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Medicine

과도 양측 공통 경동맥 폐색에 의해 유도된 허혈성 망막 손상의 뮤린 모델

Published: November 12, 2020 doi: 10.3791/61865
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,4, 1,2
1Laboratory of Photobiology, Keio University School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, Keio University School of Medicine, 3Animal eye care, Tokyo Animal Eye Clinic, 4Tsubota Laboratory, Inc.
* These authors contributed equally

Summary

여기서, 우리는 간단한 봉합사 및 클램프를 사용하여 일시적인 양측 공통 경동맥 폐색에 의한 망막 허혈의 마우스 모델을 설명합니다. 이 모델은 심혈관 비정상으로 인한 망막 허혈의 병리학적 메커니즘을 이해하는 데 유용할 수 있습니다.

Abstract

당뇨병 성 망막병증, 망막 정맥 또는 동맥 및 안구 허혈 증후군의 폐색과 같은 다양한 혈관 질환은 망막 허혈으로 이어질 수 있습니다. 망막 허혈의 병리학 적 메커니즘을 조사하려면 관련 실험 모델을 개발해야합니다. 해부학적으로, 주요 망막 혈액 공급 혈관은 안과 동맥 (OpA) 및 OpA는 일반적인 경동맥의 내부 경동맥에서 유래 (CCA). 따라서 CCA의 중단은 망막 허혈을 효과적으로 유발할 수 있습니다. 여기서, 우리는 6-0 실크 봉합사를 가진 오른쪽 CCA를 묶고 클램프를 통해 2 초 동안 좌측 CCA를 폐색하기 위하여 일시적인 양측 공통 경동맥 폐색(tBCCAO)에 의하여 망막 허혈증의 마우스 모형을 설치하고, tBCCAO가 재발성 기능 장애로 선도하는 급성 망막증증을 유도할 수 있었다는 것을 보여주었습니다. 현재 방법은 수술 바늘과 클램프를 사용하여 수술 기구에 대한 의존도를 줄이고, 중간 뇌동맥 폐색의 마우스 모델에서 흔히 볼 수 있는 예기치 않은 동물 사망을 최소화하기 위해 폐색 시간을 단축하며, 일반적인 망막 허혈성 발견의 재현성을 유지합니다. 이 모델은 마우스의 허혈성 망막병증의 병리학을 조사하기 위해 활용될 수 있으며 생체 내 약물 스크리닝에 더 사용될 수 있다.

Introduction

망막은 시각 기능을 위한 신경 감각 조직입니다. 시각 기능에 상당한 양의 산소가 필요하기 때문에 망막은 신체1에서가장 높은 산소 를 요구하는 조직 중 하나로 알려져 있습니다. 망막은 산소가 혈관을 통해 전달되기 때문에 혈관 질환에 취약합니다. 당뇨병 성 망막병증 및 망막 혈관 (정맥 또는 동맥) 폐색과 같은 다양한 유형의 혈관 질환은 망막 허혈을 유발할 수 있습니다. 망막 허혈의 병리학적 메커니즘을 조사하기 위해, 망막 허혈의 재현 가능하고 임상적으로 관련된 실험 모델은 필요하다고 간주됩니다. 중간 대뇌 동맥 폐색(MCAO)은 내트라루민 필라멘트의 삽입에 의한 실험대뇌 허혈2,3의생체 내 설치류 모델의 개발을 위해 가장 일반적으로 활용되는 방법이다. MCA에 안과 동맥(OpA)의 근접성으로 인해 MCAO 모델은 망막 허혈4,5,6의병리생리학을 이해하는 데 동시에 사용된다. 망막 허혈과 함께 대뇌 허혈을 유도하기 위해, 긴 필라멘트는 전형적으로 일반적인 경동맥 (CCA) 또는 외부 경동맥 (ECA)의 절개를 통해 삽입됩니다. 이러한 방법은 수행하기 어렵고, 수술을 완료하는 데 오랜 시간이 걸리며(한 마우스의 경우 60분 이상), 수술 후 결과에 높은 변이성을 초래할수 있다 7. 이러한 문제를 개선하기 위해 더 나은 모델을 개발하는 것이 중요합니다.

이 연구에서는, 우리는 단순히 짧은 일시적인 양자 CCA 폐색 (tBCCAO)을 바늘과 클램프로 사용하여 쥐의 망막 허혈을 유도하고 망막에서 허혈성 부상의 전형적인 결과를 분석했습니다. 이 비디오에서는 tBCCAO 절차를 시연할 것입니다.

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Protocol

여기에 설명된 모든 방법은 게이오 대학 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. 수술 기구 및 동물의 준비

  1. 자동 클캐브 수술 기구와 70 % 에틸 알코올에 보관하십시오. 새로운 수술 전, 70% 에틸 알코올을 사용하여 수술 기구를 조심스럽게 청소하십시오.
  2. 수술 전, 수술 중 및 수술 후 멸균 상태를 유지하기 위해 특정 병원균(SPF) 실에서 남성 BALB/cAJc1 마우스(6주 전, 26-28kg)를 준비한다.

