Identificazione, isolamento e caratterizzazione di progenitori fibro-adipogeni (FAPs) e progenitori miogeni (MP) nel muscolo scheletrico nel ratto
Summary
Questo protocollo delinea un metodo per isolare i progenitori fibro-adipogeni (FAP) e i progenitori miogeni (MP) dal muscolo scheletrico del ratto. L’utilizzo del ratto nei modelli di lesione muscolare fornisce una maggiore disponibilità di tessuto dal muscolo atrofico per l’analisi e un repertorio più ampio di metodi convalidati per valutare la forza muscolare e l’andatura negli animali in movimento libero.
Abstract
I progenitori fibro-adipogeni (FAPs) sono cellule interstiziali residenti nel muscolo scheletrico che, insieme ai progenitori miogeni (MP), svolgono un ruolo chiave nell’omeostasi muscolare, nelle lesioni e nella riparazione. Gli attuali protocolli per l’identificazione e l’isolamento dei FAP utilizzano la citometria a flusso/ lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) e gli studi che valutano la loro funzione in vivo fino ad oggi sono stati intrapresi esclusivamente nei topi. La maggiore dimensione intrinseca del ratto consente un’analisi più completa dei FAP nei modelli di lesione del muscolo scheletrico, specialmente nel muscolo gravemente atrofico o quando gli investigatori richiedono una massa tissutale sostanziale per condurre più saggi a valle. Il ratto fornisce inoltre una selezione più ampia di saggi funzionali muscolari che non richiedono sedazione o sacrificio animale, riducendo così al minimo la morbilità e l’uso di animali consentendo valutazioni seriali. I protocolli di citometria a flusso/FACS ottimizzati per i topi sono specifici per specie, in particolare limitati dalle caratteristiche degli anticorpi disponibili in commercio. Non sono stati ottimizzati per separare i FAP dal ratto o dal muscolo altamente fibrotico. È stato sviluppato un protocollo di citometria a flusso/FACS per l’identificazione e l’isolamento di FAP e MP dal muscolo scheletrico di ratto sano e denervato, basandosi sull’espressione differenziale dei marcatori di superficie CD31, CD45, Sca-1 e VCAM-1. Poiché gli anticorpi primari specifici per il ratto, convalidati con citometria a flusso, sono gravemente limitati, è stata eseguita la coniugazione interna dell’anticorpo che prende di mira Sca-1. Utilizzando questo protocollo, è stata confermata la coniugazione Sca-1 di successo e l’identificazione citometrica a flusso di FAP e MP è stata convalidata mediante coltura cellulare e immunocolorazione di FAPs e MP isolati da FACS. Infine, riportiamo un nuovo decorso temporale dei FAP in un modello di denervazione prolungata (14 settimane). Questo metodo fornisce ai ricercatori la possibilità di studiare i FAP in un nuovo modello animale.
Introduction
Le cellule progenitrici fibro-adipogene (FAP) sono una popolazione di cellule progenitrici multipotenti residenti nel muscolo scheletrico che svolgono un ruolo critico nell’omeostasi muscolare, nella riparazione e nella rigenerazione e, al contrario, mediano anche le risposte patologiche alle lesioni muscolari. Come suggerisce il nome, i FAP sono stati originariamente identificati come una popolazione progenitrice con il potenziale di differenziarsi in fibroblasti e adipociti1 e sono stati pretesi per essere i principali mediatori dell’infiltrazione fibro-grassa del muscolo scheletrico in lesioni croniche e malattie. Ulteriori studi hanno rivelato che i FAP sono inoltre in grado di osteogenesi e condrogenesi2,3,4. Pertanto, sono più ampiamente notati in letteratura come progenitori mesenchimali ostromali 3,5,6,7,8. Nel danno acuto del muscolo scheletrico, i FAP aiutano indirettamente nella miogenesi rigenerativa proliferando transitoriamente per fornire un ambiente favorevole per le cellule satelliti muscolari attivate e le loro controparti progenitrici miogeniche (MP) a valle1,9,10. Parallelamente alla rigenerazione di successo, i FAP subiscono l’apoptosi, riportando il loro numero ai livellibasali1,9,10,11. Al contrario, nelle lesioni muscolari croniche, i FAP sovrascrivono i segnali pro-apoptotici, il che si traduce nella loro persistenza9,10,11 e nella riparazione muscolare anormale.
