Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה לבודד אבות פיברו-אדיפוגניים (FAPs) ואבים מיוגניים (MPs) משרירי השלד של חולדה. ניצול החולדה במודלים של פגיעה בשרירים מספק זמינות רקמות מוגברת משריר אטרופי לניתוח ורפרטואר גדול יותר של שיטות מאומתות להערכת כוח השריר וההליכה בבעלי חיים הנעים חופשיים.
Abstract
אבות פיברו-אדיפוגניים (FAPs) הם תאים ביניים המתגוררים בשריר השלד, שיחד עם אבות מיוגניים (חברי פרלמנט) ממלאים תפקיד מפתח בהומאוסטזיס שרירים, פציעה ותיקון. הפרוטוקולים הנוכחיים לזיהוי FAPs ובידוד משתמשים בציטומטריה של זרימה/מיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנטיות (FACS) ומחקרים המעריכים את תפקודם ב-vivo עד כה בוצעו אך ורק בעכברים. הגודל הטבוע הגדול יותר של החולדה מאפשר ניתוח מקיף יותר של FAPs במודלים לפגיעה בשרירי השלד, במיוחד בשריר ניוון חמור או כאשר החוקרים דורשים מסת רקמה משמעותית כדי לבצע בדיקות מרובות במורד הזרם. החולדה מספקת בנוסף מבחר גדול יותר של בדיקות תפקודיות שרירים שאינן דורשות סדציה או הקרבה של בעלי חיים, ובכך מזעור התחלואה והשימוש בבעלי חיים על ידי הפעלת הערכות סדרתיות. פרוטוקולי ציטומטריית הזרימה/FACS הממוטבים לעכברים הם ספציפיים למינים, במיוחד מוגבלים על ידי המאפיינים של נוגדנים זמינים מסחרית. הם לא עברו אופטימיזציה להפרדת FAPs מעכברוש או שריר סיבי מאוד. פרוטוקול ציטומטריית זרימה /FACS לזיהוי ובידוד של FAPs וחברי פרלמנט משריר השלד של חולדה בריא ופגום פותח, תוך הסתמכות על הביטוי הדיפרנציאלי של סמני פני השטח CD31, CD45, Sca-1 ו- VCAM-1. מכיוון שנוגדנים ראשיים מאומתים בציטומטריה של זרימה מוגבלים מאוד, בוצעה הטיות פנימיות של הנוגדן שמכוון ל-Sca-1. באמצעות פרוטוקול זה, הטיות מוצלחות של Sca-1 אושרו, וזיהוי ציטומטרי של FAPs וחברי פרלמנט אומת על ידי תרבית תאים וחיסון של FAPs וחברי פרלמנט מבודדים FACS. לבסוף, אנו מדווחים על קורס זמן FAPs חדשני במודל גינה ממושכ (14 שבועות) חולדה. שיטה זו מספקת לחוקרים את היכולת לחקור FAPs במודל בעלי חיים חדשני.
Introduction
תאי אב פיברו-אדיפוגניים (FAPs) הם אוכלוסייה של תאי אב רב-תכליתיים בשריר השלד הממלאים תפקיד קריטי בהומאוסטזיס שרירים, תיקון והתחדשות, ומנגד, גם מתווכים תגובות פתולוגיות לפגיעה בשרירים. כפי שהשם מרמז, FAPs זוהו במקור כאוכלוסייה ילידית עם פוטנציאל להבדיל לתוך פיברובלסטים אדיפוציטים1, היו אמורים להיות המתווכים העיקריים של חדירה פיברו-שומני של שריר השלד בפציעה כרונית ומחלות. מחקר נוסף גילה כי FAPs מסוגלים בנוסף אוסטוגנזה וכונדרוגנזה2,3,4. לכן, הם נרשמים באופן רחב יותר בספרות כמו אבות mesenchymal או סטרומי3,5,6,7,8. בפגיעה חריפה בשריר השלד, FAPs בעקיפין לסייע myogenesis התחדשות על ידי התפשטות חולפת כדי לספק סביבה נוחה עבור תאי לווין שריר מופעל שלהם במורד הזרם myogenic אבות (MPs) עמיתיהם1,9,10. במקביל להתחדשות מוצלחת, FAPs עוברים אפופטוזיס, מחזירים את מספרם לרמות בסיסיות1,9,10,11. לעומת זאת, בפציעה כרונית בשריר, FAPs לעקוף אותות פרו-אפופטוטיים, אשר התוצאההיא ההתמדהשלהם 9,10,11 ותיקון שרירים חריג.
במחקרים של vivo המעריכים את המנגנונים התאיים והמולקולריים שבאמצעותם FAPs מתווכים תגובות שרירים השתמשו במודלים של בעלי חיים מורינים עד כה1,7,9,10,11,12,13,14. בעוד עכברים מהונדסים גנטית הם כלים רבי עוצמה לשימוש ניתוחים אלה, הגודל הקטן של החיה מגביל את זמינות הרקמות למחקר במודלים פציעה מקומית לטווח ארוך שבו ניוון שרירים יכול להיות עמוק, כגון denervation טראומטי. יתר על כן, מדידת כוח השריר ותפקוד פיזי דורשת ex vivo או מדידות במקום המחייבות סיום של העכבר, או בשיטות vivo הדורשות ניתוח ו/או הרדמה כללית כדי לאפשר הערכה של ביצועי התכווצותשרירים 15,16,17,18,19,20 . בחולדות, ניתוחים תפקודיים שרירים מאומתים היטב ומנוצלים ברחבי העולם, בנוסף לניתוחים להתנהגויות מוטוריות מורכבות יותר כגון ניתוח הליכה (למשל, מדד תפקודים סיאטיים, ניתוח מסלול) קיימים ומבוצעים בבעלי חיים ערים ונועים באופן ספונטני21,22,23,24 . זה גם מייעל את העקרונות של תחלואה מינימלית בניסויים בבעלי חיים, ומספרי בעלי החיים במחקר בשימוש. החולדה ובכך מספקת לחוקר FAPs את הגמישות הנוספת של נפח שרירים פגוע גדול יותר עבור ניתוחי חלבון ותאים ואת היכולת לבצע הערכות סדרתיות של פעילות והתנהגויות תפקודיות סטטיות ודינמיות מורכבות שרירים, בחיה המתריעה.
FAPs זוהו בעיקר ובודדו מדגימות שרירים שלמות באמצעות ציטומטריית זרימה ומיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) בהתאמה. אלה הם בדיקות מבוססות לייזר המסוגלות לזהות אוכלוסיות תאים ספציפיות מרובות בהתבסס על תכונות אופייניות כגון גודל, פירוט, ושילוב ספציפי של פני תא או סמנים תאיים25. זה יתרון רב במחקר של מערכת איברים כגון שריר השלד, כמו הומאוסטזיס והתחדשות הם תהליכים מורכבים, רב-גורמיים מתואמים על ידי שפע של סוגי תאים. מחקר מכונן זיהה FAPs, כמו גם חברי פרלמנט, באמצעות שיטות ציטומטריות זרימה בשריר השלד של העכבר1. הם הוכיחו כי FAPs הם mesenchymal בטבע, כפי שהם חסרים אנטיגנים פני השטח ספציפי לתאים מן אנדותל (CD31), hematopoietic (CD45), או מיוגניים (Integrin-α7 [ITGA7]) מקורות, אבל ביטא את סמן תא גזע mesenchymal Sca-1 (אנטיגן תא גזע1) 1 מובחן לתאים פיברוגניים אדיפוגניים בתרבות. מחקרים אחרים הדגימו בידוד מוצלח של אבות מזנכימלים בשריר בהתבסס על ביטוי של סמן תאי גזע חלופי, קולטן גורם גדילה נגזר טסיות דם אלפא (PDGFRα)2,7,8 וניתוח נוסף גילה אלה צפויים להיות אותה אוכלוסיית תאים כמו FAPs3. FAPs מזוהים כעת בציטומטריית זרימה באמצעות Sca-1 או PDGFRα כסמן בחירה חיובי1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31 . השימוש PDGFRα הוא מועדף על רקמה אנושית עם זאת, כמו הומולוג אנושי ישיר של מורין Sca-1 עדיין לא זוהה32. בנוסף, חלבונים אחרים על פני התא דווחו כסמנים של חברי פרלמנט (למשל, VCAM-1), המספקים חלופה פוטנציאלית ל- ITGA7 כאינדיקטור לתאי שושלת מיוגנית במהלך בידוד FAPs33.
בעוד cytometry זרימה / FACS היא מתודולוגיה רבת עוצמה לחקר התפקיד ואת הפוטנציאל הפתוגניים של FAPs בשריר השלד1,9,10,11,13,29, הוא מוגבל מבחינה טכנית על ידי הספציפיות והאופטימיזציה של ריאגנטים הנדרשים שלה. מאז זיהוי ציטומטרי זרימה ובידוד של FAPs פותח ונערך במודלים של חיות עכבר1,9,10,11,29, זה מציב אתגרים עבור חוקרים המעוניינים לחקור FAPs באורגניזמים מודל אחרים. גורמים רבים - כגון גודל רקמות אופטימלי לעיבוד, כמו גם ריאגנט ו / או ייחודיות נוגדנים וזמינות - שונים בהתאם למין המשמש.
בנוסף למחסומים הטכניים לחקר FAPs במודל בעלי חיים חדשני, הם נחקרו במידה רבה בסביבה חריפה ורעילה - בדרך כלל באמצעות הזרקה כימית תוך שרירית או cardiotoxin. הערכת הדינמיקה ארוכת הטווח של FAPs מוגבלת בעיקר להערכה בניוון השרירים של דושן, באמצעות עכבר mdx מודל9,10,11, ומודלים של פגיעה שרירים משולבת כגון קרע מסיבי בשרוול סיבוב שבו טרנספר גיד בו זמנית ו denervation מבוצע על שריריהכתף 26,27,28 . התגובה של FAPs לעלבון הבלעדי של denervation טראומטי כרוני, תופעה שכיחה בתאונות במקום העבודה בתעשייה כבדה, בחקלאות, ובטראומות לידה (פגיעת מקלעת ברכיאלית)34,35,36,37עםתחלואה משמעותית, לא היה מאופיין היטב, לעתים קרובות מוגבל למסגרת זמן לטווח קצר11,38.
אנו מתארים שיטה לזיהוי ובידוד של FAPs וחברי פרלמנט משריר שלד בריא, כמו גם ניוון וסיברוטי חמור בחולדה. ראשית, זיהוי של CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- FAPs ו- CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ חברי פרלמנט באמצעות עיכול רקמות ופרוטוקול הכתמת ציטומטריה של זרימה מוצג ואימות לאחר מכן של הממצאים שלנו מתבצע באמצעות תרבית והכתמה חיסונית של תאים מבודדים FACS. באמצעות שיטה זו, אנו מדווחים גם על קורס זמן חדש של FAPs במודל פגיעה מבודד לטווח ארוך בחולדה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
חוקרים המבצעים פרוטוקול זה חייבים לקבל אישור מוועדת האתיקה / ועדת הטיפול המקומית שלהם בבעלי חיים. כל עבודות בעלי החיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של בית החולים סנט מייקל בטורונטו (ACC #918) ובוצעו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים (CCAC). תרשים של פרוטוקול ציטומטריית הזרימה מוצג באיור 1. אם היישום במורד הזרם הוא FACS ותרבות התאים הבאים, יש להשלים את כל השלבים בטכניקה אספטית מתאימה.
1. קצירת שרירים
- מרדים חולדות באמצעות הרדמה מתאימה והקרבה על פי הנחיות ויבריום מקומיות ואתיקה של בעלי חיים. פרוטוקול זה קוצר את שריר gastrocnemius מחולדות לואיס נקבה בוגרת (200-250 גרם), כדוגמה. חולדות היו מרדים באמצעות 2-3% Isoflurane והוקרבו על ידי הזרקה תוך לבבית של T61.
- לאחר שבעל החיים הוקרב, לגלח את כל אחורי כדי להקל על המיקום של השריר ולמזער זיהום פרווה של הרקמה שנקטפה.
- באמצעות אזמל סטרילי, לעשות שני חתכים בעור: הראשון סביב היקף מפרק הקרסול והשני עד קו האמצע של ההיבט המתיי של האחורי מהקרסול לירך.
- לקלף את העור ואת שכבות השרירים שטחי לחשוף את gastrocnemius הבסיסי, שמקורו ב condyles המתיידל לרוחב של עצם הירך ומכניס בגיד אכילס.
- השתמש ב ניתוח קהה כדי להפריד את gastrocnemius מן הרקמה שמסביב, טיפול בשריר רק על ידי הגיד כדי למנוע פגיעה למחוץ.
- להפריד את gastrocnemius מן החדרתו על ידי חציית גיד אכילס בצורה מזוקקת ככל האפשר עם מספריים חדים. לאחר חיתוך, לתפוס את גיד אכילס עם מלקחיים בעדינות לקלף את gastrocnemius את העצם underlaying. עדיין מחזיק את השריר עם מלקחיים ביד אחת, לאתר את שני המקורות של gastrocnemius לחתוך את condyles הירך המהופלי לרוחב.