2. 일시적인 양자 공통 경동맥 폐색 (tBCCAO)

  1. 미다졸람(40 μg/100 μL), 메데토미딘(7.5 μg/100 μL) 및 부안소솔 타르테레이트(50 μg/100 μL)의 조합으로 관내 주사를 통해 마취하에 마우스를넣어8,9. 마우스의 뒤쪽 스킨을 잡고 마우스가 완전히 마취될 때까지 마우스가 눈을 부딪히지 않도록 합니다.
    1. 응답이 없을 때까지 마우스 발가락을 꼬집어 마취의 깊이를 판단하며, 그 중 어떤 방법은 일반적으로 완전한마취(10)를확인하는 데 사용됩니다.
      참고: 일반적으로 생쥐가 잠들기 위해서는 5분 미만이 필요합니다. 전신 마취를위한 적절한 조리법은 기관에 의해 다를 수 있습니다.
  2. 마취 하에 눈의 건조를 방지하기 위해 피부에 0.1 % 정제 된 히알루네이트 안약 용액을 1 방울을 적용하십시오.
  3. 마우스를 뒷면에 놓고 접착제 테이프를 사용하여 마우스의 발을 고정합니다.
  4. 수술 전 70%의 에틸 알코올을 사용하여 마우스의 목 부위를 소독합니다.
    참고: 모피의 추가 클리핑은 후속 피부염증(11,12)을유발할 수 있으므로 수행되지 않았다.
  5. 칼날(도1)으로목의 처상 절개를 수행합니다.
    참고 : 절개는 목, 흉골 및 기관 사이의 중간선에서 만들어져야합니다.
  6. 두 개의 집게를 사용하여 침샘을 조심스럽게 분리하고 이를 동원하여 기본 CCA를 시각화합니다.
  7. 올바른 CCA를 각 진골 신경과 동반 정맥으로부터 조심스럽게 분리하고 구조물에 해를 끼치지 않고 CCA 아래에 6-0 실크 봉합사 2개를 배치합니다. 혈류를 차단하기 위해 두 넥타이를 단단히 묶습니다(도1).
    참고: 시술 중에 작은 정맥이 손상될 수 있습니다. 출혈이 보이는 경우 CCA를 명확하게 시각화하려면 닦아야 합니다.
  8. 왼쪽 CCA를 각각의 진골 신경과 동반정맥으로부터 조심스럽게 찾아내고, 클램프(그림1)에의해 2초 동안 왼쪽 CCA를 폐포한다.
    참고: 클램핑 을 위한 사이트를 표시하기 위해 왼쪽 CCA 아래에 6-0 실크 봉합사 바늘을 배치해야 합니다.
  9. 왼쪽 CCA의 재개 후, 6-0 실크 봉합사에 의해 목의 봉합상처와 세균 감염을 억제하기 위해 목에 항생제(50 μL)를 적용한다.
    참고: 왼쪽 CCA를 다시 열 때 동맥 벽이 손상되지 않도록 클램프를 부드럽게 제거합니다.
  10. 마우스에 0.75 mg/kg의 아티파메졸 염산염을 마우스에 삽입하여 마우스가 깊은 마취에서 신속하게 회복할 수 있도록 돕습니다. 미리 가열 된 패드가있는 마우스 케이지에 마우스를 반환합니다.
    참고: 마우스가 흉골 의상환을 유지하기에 충분한 의식을 되찾을 때까지 마우스를 방치하지 마십시오.
  11. 마우스가 깨어날 때 통증의 관리를 위해 마우스에 0.4 mg/kg의 부차톨타르트를 주입하십시오.
    참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 성공적인 tBCCAO에 대한 첫 번째 힌트로서 마우스의 눈꺼풀 처짐을 관찰할 수있습니다(그림 2).
  12. 안락사의 경우, 마우스에 MMB 혼합물의 3x를 주입하고 실험을 위해 그들을 희생.

3. 일반적인 관찰 (생존율과 눈꺼풀 처진)

  1. 수술 후, 0일째(수술 후), 1, 3, 7일의 모든 사망 원인에 대한 생존율을 확인한다.
  2. 눈꺼풀을 4점 등급 척도로 평가합니다: 1 = 처진 없음, 2 = 가벼운 처진 (~50%), 3 = 심한 처진 (50%), 및 4 = 눈 배출이 심한 처진.

4. 망막 혈액 관류

  1. FITC-dextran(25 mg/mL)을 마우스의 좌심실로 200 μL을 주입하며, 이는 일반적으로 마우스 망막혈관(13,14)의혈액 관류 관찰에 일반적으로 사용된다.
  2. 순환 후 2분 후, 눈을 방출하고 1 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드에 고정합니다. 망막은 이전에 설명된15와같이 신중하게 얻어지고 평평하게 장착되었고, 형광 현미경을 통해 검사하였다.
  3. 4배 배율로 망막 전체 마운트의 사진을 찍고 이전에 설명한16개의병합 분석기를 사용하여 단일로 병합한다.
  4. NIH 피지/ImageJ 소프트웨어의 선박 분석 도구를 통해 perfused 영역을 측정합니다.

5. 웨스턴 블롯

  1. tBCCAO 후 3 시간 및 6 시간, 마우스의 눈을 얻고 즉시 망막을 분리하기 위해 차가운 PBS를 포함하는 페트리 접시로 전송.
  2. 망막의 격리 후, 이전에 설명 된 바와 같이, 서쪽 블로팅을 수행9.
  3. 저산소유도인자-1α(HIF-1α; 일반 저산소증 마커)와 hrP-접합 이차 항체의 배양이 이어지는 β-액틴(내부 적재 제어)에 대한 항체를 배양한다. 화학 발광을 통해 신호를 시각화합니다.

