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Un modelo murino de lesión retiniana isquémica inducida por la oclusión bilateral transfronteriza de la arteria carótida común

Published: November 12, 2020 doi: 10.3791/61865
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,4, 1,2
1Laboratory of Photobiology, Keio University School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, Keio University School of Medicine, 3Animal eye care, Tokyo Animal Eye Clinic, 4Tsubota Laboratory, Inc.
* These authors contributed equally

Summary

Aquí, describimos un modelo de ratón de isquemia retiniana por oclusión bilateral transitoria de la arteria carótida común bilateral utilizando suturas simples y una abrazadera. Este modelo puede ser útil para entender los mecanismos patológicos de la isquemia retiniana causados por anomalías cardiovasculares.

Abstract

Diversas enfermedades vasculares como la retinopatía diabética, la oclusión de venas o arterias retinianas y el síndrome isquémico ocular pueden conducir a isquemia retiniana. Para investigar los mecanismos patológicos de la isquemia retiniana, es necesario desarrollar modelos experimentales relevantes. Anatómicamente, un vaso principal de suministro de sangre de retina es la arteria oftálmica (OpA) y OpA se origina en la arteria carótida interna de la arteria carótida común (CCA). Por lo tanto, la interrupción de la CCA podría causar efectivamente isquemia retiniana. Aquí, establecimos un modelo de ratón de isquemia retiniana mediante oclusión bilateral transfronteriza de la arteria carótida común (tBCCAO) para atar la CCA derecha con suturas de seda 6-0 y ocluir la CCA izquierda transitoriamente durante 2 segundos a través de una abrazadera, y demostramos que tBCCAO podría inducir isquemia retiniana aguda que conduce a disfunción retiniana. El método actual reduce la dependencia de los instrumentos quirúrgicos utilizando únicamente agujas quirúrgicas y una abrazadera, acorta el tiempo de oclusión para minimizar la muerte inesperada de animales, que a menudo se ve en modelos de ratón de oclusión arterial cerebral media, y mantiene la reproducibilidad de los hallazgos isquémicos retinianos comunes. El modelo se puede utilizar para investigar la fisiopatología de las retinopatías isquémicas en ratones y más se puede utilizar para la detección de fármacos in vivo.

Introduction

La retina es un tejido neurosensorial para la función visual. Dado que se necesita una cantidad sustancial de oxígeno para la función visual, la retina se conoce como uno de los tejidos más exigentes de oxígeno en el cuerpo1. La retina es susceptible a enfermedades vasculares, ya que el oxígeno se administra a través de los vasos sanguíneos. Varios tipos de enfermedades vasculares, como la retinopatía diabética y la oclusión de los vasos sanguíneos retinianos (venas o arterias), pueden inducir isquemia retiniana. Para investigar los mecanismos patológicos de la isquemia retiniana, se consideran necesarios modelos experimentales reproducibles y clínicamente relevantes de isquemia retiniana. La oclusión arterial cerebral media (MCAO) mediante la inserción de un filamento intraluminal es el método más utilizado para el desarrollo de modelos de roedores in vivo de isquemia cerebral experimental2,3. Debido a la proximidad de la arteria oftálmica (OpA) a MCA, los modelos MCAO también se utilizan simultáneamente para entender la fisiopatología de la isquemia retiniana4,5,6. Para inducir la isquemia cerebral junto con la isquemia retiniana, los filamentos largos se insertan típicamente a través de la incisión de la arteria carótida común (CCA) o la arteria carótida externa (ECA). Estos métodos son difíciles de realizar, requieren mucho tiempo para completar la cirugía (más de 60 minutos para un ratón), y conducen a altas variabilidades en los resultados después de la cirugía7. Sigue siendo importante desarrollar un mejor modelo para mejorar estas preocupaciones.

En este estudio, simplemente utilizamos una breve oclusión bilateral transitoria de CCA (tBCCAO) con agujas y una abrazadera para inducir isquemia retiniana en ratones y analizamos los resultados típicos de lesiones isquémicas en la retina. En este vídeo, daremos una demostración del procedimiento tBCCAO.

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Protocol

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Escuela de Medicina de la Universidad keio.