Studi in vivo che valutano i meccanismi cellulari e molecolari con cui i FAP mediano le risposte muscolari hanno utilizzato modelli animali murini fino ad oggi1,7,9,10,11,12,13,14. Mentre i topi geneticamente modificati sono potenti strumenti da utilizzare in queste analisi, le piccole dimensioni dell’animale limitano la disponibilità di tessuti per lo studio in modelli di lesioni localizzate a lungo termine in cui l’atrofia muscolare può essere profonda, come la denervazione traumatica. Inoltre, la misurazione della forza muscolare e della funzione fisica richiede misurazioni ex vivo o in situ che richiedono la cessazione del topo, o metodi in vivo che richiedono un intervento chirurgico e/o un anestetico generale per consentire la valutazione delle prestazioni contrattili muscolari15,16,17,18,19,20 . Nei ratti, esistono analisi funzionali muscolari ben convalidate e utilizzate a livello globale, oltre alle analisi per comportamenti motori più complessi come l’analisi dell’andatura (ad esempio, indice di funzione sciatica, analisi CatWalk) e vengono eseguite in animali svegli e in movimento spontaneo21,22,23,24 . Ciò ottimizza ulteriormente i principi di morbilità minima nella sperimentazione animale e il numero di animali da ricerca utilizzati. Il ratto fornisce quindi al ricercatore FAPs la flessibilità aggiuntiva di un maggiore volume muscolare ferito per analisi proteiche e cellulari e la capacità di intraprendere valutazioni seriali dell’attività e dei comportamenti funzionali statici e dinamici del complesso muscolare, nell’animale di allerta.
I FAP sono stati identificati e isolati principalmente da campioni di muscoli interi utilizzando rispettivamente la citometria a flusso e lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS). Si tratta di saggi basati su laser che sono in grado di identificare più popolazioni cellulari specifiche in base a caratteristiche caratteristiche come dimensioni, granularità e una combinazione specifica di superficie cellulare o marcatori intracellulari25. Questo è molto vantaggioso nello studio di un sistema di organi come il muscolo scheletrico, poiché l’omeostasi e la rigenerazione sono processi complessi e multifattoriali coordinati da una pletora di tipi di cellule. Uno studio seminale ha identificato i FAP, così come i MP, utilizzando metodi citometrici a flusso nel muscolo scheletrico del topo1. Hanno dimostrato che i FAP sono di natura mesenchimale, in quanto mancavano di antigeni di superficie specifici per le cellule di origine endoteliale (CD31), ematopoietica (CD45) o miogenica (Integrina-α7 [ITGA7]), ma esprimevano il marcatore delle cellule staminali mesenchimali Sca-1 (antigene delle cellule staminali 1)1 e differenziato in cellule fibrogene e adipogeniche in coltura. Altri studi hanno dimostrato il successo dell’isolamento dei progenitori mesenchimali nel muscolo in base all’espressione di un marcatore alternativo di cellule staminali, il recettore alfa del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFRα)2,7,8 e ulteriori analisi hanno rivelato che questi probabilmente sono la stessa popolazione cellulare dei FAPs3. I FAP sono ora comunemente identificati nella citometria a flusso utilizzando Sca-1 o PDGFRα come marcatore di selezionepositiva 1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31 . L’uso di PDGFRα è preferenziale per il tessuto umano tuttavia, in quanto un omologo umano diretto di Sca-1 murino deve ancora essere identificato32. Inoltre, altre proteine di superficie cellulare sono state segnalate come marcatori di MP (ad esempio, VCAM-1), fornendo una potenziale alternativa a ITGA7 come indicatore di cellule di lignaggio miogenico durante l’isolamento dei FAPs33.