6. 정량적 PCR (qPCR)

  1. tBCCAO 후 6, 12 및 24시간 후, 이전에 설명된 바와 같이 qPCR에 대해 얻은 망막을처리한다.
  2. 실시간 PCR 시스템을 통해 qPCR을 수행합니다. 사용되는 프라이머는 표 1에나열됩니다. ΔΔCT 메서드에 의해 서로 다른 전사체 수준 간의 접기 변화를 계산합니다.

7. 면역 화학 (IHC)

  1. tBCCAO 후 3 일, 마우스의 눈을 얻고 파라핀에 포함.
  2. 눈 섹션을 얻기 위해 마이크로 토메에 의해 파라핀 임베디드 눈을 잘라.
  3. 앞서 설명한 바와 같이 5 μm 두께의 눈 단면을 분리하고염색하였다.
  4. 신경교 세동 산성 단백질 (GFAP; 망막에 있는 성상 세포 및 뮐러 세포를 위한 믿을 수 있는 마커)에 대한 항체와 함께 배양한 다음 알렉사 플루어 555-공주 이차 항체의 배양에 선행됩니다.
  5. 망막에 핵을 염색하기 위해 DAPI (4′,6-디아미드노-2-페닐린돌)를 사용합니다. 형광 현미경을 통해 신호를 시각화합니다.
  6. 이전에 설명한 바와 같이 4점 등급 척도로 형태 점수를 평가하였고,13,18: 신호 없음, 1 = 신경절 세포 층(GCL)에서 몇 가지 양성 신경교 말발, 2 = GCL에서 외부 핵층(ONL)까지 도달하는 몇 가지 라벨이 붙은 공정, 그리고 3 = GCL에서 ONL로 도달하는 가장 라벨이 붙은 공정이 거의 없다.

8. 전기 전하 (ERG)

  1. tBCCAO 후 3 및 7일 후, 이전에 설명한 바와 같이 간즈펠트 돔, 획득 시스템 및 LED 자극기를 사용하여 ERG를수행한다.
  2. 하룻밤 어두운 적응 에 따라, 희미한 붉은 빛 아래 MMB의 조합으로 마우스를 마취.
  3. 0.5% 열대아미드와 0.5% 페닐레프린의 혼합 용액을 사용하여 동공을 넓힙시다.
  4. 활성 전극을 콘택트 렌즈에 놓고 참조 전극을 입에 놓습니다.
  5. 각 동물의 양눈에서 ERG 응답을 얻습니다.
  6. 다양한 자극으로 어두운 적응하에 스쿠토피 응답을 기록합니다.
  7. 기준선에서 가장 낮은 파도 지점까지 의 진폭을 측정합니다.
  8. 파도의 가장 낮은 지점에서 b-wave의 피크까지 b-wave의 진폭을 측정합니다.
  9. 열 패드를 사용하여 시술 중에 모든 마우스를 따뜻하게 유지하십시오.

9. 광학 일관성 단층 촬영 (10월)

  1. tBCCAO 후 2 주, SD-OCT 시스템을 사용하여 OCT를 수행, 이전에보고 된 대로8,9.
  2. 측정을 위해, 피험자 마우스는 0.5% 열대성 및 0.5% 페닐레프린의 혼합 용액에 의한 mydriasis, 및 MMB의 혼합물에 의한 전신 마취에 의해.
  3. en-face 스캔의 적도 조각에서 B 스캔 이미지를 가져옵니다.
  4. 시신경 헤드에서 망막 0.2, 0.4 및 0.6 mm에서 망막을 검사하십시오.
  5. 망막 신경 섬유 층(NFL)에서 외부 제한 막(ELM)으로 망막 두께를 측정하고 측정된 값의 평균을 개별 마우스의 망막 두께로 고려한다.
  6. 결과를 거미 다이어그램으로 플롯합니다.

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Representative Results

FITC-dextran의 전신 순환 후 2분 동안, 가짜 작용 마우스 및 tBCCAO 수술 마우스에서 좌우 망막의 망막 혈관을 검사하였다(보충도 1). FITC-dextran은 tBCCAO 수술 마우스에서 샴 작동 마우스와 왼쪽 망막의 두 망막모두에서 완전히 보였으며 tBCCAO 수술 마우스의 오른쪽 망막에서 부분적으로 검출되었습니다.

tBCCAO 후, 눈꺼풀 처진 검사(그림 2). 오른쪽 눈은 온화한 나타났다 (점수 2; 75%) 심한 눈꺼풀 (점수 3 및 4; 25%) 처진, 왼쪽 눈은 처져 없는 동안 (점수 1; 93.75%) 마우스 1개를 제외한 (점수 2, 6.25%). tBCCAO 수술 마우스에서 눈 배출로 처진 심한 눈꺼풀이 상당히 관찰되지는 않았지만, 우리는 이 표현형에 대한 마우스 1개(점수 4; 6.25%)를 볼 수 있었다.