1. Preparación de instrumentos quirúrgicos y animales

  1. Autoclave instrumentos quirúrgicos y mantenerlos en 70% alcohol etílico. Antes de cada nuevo procedimiento quirúrgico, limpie los instrumentos quirúrgicos cuidadosamente usando un 70% de alcohol etílico.
  2. Preparar ratones MACHO BALB/cAJc1 (6 semanas de edad, 26-28 kg) en un espacio específico libre de patógenos (SPF) para mantener condiciones estériles antes, durante y después de la cirugía.

2. Oclusión bilateral transitoria de la arteria carótida común (tBCCAO)

  1. Coloque un ratón bajo anestesia mediante inyección intraperitoneal con una combinación de midazolam (40 μg/100 μL), medetomidina (7,5 μg/100 μL) y tartrato de butorphanol (50 μg/100 μL), denominado "MMB", como se describió anteriormente8,9. Sostenga las pieles traseras del ratón para evitar que el ratón golpee sus ojos hasta que el ratón esté completamente anestesiado.
    1. Juzgue la profundidad de la anestesia pellizcando el dedo del pie del ratón hasta que no tenga respuesta, cuyo método se utiliza comúnmente para comprobar la anestesia completa10.
      NOTA: Generalmente, se requieren menos de 5 minutos para que los ratones se queerman dormidos. Las instituciones pueden ser diferentes para las recetas adecuadas para la anestesia general.
  2. Aplicar una gota de 0.1% solución purificada de gota para los ojos de hialuronato sódico a los ojos para evitar la sequedad en los ojos bajo anestesia.
  3. Coloque el ratón en su parte posterior y fije las patas del ratón usando cintas adhesivas.
  4. Desinfectar el área del cuello del ratón usando un 70% de alcohol etílico antes de la cirugía.
    NOTA: No se realizó un recorte adicional de la piel, ya que esto puede causar inflamación posterior de la piel11,12.
  5. Realizar incisión sagital del cuello con una cuchilla (Figura 1).
    NOTA: La incisión debe hacerse en la línea media entre el cuello, el esternón y la tráquea.
  6. Separe cuidadosamente ambas glándulas salivales usando cuidadosamente dos fórceps y moviélgas para visualizar los CCA subyacentes.
  7. Aísle cuidadosamente a la CCA derecha de los respectivos nervios vagal y venas que lo acompañan sin dañar sus estructuras, y coloque dos suturas de seda 6-0 bajo el CCA. Ata los dos lazos firmemente para bloquear el flujo sanguíneo(Figura 1).
    NOTA: Durante el procedimiento, las venas pequeñas podrían dañarse. Si se observa sangrado, se requiere la limpieza para visualizar claramente los CCA.
  8. Encuentra el CCA izquierdo cuidadosamente de los respectivos nervios vagal y venas que lo acompañan sin dañar sus estructuras, y ocluye el CCA izquierdo durante 2 segundos por una abrazadera(Figura 1).
    NOTA: Se necesita una aguja de sutura de seda de 6-0 para ser colocada debajo de la CCA izquierda para marcar un sitio para la sujeción.
  9. Después de la reapertura de la CCA izquierda, sutura heridas del cuello por una sutura de seda 6-0 y aplicar un toque de antibióticos (50 μL) en el cuello para inhibir la infección bacteriana.
    NOTA: Retire suavemente una abrazadera para evitar dañar la pared arterial al reabrir el CCA izquierdo.
  10. Inyecte 0,75 mg/kg de clorhidrato de atipamezol por vía intraperitoneally al ratón para ayudar al ratón a recuperarse rápidamente de la anestesia profunda. Devuelve el ratón a una jaula de ratón con almohadillas precalentados.
    NOTA: No deje que el ratón quede desatendido hasta que el ratón recupere la conciencia suficiente para mantener la recumbencia severa.
  11. Inyectar 0,4 mg/kg de tartrato de butorphanol en el ratón para el manejo del dolor cuando el ratón se despierta.
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Como primera pista para el éxito de tBCCAO, se puede observar la caída del párpado del ratón (Figura 2).
  12. Para la eutanasia, inyecte 3x de mezcla de MMB a los ratones y sacrifique para experimentos.