- כתם gastrocnemius excised בעדינות נגד חתיכת גזה סטרילית כדי להסיר דם רב ככל האפשר. לקצץ את השריר על משטח סטרילי ולהסיר כל רקמת חיבור עודף, כמו גם את גיד אכילס.
- מניחים את השריר בסירת שקילה ומשקלים באמצעות סולם מדויק. פרוטוקול זה מותאם לעיכול שרירים עם משקל רטוב הנע בין 200-600 מ"ג. מפעילים עשויים להקנות רקמות עודפות שנקטפו לבדיקות במורד הזרם, אם תרצה.
- יש לחלק בעדינות את השריר שנקטף כדי לשמש לציטומטריית זרימה ל-3-4 חתיכות קטנות יותר (כ-1-2 ס"מ3)ולשקוע ב-PBS 1x קר כקרח. שמור קר על קרח עד שכל הדגימות נקצרו.
2. עיכול שרירים
- הסר את השריר מ- PBS ומניחים בצלחת תרבית תאים סטרילית של 10 ס"מ. קרע בעדינות ורקמת טחון עם מלקחיים עד חתיכות הם כ 3-4 מ"מ3, הסרת רקמת חיבור ככל האפשר. לאחר טחון ביסודיות, להעביר צינור חרוטי סטרילי 50 מ"ל המכיל 6 מ"ל DMEM + 1% פניצילין / סטרפטומיצין (P /S).
- הוסיפו 10 מיקרו-אל של תמיסת CaCl2 של 300 מ"מ ל-365 מיקרול של תמיסת קולגנאז II (ריכוז מלאי 4800 U/ML) כדי להפעיל את האנזים קולגנאז. הוסיפו את תמיסת הקולגנאז II הפעילה לצינור החרוטי 50 מ"ל המכיל את תרחיף הרקמות. ריכוז הקולגנאז II הסופי הוא 250 U/mL.
- צינורות דגירה בשייקר במשך 1 שעות ב 37 °C (37 °F), 240 x g, הקפדה להסתובב באופן ידני כל 15 דקות כדי לעקור כל רקמה כי יש דבק בצד של הצינור.
- לאחר שעה אחת, להסיר צינורות משייקר ולהוסיף את הדברים הבאים לכל מדגם: 100 μL של Collagenase II (4,800 U / mL) ו 50 μL של Dispase (4.8 U / mL).
- דגימות פיפטה באמצעות פיפטה סרולוגית 15-20 פעמים עד שהפתרון הומוגני. במקרה של עיבוד דגימות מרובות, השתמש בצינור סטרילי נפרד עבור כל דגימה כדי למנוע זיהום צולב לדוגמה.
- דגירה שוב בשייקר במשך 30 דקות ב 37 °C (7 °F) ו 240 x g. לאחר 15 דקות, לנער דגימות ביד כדי לעקור רקמה דבק את הצד של הצינור.
3. יצירת השעיית תא בודד
- לאט לאט לגזור דגימות דרך מזרק 10 מ"ל עם מחט 20 G במשך 10 מחזורים.
הערה: מחזור אחד כרוך לוקח פתרון שריר לתוך מזרק, והזרקת אותו בחזרה לתוך הצינור. הקפד למזער את כל הבועות על ידי השלמת גיזום לאט, כמו קצף מוגזם יכול לגרום למוות תאים נוסף39. - מניחים מסננת תאים 40 מיקרומטר על צינור חרוטי סטרילי 50 מ"ל והרטיבו אותו על ידי צנרת 5 מ"ל DMEM + 10% FBS ו 1% P /S.
- פיפטה 1 מ"ל של המדגם בכל פעם דרך מסננת התא.
- לשטוף את מסננת התא על ידי pipetting DMEM עם 10% FBS ו 1% P /S דרך מסננת להביא את הנפח הכולל בצינור ל 25 מ"ל.
- לפצל 25 מ"ל של המדגם באופן שווה לשני צינורות חרוט 15 מ"ל צנטריפוגה ב 15 °C (70 °F), 400 x g במשך 15 דקות.
הערה: פיצול פתרון השריר לשני צינורות חרוטיים 15 מ"ל מבטיח התאוששות תאים טובה יותר לאחר צנטריפוגה לעומת צינור יחיד. - שאפו את supernatant ולהשעות מחדש את הכדור 1 מ"ל 1x RBC חיץ תמיסת RBC (ראה קובץ משלים) בטמפרטורתהחדר במשך 7 דקות כדי לחסל אריתרוציטים.
- העלה את עוצמת הקול ל-10 מ"ל עם 9 מ"ל של מאגר כביסה(ראה קובץ משלים) וצינורות ספין ב-400 x גרם,15 °C (70 °F) למשך 15 דקות.
- שאפו את כדורי העל והרקומבין על ידי השעיה מחדש במאגר כביסה של מ"ל אחד.
- העבר נפח מתאים של תאים לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל נפרד ומערבבים עם צבע כחול טריפן. לספור תאים חיים על מיקרוסקופ אור באמצעות hemocytometer.
4. כתמי נוגדנים לציטומטריית זרימה
הערה: נוגדן Sca-1 חייב להיות מצומד ל- APC לפני ניסויי ציטומטריה /FACS של זרימה, בהתאם להוראות היצרן. יש לאמת את הביצועים עבור כל אצווה של מצומדים(איור 2). הטיות סופיות ניתן לאחסן ב 20 aliquots μL ב -20 °C (70 °F) והם יציבים במשך שלושה שבועות. עיין בקובץ המשלים לקבלת פרוטוקול הטיות מלא.
- עבור ציטומטריית זרימה, להעביר 1-2 x 106 תאים לכל מדגם ניסיוני לצינור microcentrifuge סטרילי 1.5 מ"ל. העלה את עוצמת הקול עד מ"ל אחד עם חיץ כביסה והנח על הקרח.
- עבור כל ניסוי, הגדר את הפקדים הנדרשים הבאים: i) בקרות הכדאיות הלא נגועות ו- ii) כדי לבחור במדויק עבור אוכלוסיית התאים החיים; iii) פלואורסצנטיות מינוס פקד אחד (FMO) על מתלים של תאים בודדים כדי להגדיר שערים מדויקים עבור CD31-/CD45- שברים, FAPs וחברי פרלמנט; ו-4) חרוזי פיצוי מוכתמים בודדים לתיקון דליפת פלואורסצנטיות בין הערוצים.
- עבור כל פקדי התא, aliquot 5 x 105 - 1 x 106 תאים ב 1 מ"ל של חוצץ לשטוף בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל ומניחים על קרח.
- עבור פקדי חרוזים, הוסף טיפה אחת של חרוזי פיצוי חיוביים (~ 1.5 x 105 חרוזים לכל טיפה) לכל צינור מיקרוצנטריפוגה עם תווית של 1.5 מ"ל. ההשלמה המלאה של הפקדים מופיעה בטבלה 1.
הערה: אם הניסוי מתבצע בפעם הראשונה, הפעל בקרות מוכתמות אחת עבור כל נוגדן מצומד על מתלים של תאים בודדים (בנוסף לחרוזים לא מוכתמים, בעלי כדאיות, חרוזי פיצוי מוכתמים יחידים ובקרות FMO) כדי להעריך את האוכלוסייה המוכתמת החיובית בתאים ולאמת את חרוזי הפיצוי שנצפו על חרוזי פיצוי. אמת כל הכנה של Sca-1::APC מצומדת זה עתה על-ידי ביצוע כתמים בודדים על חרוזי פיצויים ומתלים של תאים בודדים. עיין בטבלה 1 לקבלת רשימה מלאה של פקדי כתמים.
- כדי להכין את בקרת הכדאיות, להעביר מחצית מנפח התאים מן הצינור "הכדאיות" לצינור microcentrifuge חדש 1.5 מ"ל. תייג את הצינור הזה "מת".
- לדגור צינור "מת" ב 65 °C (65 °F) במשך 2-3 דקות כדי להרוג את התאים, ולאחר מכן למקם על קרח. לאחר 2-3 דקות, לשלב מחדש תאים מתים עם תאים חיים שנותרו בצינור בקרת הכדאיות. אוכלוסייה זו של תאים תשמש כדי להגדיר ערכי פיצוי (במידת הצורך) ולהגדיר כראוי שערים עבור צבע הכדאיות.
- צנטריפוגה השעיות תא יחיד (דגימות ניסיוניות ובקרות) ב 500 x גרם,4 °C (5 דקות).
- שאפו את כדורי התאים השעייתיים-על-טבעיים ב-100 מיקרו-אל.
- הוסף נוגדנים, בהתאם לדגימה הניסיונית או לשליטה. עיין במטריצת הכתמים (טבלה 2) לקבלת מידע על שילובי נוגדנים וכמויות.
- מזיזים בעדינות כל דגימה כדי להבטיח ערבוב מלא ודגרה על קרח בחושך במשך 15 דקות. עבור חרוזי פיצוי, דגירה בטמפרטורת החדר בחושך במשך 15 דקות.
- עבור דגימות ניסיוניות ובקרה של השעיית תא יחיד, העלה את עוצמת הקול ל- 1 מ"ל על-ידי הוספת מאגר כביסה של 900 μL. עבור פקדי חרוזים פיצוי, להעלות את עוצמת הקול ל 1 מ"ל עם 900 μL של 1x PBS.
- דגימות מתלה תא יחיד צנטריפוגה ב 500 x גרם,4 °C (5 דקות). צנטריפוגות פיצוי חרוזים פקדים ב 300 x גרם,4 °C (5 דקות).
- עבור כל דגימות השעיית תא יחיד, לשאוף ולהשליך supernatant ולהשעות מחדש את גלולה התא במאגר 300 μL לשטוף. עבור פקדי חרוז פיצוי, לשאוף ולהשליך את supernatant, להשעות מחדש את הכדור ב 300 μL של 1x PBS, ולאחר מכן להוסיף 1 טיפה (~ 1.5 x 105) של חרוזי פיצוי שליליים.
- שמור את כל דגימות השעיית תא יחיד על קרח תחת רדיד אלומיניום ולהמשיך לזרום רכישה ציטומטרית. בקרות חרוזי פיצוי צריכות להיות מוגנות גם מפני אור אך ניתן לשמור עליהן בטמפרטורת החדר.
הערה: אם נקודת קצה ניסיונית היא זיהוי FAPs לפי ציטומטריית זרימה, אנא בצע את השלבים 5.1.1-5.1.11. אם נקודת הקצה היא בידוד תאים באמצעות FACS לתרבות וכתמים, אנא בצע את השלבים 5.2.1-5.2.9 וסעיפים 6-7.
5. ציטומטריית זרימה ומיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנטיות (FACS)
- ציטומטריית זרימה
הערה: פרוטוקול זה משתמש cytometer זרימה benchtop מצויד 405 ננומטר, 488 ננומטר, ו 640 ננומטר לייזרים המסוגלים להבחין בו זמנית 10 צבעים שונים. מסנני Bandpass והפלואורכרום הקשורים שלהם המשמשים בפרוטוקול זה הם כדלקמן: 450/50 (כחול SYTOX), 530/30 (FITC), 575/25 (PE) ו- 670/30 (APC). המתחים עבור כל גלאי הם כדלקמן: FSC 700; אס.סי. 475; FITC 360; PE 460; PE-Cy7 600; SyTOX כחול 360; נגמ"ש 570. ודא שאתה מאומן על הפעולה הנכונה של cytometer הזרימה או סדרן התא לפני השימוש.- ודאו שהציטומטר הופעל במשך 10-20 דקות לפני השימוש, ומוכנות על ידי ניקוי רציף עם פתרונות נוזלי נדן נקיים, שטופים ונדן למשך 30-45 כל אחד. סיים בשטיפה עם dH2O. ודא כי נפח נאות של נוזל נדן נוספה למיכל האחסון כדי לשמור על זרימת דגימה נאותה לאורך כל הרכישה.
- הגדר את אסטרטגיית הג'יטינג לזיהוי FAPs וחברי פרלמנט כמסווג באיור 3.
הערה: FAPs וחברי פרלמנט מזוהים על-ידי אסטרטגיית הג'יטינג הירארכית הבאה: i) SSC-A לעומת FSC-A (אזור פיזור תא צד לעומת אזור פיזור תאים קדמיים לתאים נפרדים לעומת פסולת), ii) FSC-W לעומת FSC-H (רוחב פיזור תאים קדימה לעומת גובה פיזור תאים קדימה כדי להפלות סינגלים מכפילים בפרמטר FSC), iii) SSC-W לעומת SSC-H (רוחב פיזור תא צד לעומת גובה פיזור תא צד כדי להפלות סינגלים מכפילים בפרמטר SSC), iv) SSC-A לעומת SYTOX כחול (להבחין בין סינגלים חיים לעומת מתים), v) SSC-A לעומת CD31/45::FITC (כדי לא לכלול CD31+ ו- CD45 + תאים מניתוח נוסף), ו vi) Sca-1::APC לעומת VCAM-1::P E מה- CD31-/CD45- (שושלת; אוכלוסיית לין-) (זיהוי של FAPs וחברי פרלמנט). FAPs מזוהים כאירועי CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- וחברי פרלמנט מזוהים כאירועי CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+. - הפעל תחילה כל בקרת חרוזי פיצוי מוכתמת אחת דרך הציטומטר במהירות נמוכה כדי ליצור ערכי פיצוי המשמשים לתיקון כל דליפת פלואורסצנטיות בין הערוצים. להעריך פיצוי על ידי השוואת אות פלואורסצנטי של כל פקד בגלאי שלה (למשל, SSC-A לעומת APC עבור חרוזים מוכתמים יחידים Sca-1::APC) כמו גם כל גלאים אחרים. צריכות להיות שתי אוכלוסיות נפרדות (אחת עם שלילי ואחת עם אות חיובי) בגלאי המתאים ורק אוכלוסייה שלילית בכל הגלאים האחרים. הגדר את שער העצירה ל-10,000 אירועי חרוזי פיצוי ורשום את הנתונים.