조직에서 감소된 산소 상태는 EPO, VEGF 및 BNIP319,20,21과같은 다수의 저산소 반응성 유전자의 HIF-1α 및 유도의안정화로이어집니다. 우선, 일반적인 저산소마커 HIF-1α를 이용한 분자 생물학적 저산소증은 서부블로팅(도 3)을통해 평가하였다. HIF-1α 발현이 증가하여 tBCCAO 후 오른쪽 망막 3 및 6시간 후에 현저히 관찰되었다. 다음으로, 저산소반응 유전자의 발현은 qPCR(보충도2)을통해 평가되었다. tBCCAO 후 6시간 후에 저산소반응 유전자 발현에 큰 변화는 없었습니다. tBCCAO 후 12시간 후, Binp3 발현이 현저히 증가하고 에포 발현이 약간 증가하여 오른쪽 망막에 나타났습니다. tBCCAO 후 24 시간, 우리는 또한 통계적으로 유의하지 않았지만 오른쪽 망막에서 Epo 발현의 약간의 증가를 찾을 수 있었다. Vegf 발현은 tBCCAO 작동 마우스에서 6 시간에서 24 시간까지 변경되지 않았다.

망막 반응성 글리오시스는 tBCCAO(도4)후 3일 후, 성상세포 및 뮐러 세포와 같은 글리아가 망막 허혈(22)과 밀접한 관련이 있는 것으로 조사되었다. GFAP는망막(23)에서성상세포 및 뮐러 세포의 검출을 위해 널리 사용되어 왔다. 오른쪽 망막에 있는 GFAP 라벨링에 대한 형태학 점수의 평균은 tBCCAO 수술 마우스에 있는 sham 조작 마우스및 좌망막에 있는 두 망막 중 가장 높았습니다. GFAP 발현의 국소화에 기초하여, GFAP 라벨링의 형태에 대한 변화는 뮐러 세포의 활성화를 반영하는 것으로 여겨진다.

ERG는 tBCCAO(그림 5)후에망막 기능 장애를 검사하기 위하여 이용되었습니다. 오른쪽 눈의 b-wave의 진폭은 tBCCAO 후 3 일과 7 일 극적으로 감소했습니다. 그러나 오른쪽 눈의 파도진폭은 크게 변하지 않았습니다. 왼쪽 눈에 관해서는, 우리는 a-와 b-waves(보충 도 3)의진폭에 어떤 변화를 볼 수 없습니다.

tBCCAO(도6)의후 망막 두께의 변경을 결정하기 위해 OCT를 수행했습니다. 오른쪽 눈의 망막 두께는 tBCCAO 후 2 주 극적으로 증가, tBCCAO와 sham 조작 마우스 사이의 왼쪽 눈의 망막 두께에 차이가 없었다 동안.