3. Observaciones generales (tasas de supervivencia y caída de párpados)

  1. Después de la cirugía, compruebe las tasas de supervivencia de todas las causas de muerte en el día 0 (después de la cirugía), 1, 3 y 7.
  2. Evaluar el caída del párpado por una escala de clasificación de 4 puntos: 1 = sin caídas, 2 = caída leve (~50%), 3 = caída grave (más del 50%), y 4 = caída severa con secreción ocular.

4. Perfusión de sangre retiniana

  1. Inyectar 200 μL de FITC-dextran (25 mg/ml) en el ventrículo izquierdo del ratón, que se utiliza comúnmente para la observación de perfusión de sangre en vasos retinianos de ratón13,14.
  2. 2 minutos después de la circulación, enuclear los ojos y fijar en 4% paraformaldehído durante 1 hora. Las retinas fueron cuidadosamente obtenidas y montadas planas, como se describió anteriormente15,y examinadas a través de un microscopio de fluorescencia.
  3. Tome fotografías de los soportes enteros de la retina a una ampliación de 4x y combínese en una sola usando un analizador de fusión, descrito previamente16.
  4. Mida las áreas perfundidas a través de una herramienta de análisis de buques en el software NIH Fiji/ImageJ.

5. Mancha occidental

  1. 3 y 6 horas después de tBCCAO, obtener los ojos de ratones y transferir inmediatamente a una placa De Petri que contiene PBS frío para aislar las retinas.
  2. Después del aislamiento de las retinas, realice la hinchazón occidental, como se describió anteriormente9.
  3. Incubar con anticuerpos para el factor-1α inducible a la hipoxia (HIF-1α; un marcador de hipoxia general) y para β-Actin (un control interno de carga) durante la noche seguido de la incubación de anticuerpos secundarios conjugados por HRP. Visualice las señales a través de la quimioluminiscencia.

6. PCR cuantitativo (qPCR)

  1. 6, 12 y 24 horas después de tBCCAO, procesar las retinas obtenidas para qPCR, como se describió anteriormente17.
  2. Realice qPCR a través del sistema PCR en tiempo real. Las imprimaciones utilizadas se enumeran en la Tabla 1. Calcule los cambios de pliegue entre los niveles de diferentes transcripciones mediante el método ΔΔCT.

7. Inmunohistoquímica (IHC)

  1. 3 días después de tBCCAO, obtener los ojos de ratones e incrustar en parafina.
  2. Corta los ojos incrustados en parafina por un microtome para obtener las secciones oculares.
  3. Desfinalice y manche las secciones oculares de 5 μm de espesor como se describió anteriormente13.
  4. Incubar con un anticuerpo para proteína ácida fibrilariana glial (GFAP; un marcador fiable para astrocitos y células de Müller en la retina) durante la noche seguido de la incubación de anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor 555.
  5. Utilice DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) para manchar el núcleo en la retina. Visualice las señales a través de un microscopio de fluorescencia.
  6. Evalúe la puntuación de morfología por una escala de clasificación de 4 puntos, como se describió anteriormente13,18: 0 = sin señal, 1 = pocos pies finales gliales positivos en la capa de células gangliona (GCL), 2 = pocos procesos etiquetados que llegan de GCL a la capa nuclear externa (ONL), y 3 = la mayoría de los procesos etiquetados que llegan de GCL a ONL.

8. Electroretinografía (ERG)

  1. 3 y 7 días después de tBCCAO, realizar ERG utilizando un domo Ganzfeld, sistema de adquisición y estimuladores LED, como se describió anteriormente9.
  2. Después de la adaptación oscura durante la noche, anestesia a ratones con una combinación de MMB bajo luz roja tenue.
  3. Utilice una solución mixta de 0,5% tropicamida y 0,5% fenilefrina para dilatar las pupilas.
  4. Coloque los electrodos activos en la lente de contacto y coloque el electrodo de referencia en la boca.
  5. Obtenga respuestas ERG de ambos ojos de cada animal.
  6. Registre las respuestas escocesas bajo una adaptación oscura con varios estímulos.
  7. Mida las amplitudes de una onda desde la línea base hasta el punto más bajo de una onda.
  8. Mida las amplitudes de onda b desde el punto más bajo de una onda hasta el pico de onda b.
  9. Mantenga a todos los ratones calientes durante el procedimiento usando almohadillas de calor.