הערה: בין רכישת כל מדגם, הקפד להפעיל dH2O דרך cytometer במשך 10-20 שניות כדי למנוע זיהום מדגם לדגימה. - התהליך הבא דגימות בקרת קיימא ולא נגועות לשער כראוי על תאים בודדים חיים. הגדר את שער העצירה ל- 10,000 אירועי יחידים ותיעד נתונים.
הערה: כ 5 דקות לפני הרכישה של כל מדגם השעיה תא יחיד למעט המדגם לא נגוע, להוסיף 1 μL של צבע הכדאיות כחול SYTOX (ריכוז עבודה 300 μM מדולל מ 1 mM פתרון מלאי) לכל מדגם להחליק בעדינות לערבב (ריכוז סופי 1 μM). - לאחר מכן לרכוש את דגימות בקרת השעיית תא יחיד הנותרות. הערכת כל בקרת FMO עם העלילה המתאימה באסטרטגיית הגטינג(איור 3). לדוגמה, להעריך את אות FITC של CD31 + CD45 FMO כדי להבטיח שער CD31-/CD45 מדויק. דוגמה אופטימלית מוצגת באיור 3G. אם הפרוטוקול מבוצע בפעם הראשונה, יש להפעיל פקדים עם כתם יחיד בתאים לפני רכישת פקדי FMO.
- להעריך את האות הפלואורסצנטי של כל דגימת תא מוכתם יחיד בגלאי המתאים שלה, כמו גם בכל הגלאים האחרים כדי לאמת פיצוי הולם. הגדר את שער העצירה ל-10,000 אירועי סינגל חיים והקלט בתוכנה.
- לאחר שכל הפקדים (השעיות וחרוזים של תאים בודדים) עובדו, הכינו את כל הדגימות הניסיוניות על ידי מדידה ראשונה והקלטת עוצמת הקול של כל דגימה. מדידות אלה ישמשו לכימות מדויק של FAPs וחברי פרלמנט, כמתואר בשלב 5.1.11. לאחר מכן, להוסיף 50 μL של חרוזים ספירה מדויקת לערבב בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה 2-3 פעמים.
- הפעל בקצרה את המדגם הניסיוני הראשון כדי לאמת זיהוי של אוכלוסיית חרוזי הספירה. אוכלוסייה זו מופיעה כאשכול קטן ומובהק נפרד מאוכלוסיית התאים הכללית בחלקת FSC-A לעומת SSC-A(איור 3A, תיבה אדומה). צור שער סביב אוכלוסיית החרוזים הספירה. לאחר מכן לרכוש נתונים עבור כל מדגם ניסיוני על ידי עיבוד דרך cytometer על מהירות נמוכה. הגדר את שער העצירה ל-10,000 אירועי חרוזים ותיעד.
הערה: החוקרים עשויים לזהות חרוזי ספירה לחילופין על ידי הגדרת חלקה נוספת להערכת SSC-A לעומת כל אחד מהגלאים, שכן חרוזי הספירה הם פלואורסצנטיים בכל הגלאים. - לאחר שכל הדגימות עובדו, נקו את הציטומטר באמצעות הפרוטוקולים המתאימים. יצא את כל הנתונים לניתוח.
- פתח את כל קבצי הנתונים בתוכנת ניתוח ציטומטריית זרימה מתאימה. הגדר את אסטרטגיית הגטינג כפי שהיא משמשת לרכישת נתונים כמתואר בשלב 5.1.2. בדוק פקדים באותו סדר כמו ברכישת נתונים (למשל, לא מוכתם, כדאיות, כתם יחיד, ואז פקדי FMO) כדי לאמת מחדש את אסטרטגיית הג'יטינג. לאחר שערים מדויקים נקבעו באמצעות פקדי FMO, להחיל את השערים על כל הדגימות הניסיוניות. יצא נתונים גולמיים כגליונות אלקטרוניים לכימות.
- חשב את מספר ה- FAPs וחברי פרלמנט בכל מדגם ניסיוני באמצעות חרוזי הספירה:
כאשר, ספירת תאים שנרכשה היא מספר האירועים המתועדת של אוכלוסיית תאים רלוונטיים (למשל FAPs או חברי פרלמנט) בתוכנת הרכישה; ספירת חרוזים שנרכשה היא מספר האירועים המתועדים של ספירת חרוזים בתוכנת הרכישה; ספירת חרוזים נפח הוא הנפח של פתרון חרוז ספירה הוסיף בשלב 5.1.7; נפח מדגם הוא הנפח של כל מדגם ניסיוני מוכתם לפני הוספת חרוזים ספירה.; ריכוז חרוזים הוא מספר החרוזים לפתרון μL; ערך זה נמצא בגליון הנתונים של המוצר.
- FACS - מיון לתרבות תאים
הערה: פרוטוקול זה מבצע FACS על סדרן תאים מצויד 4 לייזרים (UV, סגול, כחול, אדום) המסוגל להבחין בו זמנית 11-14 צבעים. פעל בהתאם להכתמת הדגימה הניסיונית (סעיף 4) ופרוטוקול ציטומטריית הזרימה, למעט שלבים 1 עד 3 המסווגים להלן, כדי למטב את זרימת העבודה של FACS:- הגדל את ריכוז התאים בדגימות הניסיוניות שיש למיין ל- 7 x 106 תאים/מ"ל כדי ליצור תשואות חזקות של FAPs וחברי פרלמנט.
- כדי להסביר את העלייה המשמעותית בריכוז התאים, להכפיל את כל ריכוזי הנוגדנים בדגימות הניסוי להיות ממוין.
- לעבד את דגימות התא המוכתם הסופי באמצעות מכסה מסננת תא 40 מיקרומטר המודבקת לצינור פוליסטירן 5 מ"ל מיד לפני המיון כדי להפחית את גושי התא ולהגדיל את תשואות המיון.
- לאסוף FAPs עכברוש יחיד, חי וחברי פרלמנט ישירות מממיין התא לתוך צינור איסוף פוליפרופילן 5 מ"ל המכיל 1 מ"ל של סטרילי, 100% סרום בקר עוברי (FBS). שמור תאים על קרח עד המיון הושלם.
הערה: אם אתם מבצעים FACS במיקום מחוץ לאתר, העבירו את כל התאים הממוינים על קרח ובמכל מאובטח ומכוסה. - עבודה בארון בטיחות ביולוגי סטרילי (BSC), להביא נפח של תאים ממוינים עד 7 מ"ל עם מדיית צמיחה מתאימה (למשל, מדיה צמיחה FAP (FAP GM) עבור FAPs ממוינים, ומדיית צמיחה MP (MP GM) עבור חברי פרלמנט ממוינים; ראה קובץ משלים למתכונים) וצנטריפוגה ב 500 x g, 4 °C במשך 7 דקות כדי להסיר כמה שיותר חיץ כביסה שיורית ככל האפשר.
- כדורי resuspend ב 1 מ"ל של מדיה צמיחה מתאימה צלחת לתוך צלחת 12 טוב המכיל סטרילי, מצופה קולגן 12 מ"מ זכוכית מכסה / גם עבור חיסונים הבאים (ראה סעיף 6).
הערה: אם מכתים אימונוציטוכימיה קולגן, לוחות ממוינים תאים לתוך צלחת 12 היטב המכילה כיסוי זכוכית סטרילי, מצופה למינין 12 מ"מ / טוב, במקום מצופה קולגן. אם נדרשים ניסויי אימונוציטוכימיה של אבות מבודדים באופן מיידי, FAPs זרעים וחברי פרלמנט בצפיפות של 15,000 תאים לס"מ2 ולהמשיך ישירות לשלב 6.1. עבור תרביות ארוכות טווח כדי לגרום בידול אבות, FAPs זרע בצפיפות של 5,000 תאים לס"מ2, וחברי פרלמנט בצפיפות של 7,500 תאים לס"מ2. - דגירה תאים ב 37 °C ו 5% CO2 באינקובטור תרבית התא. אחרי 72 שעות בתרבות, לשנות חצי מהתקשורת. שנה מדיה באופן מלא כל 2-4 d לאחר מכן.
- כדי לגרום להתפתחות מיוצייט, החליפו תרבויות חברי פרלמנט לבידול MP (MD) מדיום ביום התשיעי לתרבות. כדי לגרום לאדיפוציטים, החלף תרביות FAPs למדיום בידול אדיפוגני של FAP (AD) ביום העשירי של התרבות.
- כדי לגרום לפירוגנזה, FAPs עשויים לעבור למדיית בידול פיברוגני (FD) בזמנים משתנים במהלך התרבות, או לחילופין, עשויים להיות ייזרעים ישירות למדיית FD לאחר בידוד (שלב 5.2.6) (ראה קובץ משלים עבור כל מתכוני המדיה).
6. אימונוציטוכימיה של FAPs תרבותיים וחברי פרלמנט
- כדי לאמת מיון תאים ולהדגים טוהר של FAPs ותרבויות חברי פרלמנט, חיסונים עם סמנים ספציפיים מסוג התא כולל PDGFRα (סמן FAPs), Pax-7 (גזע שריר [לווין] סמן תא), חלבון ספציפי פיברובלסט (FSP-1, סמן פיברובלסט), Perilipin-1 (פלין-1, סמן אדיפוציט), קולגן סוג 1 (Col1a1, אינדיקטור של פיברוזיס), שרשרת כבדה מיוסין (MHC, סמן מיוציטים בוגר).
- עבור חיסון של תאים ממוינים טריים, צנטריפוגה צלחת 12-well ב 200 x g במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר כדי להקל על הדבקות של תאים כיסוי / טוב. צעד זה אינו הכרחי לתרבויות ארוכות טווח. הסר מדיית תרבות.
- עבור חיסונים עם FSP-1, לתקן תאים עם 1 מ"ל 100% מתנול (MeOH) במשך 2 דקות ב 4 °C (70 °F). אם אתם מחסן עבור PDGFRα, Plin-1, Pax7 או Col1a1, תקן את תרביות התאים עם 1 מ"ל 4% PFA ב-1x PBS למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. MHC חיסונים סובלים או קבוע.
הערה: עבור תאים קבועים מתנול, דלג על שלב 6.2 והמשיך לשלב 6.3.
- שאפו 4% PFA ושטפו במהירות תרביות תאים 3-4 פעמים עם PBS 1x. הוסף 1 מ"ל של 100 mM גליצין ב 1x PBS ודגר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאימת PFA שיורית. שאפו ושטפו 1-2 פעמים עם PBS 1x.
הערה: תאים ניתן להשאיר בשלב זה 2 מ"ל של 1x PBS, עטוף בסרט הדבקה ומאוחסן ב 4 °C (7-10 ימים לכל היותר. - לאחר הכביסה, הוסיפו 1 מ"ל של טריטון-X 0.1% ב-1x PBS ודגרו במשך 20 דקות כדי לפרוע לקרום התא.
- לשטוף בארות 2-3 פעמים עם 1-2 מ"ל של 1x PBS ואז לחסום תאים עם 1 מ"ל של 1x PBS + 3% BSA לבאר עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר.
- Pipette 80 μL של נוגדן ראשוני מדולל ב 1x PBS + 3% BSA (PDGFRα 1:100, Pax7 מסודר, FSP-1 1:50, פלין-1 1:400, Col1a1 1:250, MHC 3 מיקרוגרם / מ"ל) על פיסת parafilm מודבק למיכל נייד. בעזרת מלקחיים דקים סטריליים, הרימו בזהירות את הכיסוי מהבאר והפוך לירידה של תמיסה נוגדנית. כיסויי דגירה עם שתי חתיכות רטובות של מגבת נייר ומיכל כיסוי בסרט פלסטיק כדי למנוע אידוי של פתרון הנוגדנים. דגירה לילה ב 4 °C (5 °F).
הערה: כתמים מכסים מתוך הבאר משתמש פחות נוגדן (~ 80 μL) מאשר כתמים בתוך הבאר (500 מינימום μL). - ביום 2, להשאיר כיסויים בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות כדי להתחמם. באמצעות מלקחיים בזהירות ימינה ולהעביר כיסויים בחזרה לבארות שלהם (תאים מול למעלה) ולשטוף 2-3 פעמים עם 1-2 מ"ל של 1x PBS במשך 2 דקות כל אחד כדי להסיר נוגדן ראשוני ככל האפשר.
