Detta protokoll skisserar en metod för att isolera Fibro-adipogenic stamceller (FAPs) och myogena stamceller (MPs) från råtta skelettmuskulaturen. Användning av råttan i muskelskada modeller ger ökad vävnad tillgänglighet från bestod muskel för analysen och en större repertoar av validerade metoder för att bedöma muskelstyrka och gång i fria djur.
Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) är bosatta interstitiella celler i skelettmuskulaturen som, tillsammans med myogena stamceller (MPs), spelar en nyckelroll i muskel homeostas, skada och reparation. Nuvarande protokoll för FAPs identifiering och isolering använder flöde cytometri/fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) och studier som utvärderar deras funktion in vivo hittills har genomförts uteslutande på möss. Råttans större inneboende storlek möjliggör en mer omfattande analys av FAPs i skelettmuskelskada modeller, särskilt i allvarligt bestod muskel eller när utredare kräver betydande vävnad massa att genomföra flera nedströms analyser. Råttan ger dessutom ett större urval av muskelfunktionella analyser som inte kräver djursedering eller uppoffring, vilket minimerar sjuklighet och djuranvändning genom att möjliggöra seriella bedömningar. Flödescytometrin/FACS-protokollen optimerade för möss är artspecifika, särskilt begränsade av egenskaperna hos kommersiellt tillgängliga antikroppar. De har inte optimerats för att separera FAPs från råtta eller mycket fibrotic muskel. Ett flöde cytometry/FACS protokoll för identifiering och isolering av FAPs och MPs från både friska och denervated råtta skelettet muskel utvecklades, förlita sig på differentiell uttryck av ytan markörer CD31, CD45, Sca-1 och VCAM-1. Eftersom råttspecifikt flöde cytometri-validerade primära antikroppar är allvarligt begränsade, utfördes intern konjugation av antikroppen som riktade sig mot Sca-1. Med hjälp av detta protokoll bekräftades framgångsrik Sca-1 konjugation, och flöde cytometrisk identifiering av FAPs och parlamentsledamöter validerades av cell kultur och immunstaining av FACS-isolerade FAPs och parlamentsledamöter. Slutligen rapporterar vi en ny FAPs tidskurs i en långvarig (14 veckor) råtta denervation modell. Denna metod ger utredarna möjlighet att studera FAPs i en ny djurmodell.
Fibro-adipogenic stamceller (FAPs) är en population av bosatta multipotent stamceller i skelettmuskulaturen som spelar en kritisk roll i muskel homeostas, reparation och regenerering, och omvänt också medla patologiskt svar på muskel skada. Som namnet antyder identifierades FAPs ursprungligen som en stampopulation med potential att differentiera sig till fibroblaster och adipocyter1 och påstods vara de viktigaste medlarna för fibro-fet infiltration av skelettmuskulaturen i kronisk skada och sjukdom. Ytterligare studie visade att FAPs dessutom är kapabla till osteogenes och kondrogenes2,3,4. Således noteras de mer allmänt i litteraturen som mesenkymala eller stromala föregångare3,5,6,7,8. Vid akut skelettmuskelskada hjälper FAPs indirekt till regenerativ myogenes genom att tillfälligt föröka sig för att ge en gynnsam miljö för aktiverade muskelsatellitceller och deras nedströms myogena stamceller (MPs) motsvarigheter1,9,10. Parallellt med framgångsrik regenerering genomgår FAPs apoptos och återgår till baslinjenivåerna1,9,10,11. Däremot, i kronisk muskelskada, FAPs åsidosätta pro-apoptotic signaler, vilket resulterar i deras persistens9,10,11 och onormal muskelreparation.
In vivo-studier som utvärderar de cellulära och molekylära mekanismer genom vilka FAPs förmedlar muskelsvar har använt murindjurmodeller hittills1,7,9,10,11,12,13,14. Medan genetiskt konstruerade möss är kraftfulla verktyg för användning i dessa analyser, begränsar djurets lilla storlek vävnadstillgängligheten för studier i långsiktiga lokaliserade skademodeller där muskelatrofi kan vara djupgående, såsom traumatisk denervation. Dessutom kräver mätning av muskelstyrka och fysisk funktion ex vivo- eller in situ-mätningar som kräver att musen avslutas, eller in vivo-metoder som kräver operation och/eller narkos för att möjliggöra utvärdering av muskelkontraktilprestanda15,16,17,18,19,20 . Hos råttor finns väl validerade och globalt använda muskelfunktionella analyser, förutom analyser för mer komplexa motoriska beteenden som gånganalys (t.ex. ischiasfunktionsindex, CatWalk-analys) och utförs i vakna och spontant rörliga djur21,22,23,24 . Detta optimerar dessutom principerna om minimal sjuklighet i djurförsök och antalet forskningsdjur som används. Råttan ger därmed FAPs utredare den extra flexibiliteten av större skadad muskelvolym för protein- och cellulära analyser och förmågan att genomföra seriella bedömningar av muskelkomplex statisk och dynamisk funktionell aktivitet och beteenden, i varningsdjuret.
