MP 배양은 MHC-발현 성숙한 심낭및 다중 핵심튜브12일 포스트도금(도 4C)을시연하였다. FSP-1과 MP 배양을 공존시키고, Plin-1은 각각 섬유아세포 또는 반포세포를 오염시키는 부재를 입증했다. 유사하게, ORO 염색은 지질 오염을 보여주지 않았다(도 4C). 섬유아세포에 의해 높게 표현되는 Col1a1은, 또한 근생 전구체 및 myoblasts에 의해 더 적은 정도로 생산되는 것으로 보고되었습니다, 이 점에서 문학에 모순된 데이터가 있더라도8,43,44. Col1a1 및 MHC와 의원의 공동 면역 스테인링은 우리의 MP 문화의 심근세포 분화를 드러내는 동안, Col1a1 면역 양성도의 아무 기록도 발견되지 않았습니다(그림 4C). 인구의 순도를 더욱 확인하기 위해, MP 배양은 지방세포및 섬유아세포(보충도 2B)의성장을 장려하기 위해 선포성 또는 섬유질 질환을 겪었다. FAP 혈통에서 오염세포가 관찰되지 않았다.
쥐 근육에서 FAP와 의원의 순수한 인구를 식별하고 분류하는 능력을 입증했지만, 우리는 다음 Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ (이중 양성) 세포의 신원을 확인하려고 노력했습니다. Sca-1 발현은 건강한 근육45에서 의원 (약 3 %)의 매우 작은 비율 (약 3 %)에 보고되었기 때문에 비슷한 몇 FAP (약 4%)는 건강한 근육10에서 VCAM-1을표현하는 것으로 보고되었으며, 새로 정렬 된 Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ 세포의 면역 염색은 PDGFRα 및 Pax7에 대해 수행되었습니다. 및 섬유겐성 조건은 각각 근신생, 사이포발생 및 섬유발생을 유도한다. 이중 양성 세포는 PDGFRα 또는 Pax7(보충 도3A)및 성숙한 심세포, 지방세포 또는 섬유아세포로 분화하는 배양세포(보충도 3B,C)에대해 양성반응을 보이는 갓 선별된 세포를 가진 의원과 FAP의 혼합 집단이었다는 것을 발견하였다.
ITGA7 vs VCAM-1은 흐름 사이토메트릭 FAP 식별 중 의원을 식별합니다.
각각 Sca-1 및 VCAM-1을 사용하여 쥐 FAP와 의원의 흐름 세포 측정 식별을 위한 성공적인 프로토콜이 설립되었지만, 우리는 자체 컨쥬게이징 된 ITGA7 항체가 마우스의 표준과 마찬가지로 VCAM-1 대신 의원을 식별하는 데 유사하게 사용될 수 있는지 확인하려고 노력했습니다. 쥐 특이적 ITGA7 항체는 PE-Cy7(보충 파일참조)에 공주되었고 항체의 성능은 쥐 위트로종양(보충도 4A-C)에서생성된 상업적 보상 구슬 및 단일 세포 현탁액에 대해 검증되었다. ITGA7::P E-Cy7 항체는 단일 염색 및 FMO실험(보충 도 4D)에적절하게 수행하였다. 그러나, CD31:FITC, CD45:FITC, Sca-1:APC 및 ITGA7::P E-Cy7을 가진 완전한 염색 위장 위트렌혈증 세포 현탁액이 있을 때, Sca-1:APC와 ITGA7::P E-Cy-7 항체 사이에 상호 작용이 분명해졌습니다. FACS의 후속 배양은 린/Sca-1+/ITGA7-세포(의도된 FAP)와 린/스카-1-/IGTA7+ 셀(사칭 의원)을분류하였다(추가 수치 4E)주로 FAP를 산출하고 소수의 의원(보충 도 4F),Sca-1:APC와 ITGA7::P E-Cy-7 항체 사이의 상호 작용을 나타내는 세포 식별의 특이성에 부정적인 영향을 미쳤다.
장기 에 이질 골격 근육에 새로운 FAP 시간 과정
FAP 역학은 단기 외상 성 기종의 맥락에서 평가된 바와 같이, 뮤린 모델에서 11,38,우리는 건강하고 가혹하게 위축, 섬유 근육 모두에서 FAP 격리에 대한 우리의 방법의 성능을 검증하기 위해 노력했다. 쥐는 잘 검증 된 일방적 인 신경 트랜섹션 모델(46)을 사용하여 외상성 장기 기형 절단 부상을 입었으며, 위장 혈증 근육은 14 주 동안 4 개의 연속 타임 포인트에서 수확된 기저반 사지와 모순된 내면의 사지 (내부 통제역할을 함). 이전에 보고된 바와 같이, 기질적인 근육은47에걸쳐 섬유증 및 지방 증착(도 5C-F)이증가함에 따라 진보적 인 위축(그림 5A,B)을입증했다.