- באמצעות אותה טכניקת הכתמה כמו עם כתמי נוגדנים ראשוניים, כתם תאים עם אנטי ארנב עז אלכסה פלור 488 נוגדן משני (1:400) כדי לזהות FSP-1, פלין-1, Col1a1, או PDGFRα ו עיזים נגד עכבר אלכסה פלור 555 נוגדן משני (1:300) כדי לזהות MHC או Pax-7. לדגור על תאים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ולשמור על תאים מוגנים מפני אור.
- להחזיר תאים לבאר ולדגירה תאים עם Hoechst (1:10,000) במשך 2-4 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף תאים עוד 2-3 פעמים עם 1x PBS במשך 2 דקות כל אחד כדי להסיר עודף Hoechst.
- הרכבה מכסה על מגלשות זכוכית באמצעות מדיום הרכבה פלואורסצנטי אנטי-דהוי ומשאירים שקופיות להתייבש למשך הלילה בחושך בטמפרטורת החדר. יש לאחסן כיסויים רכובים ב-4 מעלות צלזיוס בחושך.
7. שמן אדום O (ORO) כתמים של FAPs תרבותי וחברי פרלמנט
- בצע מכתים ORO על תאים שאינם מחלחלים, כמו permeabilization של קרום התא יכול לגרום כתמים לא ספציפיים / לא רצויים של סוגי תאים לא אדיפוגניים. לפני תחילת הכתמים, להכין מלאי עבודה ORO (ראה קובץ משלים למתכון) ודגר בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
- לאחר 20 דקות, לסנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר כדי להסיר כל אגרגטים לא פתורים.
- שאפו מדיה מבאר והוסיפו 1 מ"ל של 10% פורמלין חוצץ נייטרלי (10% NBF). דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: השפעה על התאים עלולה לגרום להרמה מהבאר/כיסוי. יש לדאוג בעת שאיפה / הוספת פתרונות. - שאפו והוסיפו 1 מ"ל של 10% NBF טריים ודגרה לפחות שעה בטמפרטורת החדר.
הערה: ניתן להפסיק את הפרוטוקול בשלב זה, מכיוון שניתן להשאיר תאים ב- 10% NBF למשך הלילה. - לשטוף במהירות את בארות פעם אחת עם 1 מ"ל של 60% איזופרופנול, ולאחר מכן לשאוף ולאפשר בארות להתייבש לחלוטין (כ 2 דקות).
- הוסף 400 μL שמן אדום O עובד מלאי לבאר ודגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, הקפדה להימנע כל צינור כל ORO על קירות הצלחת.
- הסר את כל O אדום שמן במהירות לשטוף את הבאר 4 פעמים עם dH2O.
הערה: אם בארות מוכתמות מכילות כיסויים, הר באותה טכניקה כמתואר בשלב 6.9. - תמונה רכובה על כיסויים או הבאר המוכתמת באמצעות מיקרוסקופ בהיר.
8. כתמי רקמות של מקטעי גסטרוקנמיוס חולדה מנוגדים ומוקשים
-
פירוסיריוס אדום (PSR)
- בצע כתמי PSR על 5 מיקרומטר עבה, פורמלין קבוע פרפין מוטבע (FFPE) חולדה גסטרוקנמיוס קטעים היסטולוגיים כפי שתואר בעבר40.
-
שמן אדום O (ORO)
- תקן 5 מיקרומטר עבה איזופנטן חולדה קפואה גסטרוקנמיוס קטעים היסטולוגיים ב 4% PFA במשך 10 דקות, דגירה ב 60% אלכוהול איזופרופיל במשך 1 דקות.
- כתם עם מלאי עבודה ORO במשך 12 דקות. דגירה ב 60% אלכוהול איזופרופיל במשך 1 דקות, לשטוף במשך 10 דקות ב dH2O. הר על כיסויים באמצעות מדיה הרכבה מסיס במים.
-
סקא-1 ורקמת למינין אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית (IHC)
- בצע IHC פלואורסצנטי על 5 מיקרומטר עובי איזופנטן קפוא חולדה גסטרוקנמיוס קטעים היסטולוגיים.
- לחות דגימות ב 1x PBS במשך 5 דקות, לתקן 4% PFA במשך 10 דקות ולאחר מכן לדגירה דגימות פתרון חסימת רקמה אם (ראה קובץ משלים)במשך 90 דקות.
- דגירה עם נוגדן ראשי נגד Sca-1 (1:500) מדולל ב-1x PBS + 0.05% טווין ב-4 מעלות צלזיוס בלילה.
- ביום 2, לשטוף שלוש פעמים ב 1x PBS + 0.05% Tween במשך 5 דקות כל אחד, ולאחר מכן דגירה נגד ארנב עז אלכסה פלור 555 (1:500) עבור 1 שעה.
- לשטוף שוב (כמו קודם), דגירה עם פתרון חסימה עבור 1 שעה, ולאחר מכן להוסיף נוגדן ראשי אנטי למינין (1:500) מדולל ב 1x PBS + 0.05% Tween עבור 1 שעה.
- לשטוף שוב (כמו קודם), ואז לדגור על עז נגד ארנב אלכסה פלור 488 (1:500) עבור 1 שעה (עבור למינין).
- לשטוף שוב (כמו קודם) ואז לדגור ב DAPI (1:10,000) במשך 4 דקות. יש לשטוף ולהרכיב על כיסויים באמצעות מדיום נגד עמעום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
זיהוי FAPs וחברי פרלמנט באמצעות ציטומטריית זרימה באמצעות לוח נוגדנים חדשני כולל Sca-1 ו- VCAM-1
אסטרטגיית הגינג לזיהוי FAPs בשריר החולדה מבוססת על פרוטוקולי ציטומטריית זרימה בעכבר29, אשר שער על CD31 (אנדותל) ו CD45 (hematopoietic) תאים חיוביים (המכונה שושלת היוחסין [Lin]) ובוחן את הפרופיל הפלואורסצנטי של סמן FAPs Sca-1 וחברי פרלמנט סמן ITGA7 מאוכלוסיית הלשון השלילית (Lin-) . בהיעדר נוגדנים זמינים מסחרית, מצומדים פלואורופור, ורמת ציטומטריה זורמת עבור חולדה Sca-1 ו- ITGA7, הוצבטנו את נוגדן Sca-1::APC, והתחייבנו לאסטרטגיה חלופית לזיהוי חברי הפרלמנט. כמו VCAM-1 הוכח לאחרונה להיות סמן בחירה חיובי יחיד יעיל לבידוד של חברי פרלמנט חולדה33 ו נוגדן ספציפי לחולדה, מצומד, ציטומטריה זרימה מיקוד VCAM-1 זמין, השתמשנו VCAM-1 כדי לזהות חברי פרלמנט, בניגוד ITGA7.
אישרנו הטיות וביצועים מוצלחים של נוגדן Sca-1:APC עם כתם יחיד של חרוזי פיצויים ומתלי תאים שנוצרו מגסטרוקנמיוס עכברוש בריא(איור 2A,B). טיטציה של חמש נקודות של Sca-1::APC (איור 2C) בוצעה בנוסף לכל הנוגדנים האחרים (CD31::FITC, CD45::FITC, VCAM-1:PE) המשמש בפרוטוקול ( איור משלים 1), כדי לזהות את הריכוזים האופטימליים. באמצעות עיצוב פאנל חדשני זה, FAPs putative וחברי פרלמנט זוהו בו זמנית מן gastrocnemius בריא (איור 3),לפיו תאים חיובי יחיד עבור Sca-1 (Lin-/Sca-1+/VCAM-1-) הוגדרו FAPs (תיבה אדומה) ותאים חיובי יחיד עבור VCAM-1 (Lin-/Sca-1-/VCAM-1+) הוגדרו חברי פרלמנט (תיבה כחולה). זיהינו גם אוכלוסייה של תאים חיוביים כפולים עבור Sca-1 ו- VCAM-1 (Lin-/Sca-1+/VCAM-1+)(איור 3F;רבע ימני עליון).
אימות זיהוי של FAPs וחברי פרלמנט על-ידי FACS ותרבות תאים
כדי לאמת את הפרוטוקול שהוצג לזיהוי ציטומטרי זרימה של FAPs וחברי פרלמנט בשריר השלד חולדה, ביקשנו לבודד תאים חיים עבור תרבות במבחנה. באמצעות FACS, FAPs מעשיים וחברי פרלמנט היו מבודדים באמצעות אותה אסטרטגיית gating כמו בניתוח ציטומטרי זרימה. כ-20,000-40,000 חברי פרלמנט ו-30,000-50,000 חברי פרלמנט נאספו עבור תרבית התאים משריר גסטרוקנמיוס יחיד מ-230 גרם חולדה.
כדי לאשר את הטוהר של כל אוכלוסייה, היינו שותפים לחיסון FAPs וחברי פרלמנט ממוינים טריים עבור PDGFRα ו Pax7. PDGFRα הוא סמן האבות המזנכימלי השני, מלבד Sca-1, המשמש בדרך כלל לזיהוי FAPs2,7,8. Pax-7 הוא סמן מוכר ונפוץ של תאי לווין שריר (גזע)41. האוכלוסייה ממוינת של FAPs הציגה כתמים חיוביים עבור PDGFRα ללא זיהום על ידי תאים חיוביים Pax7(איור 4A; שורה עליונה). לעומת זאת, האוכלוסייה ממוינת של חברי פרלמנט מוכתמת חיובית עבור Pax7 בהיעדר תאים חיוביים PDGFRα (איור 4A; שורה תחתונה), אימות היכולת של Lin-/Sca-1+/VCAM-1- ו- Lin-/Sca-1-/VCAM-1+ פרופילי אנטיגן על פני השטח של תאים כדי לבודד אוכלוסיות טהורות של FAPs וחברי פרלמנט בהתאמה.
לאחר מכן אנו לתרבות FAPs ממוינים וחברי פרלמנט על פני זמן של 10-12 ימים בתנאים כדי לגרום לבידול אדיפוגני, פיברוגני, ומיוגניים. ביום 12, תרביות FAPs נתונים לתנאים אדיפוגניים הכילו תאים עם מורפולוגיה דמוית פיברובלסט או מורפולוגיה רב-עינית דומה לזו של פרה-אדיפוציטים לבנים עם טיפות שומן (נתונים לא הראו). חיסון עבור חלבון ספציפי פיברובלסט-1 (FSP-1) אישר בידול פיברובלסט, תוך הכתמה עבור פלין-1 (Perilipin-1; סמן אדיפוזיטים)42 ושמן אדום O אישר את הבידול של אדיפוזיטים ואת נוכחותם של טריגליצרידים נייטרליים ושומנים, בהתאמה(איור 4B). היעדר תאים מזהמים משושלת מיוגנית בתרביות FAPs אושר על ידי חיסון משותף לשרשרת כבדה מיוסין (MHC), סמן של מיוציטים מובחנים. תרביות FAPs הנתונות לבידול פיברוגני (FD) הוערכו עבור ביטוי קולגן מסוג 1 (Col1a1), אחד הקולגנים העיקריים שמקורם ב- FAPs8. חיסון משותף עבור Col1a1 ו- MHC ביום 11 חשף ביטוי קולגן חזק מסוג 1 ללא תאים חיוביים מזהמים MHC (איור 4B). אישור סופי לטוהר אוכלוסיית ה-FAPs נעשה על ידי פולחן FAPs בתקשורת המיוגנית, כדי לעודד את תולדתם של כל חברי פרלמנט מזהמים. לא נצפו תאים חיוביים MHC (איור משלים 2A).
תרבויות MP הכפופים לתנאים מיוגניים הדגימו מיוציטים בוגרים של MHC ומיוטיוב מרובה נוקלים 12 ימים לאחר ציפוי (איור 4C). חיסון משותף של תרבויות MP עם FSP-1, ו Plin-1 הדגים את היעדרם של פיברובלסטים מזהמים או אדיפוציטים, בהתאמה. באופן דומה, כתמי ORO לא הדגימו זיהום שומנים בדם (איור 4C). Col1a1, אשר בא לידי ביטוי מאוד על ידי פיברובלסטים, דווח גם להיות מיוצר במידה פחותה על ידי מבשרי מיוגניים myoblasts, אם כי יש נתונים סותרים בספרות בהקשר זה8,43,44. בעוד שיתוף חיסוני של חברי פרלמנט עם Col1a1 ו- MHC חשף בידול מיוציט של תרבות MP שלנו, לא נמצאו ראיות של Immunopositivity Col1a1 (איור 4C). כדי לאשר עוד יותר את טוהר האוכלוסייה, תרבויות MP היו נתונים לתנאים אדיפוגניים או פיברוגניים כדי לעודד את הצמיחה של אדיפוציטים ופיברובלסטים(איור משלים 2B). לא נצפו תאים מזהמים משושלת ה-FAPs.