Figure 1
그림 1: 윌리스 원에서 모델 절차 및 혈액 순환의 회로도. 회로도 그림은 tBCCAO 유도망막 허혈성 마우스 모델 절차 및 망막에 혈액 순환을 보여 주었다. CCA, ECA, ICA, PCA 및 OpA는 각각 일반적인 경동맥, 외부 경동맥, 내부 경동맥, 후방 통신 동맥 및 안과 동맥을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: tBCCAO 후 처진 눈꺼풀. 눈꺼풀 처진의 심각도는 기준 이미지에 따라 4점 등급으로 평가되었다: 1 = 처진 없음, 2 = 가벼운 처진 (~50% 처진), 3 = 심한 처진 (50% 처진 이상), 및 4 = 눈 배출이 심한 처핑. 눈꺼풀 처진 tBCCAO 후 관찰 하 고 실험 관찰 하는 동안 유지 되었다. 결과(sham: n = 10, tBCCAO: n = 16)는 분산점 플롯으로 플롯하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
도 3: tBCCAO 후 HIF-1α 안정화. 대표적인 면역블롯 및 정량분석(시간 3; sham: n= 3, tBCCAO: n= 6및 시간 6; 샴 및 tBCCAO: n= 6) HIF-1α 및 β-Actin에 대한 HIF-1α가 tBCCAO 후 오른쪽 망막3 및 6시간 후에 안정화된 것으로 나타났다. *P&05. 데이터는 학생의 t-test를사용하여 분석되었으며 ± 표준 편차로 평균으로 제시되었습니다. L과 R은 각각 좌우 망막을 지지합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: tBCCAO 후 반응성 글리오시스. 망막의 대표적인 처질 섹션(sham: n = 4, tBCCAO: n = 4) 및 GFAP 라벨링(red)의 정량적 분석은 형태 점수(0-3)에 의해 주로 NFL+GCL에서 제한되는 GFAP 라벨링이 GCL에서 ONL(흰색 화살표)으로 GCL에서 오른쪽 망막으로 확장된 것으로 나타났다. 스케일 바, 50 μm. DAPI(파란색)는 망막에서 핵을 염색하는 데 사용되었다. NFL, GCL, IPL, INL 및 ONL은 각각 신경 섬유 층, 신경절 세포 층, 내부 플렉시폼 층, 내부 핵층 및 외부 핵층을 나타낸다. 데이터는 학생의 t-test를사용하여 분석되었으며 25번째 및 75번째 백분위수인 중간체범위로 제시되었습니다. *P&05. L과 R은 각각 좌우 망막을 지지합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: tBCCAO 후 오른쪽 눈의 시각 기능 장애. (A)tBCCAO 후 3일과 7일 후에 는 암흑 적응 ERG의 대표적인 파형이 수행되었다. 자극 강도 (cd.s/m2):0.005. (B)정량적 분석은 오른쪽 눈에서 b파의 진폭이 감소한 것으로 나타났다(sham: n= 5, tBCCAO: n = 6) 파도의 진폭은 변하지 않았다. *P&05, **P< 0.01. 데이터는 학생의 t-test를사용하여 분석되었으며 ± 표준 편차로 평균으로 제시되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: tBCCAO 후 망막 두께의 변화. sham-및 tBCCAO 작동 망막 및 정량 분석에서 대표적인 OCT 이미지는 오른쪽 망막에서 망막 두께가 증가한 것으로 나타났습니다 (sham: n = 4, tBCCAO: n = 8). 왼쪽 망막에서 망막 두께에 변화가 없었다 (샴 : n = 4, tBCCAO : n = 8). 스케일 바는 각각 200(위) 및 100(하부) μm입니다. *P&05. 다이어그램의 수평 축의 값은 녹색 선에서 검출된 시신경 헤드(0)로부터 0.2, 0.4 및 0.6mm 먼 거리입니다. 데이터는 양방향 ANOVA를 사용하여 분석되었고, 그 다음에는 본페로니 포스트 호크 테스트가 뒤따랐습니다. 거미 다이어그램은 표준 편차가 ± 의미로 제시되었습니다. NFL, INL, ONL 및 ELM은 각각 신경 섬유 층, 내부 핵층, 외부 핵층 및 외부 제한 멤브레인입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 도 1: tBCCAO 후 망막 혈액 관류. 대표적인 망막 플랫 마운트 이미지(각 이미지의 배율 가 높은) FITC-dextran 순환 및 정량적 분석 후 2분 후 tBCCAO 작동 마우스의 샴 작동 마우스와 왼쪽 망막모두에서 전체 관류를 관찰할 수 있는 것으로 나타났다. 그러나, tBCCAO 수술 마우스에 있는 오른쪽 망막은 부분적인 혈액 관혈을 보였다. 데이터는 학생의 t-test를사용하여 분석되었으며 ± 표준 편차로 평균으로 제시되었습니다. L과 R은 각각 좌우 망막을 지지합니다. 스케일 바는 각각 800 μm과 400 μm입니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 도 2: tBCCAO 후 저산소 반응 유전자의 발현. 정량분석은 tBCCAO 후에 통계적인 유의성 12 시간 가진 오른쪽 망막에 있는 Bnip3 mRNA 발현에 있는 일시적인 증가를 보여주었습니다. Epo mRNA 발현은 tBCCAO 후 24시간 동안 오른쪽 망막에서 증가하는 경향을 보였지만, 그 값은 샴 조작 된 오른쪽 망막과 비교하여 크게 다르지 않았습니다. **P&01. 데이터는 학생의 t-test를사용하여 분석되었으며 ± 표준 편차로 평균으로 제시되었습니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 도 3: tBCCAO 후 왼쪽 눈의 시각 기능. 정량적 분석은 왼쪽 눈의 a-와 b-waves의 진폭에 변화가 없음을 보여주었습니다 (sham: n = 5, tBCCAO: n = 6). P > 0.05. 데이터는 학생의 t-test를사용하여 분석되었으며 ± 표준 편차로 평균으로 제시되었습니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 도 4: C57BL6 및 BALB에서 tBCCAO 후 생존율. 카플란 마이어 생존 곡선은 거의 모든 마우스가 C57BL6 마우스에서 tBCCAO 후 3 일 이내에 사망 것을 입증했다. BALB 마우스에 관해서, tBCCAO에서 더 긴 클램핑 시간은 갑작스럽고 가혹한 동물 죽음을 유도합니다 (7 일째, 20 초: 10%, 10 초 : 20%, 2 초: 81%, 0 초: 95%). 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 도 5: 일방적인 CCAO 후 HIF-1α 안정화. HIF-1α 및 β-Actin에 대한 대표적인 면역블롯 및 정량 분석(sham: n = 3, 일방적인 CCAO: n =3)은 HIF-1α가 일방적인 CCAO 후 3시간 후에 망막에서 안정화되지 않은 것으로 나타났다. P > 0.05. 데이터는 학생의 t-test를사용하여 분석되었으며 표준 편차가 ± 의미로 제시되었습니다. L과 R은 각각 좌우 망막을 지지합니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 도 6: 긴 클램핑 시간으로 tBCCAO 후 처진 심한 눈꺼풀. tBCCAO의 10초는 4점 등급 척도로 평가된 심한 눈꺼풀 처짐을 유도했습니다: 1 = 처짐 없음, 2 = 가벼운 처짐(~50%), 3 = 심한 처짐(50%), 및 4= 눈 배출이 심한 처짐( 도 2에설명된 바와 같이) . 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

연구에서, 우리는 tBCCAO, 간단한 봉합사 및 클램프를 사용하여, 망막 허혈및 동반망막 기능 장애를 유도할 수 있었다는 것을 보여주었습니다. 더욱이, 망막 허혈의 마우스 모델 의 개발을 위한 현재 의정서가 망막 허혈성 상해 모델2,3,7의개발을 위한 다른 이전 프로토콜과 비교하여 더 쉽고 빠르다는 것을입증했습니다.