우리의 프로토콜은 12 및 14 주 데너바드 위트로테네미에 약 0.2-0.3g (각 단횡 대조군 근육의 15-20%)(그림5B)을저울에도 불구하고 유동 세포 측정 분석을 위한 충분한 수의 세포를 생성했습니다. 우리는 내분적 인 금식 대조군 근육에 비해 기체 가중 된 위장 근육에서 FAPs의 업 레코딩을 관찰, 실험의 14 주 기간 동안 유지(도 6A,B),진보적 인 근육 섬유증 및 지방 증착과 일치. Sca-1 면역염색근육의 면역염색은 건강한 근육의 심섬유 사이의 중간체 발현 외에 14주-고음근육(도 5G)에서섬유지방 변화의 부위에 세포를 발현하는 Sca-1의 국소화를 확인하였다. 세포의 뚜렷한 하위 집합은 Sca-1 신호의 강력한 증가를 특징으로 하는 시간 후 기형 후 FAP 인구에서 나타났다 (Sca-1 높은; 도 6A,적색 상자) 유동 세포 분석시, FAP 기저 Sca-1 발현(Sca-1 Med/Low; 그림 6A,그린 박스). 이러한 하위 집단의 정량화는 시간이 지남에 따라 차동역학을 밝혀; Sca-1 높은 FAP는 12주 및 14주 후 기질(그림6B)에서크게 증가하여 전체 FAP 집단(도6C)의약 절반을 차지합니다. 대조적으로, Sca-1 Med/Low Fap는 2-5주에서 지배적인 하위 집단(도6C)을보였으며, 초기 사후 기질(그림6B)의급격한 증가만 을 보였다.
장기 에 의한 근육에 FAP의 지속적인 존재와는 대조적으로, 의원은 기재에 대한 예상 양면 반응을 보여 주었다. 처음에 의원은 대조군 사지에서 본 위의 기질근육에서 증가했지만, 5주 후 인구는 감소하기시작했다(그림 6D). 장기 에 근육 위성 세포 인구의 잘 알려진 피로 유지47,에 의해 12 주 의원은 선저선 수준 이후 선명 신경 편부.
우리는 또한 Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ 인구(보충 도 3D-E)의역학을 분석했습니다. Lin-population에 비해 이중 양성 세포의 빈도는 시간이 지남에 따라 데너바드 된 근육에서 점진적으로 감소하는 반면, 절대 세포 수가 근육 의 그램당 결정되었을 때 이중 양성 집단의 일시적인 증가가 관찰되었으며, 14주 후 기준선 수준으로 떨어지기 전에.
그림 1: FAP 및 의원 식별, 격리 및 문화에 대한 그래픽 회로도 : 쥐 위장에서 FAP 와 의원 식별을 묘사 그래픽 회로도. 샘플은 두 가지 순차적 효소 소화를 겪기 전에 수확되고 기계적으로 다진 것입니다. 조직 제제는 그 때 처리되고 단 하나 세포 현탁액을 생성하기 위하여 여과됩니다. 형광으로 공각된 항체의 칵테일은 각 샘플에 첨가되어 각각 FAP 및 의원을 식별하거나 분리하기 위해 유동 사이토미터 또는 세포 선별기를 통해 실행됩니다.
그림 2: Sca-1::APC 자가 공주 항체 유효성 검사 및 적정. Sca-1::APC 항체 는 건강한 쥐 위트로테미즘근육(B)에서생성된 상용 보상 구슬(A) 및 단일 세포 현탁액에 대한 단일 염색에 의한 단일 염색에 의한 결합을 한다. Sca-1 라벨구슬과 세포의 뚜렷한 인구는 분명하다 (블랙 박스). 항체 적정은 단일 세포 현탁액(C)에Sca-1:APC의 5 개의 상이한 농도를 테스트하여 수행되었다. 최적의 농도는 최소한의 배경 염색으로 가장 큰 형광 강도에 기초하여 선택되었으며 배치 의존성 것으로 나타났습니다. 대표적인 적정은 빨간색 상자에 의해 표시된 배치 특정 최적 농도로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 쥐 위장혈증에 있는 FAP및 의원의 유동 세포측정식별. (A-F) FAP 및 의원의 흐름 세포 분석에 대한 게이팅 전략은 먼저 이물질 (블랙 박스)을 제외하고 구슬 (빨간 상자)을 계산하기위한 게이트에 문이 됩니다. 그런 다음 세포는 전면 분산(FSC)(B)및 측면 분산(SSC)특성(C)에의해 두 배로 두 배를 배제하기 위해 게이트된다. 결과 단일 세포의 생존가능성은 SYTOX블루(D)로염색하여 평가된다. SYTOX 블루 네거티브(live) 싱글트는 CD31 및 CD45(리니지)를 식별하는 FITC 신호에 대해 평가됩니다. Lin) 추가 분석(블랙박스 린셀)에서 Lin+ 분획을 제외하기위해(E). 린-인구는 Sca-1::APC 대 VCAM-1::P E신호(F)에대해 평가됩니다. FAP는 Lin-/Sca-1+/VCAM-1-(F; 레드 박스)로 식별되며 의원은 Lin-/Sca-1-/VCAM-1+ 이벤트(F; 블루 박스)로 식별됩니다. Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ 이중 양성 인구도 분명합니다(오른쪽 상단 사분면). (G)CMO(형광 마이너스 원) CD31:FITC 및 CD45::FITC에 대한 제어는 린 셀에 대한 적절한 보상과 게이팅을 입증한다. (H-I) Sca-1::APC vs VCAM-1::P E FMO 컨트롤플롯은 FAP(Sca-1 FMO) 및 의원(VCAM-1 FMO)에 대한 적절한 보상과 게이팅을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 분류된 FAP 및 의원 세포 배양 및 면역염색. (A)PDGFRα(녹색) 및 Pax7(빨간색)에 대한 공동 면역스테인링은 갓 정렬된 FAP(상단 행) 및 의원(아래 줄)에 대해 조정한다. DAPI를 곁들인 핵 얼룩 블루. FAP는 PDGFRα와 Pax7 양성 세포없음만을 발현하는 반면, 의원들은 PDGFRα 양성 세포 오염없이 Pax7을 독점적으로 발현하여 정렬된 두 집단의 순도를 입증합니다. (B)12일째에 FAP는 섬유아세포 특이적 단백질 1(FSP-1; 녹색) 및 페리핀-1(Plin-1; green)에 대한 양성 포정성 분화 매체(AD)에서 각각 차별화된 섬유아세포및 사이포세포를 시연한다. 핵은 DAPI (파란색)로 염색됩니다. 오일 레드 O (ORO) 염색 (빨간색)은 12 일까지 성숙한 지방세포에서 발생하는 중성 트리글리세라이드및 지질의 존재를 나타냅니다. 섬유질 분화 물질(FD)을 실시하는 FAP는 FAP 유래 콜라겐 유형 1(Col1a1; green)의 발현을 입증한다. 대포성 또는 섬유질 성 배지에서 배양된 FAP는 근시 중형체인(MHC, 빨간색)에 대해 공동 면역스테인을 사용하지 않으며, 이는 심세포오염의 부재를 나타낸다. (C)12일째근세포화미디어(MD)에서 성장한 의원들은 성숙한 심세포와 융합된 다중핵심튜브의 존재를 보여주는 MHC 양성(red) 염색을 표시한다. 핵은 DAPI (파란색)로 염색됩니다. MP 배양은 FSP-1(녹색), 플린-1(녹색) 및 ORO 염색에 대한 공동 면역 스테인닝의 부재에 의해 표시된 섬유아세포 및 삼각세포 오염의 명확했다. Co1a1 면역스테인링을 수용하기 위해 라미닌에서 자란 의원들은 콜라겐에서 발생하는 12일까지 동일한 정도의 심전도 융합을 표시하지 않는다. Col1a1(녹색)은 MP 문화권이 없습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 위축, 섬유증 및 장기 기질 근육의 지방 침투. (A)대표적인 수확위퇴균 근육4연렬 시정점에서 기재 후 기재. 위장혈증은 CONTRA가 2 주 데너바산 동물에서 대표적인 단면 사지 샘플이라고 지적했다. (B)기형 후 근력 위축의 정량화는 기질(DEN) 위상혈의 비율로 표현된 기형(CONTRA) 사지에 대한 적시화. (C)피크로시리우스 레드(PSR)는 2주 또는 14주 후 기형 섬유증을 입증한 위트로네미우스의 염색된 요통학적 단면에 스테인드드. 근육 얼룩 노란색, 콜라겐 얼룩 빨간색. (D)전체 조직 영역에 비해 PSR 양성 조직의 영역을 결정함으로써 섬유증을 정량화하였다. (E)오일 레드 O (ORO) 기체 후 2- 또는 14 주 수확 의 단면 염색, 헤마톡시린으로 반 염색. 지질 얼룩 빨강. (F)전체 조직 영역에 비해 ORO 염색 조직의 영역을 결정함으로써 정량화된 지방 침투. (G)위장혈증 학점 단면 수확 2- 또는 14 주 후 기재, 라미닌 (녹색) 및 Sca-1 (빨간색)에 대한 면역 염색. 라미닌은 개별 근섬유를 둘러싸고 있는 기저 라미나에 긍정적으로 얼룩지게 합니다. Sca-1은 다중 선조 세포 유형을 식별합니다. 핵은 DAPI (파란색)로 염색됩니다. Inset은 건강한 근육에서 기저 라미나 외부의 Sca-1+ 세포의 국소화를 보여줍니다. 노란색 화살표는 섬유질 영역 내에서 Sca-1+ 세포의 존재를 나타냅니다. (데이터는 평균 +/- S.D; n=3 2 주 및 14주 시간 포인트입니다. 단방향 ANOVA로 분석된 패널 B의 데이터, 패널 D 및 F의 데이터는 양방향 ANOVA로 분석되었습니다. 포스트혹 시닥의 테스트는 여러 비교를 위해 수정하기 위해 수행되었습니다. * = 콘트라와 DEN 사이의 P<0.05; # = 샘플 사이에 P<0.05) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 장기 에 대한 FAP 및 의원 역학장기 기질증. (A)대표적인 Sca-1::APC 대 VCAM-1::P E 패널의 Lin-(CD31-/CD45-) 근육 샘플로부터 의 집단은 2-, 5, 12-또는 14주 후 기재후수확을 수확하였다. 