בעוד שהדגמנו את היכולת לזהות ולמיין אוכלוסיות טהורות של FAPs וחברי פרלמנט משרירי החולדה, לאחר מכן ביקשנו לקבוע את זהות התאים לין-/ Sca-1+/VCAM-1+ (חיובי כפול). מאז ביטוי Sca-1 דווח על חלק קטן מאוד של חברי פרלמנט (כ 3%) בשריר בריא45 ובאופן דומה כמה FAPs (כ. 4%) דווחו להביע VCAM-1 בשריר בריא10, חיסונים של תאי לין-/Sca-1+/VCAM-1+ ממוינים טריים בוצעו עבור PDGFRα ו Pax7 יחד עם פולחן אותם myogenic, adipogenic, ותנאים פיברוגניים כדי לגרום myogenesis, אדיפוגנזה ופירוגנזה בהתאמה. נמצא כי התאים החיוביים הכפולים היו אוכלוסייה מעורבת של חברי פרלמנט ו-FAPs, עם תאים ממוינים טריים המחסן חיובי עבור PDGFRα או Pax7 ( איור 3Aהמשלים) ותאים מתורבתים המבדילים למיוציטים בוגרים, אדיפוציטים או פיברובלסטים(איור משלים 3B,C).
ITGA7 לעומת VCAM-1 לזיהוי חברי פרלמנט במהלך זיהוי FAPs ציטומטריים של זרימה
בעוד פרוטוקול מוצלח לזיהוי ציטומטרי זרימה של FAPs חולדה וחברי פרלמנט באמצעות Sca-1 ו- VCAM-1 בהתאמה הוקם, ביקשנו לקבוע אם נוגדן ITGA7 מצומד עצמי יכול לשמש באופן דומה כדי לזהות חברי פרלמנט במקום VCAM-1, כמקובל בעכבר. נוגדן ITGA7 ספציפי לחולדה הוצמד ל- PE-Cy7 (ראה קובץ משלים) וביצועיהנוגדן אומתו על חרוזי פיצוי מסחריים ומתלים של תאים בודדים שנוצרו מגסטרוקנמיוסחולדה (איור משלים 4A-C). הנוגדן ITGA7::P E-Cy7 שבוצע כראוי על כתמים בודדים וניסויי FMO (איור 4Dמשלים). עם זאת, כאשר השעיות תאי גסטרוקנמיוס מכתימות מלאות עם CD31::FITC, CD45::FITC, Sca-1::APC, ו- ITGA7::P E-Cy7, ניכרה אינטראקציה בין הנוגדנים Sca-1::APC ו- ITGA7::P E-Cy-7. התרבות הבאה של תאי לין-/Sca-1+/ITGA7 (FAPs כביכול) ותאי לין-/Sca-1-/IGTA7+ (חברי פרלמנט כביכול) (איור 4Eמשלים) הניבה בעיקר FAPs ועם מעט חברי פרלמנט(איור משלים 4F),המציין את האינטראקציה בין Sca-1::APC ו- ITGA7::P E-Cy-7 נוגדנים השפיעו לרעה על הספציפיות של זיהוי תאים.
קורס זמן FAPs חדשני בשריר השלד לטווח ארוך
כמו FAPs דינמיקה הוערך בהקשר של denervation טראומטי לטווח קצר, במודלים מורין11,38, ביקשנו לאמת את הביצועים של השיטה שלנו לבידוד FAPs הן שריר בריא והן ניוון חמור, שריר סיבי. חולדות היו נתונות לפגיעה טראומטית לטווח ארוך denervation באמצעות מאומת היטב חד צדדי עצב טרנזית מודל46 עם שריר gastrocnemius שנקטפו בארבע נקודות זמן סדרתיות במשך 14 שבועות לאחר denervation מן הגפה denervated ואת איבר innervated contralateral (כדי לשמש שליטה פנימית). כפי שדווח בעבר, שרירים מגורה הדגימו ניוון פרוגרסיבי (איור 5A,B),עם הגדלת פיברוזיס ותצהיר שומן (איור 5C-F) לאורך זמן47.
הפרוטוקול שלנו יצר מספר מספיק של תאים לניתוח ציטומטרי של זרימה, למרות 12 ו 14 שבוע denervated gastrocnemius שקל כ 0.2-0.3 גרם (15-20% של שריר בקרה contralateral בהתאמה)(איור 5B). ראינו רגולציה מוגברת של FAPs בשריר gastrocnemius denervated לעומת שריר השליטה הנגדית innervated, נשמר במשך 14 שבועות של הניסוי (איור 6A,B),קונקורדנט עם פיברוזיס שרירים מתקדמים ותצהיר שומן. חיסון Sca-1 של חתך היסטולוגי שריר אישר לוקליזציה של Sca-1 ביטוי תאים לאזורים של שינוי שומן פיברו שריר 14 שבועות denervated (איור 5G), בנוסף ביטוי בסיסי באינטרסטיום בין myofibers בשריר בריא. תת-קבוצה נפרדת של תאים הופיעה באוכלוסיית ה-FAPs לאורך זמן לאחר denervation המאופיינת בעלייה חזקה באות Sca-1 (גבוה Sca-1; איור 6A, תיבה אדומה) בניתוח ציטומטרי של זרימה, בהשוואה לביטוי ה-FAPs בזאלי Sca-1 (Sca-1 Med/Low; איור 6A, קופסהירוקה). כימות של תת-אוכלוסין זה חשף דינמיקה דיפרנציאלית לאורך זמן; ה-FAPs הגבוהים של Sca-1 גדלו משמעותית ב-12 וב-14 שבועות לאחר ההנפקה(איור 6B),המהווים כמחצית מכלל אוכלוסיית ה-FAPs(איור 6C). לעומת זאת, Sca-1 Med/LOW FAPs היו תת-אכלוס הדומיננטי ב 2- ו 5 שבועות לאחר denervation (איור 6C) והראה רק עלייה ארעית ברמות מוקדם לאחר denervation (איור 6B).
בניגוד לנוכחות המתמשכת של FAPs בשריר מושחת לטווח ארוך, חברי פרלמנט הפגינו תגובה דו-פאזית צפויה denervation. בתחילה חברי הפרלמנט גדלו בשריר המוכתם מעל זה שנראה בגפי השליטה, אך ב 5 שבועות לאחר denervation האוכלוסייה החלה לרדת (איור 6D). בהתאם לתשישות הידועה של אוכלוסיית תאי לווין השרירים בשריר47לטווח ארוך , על ידי 12 שבועות חברי פרלמנט היו ברמות הבסיסיות או מתחתיו לאחר טרנספרציה עצבית טיביאלית.
ניתחנו גם את הדינמיקה של האוכלוסייה לין-/ Sca-1+/VCAM-1+(איור משלים 3D-E). בעוד התדירות של תאים חיוביים כפולים ביחס לאוכלוסיית לין - ירדה בהדרגה בשריר denervated לאורך זמן, כאשר ספירת התאים המוחלטת נקבעה לכל גרם של שריר נצפתה עלייה זמנית באוכלוסייה החיובית הכפולה נצפתה, לפני נפילה או מתחת לרמות הבסיס על ידי 14 שבועות לאחר denervation.
איור 1: שרטוט גרפי עבור FAPs וזיהוי חברי פרלמנט, בידוד ותרבות: שרטוט גרפי המתאר FAPs וזיהוי חברי פרלמנט מגסטרוקנמיוס חולדה. דגימות נקצרים וטחונים מכנית לפני שהם עוברים שני עיכול אנזימטי רציף. תכשירי רקמות מעובדים ומסוננים כדי ליצור השעיה של תא בודד. קוקטייל של נוגדנים מצומדים פלואורסצנטית מתווסף לכל דגימה אשר לאחר מכן לרוץ דרך cytometer זרימה או ממיין תאים בהתאמה לזהות או לבודד FAPs וחברי פרלמנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: Sca-1::APC שיתוף חיטוי ותיוג נוגדנים מצומדים. אימות של Sca-1:: הטיות נוגדנים APC על ידי מכתים יחיד על חרוזי פיצוי מסחריים (A) השעיות תא יחיד שנוצר משריר גסטרוקנמיוס חולדה בריא (B). אוכלוסיות נפרדות של חרוזים ותאים מסומנים Sca-1 ניכרות (קופסאות שחורות). טיטציה נוגדנית בוצעה על ידי בדיקת חמישה ריכוזים שונים של Sca-1::APC על השעיות תא יחיד (C); הריכוז האופטימלי נבחר על סמך עוצמת הפלואורסצנטיות הגדולה ביותר עם כתמי רקע מינימליים ונמצא כי הוא תלוי באצווה. טיטציה מייצגת מוצגת עם הריכוז האופטימלי הספציפי לאצווה המצוין על-ידי התיבה האדומה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: זיהוי ציטומטריה זורמת של FAPs וחברי פרלמנט בגסטרוקנמיוס חולדה. (A-F) אסטרטגיית גיטינג לניתוח ציטומטרי זרימה של FAPs וחברי פרלמנט. (A) דגימות מגודרות תחילה כדי לא לכלול פסולת (קופסה שחורה) וכן לשער לספירת חרוזים (תיבה אדומה). לאחר מכן, התאים מגודרים כדי לא לכלול מכפילים הן לפיזור הקדמי (FSC)(B)והן לפיזור הצד (SSC)(C). הכדאיות של תאים בודדים וכתוצאה מכך מוערכת על ידי כתמים עם כחול SYTOX (D). סינגלים שליליים (חיים) של SYTOX Blue מוערכים לאחר מכן עבור אות FITC המזהה CD31 ו- CD45 (שושלת; Lin) על מנת לא לכלול שברי Lin + מניתוח נוסף (קופסה שחורה Lin- תאים) (E). אוכלוסיית לין מוערכת לאחר מכן עבור Sca-1::APC לעומת VCAM-1::P E אות (F). FAPs מזוהים כאירועי Lin-/Sca-1+/VCAM-1- (F; תיבה אדומה) בעוד חברי פרלמנט מזוהים כאירועי Lin-/Sca-1-/VCAM-1+ (F; תיבה כחולה). ניתן לראות גם אוכלוסייה חיובית כפולה של Lin-/Sca-1+/VCAM-1 (רבע ימני עליון). (G)פקדי FMO (פלואורסצנטיות מינוס אחד) עבור CD31::FITC ו- CD45::FITC מדגימים פיצוי הולם וגטינג עבור תאי לין. (H-I) Sca-1::APC לעומת VCAM-1::P E מגרשים של פקדי FMO להפגין פיצוי הולם ו gating עבור FAPs (Sca-1 FMO) וחברי פרלמנט (VCAM-1 FMO). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: שאלות ותרביות תאים ממוינות של חברי פרלמנט וחיסון. (A)חיסון משותף עבור PDGFRα (ירוק) ו- Pax7 (אדום) על FAPs ממוינים טריים (שורה עליונה) וחברי פרלמנט (שורה תחתונה). כתם גרעיני כחול עם DAPI. FAPs מבטאים אך ורק PDGFRα ולא תאים חיוביים Pax7 ניכרים, בעוד חברי פרלמנט מבטאים באופן בלעדי Pax7 ללא זיהום תאים חיובי PDGFRα, המדגים את הטוהר של שתי האוכלוסיות ממוינות. (B)FAPs ביום 12 במדיה בידול אדיפוגנית (AD) כתמים חיוביים עבור חלבון ספציפי פיברובלסט 1 (FSP-1; ירוק) ו Perilipin-1 (Plin-1; ירוק), הדגמת פיברובלסטים מובחנים אדיפוציטים, בהתאמה. גרעינים מוכתמים ב- DAPI (כחול). שמן אדום O (ORO) כתמים (אדום) מציין את נוכחותם של טריגליצרידים נייטרליים ושומנים הנובעים אדיפוזיטים בוגרים עד היום 12. FAPs נתון מדיה בידול פיברוגני (FD) להפגין ביטוי של FAPs נגזר קולגן סוג 1 (Col1a1; ירוק). FAPs מתורבתים מדיפוגני או פיברוגנית מדיה אינם חיסון משותף עבור שרשרת כבדה myosin (MHC, אדום), המציין היעדר מיוציטים מזהמים. (C)חברי פרלמנט הגדלים במדיה בידול מיוגנית (MD) ביום 12 להציג MHC חיובי (אדום) כתמים המדגימים את נוכחותם של מיוציטים בוגרים מיוטיובים מרובי גרעיניים. גרעינים מוכתמים ב- DAPI (כחול). תרבויות MP היו ברורות של זיהום פיברובלסט ו adipocyte כפי שצוין על ידי היעדר חיסון משותף עבור FSP-1 (ירוק), פלין-1 (ירוק) ו- ORO כתמים. חברי פרלמנט הגדלים על למינין כדי להכיל חיסון Co1a1 אינם מציגים את אותה מידה של היתוך myotube ביום 12 כפי שקורה על קולגן. Col1a1 (ירוק) נעדר מתרבויות MP. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ניוון, פיברוזיס וחדירה שומנית של שרירים מנוטרל לטווח ארוך. (A)נציג שנקטפו שרירי גסטרוקנמיוס בארבע נקודות זמן סדרתיות לאחר denervation. Gastrocnemius מסומן CONTRA הוא מדגם איברים מנוגדים מייצגים מבעל חיים שבועיים denervated. (B)כימות של ניוון שרירים לאחר denervation לידי ביטוי כיחס של גסטרוקנמיוס גסטרוקנימיוס גסטרוקנימיוס גסטרו-קנרמיוס לגפיים מנוגדות (CONTRA). (C)Picrosirius אדום (PSR) מוכתם חתך היסטולוגי של גסטרוקנמיוס שנקטפו 2 או 14 שבועות לאחר denervation להפגין פיברוזיס מתקדם. שרירים מכתימים צהוב, כתמי קולגן אדומים. (D)פיברוזיס כימות על ידי קביעת אזור של רקמה חיובית PSR ביחס לאזור הרקמה הכולל. (E)שמן אדום O (ORO) מוכתם חתך של gastrocnemius שנקטפו 2-או 14 שבועות לאחר denervation, מוכתם נגד המטוקסילין. כתמי שומנים אדומים. (ו)חדירת שומן מכמתת על ידי קביעת אזור של רקמה מוכתמת ORO ביחס לאזור הרקמה הכולל. (G)חתך היסטולוגי Gastrocnemius שנקטפו 2- או 14 שבועות לאחר denervation, מחוסן עבור למינין (ירוק) ו Sca-1 (אדום). למינין מכתים באופן חיובי את הלמינה הבזלית המקיפה את המיפוברים האישיים. Sca-1 מזהה סוגי תאים מרובים של אבות. גרעינים מוכתמים ב- DAPI (כחול). Inset מראה לוקליזציה של תאי Sca-1 + מחוץ לאמינה בזאלית בשריר בריא; חצים צהובים מציינים נוכחות של תאי Sca-1+ בתוך אזורים סיביים. (הנתונים הם ממוצעים +/- S.D; n = 3 עבור נקודות זמן של שבועיים ו- 14 שבועות. נתונים בלוח B מנותחים על ידי ANOVA חד כיווני, נתונים בלוחות D ו- F נותחו על ידי ANOVA דו כיווני. הבדיקה של לאחר ההוק Sidak בוצעה כדי לתקן עבור השוואות מרובות. * = P<0.05 בין קונטרה ו DEN; # = P<0.05 בין דוגמאות) אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: שאלות ותשובות בדינמיקה של עכברושים ותיקים. (A)נציג Sca-1::APC לעומת VCAM-1::P E לוחות של האוכלוסייה Lin- (CD31-/CD45-) מדגימות שריר שנקטפו 2-, 5,12,או 14 שבועות לאחר denervation. השורה העליונה מציגה חלקות מהגסטרוקנמיוס (DEN), בעוד שהשורה התחתונה מציגה את אלה מהגסטרוקנמיוס הנגדי, שלא נפתח (CONTRA). לין-/Sca-1+/VCAM-1- FAPs (סה"כ) מחולקים לשברים Sca-1 High (תיבה אדומה) ו- Sca-1 Med/Low (תיבה ירוקה), בעוד ש- Lin-/Sca-1-/VCAM-1+ חברי פרלמנט מוצגים בתיבה הכחולה. (B)כימות של FAPs (סה"כ, Sca-1 גבוה, Sca-1 Med/Low) בכל נקודת זמן לאחר denervation, דיווח כתדירות (%) של תאי לין (שורה עליונה) ואת מספר התאים לכל שריר גרם (שורה תחתונה) מנורמל את הגסטרוקנמיוס של פקד contralateral. (C)פרופורציות יחסיות של Sca-1 גבוה ו Sca-1 Med / נמוכה של אוכלוסיית FAPs הכוללת. (D)כימות של חברי פרלמנט בכל נקודת זמן לאחר denervation שדווח כתדירות (%) של תאי Lin (גרף שמאלי) וכמו מספר התאים לכל שריר גרם (גרף ימני) מנורמל לבקרה contralateral. (הנתונים הם ממוצעים +/- S.D; n = 4 עבור נקודות זמן של שבועיים ו- 12 שבועות; n = 5 עבור נקודת זמן של 5 שבועות; n = 2 עבור נקודת זמן של 14 שבועות. נתונים שנותחו על ידי ANOVA חד כיווני; הבדיקה של לאחר ההוק Sidak כדי לתקן השוואות מרובות. # = P<0.05.) אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 1: אימות נוגדנים ותמצית. אימות CD31::FITC (A-C), CD45::FITC (D-F) ו- VCAM-1::P E (G-I) נוגדנים מצומדים מסחרית על חרוזי פיצוי (A,D,G) והשעיות תא יחיד משריר גסטרוקנמיוס עכברוש בריא (B,E,H). כל נוגדן היה titrated ב 5 ריכוזים שונים (C, F, I). הריכוז האופטימלי נבחר על סמך עוצמת הפלואורסצנטיות הגדולה ביותר עם כתמי רקע מינימליים (קופסאות אדומות). נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור 2 משלים: FAPs ממוינים וחברי פרלמנט בתנאי תרבות בידול הפוך. (A)FAPs בתרביתות במדיה בידול מיוגנית (MD) ביום 12 חיסון משותף עבור FSP-1 (ירוק), Plin-1 (ירוק) או Col1a1 (ירוק) ו- MHC (אדום) אינם מדגימים זיהום מיוציטה. FSP-1 חיובי, וכתמים Col1a1 לחשוף FAPs הבחנה פיברובלסטים. מכתים ORO (אדום) מגלה ייצור שומנים למרות Plin-1 אדיפוזיטים חיוביים אינם גלויים בקלות. גרעינים מוכתמים ב- DAPI (כחול). (ב)חברי פרלמנט נתונים למדיה הבידול אדיפוגנית מתו. חברי פרלמנט מתורבתים במדיה צמיחה FAP (FAP GM) במשך 12 ימים וחיסון משותף עבור FSP-1 (ירוק) או Plin-1 (ירוק) ו- MHC (אדום) להפגין מיוציטים מובחנים myotubes עם היעדר תאים חיוביים FSP-1 או Plin-1. היעדר כתמי ORO מאשר עוד יותר את המחסור בתאים אדיפוגניים בתרבית. חברי פרלמנט שגדלו בתקשורת בידול פיברוגנית (FD) ובחיסון משותף עבור Col1a1 ו- MHC מראים מיוציטים בוגרים והיעדר תאים חיוביים Col1a1. חברי פרלמנט הגדלים על למינין כדי להכיל חיסון Col1a1 אינם מציגים את אותה מידה של היתוך למיוטיוב ב 12 ימים בתרבות כפי שקורה על קולגן. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 3: Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ תאים הםאוכלוסייה מעורבת של FAPs וחברי פרלמנט. (A)PDGFRα ו Pax7 חיסון משותף של תאים לין-/ Sca-1+/VCAM-1+ מבודדים זה עתה, מציגים אוכלוסייה מעורבת של תאי PDGFRα חיוביים יחידים (חצים לבנים) ו- Pax7 חיובי יחיד (חץ צהוב) המזהים FAPs וחברי פרלמנט, בהתאמה. (B)תרביות לין-/Sca-1+/VCAM-1+ ביום 12 הגדלות במדיה בידול מיוגנית (MD) מכילות הן FSP-1 חיובי יחיד חיובי (ירוק) והן MHC יחיד חיובי (אדום) תאים המזהים פיברובלסטים ומיוציטים / צינורות, בהתאמה. היעדר כתמים פלין-1 (ירוק) ו ORO (אדום) מצביע על היעדר אדיפוציטים בוגרים. חיסון משותף עבור Col1a1 (ירוק) ו- MHC (אדום) להראות מיוציטים ופיברובלסטים בוגרים. (C)תאי Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ ביום 12 גדלו במדיה של בידול אדיפוגני (AD) באופן דומה להראות שילוב של FSP-1 (ירוק) חיובי יחיד MHC (אדום) תאים חיוביים בודדים, אבל גם עם Plin-1 (ירוק) תאים חיוביים יחידים מכתימים ORO נוכח, המאשר את ההבחנה של פיברובלסטים, מיוציטים אדיפוציטים. תרבויות הגדלות במדיה בידול פיברוגני (FD) להראות מיוציטים בוגרים Col1a1 תאים חיוביים בודדים (פיברובלסטים). (D)נציג Sca-1::APC לעומת VCAM-1::P E לוחות של האוכלוסייה לין- (CD31-/CD45-) מדגימות שריר denervated שנקטפו 2-, 5,12,או 14 שבועות לאחר denervation; לין-/Sca-1+/VCAM-1+ האוכלוסייה מסומנים בתיבה הסגולה. (E)כימות של תאי Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ בארבע נקודות זמן סדרתיות לאחר denervation, שדווח כתדירות של תאי לין (גרף שמאלי) ותאים לכל שריר גרם (גרף ימני) מנורמל לגסטרוקנמיוס הנגדי. (הנתונים הם ממוצעים +/- S.D; n = 4 עבור נקודות זמן של שבועיים ו- 12 שבועות; n = 5 עבור נקודת זמן של 5 שבועות; n = 2 עבור נקודת זמן של 14 שבועות. הנתונים נותחו על ידי ANOVA חד כיווני; הבדיקה של סידאק לאחר ההוק לתיקון השוואות מרובות; # = P<0.05.) נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 4: ITGA7 כסמן של תאים מיוגניים בציטומטריית הזרימה של שריר השלד של חולדה. אימות של ITGA7::P E-Cy7 הטיות נוגדנים על ידי מכתים יחיד על חרוזי פיצוי מסחריים (A) ומתלים תא יחיד שנוצר משריר גסטרוקנמיוס חולדה בריא (B). אוכלוסיות של חרוזים ותאים המסומנים על ידי ITGA7 ניכרות (קופסאות שחורות) (C)טיטציה נוגדנית בוצעה על ידי בדיקת חמישה ריכוזים שונים על השעיות תא יחיד. קופסה אדומה מצביעה על ריכוז אידיאלי. (D)חלקות של פקדי פלואורסצנטיות מינוס אחד (FMO) ממחישות את היעדר דליפת הפלואורסצנטיות על פני הנוגדנים, אך כתם מלא של השעיות תאים חושף אינטראקציה לא ספציפית בין Sca-1::APC ו- ITGA7::P E-Cy7 (קופסה ירוקה). Gating (E) להפריד בין תאי Lin-/Sca-1+/ITGA7 (כביכול "FAPs") ותאי לין-/Sca-1-/IGTA7+ (כביכול "חברי פרלמנט"). (ו)חיסון משותף של תרביות תאים ממוינות FACS ב 12 ימים לאחר ציפוי עם Perilipin-1 (ירוק) ו- MHC (אדום) מדגים את שתי קבוצות התאים ממוינים התבגרו בעיקר לתוך אדיפוציטים עם מעט מיוציטים נוכחים. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
| 1. לא נגוע |
| 2. בקרת כדאיות |
| 3. CD31 + CD45 FMO |
| 4. סקא-1 FMO |
| 5. VCAM-1 FMO |
| 6. CD31 + CD45 כתם יחיד (חרוזים) |
| 7. CD31 + כתם יחיד CD45 (תאים) |
| 8. כתם יחיד סקא-1 (חרוזים) |
| 9. כתם יחיד סקא-1 (תאים) |
| 10. VCAM-1 כתם יחיד (חרוזים) |
| 11. VCAM-1 כתם יחיד (תאים) |
טבלה 1: פקדי כתמי נוגדני ציטומטריה זורמים. השלמה מלאה של פקדי כתמי נוגדנים. אם הניסוי מתבצע בפעם הראשונה, פקדים מוכתמים יחידים צריכים להיות מופעלים הן על חרוזי פיצוי והן על מתלים של תאים בודדים. עבור כל הניסויים הבאים, פקדים מוכתמים יחידים צריכים להיות מופעלים רק על חרוזי פיצוי.
| CD31::FITC (מיקרוגרם) | CD45::FITC (מיקרוגרם) | Sca-1::APC (מיקרוגרם)* | VCAM-1::P E (מיקרוגרם) | SyTOX כחול (μM; ריכוז סופי) |
|
| בקרה לא נגועה | |||||
| -- | -- | -- | -- | -- | |
| פקדים עם כתמים בודדים | |||||
| SYTOX כחול (בקרת כדאיות) | -- | -- | -- | -- | 1 |
| CD31 ו- CD45 | 0.5 | 0.25 | -- | -- | 1 |
| סקא-1 | -- | -- | 0.25 | -- | 1 |
| VCAM-1 | -- | -- | -- | 0.25 | 1 |
| פלואורסצנטיות מינוס אחד (FMO) | |||||
| CD31 ו- CD45 | -- | -- | 0.25 | 0.25 | 1 |
| סקא-1 | 0.5 | 0.25 | -- | 0.25 | 1 |
| VCAM-1 | 0.5 | 0.25 | 0.25 | -- | 1 |
| דגימות ניסיוניות | |||||
| כתם מלא | 0.5 | 0.25 | 0.25 | 0.25 | 1 |
טבלה 2: מטריצת הכתמת נוגדנים ציטומטריית זרימה. כמות הנוגדנים להכתמה של דגימות ניסיוניות ושליטה עבור ציטומטריית זרימה מוצגת. כל הכתמים מבוצעים בנפח כולל של 100 μL של חוצץ לשטוף. *הכמות האופטימלית של נוגדן Sca-1::APC מצומד באופן עצמי עשויה להשתנות בהתאם לאצוות בהן נעשה שימוש. כל אצוות Sca-1::APC מצומדות זה עתה צריכות להיות מאומתות תחילה על ידי מכתים יחיד הן חרוזי פיצוי והן מתלים של תא בודד.