해부학적으로, 좌우 뇌동맥은 윌리스의 원에 부수적인 혈액 공급을 제공하는 후방 통신 동맥(PCA)을 통해 연결될 수 있으며, 개별 혈관의 폐색 또는 협착으로부터의 흐름 중단으로부터의 혈류 중단에 대하여 중추신경계에 적절한 혈액 공급을 유지한다(도1). Lee et al al. 입증된 망막 혈액 관류는 C57BL6 마우스13에서영구 일방적인 CCAO에 의해 10분 지연될 수 있다(이는 입실망막내의 망막 혈중 전체 봉쇄가 아님)일 수 있다. 이것은 CCAO에 의한 망막 허혈의 유도가 윌리스의 원에 있는 부수적인 순환의 조건과 밀접하게 연관된다는 것을 의미합니다. C57BL6는 BCCAO에 의한 뇌허혈에 가장 취약한 마우스 균주로 알려져 있으며, 현재 연구의 마우스 균주BALB(26)를포함한 7개의 마우스 균주 중 에서. C57BL6에 있는 윌리스의 불완전한 원 때문에, 두 CCA에서 두뇌 혈액 공급의 중단은 중추 신경계에 있는 가혹한 손상을 유도하고, 마침내 죽음으로 이끌어 냅니다. 또한, 우리의 예비 연구에서, 우리는 거의 모든 마우스로 C57BL6에서 tBCCAO를 유도하는 데 실패 (약 80%) 수술 후 3일 이내에사망했다(보충도 4). 따라서, 우리는 우리의 현재 연구를 위해 다른 마우스 변형 BALB에 tBCCAO를 적용.

우리의 BALB 모형에 있는 심각한 망막 허혈성 상해를 유도하기 위하여는, 오른쪽 CCA는 영구적으로 결합되고 좌측 CCA는 과도성 폐색을 통해 급성 망막 허혈성 응력을 강화하기 위하여 적용되었습니다. 이는 마우스가윌리스(27)의완전한 원을 가진 쥐와 달리 영구 BCCAO에 의해 유도된 허혈성 스트레스를 용인할 수 없기 때문이다. 다음으로, 폐색 시간이 중추 신경계에 허혈성 부상에 영향을 미치고 실험 모델28,29의생존율과 직접 연결되는 주요 요인 중 하나로 간주되었기 때문에 폐색 시간을 최적화하려고 시도했습니다. 우리는 BALB 마우스의 생존율이 폐색 시간 의존방식으로 감소한다는 것을 것을을 발견했습니다(보충 도 4). 10초 이상 왼쪽 CCA의 폐색은 사망률이 50이상인 반면, 왼쪽 CCA의 폐색은 2초 동안 또는 폐색(또는 일방적인 CCAO)이 상대적으로 높은 생존율(80% 이상)을 보였다. 따라서, 우리는 효율적이고 비용 효율적인 실험을 사용할 수 없기 때문에 추가 실험에 대한 그룹 (10 및 20 초)를 제외. 다음으로, 우리는 2 초 동안 왼쪽 CCA의 폐색또는 폐색없음 (또는 일방적인 CCAO)가 망막 저산소증을 유도할 수 있는지 여부를 조사했습니다. HIF-1α는 저산소 반응에서 작동하는 주요 레귤레이터이며 저산소조건(30)에서안정화된다. 이와 관련하여, HIF-1α 안정화는 저산소증에 대한 일반적인 분자 생물학적 마커로서 사용되어 왔다. 우리는 일방적 인 CCAO(보충 도 5)의그룹에서 망막에서 HIF-1α 안정화를 검출 할 수 없었다. 흥미롭게도, 우리는 tBCCAO(도 3)의2 초 의 그룹에서 HIF-1α 안정화를 검출 할 수 있었다. 이것은 망막 저산소 응력이 BALB 마우스에 있는 tBCCAO의 2 초에 의해 유도될 수 있었다는 것을 암시합니다. 따라서, HIF-1α 안정화를 통해 망막 허혈의 수술 및 유도 후 높은 생존율에 기초하여 우리의 연구를 위해 2 초 의 클램핑 시간이 최종적으로 선택되었다.

오른쪽 CCA는 tBCCAO 수술 마우스에서 영구적으로 가려졌지만, FITC-dextran의 전신 순환 후 2 분 오른쪽 망막에서 혈액 관류가 부분적으로 검출되었다(보충 도 1). 더욱이, 우리는 HIF-1α 안정화에서의 변경이 일방적인 CCAO 작동 BALB 마우스에서 오른쪽 망막에서 검출되지 않았다는 것을 것을을 발견했습니다. 이러한 현상은 윌리스 원을 통한 부수적 순환의 영향으로 망막에 혈액 공급을 유지함으로써 설명될 수있다(도 1). 우리는 명확하게 오른쪽 망막에 혈액 관류에 왼쪽 일시적인 CCAO의 효과를 이해할 수 없었지만, 영구 오른쪽 CCAO와 함께 일시적인 왼쪽 CCAO는 tBCCAO 후 오른쪽 망막에서 HIF-1α 발현의 중요한 변화에 의해 입증된 바와 같이 오른쪽 망막에 있는 급성 저산소 모욕을 높일 수 있습니다(그림 3). 또한, 마우스의 생존율은 왼쪽 CCA의 폐색 시간에 의존하였다. 함께 촬영, 망막 허혈성 스트레스의 강도왼쪽 CCAO를 통해 제어 될 수있다.