맨 위 행은 denervated (DEN) 위장혈증에서 플롯을 보여줍니다, 하단 행은 모순, 작동하지 않는 (CONTRA) 위장에서 그들을 보여줍니다 동안. Lin-/Sca-1+/VCAM-1-FAP(총)는 스카-1 하이(빨간색 상자)와 Sca-1 메드/로우(녹색 상자) 분획으로 세분화되며, Lin-/Sca-1-1-/VCAM-1+ MP는 파란색 상자에 표시됩니다. (B)각 시점에서 FAPs(총, Sca-1 High, Sca-1 Med/Low)의 정량화는, 린-세포(위행)의 빈도(%) 및 그램당 세포 수(아래줄)로 보고되어 반대측 대조군 위트로네미에 정규화된다. (C)총 FAP 집단의 Sca-1 높고 스카-1 메드/낮은 하위 집단의 상대적인 비율. (D)각 시점에서 의원의 정량화는 린-세포(왼쪽 그래프)의 주파수(%) 및 그람당 세포 수(오른쪽 그래프)로 보고되어 반대대조군으로 정상화된다. (데이터는 평균 +/- S.D; n=4 2 주 및 12주 시점, 5주 시점에 대한 n=5, 14주 시점에 대한 n=2입니다. 일방적인 ANOVA로 분석된 데이터; 여러 비교를 위해 수정하기 위해 시닥 후 의 테스트. # = P<0.05.) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 1: 항체 검증 및 적정. CD31:FITC(A-C), CD45:FITC(D-F), 및 VCAM-1::P E(G-I) 보상 비드(A,D,G) 및 건강한 쥐 위트로테미우스 근육(B,E,H)의 단일 세포 현탁액에 대해 상업적으로 공각된 항체의 유효성검사(B,E,H)의 유효성검사. 각 항체는 5개의 다른 농도 (C, F, I)에서 적정하였다. 최적의 농도는 최소한의 배경 염색 (빨간 상자)으로 가장 큰 형광 강도를 기반으로 선택되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 2: 역차별화 문화 조건에서 분류 된 FAP 및 의원. (A)FSP-1(녹색), 플린-1(녹색) 또는 Col1a1(녹색) 및 MHC(빨간색)에 대한 공동 면역스테인드에서 근생 분화 매체(MD)에서 배양된 FAP는 심근세포 오염을 입증하지 않는다. 양성 FSP-1, 및 Col1a1 염색은 섬유아세포에 FAP 분화를 공개합니다. ORO 염색(빨간색)은 플린-1 양성 선포세포가 쉽게 보이지 않지만 지질 생산을 보여줍니다. 핵은 DAPI (파란색)로 염색. (B)대포원 분화 매체의 의원이 사망했다. 12일 동안 FAP 성장 미디어(FAP GM)에서 배양된 의원들은 FSP-1(녹색) 또는 플린-1(녹색) 및 MHC(빨간색)에 대해 공동 면역을 발휘하여 FSP-1 또는 플린-1 양성 세포가 없는 분화된 심구세포및 근구를 시연한다. ORO 염색의 부재는 배양에 있는 adipogenic 세포의 부족을 더 확인합니다. 의원은 섬유질 분화 매체 (FD)에서 성장하고 Col1a1 및 MHC에 대한 공동 면역 염색 성숙한 심구세포와 Col1a1 양성 세포의 부재를 보여줍니다. Col1a1 면역스테인링을 수용하기 위해 라미닌에서 자란 의원들은 콜라겐에서 발생하는 배양에서 12일 동안 myotube에 동일한 수준의 융합을 표시하지 않는다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 3: 린 / 스카 -1+/VCAM-1+세포는 FAP와 의원의 혼합 인구입니다. (A)PDGFRα 및 Pax7의 새로 분리된 린-/Sca-1+/VCAM-1+ 세포의 공동 면역스테인링은 각각 FAP와 의원을 식별하는 PDGFRα 단일 양성(white arrow)과 Pax7 단일 양성(yellow arrow) 세포의 혼합된 집단을 나타내고 있다. (B)12일째근생분분암(MD)에서 자란 린/Sca-1+/VCAM-1+ 배양에는 FSP-1 단일 양성(green)과 MHC 단일 양성(red) 세포가 각각 섬유아세포와 심세포/튜브를 식별하는 것을 포함한다. Plin-1(녹색) 및 ORO(빨간색) 염색이 없는 것은 성숙한 지방세포의 부재를 나타냅니다. Col1a1 (녹색) 및 MHC (빨간색)에 대한 면역 염색은 성숙한 심근세포및 섬유아세포를 보여줍니다. (C)12일째에 아디포겐성 분화 미디어(AD)에서 자란 Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ 세포는 FSP-1(녹색) 단일 양성 및 MHC(빨간색) 단일 양성 세포의 혼합을 유사하게 나타내지만, 플린-1(녹색) 단일 양성 세포및 ORO 염색증을 통해 제섬유세포의 다른 것을 확인한다. 