קובץ משלים: מתכונים ריאגנט. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול בידוד FAPs מותאם ומאומת לשרירי חולדות חיוני לחוקרים המעוניינים לחקור מודלים לפציעות שאינם אפשריים בעכבר מסיבות ביולוגיות או טכניות. לדוגמה, עכברים אינם מודל בעלי חיים אופטימלי שבו לחקור פגיעות מקומיות כרוניות, או ניווניות כגון denervation לטווח ארוך. מבחינה ביולוגית, תוחלת החיים הקצרה וההזדקנות המהירה של עכברים מקשים על תיוג מדויק של סקוואלה השרירים עקב denervation מגורם ההזדקנות המבלבל. מבחינה טכנית, מסת השריר המופחתת באופן דרסטי עקב ניוון חמור לא תהיה מספיקה לניתוח ציטומטרי יעיל של זרימה. למעשה, פרוטוקולי בידוד FAPs עכבר מציע קיבוץ שרירים בריאים יחד כדי להגדיל טוב יותר את התשואה של FAPs ממוין29. בעוד זה פותר את המחסום הטכני של השגת רקמת שריר נאותה לניתוח, זה בו זמנית מגביל חוקרים מהערכת FAPs ברמה ספציפית לשרירים. מאז קבוצות שרירים ספציפיות להשתנות מטבעו הרכב סוג הסיבים שלהם, מידת כלי הדם, ומספרים מיטוכונדריאליים47 למשל, שילוב שרירים שונים מרובים לניתוח ציטומטרי זרימה מונע אפיון FAPs ספציפי לשרירים. לעומת זאת, אנו מראים כי הן בריא לטווח ארוך denervated, ניוון ופיברוטי חולדה gastrocnemius לספק כמות נאותה של חומר התחלתי עבור cytometry זרימה יעילה. יתר על כן, בדגימות בריאות, עודף השרירים יכול להיות מחולק עוד יותר לבדיקות במורד הזרם מרובות, המאפשר לחוקרים לנתח בו זמנית את התכונות התאיות, המולקולריות וההיסטיולוגיות של אותה רקמה. לבסוף, לניסויים מניפולציה FAPs במודלים פציעה עם טיפולים, ניתוחים מאומתים היטב של תפקוד פיזי הליכה בכוננות חולדות פעילות זמינים21,22,23,24, המאפשר הערכה סדרתית של תפקוד השריר ללא צורך בסיום החיה.
מכשול מרכזי ביצירת פרוטוקול בידוד FAPs ממוטב עבור החולדה היה זמינות נוגדנים. הגישה הראשונית שלנו ביקשה להעתיק את לוח הנוגדנים ופרוטוקולי אסטרטגיית הג'יטינג המועסקים באופן נרחב בעכבר1,7,8,9,10,11,12,13,14. בעוד שתרופות זמינות מסחרית, מצומדות, נבדקות בציטומטריה זורמת ונוגדנים מאומתים המזהים חולדות היו זמינות עבור סמני השושלת CD31 ו- CD45, אף אחד מהם לא היה קיים עבור FAPs חיוביים המזהים סמנים Sca-1 או PDGFRα, כמו גם עבור סמן הבחירה השלילי ITGA7. נוגדנים עיקריים שאינם מתיישבים ספציפיים לסמנים אלה ונטען כיעילים בציטומטריית הזרימה היו זמינים, אך מתוך סמני ה- FAPs Sca-1 ו- PDGFRα, רק נוגדן Sca-1 אומת בספרות שפורסמה בניתוח ציטומטרי של זרימה של תאי חולדה48. לכן, בחרנו ב- Sca-1 כסמן בחירה חיובי עבור FAPs. הסיכוי להשתמש בנוגדנים משניים כדי לתייג סמני Sca-1 ו- ITGA7 לא היה ריאלי מכמה סיבות, אלא בעיקר משום שהנוגדנים הספציפיים רק לחולדה עבור Sca-1 ו- ITGA7 שאומתו עבור ציטומטריית זרימה נוצרו באותו מין מארח. לכן, האפשרות הנותרת הייתה הטיות עצמיות של שני הנוגדנים באמצעות ערכות זמינות מסחרית.
תהליך בחירת ערכה אופטימלית להטיית נוגדנים היה נרחב, שכן ערכות רבות אינן סובלניות לחלוטין או חלקית לדילולי חוצץ שונים (למשל, גליצין, גליצל, BSA, נתרן אזיד) הנמצאים בנוגדנים העיקריים. בנוסף, הפלורופור המסופק חייב להיות תואם ללייזרים המצוידים בתוך ציטומטר הזרימה / ממיין התאים העומדים לרשות החוקר, ולא לפלוט אורך גל דומה לפלורופורים אחרים המשמשים לזיהוי סוגי תאים אחרים במדגם. נוכחותם של רכיבים מדוללים בנוגדנים העיקריים PDGFRα ספציפיים לעכברושים שהיו תואמים באופן גרוע לערכות ההטיה, הייתה שיקול נוסף בבחירת Sca-1 כסמן הבחירה החיובי של FAPs בפרוטוקול זה. בעוד שתוצאות אלה מראות כי הן Sca-1::APC והן ITGA7::P הטיות שלE-Cy7 הביאו לזיהוי אוכלוסיות מוכתמות חיוביות מובהקות הן בחרוזי פיצוי והן בתאים, הראשון נמצא להפגין ריקבון בפלואורסצנטיות מוקדם יותר ממה שפורסם על ידי היצרן. מומלץ מאוד לחוקרים להטות את Sca-1::APC על פי הוראות היצרן, מיד לפני השימוש הראשון (למשל, יום לפני הניסוי) כדי להבטיח אות חזק, לתכנן ניסויים בהתאם כך שניתן להשתמש באצווה אחת של נוגדן מצומד בתוך חלון האפקטיביות של הנוגדן, ולאמת כל אצווה על ידי חרוזי פיצוי מכתימים יחידים ומחט על מתלים של תא בודד. חשוב מכך, עם זאת, האינטראקציה הקריטית שצוין בין Sca-1::APC ו- ITGA7::P E-Cy7 מנעה תיווג מדויק של אוכלוסיות של FAPs לעומת חברי פרלמנט, המחייבת שימוש באסטרטגיה חלופית.
Boscolo Sesillo ואח ' הוכיח לאחרונה את בידוד ציטומטרי זרימה מוצלח של תאי גזע שריר חולדה באמצעות VCAM-1 כסמן בחירה חיובי יחיד33 ב CD31, CD45 ו CD11b תאים שליליים. עם VCAM-1 כסמן בחירת MP, השתמשנו בלוח נוגדנים חדשני כדי לזהות FAPs (לין-/Sca-1+/VCAM-1-) וחברי פרלמנט (Lin-/Sca-1-/VCAM-1+) ואימתנו את הגישה עם תרבית במבחנה של תאים ממוינים FACS משריר גסטרוקנמיוס בריא. FAPs וחברי פרלמנט מבודדים טריים מחוסנים אך ורק עבור הסמנים החלופיים שלהם PDGFRα ו- Pax7. FAPs מתורבתים נבדלו לאוכלוסיות של פיברובלסטים בוגרים ואדיפוציטים, וחברי פרלמנט למיוציטים / מיוטיוב בוגרים. לא התרחש זיהום צולב של FAPs וחברי פרלמנט בתוך התרבויות. חיסון של חתך היסטולוגי אישר חדירה של אזורים של השפלה שומן פיברו בשריר denervated עם תאים חיוביים Sca-1.
בעוד אנו התחייבנו ניתוח ציטומטרי זרימה של שריר denervated לטווח ארוך כדי לאמת את הפרוטוקול שלנו שרירים ניוון חמור, פיברוטי ושומן הסתנן, אנו אגב ראינו את הופעתה של תת אוכלוסייה FAPs עם אות Sca-1 מוגבר (מסומן Sca-1 גבוה) בהשוואה לביטוי Sca-1 הבסיסי (ציין Sca-1 Med / נמוך) לאורך זמן. Sca-1 FAPs גבוה גדל באופן משמעותי מאוחר לאחר denervation (12 שבועות פלוס), בעוד Sca-1 Med / נמוך FAPs הגיע לשיא מוקדם ב 5 שבועות לפני ירידה חזרה לרמות הבסיס. הטרוגניות בפנוטיפ FAPs דווח10,30. FAPs עם ביטוי Sca-1 גבוה יותר הוכחו להבדיל בקלות רבה יותר לתוך אדיפוזיטים, וכאשר נחשף לגירוי פיברוגני הגביר את הביטוי של Col1a130,49. הדינמיקה של תת-אוכלוסיות FAPs שנצפו כאן נראה בקנה אחד עם מהלך הזמן של sequelae המושרה denervation ויכולת התחדשות של שריר47 ולכן עשוי לאפיין FAPs תת אוכלוסיות עם תוכניות סלולריות שונות. Sca-1 FAPs גבוה להיות מוסדר בשלב מאוחר של נקודות זמן במקביל חדירת פיברו / שומן וירידה בפוטנציאל התחדשות, בעוד Sca-1 Med / FAPs נמוך להיות מוסדר במהלך החלון המתחדש של השריר ועשוי לסייע מיוגנזה התחדשות יעילה. פרוטוקול הבידוד של ה-FAPs המוצג כאן מספק לחוקרים את היכולת לזהות ולבודד אוכלוסיות שונות אלה למחקר עתידי.
זיהינו אוכלוסייה של תאים מוכתמים חיוביים הן עבור Sca-1 והן עבור VCAM-1 (Lin-/Sca-1+/VCAM-1+) וזיהינו את האוכלוסייה החיובית הכפולה הזו להיות תערובת של FAPs וחברי פרלמנט. הפרדה של אוכלוסייה זו באמצעות סמן שלישי - ITGA7 - לא התאפשרה בשל האינטראקציה בין הנוגדנים העיקריים של Sca-1 ו- ITGA7. Malecova ועמיתיו דיווחו על תת אוכלוסייה של VCAM-1 המבטא FAPs כי הוא כמעט נעדר בשריר בריא, גדל באופן חולף עם דלקת חריפה, ואת ההתמדה שלהם בעכברים mdx (מודל של ניוון שרירים) היה קשור דלקת שריר כרונית פיברוזיס10. לעומת זאת, ולמרות שלא אוכלוסיית FAPs טהורה, מצאנו כי האוכלוסייה Lin-/Sca-1+/VCAM-1+ ירדה לרמות הבסיס או מתחתיה עם פיברוזיס שריר כרוני ב 12- ו 14 שבועות לאחר denervation. Denervation אינו גורם לאותה תגובה דלקתית וניסיונות התחדשות רכיבה על אופניים שחווים עכברי mdx, אשר עשוי להסביר את ההבדלים בתוצאות שלנו. הזיהוי שלנו של חברי פרלמנט באוכלוסיית התאים Lin-/Sca-1+/ VCAM-1+ עולה בקנה אחד עם הדיווח על ביטוי Sca-1 על שיעור קטן מאוד של חברי פרלמנט בשריר בריא, עם עלייה ארעית בעקבות פציעה במהלך התפשטות myoblast ונסיגה לאחר מכן ממחזור התא45. לכן, בעוד שאסטרטגיית תיוג הנוגדנים וה-FACS שלנו מבודדת בהצלחה אוכלוסיות טהורות של FAPs וחברי פרלמנט למחקר, ניסויים הדורשים כימות מבוסס ציטומטריה של זרימה של אוכלוסיות אלה עשויים לזלזל מעט במספרם בשל האחוז הקטן של תאים בשני קווי האבות המבטאים במשותף את Sca-1 ו- VCAM-1. ללא קשר, הפרוטוקול הנוכחי מדגים בבירור את התגובה הביפאזית הקלאסית של חברי פרלמנט לפגיעה denervation, עם upregulation לטווח קצר ודלדול לאחר מכן של האוכלוסייה בשריר denervated לטווח ארוך. באופן דומה, העלייה ב FAPs שדווחו בפגיעת denervation לטווח קצר מבודדת הוא recapitulated כאן, והוכח כי הוא מתמשך עוד יותר באמצעות מודל טרנספרציה עצבית טיבית לטווח ארוך.