처진 눈꺼풀의 표현형은 중증 신경질환, 특히 허혈성뇌졸중(31,32)의징후 또는 병리학적 증상으로 제안되고 있다. 처진 눈꺼풀과 관련된 근육은 레바터 palpebrae우월성(33)이다. 이 근육은 OpA에서 파생 된 가지 중 하나 인 측면 팔페브랄 동맥에 의해 공급됩니다. 따라서 망막을 공급하는 OpA가 영향을 받으면 눈꺼풀이 처져 있는 것을 볼 수 있었습니다. 눈꺼풀 처진 MCAO 마우스 모델(34)에서관찰되었다 34, 이는 또한 우리의 tBCCAO 모델에서 재현되었다. 더욱이, 우리는 왼쪽 CCA의 폐색 시간이 더 오래 걸리면 눈꺼풀 처짐이 심해진다는 것을 설명했습니다(도 2 및 보충 도 6). 이것은 눈꺼풀 처짐의 엄격 (간접적으로 망막 허혈성 응력의 강도로 불린) 왼쪽 CCA의 폐색 시간에 의존할 수 있다는 것을 의미합니다.

망막 기능 장애는쥐35 및 BCCAO 쥐에서 BCCA의 협착을 포함하는 망막 허혈성 망막병증에서 볼 수있는 결과 중 하나입니다36. 우리는 b파의 진폭이 tBCCAO 작동 마우스에서 감소한다는 것을 것을을 발견했습니다. 몇몇 이전 연구는 MCAO가 또한 수술 후 b-wave의 진폭감소를 일으켰다는 것을 보여주었다37,38. b-wave는 양극성 세포 및 뮐러세포(39)를포함하는 망막 내층에서 세포의 생리적 상태를 반사한다. 더욱이, 뮐러 세포에 의한 반응성 글리오시스는 tBCCAO 후 내부 망막 층에서 검출되었다. 이 결과는 MCAO 모델40,41 및 기타 CCAO모델(13,42)에서도재현된다. 종합하면, 그것은 내부 망막 기능 장애 tBCCAO에 의해 유도 될 수 있음을 의미. 망막 두께는 급성 망막 허혈(43,44)에서일시적으로 증가하는 것으로 보고되었다. 우리는 또한 tBCCAO 수술 마우스에서 이 사실 인정을 재현했습니다. 이 데이터는 tBCCAO에 의한 혈액 순환의 손상이 망막에 도달하고 마지막으로 망막 층에 영향을 미칠 수 있었다는 것을 보여줍니다.

일관된 결과를 위해, 수술 절차의 마취 시간 및 길이뿐만 아니라 실험 모델의 무게와 나이 및 수술 중 및 수술 후의 체온과 같은 다른 요인은45표준화되어야합니다. 특히, 실험 관찰 기간 동안 마우스의 체온을 유지하기 위해서는 주의가 필요하다. 이것은 저체온증이 전침 효과를 가지고 tBCCAO46에의해 허혈성 효과를 방해 할 수 있기 때문이다. 실험에서 마우스의 정확한 체온을 측정할 수는 없었지만, 쥐가 충분한 의식을 되찾을 때까지 쥐를 따뜻하게 하기 위해 가열 패드를 사용했습니다. 더욱이, 우리는 통제할 수 없는 요인의 잠재적인 혼란 효력을 통제하기 위하여 가짜 작동마우스와 tBCCAO 작동마우스를 비교했습니다.

마우스 균주는 tBCCAO에 의한 망막 허혈성 상해를 유도하는 추가 중요한 가변 요인이 될 수 있습니다. 마우스 긴장에서 윌리스의 원의 실질적인 변화는 망막 이세미아(47)를 포함하여 뇌 허혈의 원치 않는 감소 또는 유도귀착될 수 있고, 따라서 결과의 변이성으로 이끌어 낼 수 있었습니다. 클램핑 시간의 조정은 마우스의 그밖 긴장이 적용될 필요가 있을 때 성공적인 tBCCAO 유도한 허혈성 망막증을 위해 추천됩니다.

일반적으로 뇌졸중이나 다른 뇌 손상의 사건은 변함없이 일시적 또는 영구적 인 비슨 손실(48)과동반됩니다. 현재까지 MCAO 마우스 모델은 뇌졸중 연구에 널리 사용됩니다. OpA는 MCA의 기원에 근접유래로, MCA에 있는 혈류에 있는 어떤 방해든지 망막에 흐름을 방해합니다. 망막 허혈은 먼저 MCAO37에의해 쥐에서 입증되었다. 나중에, 동일한 망막 허혈성 모델이마우스(49)에적용되었다. 그러나, 절차에 대 한, 폐 색 60 분 이상 소요 하 고 폐 색 사이트를 찾는 것은 매우 어려운 MCA는 뇌 내부 깊은 묻혀. 또한 MCAO의 필라멘트 크기와 삽입 길이는 수술의 성공을 크게 결정합니다. 그 추가 가변요인은 수술 후에 허혈성 결과의 변성을 유도합니다. tBCCAO와 MCAO 사이에 직접 비교 연구가 필요하지만, 우리는 이 연구에서 실험 모델의 유익한 특징을 설명했습니다: 짧은 폐색 시간, 간단한 실험 절차 및 접근성이 높은 폐색 사이트. 이 모델은 MCAO 모델에서 볼 수 있는 문제를 해결할 수 있습니다.