섬유질 분화 매체(FD)에서 자란 배양은 성숙한 심근세포와 Col1a1 단일 양성 세포(fibroblasts)를 보여줍니다. (D)대표 Sca-1::APC 대 VCAM-1::P E 패널- 덴러베드 근육 샘플에서 2-, 5, 12-또는 14 주 후 기재; Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ 인구는 보라색 상자에 표시됩니다. (E)Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ 세포의 4개의 연속 타임포인트 에 걸쳐 시원지 후, 린 세포(왼쪽 그래프) 및 그램 당 세포(오른쪽 그래프)의 주파수로 보고되어 반대측 위장에 정규화되었다. (데이터는 평균 +/- S.D; n=4 2 주 및 12주 시점, 5주 시점에 대한 n=5, 14주 시점에 대한 n=2입니다. 데이터는 일방적인 ANOVA로 분석되었습니다. 여러 비교를 위해 수정하기 위해 시닥 후 의 테스트; # = P<0.05.) 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충도 4: ITGA7은 쥐 골격 근의 유동 세포면에서 근생 세포의 마커로서. ITGA7::P E-Cy7 항체 컨쥬게이션은 건강한 쥐 위트렌혈증근육(B)에서생성된 상용 보상 구슬(A) 및 단일 세포 현탁액에 대한 단일 염색에 의한 단일 염색에 의한 결합을 한다. ITGA7 라벨이 부착된 구슬과 세포의 인구는 단일세포 현탁액에 5개의 상이한 농도를 테스트하여 수행하였다(블랙박스)(C) 항체 적정이 분명하다. 빨간색 상자는 이상적인 농도를 나타냅니다. (D)형광 마이너스 원(FMO) 컨트롤의 플롯은 항체 컨쥬게이트를 가로지르는 형광 유출의 부재를 입증하지만, 세포 현탁액의 전체 얼룩은 Sca-1:APC와 ITGA7::P E-Cy7(녹색 상자) 사이의 비특이적 상호 작용을 드러낸다. 게이팅(E)린 / Sca-1 +/ ITGA7- 세포 (사칭 "FAP") 및 린 / 스카 -1 -/ IGTA7 + 셀 (사칭 "MP")을 분리합니다. (F)12일 에 FACS 선별 세포 배양을 공동 면역염색하여 페리핀-1(녹색) 및 MHC(빨간색)와 함께 도금 후 두 군을 모두 심근세포가 거의 없는 선각세포로 성숙시켰다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
| 1화 얼룩진 |
| 2. 생존 가능성 제어 |
| 3. CD31 + CD45 FMO |
| 4. Sca-1 FMO |
| 5. VCAM-1 FMO |
| 6. CD31 + CD45 싱글 스테인 (구슬) |
| 7. CD31 + CD45 단일 얼룩 (셀) |
| 8. Sca-1 싱글 스테인 (구슬) |
| 9. Sca-1 단일 얼룩 (세포) |
| 10. VCAM-1 싱글 스테인 (구슬) |
| 11. VCAM-1 단일 얼룩 (세포) |
표 1: 유동 세포측정 항체 염색 제어. 항체 염색 컨트롤의 전체 보완. 실험이 처음으로 수행되는 경우 보정 구슬과 단일 셀 서스펜션 모두에서 단일 스테인드 컨트롤을 실행해야 합니다. 이후의 모든 실험의 경우 단일 스테인드 컨트롤은 보상 구슬에서만 실행되어야 합니다.
| CD31:FITC(μg) | CD45:FITC(μg) | Sca-1::APC(μg)* | VCAM-1::P E (μg) | SYTOX 블루 (μM; 최종 농도) |
|
| 얼룩지지 않은 제어 | |||||
| -- | -- | -- | -- | -- | |
| 단일 스테인드 컨트롤 | |||||
| SYTOX 블루 (생존 제어) | -- | -- | -- | -- | 1 |
| CD31 및 CD45 | 0.5 | 0.25 | -- | -- | 1 |
| 스카-1 | -- | -- | 0.25 | -- | 1 |
| VCAM-1 | -- | -- | -- | 0.25 | 1 |
| 형광 마이너스 원 (FMO) | |||||
| CD31 및 CD45 | -- | -- | 0.25 | 0.25 | 1 |
| 스카-1 | 0.5 | 0.25 | -- | 0.25 | 1 |
| VCAM-1 | 0.5 | 0.25 | 0.25 | -- | 1 |
| 실험 샘플 | |||||
| 전체 얼룩 | 0.5 | 0.25 | 0.25 | 0.25 | 1 |
표 2: 유동 세포측정 항체 염색 매트릭스. 유동 세포측정을 위한 실험 및 대조시 시료의 염색을 위한 항체 양이 도시된다. 모든 염색은 세척 버퍼의 총 부피 100 μL에서 수행됩니다. *자체 컨쥬게이트 Sca-1::APC 항체의 최적 양은 사용되는 배치에 따라 달라질 수 있습니다. 모든 갓 컨쥬게이팅된 Sca-1::APC 배치는 먼저 보상 구슬과 단일 셀 현탁액을 단일 염색하여 유효성을 검사해야 합니다.