FAPs har främst identifierats och isolerats från hela muskelprover med hjälp av flödescytometri respektive fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Dessa är laserbaserade analyser som kan identifiera flera specifika cellpopulationer baserat på karakteristiska egenskaper som storlek, granularitet och en specifik kombination av cellyta eller intracellulära markörer25. Detta är mycket fördelaktigt i studien av ett organsystem som skelettmuskulatur, eftersom homeostas och regenerering är komplexa, multifaktoriella processer samordnade av en mängd celltyper. En viktig studie identifierade FAPs, liksom parlamentsledamöter, med hjälp av flöde cytometriska metoder i mus skelettmuskel1. De visade att FAPs är mesenkymal till sin natur, eftersom de saknade ytan antigener specifika för celler från endotel (CD31), hematopoietic (CD45), eller myogena (Integrin-α7 [ITGA7]) ursprung, men uttryckte den mesenkymala stamcellsmarkör sca-1 (stamcell antigen 1)1 och differentieras till fibrogenic och adipogenic celler i kultur. Andra studier visade framgångsrik isolering av mesenkymala stamceller i muskler baserat på uttrycket av en alternativ stamcellsmarkör, trombocyt-härledd tillväxtfaktorreceptor alfa (PDGFRα)2,7,8 och ytterligare analys visade att dessa sannolikt är samma cellpopulation som FAPs3. Faps identifieras nu ofta i flödescytometri med antingen Sca-1 eller PDGFRα som en positiv urvalsmarkör1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31 . Användningen av PDGFRα är dock företräde för mänsklig vävnad, eftersom en direkt mänsklig homolog av murin Sca-1 ännu inte har identifierats32. Dessutom har andra cellytans proteiner rapporterats som markörer för parlamentsledamöter (t.ex. VCAM-1), vilket ger ett potentiellt alternativ till ITGA7 som en indikator på celler av myogen härstamning under FAPs isolering33.
Medan flöde cytometri / FACS är en kraftfull metod för att studera rollen och patogen potential av FAPs i skelettmuskeln1,9,10,11,13,29, det begränsas tekniskt av specificiteten och optimeringen av dess nödvändiga reagenser. Eftersom flödescytometrisk identifiering och isolering av FAPs har utvecklats och utförts i musdjursmodeller1,9,10,11,29, innebär detta utmaningar för forskare som vill studera FAPs i andra modellorganismer. Många faktorer – såsom optimal vävnadsstorlek som ska bearbetas, liksom reagens och/eller antikroppsitalitet och tillgänglighet – varierar beroende på vilken art som används.
Förutom de tekniska hindren för att studera FAPs i en ny djurmodell har de till stor del studerats i en akut, giftig miljö – vanligtvis via intramuskulär kemisk injektion eller kardiotoxin. Utvärdering av den långsiktiga dynamiken hos FAPs är främst begränsad till bedömning i Duchennes muskeldystrofi, med hjälp av mdxmusmodell9,10,11, och modeller av kombination muskelskada såsom massiv rotator manschett tår där samtidig sena transection och denervation utförs på axel muskulatur26,27,28 . Faps svar på den enda förolämpningen av kronisk traumatisk denervation, en vanlig förekomst i arbetsplatsolyckor i tung industri, jordbruk och i födelsetrauma (brachial plexusskada)34,35,36,37 med betydande sjuklighet, har inte karakteriserats lika väl, ofta begränsat till en kortvarig tidsram11,38.
Vi beskriver en metod för att identifiera och isolera FAPs och parlamentsledamöter från friska samt allvarligt atrofiska och fibrotic skelettmuskulaturen i råttan. För det första, identifiering av CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- FAPs och CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ MPs med hjälp av en vävnad matsmältning och flöde cytometri färgning protokoll visas och efterföljande validering av våra resultat utförs genom kultur och immunocytochemical färgning av FACS-isolerade celler. Med den här metoden rapporterar vi också en ny FAPs tidskurs i en långsiktig isolerad denervation skada modell i råttan.
Ett optimerat, validerat FAPs isoleringsprotokoll för råttmuskel är viktigt för forskare som vill studera skademodeller som inte är genomförbara i musen av biologiska eller tekniska skäl. Till exempel är möss inte en optimal djurmodell för att studera kroniska lokala eller neurodegenerativa skador som långsiktig denervation. Biologiskt gör mössens korta livslängd och snabba åldrande det svårt att noggrant avgränsa muskelsequalae på grund av denervation från den förvirrande faktorn åldrande. Ur teknis…
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Flow cytometri Core Facilities vid University of Ottawa och Keenan Research Centre for Biomedical Sciences (KRC), St Michaels Hospital Unity Health Toronto för deras expertis och vägledning i optimering av flödescytometri/ FACS-protokollet som presenteras i detta manuskript. Detta arbete finansierades av Medicine by Design New Ideas 2018 Fund (MbDNI-2018-01) till JB.