망막 허혈의 마우스 모델의 사용은 망막 허혈성 상해를 공부하기위한 큰 이점이 있지만,이 접근 방식에 대한 제한은 남아있다. 목에 외과 절개, 봉합사를 가진 오른쪽 CCA에 있는 타액 선지 및 폐색의 분리는 절차를 위해 적용되어야 하기 때문에, 동반된 조직 중단은 체계적으로 또는 적어도 현지에서 관련있는 염증을 불러 올릴 수 있습니다. 이 관심사는 모든 수술 단계가 모두 tBCCAO 없이 진행되는 가짜 수술 마우스를 사용하여 부분적으로 해결되었습니다. 또 다른 문제는 수술 중과 수술 후에 발생하는 통증을 관리하는 요구 사항입니다. 우리의 연구에서, 마우스의 고통을 방지하기 위해 통증 관리는 phenanthrene 시리즈의 합성 유래 오피오이드 작용제 - 길항제 진통, 부안소졸 타르타르트 용액의 주입을 통해 적용되었다. 다양한 유형의 마취제와 진통제를 사용하면 망막 허혈에 대한 tBCCAO의 영향을 방해할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요할 수 있습니다. 이 접근법에 대한 또 다른 제한 (현재 사용되는 다른 모델의 접근 방식과 함께) 인간의 심장 혈관 망막 장애와 관련된 병리학의 완벽한 시뮬레이션을 제공하지 않는다는 것입니다. 현재까지, 이러한 실험에 사용되는 마우스 모델은 주로 당뇨병(50)과같은 대사 증후군을 가진 인간에서 허혈성 망막증의 기초가되는 동형 병으로 고통받지 않는다. 현재 마우스 모형에 존재하지 않는 이러한 합병증은 허혈성 망막증의 발달을 위한 병리학적인 통로에 부정적인 시너지 효과를 가질 수 있었습니다. 따라서 tBCCAO 마우스 모델을 포함하여 현재 사용되는 실험 모델의 결과를 해석할 때 이를 고려해야 합니다. 인간에서 허혈성 망막증의 병리학적 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해, 우리의 모델은 허혈성 당뇨병 망막증의 발달을 위한 연쇄상 조토신 주입51 또는 고지방 규정식 보충52와 같은 그밖 병리학적인 요인과 결합될 수 있습니다. 마침내 tBCCAO 수술마우스에서 망막 혈액 관류가 감소되었음에도 불구하고 오른쪽 망막에 대한 혈중 수분에 대한 좌측 과도 CCAO의 효과를 명확하게 이해할 수 없었습니다. 이 문제는 일반적으로 폐색이 일어났고 허혈이 실시간으로53,54에서발생했는지 확인하는 데 사용되는 레이저 도플러를 사용하여 해결 될 수있다. 이 기술은 윌리스 원의 부수적 순환에 관한 개별 tBCCAO 작동 마우스에서 망막 허혈의 더 나은 이해를 위해 이용될 수 있었습니다.

이러한 한계에도 불구하고, 여기에 설명된 우리의 tBCCAO 방법은 마우스에 있는 망막 허혈을 생성하는 효과적인 접근을 나타냅니다. tBCCAO에 의한 망막 변경을 공부하는 것은 인간에 있는 허혈성 망막병증의 병리학적인 기계장치를 해명하는 것을 돕습니다. 또한, 우리는 tBCCAO 마우스 모델이 생체 내 약물 검사에 사용될 수 있기를 바랍니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이 작품은 과학연구보조금(KAKENHI)(18K09424)과 구리하라 도시히데, 20K18393, 미와 유키히로(MEXT)가 지원했다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atipamezole hydrochloride Zenoaq Antisedan For anti-anesthesia
Applied Biosystems 7500 Fast Applied Biosystems - For qPCR
Butorphanol tartrate Meiji Seika Pharma Vetorphale For anesthesia
BZ-II Analyzer KEYENCE - For an image merge
BALB/cAJc1 CLEA - Mouse strain
β-Actin (8H10D10) Mouse mAb CST 3700 For western blot
Clamp Forcep World Precision Instruments WPI 500451 For surgery
Dumont forceps #5 Fine Science Tools 11251-10 For surgery
DAPI solution Dojindo 340-07971 For IHC
Envisu SD-OCT system Leica R4310 For OCT
FITC-dextran Merk FD2000S For retinal blood perfusion
Fluorescence microscope KEYENCE BZ-9000 For fluorescence detection
Gatifloxacin hydrate Senju Pharmaceutical Gachifuro For anti-bacterial infection
GFAP Monoclonal Antibody (2.2B10) Thermo 13-0300 For IHC
Heating pad Marukan RH-200 For surgery
HIF-1α (D1S7W) XP Rabbit mAb CST 36169 For western blot
ImageQuant LAS 4000 mini GE Healthcare - For chemiluminescence
Midazolam Sandoz K.K SANDOZ For anesthesia
Microtome Tissue-Tek TEC 6 Sakura - For sectioning
Medetomidine Orion Corporation Domitor For anesthesia
Needle holder Handaya HS-2307 For surgery
PuREC MAYO Corporation - For ERG
Scissor Fine Science Tools 91460-11 For surgery
Sodium hyaluronate Santen Pharmaceutical Hyalein For eye lubrication
Tropicamide/Penylephrine hydrochloride Santen Pharmaceutical Mydrin-P For mydriasis
6-0 silk suture Natsume E12-60N2 For surgery

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