보충 파일 : 시약 조리법. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
쥐 근육에 대 한 최적화 된, 검증 된 FAP 격리 프로토콜은 생물학적 또는 기술적 인 이유로 마우스에서 가능 하지 않는 부상 모델을 공부 하고자 하는 연구자에 대 한 필수적이다. 예를 들어, 마우스는 만성 국소, 또는 장기 기형 과 같은 신경 퇴행성 상해를 연구하는 최적 동물 모델이 아닙니다. 생물학적으로, 마우스의 짧은 수명과 급속한 노화는 노화의 혼란스러운 요인으로부터 의결로 인한 근육 의 균등화를 정확하게 묘사하기 어렵게 만듭니다. 기술적 관점에서, 심한 위축으로 인해 근육 질량이 크게 감소하면 효과적인 유동 세포 분석이 충분하지 않을 것입니다. 사실, 마우스 FAP 격리 프로토콜은 정렬 된 FAP29의수율을 더 잘 높이기 위해 건강한 근육을 함께 그룹화하는 것을 제안합니다. 이 분석을 위한 적당한 근육 조직을 얻기의 기술적인 장벽을 해결하는 동안, 동시에 근육 특정 수준에 FAP를 평가에서 연구원을 제한합니다. 특정 근육 그룹은 섬유 유형 조성에서 본질적으로 다르기 때문에, 혈관화 정도 및 미토콘드리아숫자(47)는 예를 들어, 유동 세포 측정 분석을 위해 여러 개의 상이한 근육을 결합하면 근육별 FAP 특성화를 방지합니다. 대조적으로, 우리는 건강하고 장기 에지 덴, 위축및 섬유성 쥐 위질혈증이 효과적인 유동 세포측정을 위한 시작 물질의 적당한 양을 제공한다는 것을 보여줍니다. 더욱이, 건강한 견본에서, 근육의 잉여는 다중 하류 분석에 대해 더 세분화될 수 있고, 연구원이 동일 조직의 세포, 분자 및 조직학적 특징을 수반적으로 분석할 수 있게 합니다. 마지막으로, 치료치료와 상해 모델에서 FAP를 조작하는 실험을 위해, 신체 기능과 보행의 잘 검증된 분석이21,22,23,24로가능하여 동물의 종결 없이 근육 기능의 연쇄 평가를 가능하게 한다.
쥐에 대한 최적화된 FAP 격리 프로토콜을 만드는 데 있어 주요 장애물은 항체 가용성이었습니다. 우리의 초기 접근법은마우스1, 7, 8, 9,10,11,12,13,14에널리 사용되는 항체 패널 및 게이팅 전략프로토콜을복사하고자 했습니다. 시판되는 동안, 공주, 유동 세포측정시험, 그리고 계보 마커 CD31 및 CD45에 사용할 수 있었다는 것을 인식하는 검증된 항체는, 마커 Sca-1 또는 PDGFRα를 식별하는 양성 FAP뿐만 아니라 부정적인 선택 마커 ITGA7에 대해 존재하지 않았다. 이러한 마커에 특이적이고 유동 세포측정에 효과적이라고 사칭된 1차 항체는 사용 가능했지만, FAP 마커 Sca-1 및 PDGFRα, 쥐세포(48)의유동 세포측정 분석에서 발표된 문헌에서만 Sca-1 항체만이 검증되었다. 따라서 우리는 Sca-1을 FAP에 대한 긍정적 선택 마커로 선택했습니다. Sca-1 및 ITGA7 마커를 묘사하기 위해 이차 항체를 사용하는 전망은 여러 가지 이유로 실현 가능하지 않았지만, 주로 Sca-1 및 ITGA7에 대한 유일한 쥐 특이 적 항체가 동일한 숙주 종에서 생성되었기 때문입니다. 따라서, 나머지 옵션은 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하여 두 항체의 자가 연상이었다.
항체 연상을 위한 최적의 키트를 선택하는 과정은 광범위했으며, 많은 키트가 1차 항체에 존재하는 다양한 완충액 희석제(예를 들어, 글리신, 글리세롤, BSA, 나트륨 아지드)에 완전히 또는 부분적으로 내포되어 있기 때문에 광범위했다. 또한, 제공된 형광소는 조사관이 사용할 수 있는 유동 사이토미터/셀 선별기 내에 장착된 레이저와 호환되어야 하며, 샘플에서 다른 세포 유형을 식별하는 데 사용되는 다른 형광과 유사한 파장에서 방출하지 않아야 한다. 쥐 특이적 PDGFRα 1차 항체에서 희석 성분의 존재는 컨쥬게이션 키트와 제대로 호환되지 않았다, 이 프로토콜에서 양성 FAP 선택 마커로서 Sca-1의 선택에 추가적인 고려가 있었다. 이러한 결과는 Sca-1:APC와 ITGA7::P E-Cy7 컨쥬게이션이 보상 구슬과 세포 모두에 뚜렷한 양성 얼룩진 인구를 식별하는 결과를 낳았다는 것을 입증하지만, 전자는 제조업체가 광고한 것보다 더 빨리 형광에 부패를 나타내는 것으로 나타났습니다. 연구원들이 Sca-1::APC를 제조사의 지시에 따라, 견고한 신호를 보장하기 위해 처음 사용(예: 실험 전날)에 즉시, 공해 항체의 단일 배치를 항체의 효과의 창 내에서 사용할 수 있도록 실험하고, 단일 염색 세포에 의한 각 배치를 검증하는 것이 좋습니다. 더 중요한 것은, 그러나, Sca-1:APC와 ITGA7::P E-Cy7 사이 지적된 중요한 상호 작용은 FAP 대 의원의 인구의 정확한 묘사를 방지하고, 대체 전략을 채택할 필요가 있었습니다.