Mentre la citometria a flusso / FACS è una potente metodologia per studiare il ruolo e il potenziale patogenetico dei FAP nel muscolo scheletrico1,9,10,11,13,29, è limitato tecnicamente dalla specificità e dall’ottimizzazione dei suoi reagenti richiesti. Poiché l’identificazione citometrica a flusso e l’isolamento dei FAP sono stati sviluppati e condotti in modelli animalimurini1,9,10, 11,29, ciòpone sfide per i ricercatori che desiderano studiare i FAP in altri organismi modello. Molti fattori – come la dimensione ottimale del tessuto da elaborare, nonché la specificità e la disponibilità di reagenti e/o anticorpi – differiscono a seconda della specie utilizzata.
Oltre alle barriere tecniche allo studio dei FAP in un nuovo modello animale, sono state in gran parte studiate in un ambiente acuto e tossico, di solito tramite iniezione chimica intramuscolare o cardiotossina. La valutazione delle dinamiche a lungo termine dei FAP è limitata principalmente alla valutazione nella distrofia muscolare di Duchenne, utilizzando il modello murino mdx9,10,11e modelli di lesioni muscolari combinate come la rottura massiccia della cuffia dei rotatori in cui la traslazione e la denervazione del tendine concomitanti vengono eseguite sulla muscolatura della spalla26,27,28 . La risposta dei FAP al solo insulto della denervazione traumatica cronica, un evento comune negli incidenti sul posto di lavoro nell’industria pesante, nell’agricoltura e nei traumi alla nascita (lesione del plesso brachiale)34,35,36,37 con morbilità significativa, non è stata altrettanto ben caratterizzata, spesso limitata a un breve periodo di tempo11,38.
Descriviamo un metodo per identificare e isolare FAP e MP dal muscolo scheletrico sano e gravemente atrofico e fibrotico nel ratto. In primo luogo, viene dimostrata l’identificazione di MP CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- e CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ utilizzando un protocollo di colorazione della digestione dei tessuti e della citometria a flusso e la successiva convalida dei nostri risultati viene eseguita attraverso la coltura e la colorazione immunocitochimica di cellule isolate da FACS. Usando questo metodo, riportiamo anche un nuovo decorso temporale dei FAP in un modello di lesione da denervazione isolata a lungo termine nel ratto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un protocollo di isolamento DEI FAP ottimizzato e convalidato per il muscolo di ratto è essenziale per i ricercatori che desiderano studiare modelli di lesioni che non sono fattibili nel topo per motivi biologici o tecnici. Ad esempio, i topi non sono un modello animale ottimale in cui studiare lesioni croniche locali o neurodegenerative come la denervazione a lungo termine. Biologicamente, la breve durata della vita e il rapido invecchiamento dei topi rendono difficile delineare con precisione le sequalae muscolari a c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare le strutture principali della citometria a flusso presso l’Università di Ottawa e il Keenan Research Centre for Biomedical Sciences (KRC), St Michaels Hospital Unity Health Toronto per la loro esperienza e guida nell’ottimizzazione del protocollo di citometria a flusso / FACS presentato in questo manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato da Medicine by Design New Ideas 2018 Fund (MbDNI-2018-01) a JB.