5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
10 cm cell culture dishes | Sarstedt | 83.3902 | |
12-well cell culture plate | ThermoFisher | 130185 | |
12 mm glass coverslips, No.2 | VWR | 89015-724 | |
10 mL Syringe | Beckton Dickenson | 302995 | |
15 mL centrifuge tubes | FroggaBio | 91014 | |
20 gauge needle | Beckton Dickenson | 305176 | |
25mL Serological pipette | Sarstedt | 86.1685.001 | |
40µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
50mL centrifuge tubes | FroggaBio | TB50 | |
AbC Total Antibody Compensation Beads | ThermoFisher | A10497 | |
Ammonium Chloride, Reagent Grade | Bioshop | AMC303.500 | |
APC Conjugation Kit, 50-100µg | Biotium | 92307 | |
Aquatex Aqueous Mounting Medium | Merck | 108562 | |
Biolaminin 411 LN | Biolamina | LN411 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Bioshop | ALB001 | |
Calcium Chloride | Bioshop | CCL444.500 | |
Collagenase Type II | Gibco | 17101015 | |
CountBright Plus Absolute Counting Beads | ThermoFisher | C36995 | |
Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902 | |
Dispase | Gibco | 17105041 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Gibco | 11995-065 | (+)4.5 g/L D-Glucose (+)L-Glutamine (+)110 mg/L Sodium Pyruvate |
EDTA | FisherScientific | S311 | |
FACSClean Solution | Beckton Dickenson | 340345 | |
FACSDiva Software | Beckton Dickenson | — | |
FACSRinse Solution | Beckton Dickenson | 340346 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F1051 | |
Flow Cytometry Sheath Fluid | Beckton Dickenson | 342003 | |
FlowJo Software | Beckton Dickenson | — | |
Fluorescent Mounting Medium | Dako | S302380-2 | |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody | Invitrogen | A21424 | |
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A11008 | |
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody | Invitrogen | A21429 | |
Goat Serum | Gibco | 16210-064 | |
Ham's F10 Media | ThermoFisher | 11550043 | (+) Phenol Red (+) L-Glutamine (-) HEPES |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X) | Multicell | 311-513-CL | |
Heat Inactivated Horse Serum | Gibco | 26050-088 | |
Hemocytometer | Reichert | N/A | |
HEPES, minimum 99.5% titration | Sigma | H3375 | |
Horse Serum | ThermoFisher | 16050130 | |
Human Transforming Growth Factor β1 (hTGF-β1) | Cell Signaling | 8915LF | |
Humulin R | Lilly | HI0210 | |
IBMX | Millipore Sigma | I5879 | Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine |
Isopropanol | Sigma | I9516 | Also known as 2-propanol |
Lewis Rat, Female | Charles River Kingston | 004 (Strain Code) | 200-250 grams used |
LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer | Beckton Dickenson | — | |
Microcentrifuge | Eppendorf | EP-5417R | |
MoFlo XDP Cell Sorter | Beckman Coulter | — | |
Mouse Anti-CD31::FITC Antibody | Abcam | ab33858 | Clone TLD-3A12 |
Mouse Anti-CD45::FITC Antibody | Biolegend | 202205 | Clone OX-1 |
Mouse Anti-CD106::PE Antibody | Biolegend | 200403 | Also known as VCAM-1 |
Mouse Anti-MHC Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | N/A | Also known as MF20 |
Mouse Anti-Pax7 Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | N/A | |
Neutral Buffered Formalin, 10 % | Sigma | HT501128 | |
Oil Red O | Millipore Sigma | O0625 | |
PE-Cy7 Conjugation Kit | Abcam | ab102903 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X) | Gibco | 10010-023 | (-)Calcium Chloride (-)Magnesium Chloride |
Potassium Bicarbonate, Reagent Grade | Bioshop | PBC401.250 | |
Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody | Invitrogen | MA5-32347 | FSP-1 also known as S100A4 |
Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody | Abcam | ab203254 | |
Rabbit Anti-Laminin Antibody | Sigma | L9393 | |
Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody | Abcam | ab3526 | |
Rabbit Anti-Sca-1 Antibody | Millipore Sigma | AB4336 | |
Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody | Abcam | ab260043 | Also known as Col1a1 |
Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody | Abcam | ab203491 | |
Recombinant Human FGF-basic | Gibco | PHG0266 | |
Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
Troglitazone | Millipore Sigma | T2573 | |
Tween-20 | Bioshop | TWN510 |