Boscolo Sesillo 등은 최근 CD31, CD45 및 CD11b 네거티브 세포에서 단일 양성 선택마커(33)로 VCAM-1을 사용하여 쥐 근육 줄기 세포의 성공적인 유동 세포 측정 절연을 입증하였다. Mp 선택 마커로 VCAM-1을 사용하여, 우리는 FAP (Lin-/Sca-1+/VCAM-1-) 및 의원 (Lin-/Sca-1-/VCAM-1+)을 식별하기 위하여 새로운 항체 패널을 이용하고 건강한 위장증 근육에서 FACS 분류 세포의 체외 배양으로 접근을 검증했습니다. 새로 분리된 FAP와 의원들은 각각의 대체 마커 PDGFRα 및 Pax7을 위해서만 면역염색했다. 배양 된 FAP는 성숙한 섬유 아세포와 지방 세포의 인구로 분화하고, 의원은 성숙한 심낭 / 근구로 분화했습니다. 배양 내에서 FAP와 의원의 교차 오염이 발생하지 않았습니다. Sca-1 양성 세포와 데너바산된 근육에서 섬유지방 분해 부위의 침투를 확인한 조직의 단면의 면역염색.
우리는 심각한 위축, 섬유성 및 지방 침투 근육에서 우리의 프로토콜을 검증하기 위해 장기 기질 측정 분석을 착수하는 동안, 우리는 부수적으로 증가 Sca-1 신호 (표시 Sca-1 높은 표시) 기본 Sca-1 발현에 비해 FAPs 하위 인구의 출현을 관찰 (Sca-1 메드 / 낮은 시간 이상 언급). Sca-1 높은 FAP는 크게 늦은 사후 사후 (12 주 플러스), Sca-1 메드 / 낮은 FAP는 기준 수준으로 다시 감소하기 전에 5 주에 일찍 피크 동안. FAP 표현형의 이질성은10, 30으로보고되었다. Sca-1 발현이 높은 FAP는 세포로 보다 쉽게 분화하고, 섬유생성 자극에 노출되면 Col1a130,49의발현이 증가하였다. 여기에서 관찰된 FAP 하위 인구의 역학은 기질 유도 후유및 근육의 재생 능력47의 시간 과정과 일치하는 것으로 나타나므로 다른 세포 프로그램을 가진 FAP 하위 집단을 특성화할 수 있습니다. Sca-1 높은 FAP는 섬유/지방 침투와 재생 잠재력의 감소와 함께 늦은 시간 지점에서 업 규제되고, Sca-1 Med/Low FAP는 근육의 재생 창 동안 업 규제되고 효과적인 재생 근추유전자에 도움이 될 수 있습니다. 여기에 제시된 FAP 격리 프로토콜은 조사자에게 향후 연구를 위해 이러한 다양한 인구를 식별하고 격리할 수 있는 기능을 제공합니다.
우리는 Sca-1과 VCAM-1 (Lin-/Sca-1+/VCAM-1+) 모두에 대해 양성으로 염색하는 세포의 인구를 확인하고 이 이중 양성 집단이 FAP와 의원의 혼합물로 확인했습니다. Malecova와 동료는 건강한 근육에 거의 결석한 FaPs를 표현하는 VCAM-1의 하위 인구를 보고하고, 급성 염증으로 일시적으로 증가하고, MDX 마우스에 있는 그들의 지속성 (근 이영양증의 모형)는 만성 근육 염증 및섬유증10과연관되었다. 대조적으로, 그리고 순수한 FAP 인구는 아니지만, 우리는 Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ 인구가 12- 및 14 주 후 기형에서 만성 근육 섬유증으로 기준선 수준 이하로 감소한다는 것을 것을을 발견했습니다. 기질은 MDX 마우스에 의해 경험된 것과 같은 선동적인 반응 및 사이클링 재생 시도를 유도하지 않으며, 이는 우리의 결과에 있는 다름을 설명할 수 있습니다. Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ 세포 집단에서 의원들의 신원 확인은 건강한 근육에 있는 의원의 아주 작은 비율에 Sca-1 표현의 보고와 일치하고 있습니다, myoblast 증식 도중 상해 및 세포주기45에서후속 철수 도중 손상 후에 일시적인 증가와 함께. 따라서, 우리의 항체 라벨링 및 FACS 게이팅 전략은 성공적으로 연구를 위해 FAP와 의원의 순수한 인구를 격리하는 동안, 이 인구의 흐름 세포 측정 기지를 둔 정량화를 요구하는 실험은 Sca-1과 VCAM-1을 공동 표현하는 두 전구선 둘 다에 있는 세포의 작은 백분율 때문에 약간 그들의 수를 과소평가할 수 있습니다. 에 관계없이, 현재 의정서는 명확하게 단기 업 규제와 장기 기형 근육에 인구의 후속 고갈과 함께, 기형 부상에 의원의 고전적인 biphasic 반응을 보여줍니다. 유사하게, 고립 된 단기 기종 부상에서 보고 된 FAP의 증가는 여기에서 다시 회수되고, 장기 정경 신경 편부 모델을 사용하여 더 지속되는 것으로 나타났다.
요약하자면, 이 프로토콜은 이전에 미개척 동물, 쥐를 통해 FAP와 의원을 동시에 연구하기 위해 유동 세포 측정 방법을 사용하는 쥐를 제공합니다. 전반적으로, 쥐에 있는 FAP 연구 결과는 급성 및 만성 근육 및 말초 신경 외상 및 질병에 있는 이 중요한 전구 인구의 새로운 역할을 밝힐 수 있습니다, 그 후에 세포 특정 치료를 개발하기 위한 잠재력을 증가시다.