Materials
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 10 cm cell culture dishes | Sarstedt | 83.3902 | |
| 12-well cell culture plate | ThermoFisher | 130185 | |
| 12 mm glass coverslips, No.2 | VWR | 89015-724 | |
| 10 mL Syringe | Beckton Dickenson | 302995 | |
| 15 mL centrifuge tubes | FroggaBio | 91014 | |
| 20 gauge needle | Beckton Dickenson | 305176 | |
| 25mL Serological pipette | Sarstedt | 86.1685.001 | |
| 40µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 50mL centrifuge tubes | FroggaBio | TB50 | |
| AbC Total Antibody Compensation Beads | ThermoFisher | A10497 | |
| Ammonium Chloride, Reagent Grade | Bioshop | AMC303.500 | |
| APC Conjugation Kit, 50-100µg | Biotium | 92307 | |
| Aquatex Aqueous Mounting Medium | Merck | 108562 | |
| Biolaminin 411 LN | Biolamina | LN411 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Bioshop | ALB001 | |
| Calcium Chloride | Bioshop | CCL444.500 | |
| Collagenase Type II | Gibco | 17101015 | |
| CountBright Plus Absolute Counting Beads | ThermoFisher | C36995 | |
| Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902 | |
| Dispase | Gibco | 17105041 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Gibco | 11995-065 | (+)4.5 g/L D-Glucose (+)L-Glutamine (+)110 mg/L Sodium Pyruvate |
| EDTA | FisherScientific | S311 | |
| FACSClean Solution | Beckton Dickenson | 340345 | |
| FACSDiva Software | Beckton Dickenson | — | |
| FACSRinse Solution | Beckton Dickenson | 340346 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F1051 | |
| Flow Cytometry Sheath Fluid | Beckton Dickenson | 342003 | |
| FlowJo Software | Beckton Dickenson | — | |
| Fluorescent Mounting Medium | Dako | S302380-2 | |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody | Invitrogen | A21424 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A11008 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody | Invitrogen | A21429 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210-064 | |
| Ham's F10 Media | ThermoFisher | 11550043 | (+) Phenol Red (+) L-Glutamine (-) HEPES |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X) | Multicell | 311-513-CL | |
| Heat Inactivated Horse Serum | Gibco | 26050-088 | |
| Hemocytometer | Reichert | N/A | |
| HEPES, minimum 99.5% titration | Sigma | H3375 | |
| Horse Serum | ThermoFisher | 16050130 | |
| Human Transforming Growth Factor β1 (hTGF-β1) | Cell Signaling | 8915LF | |
| Humulin R | Lilly | HI0210 | |
| IBMX | Millipore Sigma | I5879 | Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine |
| Isopropanol | Sigma | I9516 | Also known as 2-propanol |
| Lewis Rat, Female | Charles River Kingston | 004 (Strain Code) | 200-250 grams used |
| LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer | Beckton Dickenson | — | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | EP-5417R | |
| MoFlo XDP Cell Sorter | Beckman Coulter | — | |
| Mouse Anti-CD31::FITC Antibody | Abcam | ab33858 | Clone TLD-3A12 |
| Mouse Anti-CD45::FITC Antibody | Biolegend | 202205 | Clone OX-1 |
| Mouse Anti-CD106::PE Antibody | Biolegend | 200403 | Also known as VCAM-1 |
| Mouse Anti-MHC Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | N/A | Also known as MF20 |
| Mouse Anti-Pax7 Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | N/A | |
| Neutral Buffered Formalin, 10 % | Sigma | HT501128 | |
| Oil Red O | Millipore Sigma | O0625 | |
| PE-Cy7 Conjugation Kit | Abcam | ab102903 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X) | Gibco | 10010-023 | (-)Calcium Chloride (-)Magnesium Chloride |
| Potassium Bicarbonate, Reagent Grade | Bioshop | PBC401.250 | |
| Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody | Invitrogen | MA5-32347 | FSP-1 also known as S100A4 |
| Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody | Abcam | ab203254 | |
| Rabbit Anti-Laminin Antibody | Sigma | L9393 | |
| Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody | Abcam | ab3526 | |
| Rabbit Anti-Sca-1 Antibody | Millipore Sigma | AB4336 | |
| Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody | Abcam | ab260043 | Also known as Col1a1 |
| Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody | Abcam | ab203491 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Gibco | PHG0266 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Troglitazone | Millipore Sigma | T2573 | |
| Tween-20 | Bioshop | TWN510 |
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