לסיכום, פרוטוקול זה מספק לחוקרים בעל חיים שלא נחקר בעבר, החולדה, שבה ניתן להשתמש בשיטות ציטומטריות של זרימה כדי לחקור בו זמנית FAPs וחברי פרלמנט. ניסויים בעכברים המוגבלים בכמות שריר השלד, והצורך התכוף לבצע ניסויים סופניים להערכת כוח השריר ותפקודו, יכולים להתבצע בקלות בחולדה הגדולה יותר ועם מגוון רחב יותר של שיטות הערכה לא קטלניות וכוח ופונקציונליות. בסך הכל, מחקרי FAPs בחולדה עשויים לחשוף תפקידים חדשניים של אוכלוסיית אבות מפתח זו בשרירים חריפים וכרוניים ובטראומה עצבית היקפית ומחלות, ובהמשך מגדילים את הפוטנציאל לפיתוח טיפולים ספציפיים לתא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין קונפליקטים לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות למתקני הליבה של ציטומטריית הזרימה באוניברסיטת אוטווה ולמרכז המחקר קינן למדעים ביו-רפואיים (KRC), לבית החולים סנט מייקלס בריאות מאוחדת טורונטו על המומחיות וההדרכה שלהם באופטימיזציה של פרוטוקול ציטומטריית הזרימה / FACS המוצג בכתב יד זה. עבודה זו מומנה על ידי רפואה על ידי קרן עיצוב רעיונות חדשים 2018 (MbDNI-2018-01) ל- JB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 10 cm cell culture dishes | Sarstedt | 83.3902 | |
| 12-well cell culture plate | ThermoFisher | 130185 | |
| 12 mm glass coverslips, No.2 | VWR | 89015-724 | |
| 10 mL Syringe | Beckton Dickenson | 302995 | |
| 15 mL centrifuge tubes | FroggaBio | 91014 | |
| 20 gauge needle | Beckton Dickenson | 305176 | |
| 25mL Serological pipette | Sarstedt | 86.1685.001 | |
| 40µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 50mL centrifuge tubes | FroggaBio | TB50 | |
| AbC Total Antibody Compensation Beads | ThermoFisher | A10497 | |
| Ammonium Chloride, Reagent Grade | Bioshop | AMC303.500 | |
| APC Conjugation Kit, 50-100µg | Biotium | 92307 | |
| Aquatex Aqueous Mounting Medium | Merck | 108562 | |
| Biolaminin 411 LN | Biolamina | LN411 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Bioshop | ALB001 | |
| Calcium Chloride | Bioshop | CCL444.500 | |
| Collagenase Type II | Gibco | 17101015 | |
| CountBright Plus Absolute Counting Beads | ThermoFisher | C36995 | |
| Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902 | |
| Dispase | Gibco | 17105041 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Gibco | 11995-065 | (+)4.5 g/L D-Glucose (+)L-Glutamine (+)110 mg/L Sodium Pyruvate |
| EDTA | FisherScientific | S311 | |
| FACSClean Solution | Beckton Dickenson | 340345 | |
| FACSDiva Software | Beckton Dickenson | -- | |
| FACSRinse Solution | Beckton Dickenson | 340346 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F1051 | |
| Flow Cytometry Sheath Fluid | Beckton Dickenson | 342003 | |
| FlowJo Software | Beckton Dickenson | -- | |
| Fluorescent Mounting Medium | Dako | S302380-2 | |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody | Invitrogen | A21424 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A11008 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody | Invitrogen | A21429 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210-064 | |
| Ham's F10 Media | ThermoFisher | 11550043 | (+) Phenol Red (+) L-Glutamine (-) HEPES |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X) | Multicell | 311-513-CL | |
| Heat Inactivated Horse Serum | Gibco | 26050-088 | |
| Hemocytometer | Reichert | N/A | |
| HEPES, minimum 99.5% titration | Sigma | H3375 | |
| Horse Serum | ThermoFisher | 16050130 | |
| Human Transforming Growth Factor β1 (hTGF-β1) | Cell Signaling | 8915LF | |
| Humulin R | Lilly | HI0210 | |
| IBMX | Millipore Sigma | I5879 | Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine |
| Isopropanol | Sigma | I9516 | Also known as 2-propanol |
| Lewis Rat, Female | Charles River Kingston | 004 (Strain Code) | 200-250 grams used |
| LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer | Beckton Dickenson | -- | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | EP-5417R | |
| MoFlo XDP Cell Sorter | Beckman Coulter | -- | |
| Mouse Anti-CD31::FITC Antibody | Abcam | ab33858 | Clone TLD-3A12 |
| Mouse Anti-CD45::FITC Antibody | Biolegend | 202205 | Clone OX-1 |
| Mouse Anti-CD106::PE Antibody | Biolegend | 200403 | Also known as VCAM-1 |
| Mouse Anti-MHC Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | N/A | Also known as MF20 |
| Mouse Anti-Pax7 Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | N/A | |
| Neutral Buffered Formalin, 10 % | Sigma | HT501128 | |
| Oil Red O | Millipore Sigma | O0625 | |
| PE-Cy7 Conjugation Kit | Abcam | ab102903 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X) | Gibco | 10010-023 | (-)Calcium Chloride (-)Magnesium Chloride |
| Potassium Bicarbonate, Reagent Grade | Bioshop | PBC401.250 | |
| Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody | Invitrogen | MA5-32347 | FSP-1 also known as S100A4 |
| Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody | Abcam | ab203254 | |
| Rabbit Anti-Laminin Antibody | Sigma | L9393 | |
| Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody | Abcam | ab3526 | |
| Rabbit Anti-Sca-1 Antibody | Millipore Sigma | AB4336 | |
| Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody | Abcam | ab260043 | Also known as Col1a1 |
| Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody | Abcam | ab203491 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Gibco | PHG0266 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Troglitazone | Millipore Sigma | T2573 | |
| Tween-20 | Bioshop | TWN510 |
References
- Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12, 153-163 (2010).
- Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).
- Uezumi, A., Ikemoto-Uezumi, M., Tsuchida, K. Roles of nonmyogenic mesenchymal progenitors in pathogenesis and regeneration of skeletal muscle. Frontiers in Physiology. 5, 1-11 (2014).
- Biswas, A. A., Goldhamer, D. J. FACS fractionation and differentiation of skeletal-muscle resident multipotent Tie2+ progenitors. Methods in Molecular Biology. 1460, 255-267 (2016).
- Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network. Frontiers in Physiology. 10, 1-10 (2019).
- Wosczyna, M. N., Rando, T. A. A muscle stem cell support group: Coordinated cellular responses in muscle regeneration. Developmental Cell. 46 (2), 135-143 (2018).
- Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
- Uezumi, A., et al. Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle. Journal of Cell Science. 124 (21), 3654-3664 (2011).
- Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
- Malecova, B., et al. Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Madaro, L., et al. Denervation-activated STAT3-IL-6 signalling in fibro-adipogenic progenitors promotes myofibres atrophy and fibrosis. Nature Cell Biology. 20 (8), 917-927 (2018).
- Heredia, J. E., et al. Type 2 innate signals stimulate fibro/adipogenic progenitors to facilitate muscle regeneration. Cell. 153 (2), 376-388 (2013).
- Fiore, D., et al. Pharmacological blockage of fibro/adipogenic progenitor expansion and suppression of regenerative fibrogenesis is associated with impaired skeletal muscle regeneration. Stem Cell Research. 17 (1), 161-169 (2016).
- Kang, X., et al. Interleukin-15 facilitates muscle regeneration through modulation of fibro/adipogenic progenitors. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 1-11 (2018).
- Lovering, R. M., Roche, J. A., Goodall, M. H., Clark, B. B., Mcmillan, A. An in vivo rodent model of contraction-induced injury and non-invasive monitoring of recovery. Journal of Visualized Experiments. (51), e2782 (2011).
- Iyer, S. R., Valencia, A. P., Hernández-Ochoa, E. O., Lovering, R. M. In vivo assessment of muscle contractility in animal studies. Methods in Molecular Biology. 1460, 293-307 (2016).
- Mintz, E. L., Passipieri, J. A., Lovell, D. Y., Christ, G. J. Applications of in vivo functional testing of the rat tibialis anterior for evaluating tissue engineered skeletal muscle repair. Journal of Visualized Experiments. (116), e54487 (2016).
- Hakim, C. H., Wasala, N. B., Duan, D. Evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice. Journal of Visualized Experiments. (72), e50183 (2013).
- Moorwood, C., Liu, M., Tian, Z., Barton, E. R. Isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies. Journal of Visualized Experiments. (71), e50036 (2013).
- Gerlinger-Romero, F., et al. Non-invasive assessment of dorsiflexor muscle function in mice. Journal of Visualized Experiments. (143), e58696 (2019).
- Iohom, G., et al. Long-term evaluation of motor function following intraneural injection of ropivacaine using walking track analysis in rats. British Journal of Anaesthesia. 94 (4), 524-529 (2005).
- Brown, C. J., et al. Self-evaluation of walking-track measurement using a sciatic function index. Microsurgery. 10 (3), 226-235 (1989).
- Bozkurt, A., et al. CatWalk gait analysis in assessment of functional recovery after sciatic nerve injury. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 91-98 (2008).
- Deumens, R., Jaken, R. J. P., Marcus, M. A. E., Joosten, E. A. J. The CatWalk gait analysis in assessment of both dynamic and static gait changes after adult rat sciatic nerve resection. Journal of Neuroscience Methods. 164 (1), 120-130 (2007).
- McKinnon, K. M. Flow cytometry: An overview. Current Protocols in Immunology. 2018, 1-11 (2018).
- Jensen, A. R., et al. Neer Award 2018: Platelet-derived growth factor receptor α co-expression typifies a subset of platelet-derived growth factor receptor β-positive progenitor cells that contribute to fatty degeneration and fibrosis of the murine rotator cuff. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 27 (7), 1149-1161 (2018).
- Mosich, G. M., et al. Non-fibro-adipogenic pericytes from human embryonic stem cells attenuate degeneration of the chronically injured mouse muscle. JCI Insight. 4 (24), (2019).
- Lee, D., et al. HMGB2 is a novel adipogenic factor that regulates ectopic fat infiltration in skeletal muscles. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
- Low, M., Eisner, C., Rossi, F. Fibro/Adipogenic Progenitors (FAPs): Isolation by FACS and Culture. Muscle Stem Cells: Methods and Protocols. , 179-189 (2017).
- Giuliani, G., et al. SCA-1 micro-heterogeneity in the fate decision of dystrophic fibro/adipogenic progenitors. Cell Death and Disease. 12 (1), 1-24 (2021).
- Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
- Upadhyay, G. Emerging role of lymphocyte antigen-6 family of genes in cancer and immune cells. Frontiers in Immunology. 10, 819 (2019).
- Boscolo Sesillo, F., Wong, M., Cortez, A., Alperin, M. Isolation of muscle stem cells from rat skeletal muscles. Stem Cell Research. 43, 101684 (2020).
- Ciaramitaro, P., et al. Traumatic peripheral nerve injuries: Epidemiological findings, neuropathic pain and quality of life in 158 patients. Journal of the Peripheral Nervous System. 15 (2), 120-127 (2010).
- Noble, J., Munro, C. A., Prasad, V. S. S. V., Midha, R. Analysis of upper and lower extremity peripheral nerve injuries in a population of patients with multiple injuries. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 45 (1), (1998).
- Malik, S. Traumatic peripheral neuropraxias in neonates: A case series. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 8 (10), 10-12 (2014).
- Smith, B. W., Daunter, A. K., Yang, L. J. S., Wilson, T. J. An update on the management of neonatal brachial plexus palsy-replacing old paradigms a review. JAMA Pediatrics. 172 (6), 585-591 (2018).
- Rebolledo, D. L., et al. Denervation-induced skeletal muscle fibrosis is mediated by CTGF/CCN2 independently of TGF-β. Matrix Biology. 82, 20-37 (2019).
- Walls, P. L. L., McRae, O., Natarajan, V., Johnson, C., Antoniou, C., Bird, J. C. Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
- Yuen, D. A., et al. Culture-modified bone marrow cells attenuate cardiac and renal injury in a chronic kidney disease rat model via a novel antifibrotic mechanism. PLOS One. 5 (3), 9543 (2010).
- Fukada, S. I. The roles of muscle stem cells in muscle injury, atrophy and hypertrophy. Journal of Biochemistry. 163 (5), 353-358 (2018).
- Itabe, H., Yamaguchi, T., Nimura, S., Sasabe, N. Perilipins: A diversity of intracellular lipid droplet proteins. Lipids in Health and Disease. 16 (1), 1-11 (2017).
- Chapman, M. A., Mukund, K., Subramaniam, S., Brenner, D., Lieber, R. L. Three distinct cell populations express extracellular matrix proteins and increase in number during skeletal muscle fibrosis. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 312 (2), 131-143 (2016).
- Hillege, M., Galli Caro, R., Offringa, C., de Wit, G., Jaspers, R., Hoogaars, W. TGF-β regulates Collagen Type I expression in myoblasts and myotubes via transient Ctgf and Fgf-2 Expression. Cells. 9 (2), 375 (2020).
- Kafadar, K. A., Yi, L., Ahmad, Y., So, L., Rossi, F., Pavlath, G. K. Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration. Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).
- Batt, J. A. E., Bain, J. R. Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. Journal of Visualized Experiments. (81), e50657 (2013).
- Carlson, B. M. The biology of long-term denervated skeletal muscle. European Journal of Translational Myology. 24 (1), (2014).
- Kennedy, E., et al. Embryonic rat vascular smooth muscle cells revisited - A model for neonatal, neointimal SMC or differentiated vascular stem cells. Vascular Cell. 6 (1), 1-13 (2014).
- Pannérec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials. Development (Cambridge). 140 (14), 2879-2891 (2013).