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Disclosures
저자는 공개 할 충돌이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 오타와 대학과 생물 의학 에 대한 키난 연구 센터 (KRC), 세인트 마이클스 병원 유니티 건강 토론토의 전문 지식과 이 원고에 제시 된 흐름 세포측정 / FACS 프로토콜의 최적화에 대한 지도에 감사드립니다 흐름 세포 측정 핵심 시설에 감사드립니다. 이 작품은 JB에 디자인 새로운 아이디어 2018 기금 (MbDNI-2018-01)에 의해 의학에 의해 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 10 cm cell culture dishes | Sarstedt | 83.3902 | |
| 12-well cell culture plate | ThermoFisher | 130185 | |
| 12 mm glass coverslips, No.2 | VWR | 89015-724 | |
| 10 mL Syringe | Beckton Dickenson | 302995 | |
| 15 mL centrifuge tubes | FroggaBio | 91014 | |
| 20 gauge needle | Beckton Dickenson | 305176 | |
| 25mL Serological pipette | Sarstedt | 86.1685.001 | |
| 40µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 50mL centrifuge tubes | FroggaBio | TB50 | |
| AbC Total Antibody Compensation Beads | ThermoFisher | A10497 | |
| Ammonium Chloride, Reagent Grade | Bioshop | AMC303.500 | |
| APC Conjugation Kit, 50-100µg | Biotium | 92307 | |
| Aquatex Aqueous Mounting Medium | Merck | 108562 | |
| Biolaminin 411 LN | Biolamina | LN411 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Bioshop | ALB001 | |
| Calcium Chloride | Bioshop | CCL444.500 | |
| Collagenase Type II | Gibco | 17101015 | |
| CountBright Plus Absolute Counting Beads | ThermoFisher | C36995 | |
| Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902 | |
| Dispase | Gibco | 17105041 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Gibco | 11995-065 | (+)4.5 g/L D-Glucose (+)L-Glutamine (+)110 mg/L Sodium Pyruvate |
| EDTA | FisherScientific | S311 | |
| FACSClean Solution | Beckton Dickenson | 340345 | |
| FACSDiva Software | Beckton Dickenson | -- | |
| FACSRinse Solution | Beckton Dickenson | 340346 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F1051 | |
| Flow Cytometry Sheath Fluid | Beckton Dickenson | 342003 | |
| FlowJo Software | Beckton Dickenson | -- | |
| Fluorescent Mounting Medium | Dako | S302380-2 | |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody | Invitrogen | A21424 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A11008 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody | Invitrogen | A21429 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210-064 | |
| Ham's F10 Media | ThermoFisher | 11550043 | (+) Phenol Red (+) L-Glutamine (-) HEPES |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X) | Multicell | 311-513-CL | |
| Heat Inactivated Horse Serum | Gibco | 26050-088 | |
| Hemocytometer | Reichert | N/A | |
| HEPES, minimum 99.5% titration | Sigma | H3375 | |
| Horse Serum | ThermoFisher | 16050130 | |
| Human Transforming Growth Factor β1 (hTGF-β1) | Cell Signaling | 8915LF | |
| Humulin R | Lilly | HI0210 | |
| IBMX | Millipore Sigma | I5879 | Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine |
| Isopropanol | Sigma | I9516 | Also known as 2-propanol |
| Lewis Rat, Female | Charles River Kingston | 004 (Strain Code) | 200-250 grams used |
| LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer | Beckton Dickenson | -- | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | EP-5417R | |
| MoFlo XDP Cell Sorter | Beckman Coulter | -- | |
| Mouse Anti-CD31::FITC Antibody | Abcam | ab33858 | Clone TLD-3A12 |
| Mouse Anti-CD45::FITC Antibody | Biolegend | 202205 | Clone OX-1 |
| Mouse Anti-CD106::PE Antibody | Biolegend | 200403 | Also known as VCAM-1 |
| Mouse Anti-MHC Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | N/A | Also known as MF20 |
| Mouse Anti-Pax7 Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | N/A | |
| Neutral Buffered Formalin, 10 % | Sigma | HT501128 | |
| Oil Red O | Millipore Sigma | O0625 | |
| PE-Cy7 Conjugation Kit | Abcam | ab102903 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X) | Gibco | 10010-023 | (-)Calcium Chloride (-)Magnesium Chloride |
| Potassium Bicarbonate, Reagent Grade | Bioshop | PBC401.250 | |
| Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody | Invitrogen | MA5-32347 | FSP-1 also known as S100A4 |
| Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody | Abcam | ab203254 | |
| Rabbit Anti-Laminin Antibody | Sigma | L9393 | |
| Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody | Abcam | ab3526 | |
| Rabbit Anti-Sca-1 Antibody | Millipore Sigma | AB4336 | |
| Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody | Abcam | ab260043 | Also known as Col1a1 |
| Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody | Abcam | ab203491 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Gibco | PHG0266 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Troglitazone | Millipore Sigma | T2573 | |
| Tween-20 | Bioshop | TWN510 |
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