9. Tomografía de coherencia óptica (OCT)

  1. 2 semanas después de tBCCAO, realice OCT utilizando el sistema SD-OCT, como se informó anteriormente8,9.
  2. Para la medición, someta a los ratones a la mydriasis mediante una solución mixta de 0,5% de tropicamida y 0,5% fenilefrina, y a anestesia general por una mezcla de MMB.
  3. Obtenga imágenes de escaneo B de sectores ecuatoriales de escaneos en la cara.
  4. Examine las retinas a 0,2, 0,4 y 0,6 mm de la cabeza del nervio óptico.
  5. Mida el grosor de la retina desde la capa de fibra nerviosa retiniana (NFL) hasta la membrana limitante externa (OLMO), y considere el promedio de los valores medidos como grosor retiniano de un ratón individual.
  6. Trace los resultados como diagramas de arañas.

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Representative Results

Después de la circulación sistémica de FITC-dextran durante 2 minutos, se examinaron las vasculaturas retinianas de las retinas izquierda y derecha en ratones operados por sham y ratones operados por tBCCAO(Figura Suplementaria 1). Fitc-dextran era totalmente visible en las dos retinas en los ratones operados por sham y la retina izquierda en los ratones operados por tBCCAO, mientras que era parcialmente detectable en la retina derecha en los ratones operados por tBCCAO.

Después de la tBCCAO, se examinó el caída de párpados (Figura 2). Los ojos derecho mostraron leves (puntuación 2; 75%) y párpado severo (puntuación 3 y 4; 25%) caída, mientras que los ojos izquierdos no tenían caída (puntuación 1; 93,75%) excepto un ratón (puntuación 2; 6,25%). Aunque el párpado severo caído con descarga ocular no se observó considerablemente en los ratones operados por tBCCAO, pudimos ver un ratón para este fenotipo (puntuación 4; 6,25%).

La reducción del estado de oxígeno en los tejidos conduce a la estabilización de HIF-1α y a la inducción de una serie de genes sensibles a la hipoxia como EPO, VEGF y BNIP319,20,21. En primer lugar, la hipoxia biológica molecular utilizando un marcador hipoxico general HIF-1α se evaluó a través de la hinchazón occidental (Figura 3). Se observó significativamente un aumento de la expresión HIF-1α en la retina derecha 3 y 6 horas después de la tBCCAO. A continuación, se evaluaron las expresiones de genes sensibles a la hipoxia a través de qPCR (Figura suplementaria 2). No hubo ningún cambio significativo en las expresiones génicas sensibles a la hipoxia 6 horas después de la tBCCAO. 12 horas después de tBCCAO, encontramos que la expresión binp3 aumentó significativamente y se mostró un ligero aumento en la expresión epo en la retina derecha. 24 horas después de la tBCCAO, también pudimos encontrar un ligero aumento de la expresión epo en la retina derecha, aunque no fue estadísticamente significativa. La expresión vegf no fue alterada de 6 a 24 horas en los ratones operados por tBCCAO.

La gliosis reactiva retiniana se examinó 3 días después de tBCCAO(Figura 4),ya que las células de glia como los astrocitos y las células de Müller se han asociado estrechamente con la isquemia retiniana22. GFAP ha sido ampliamente utilizado para la detección de astrocitos y células de Müller en la retina23. El promedio de puntuaciones de morfología para el etiquetado GFAP en la retina derecha fue el más alto entre las dos retinas en los ratones operados por sham y la retina izquierda en los ratones operados por tBCCAO. Sobre la base de la localización de la expresión GFAP, se considera que un cambio en la morfología en el etiquetado GFAP refleja la activación de las células Müller.

ERG se utilizó para examinar la disfunción retiniana después de tBCCAO (Figura 5). Las amplitudes de onda b en el ojo derecho disminuyeron drásticamente 3 y 7 días después de la tBCCAO. Sin embargo, las amplitudes de una onda en el ojo derecho no cambiaron significativamente. Cuando se trata del ojo izquierdo, no pudimos ver ningún cambio en las amplitudes de las ondas a y b(Figura Suplementaria 3).

Realizamos OCT para determinar una alteración en el grosor de la retina después de tBCCAO (Figura 6). El grosor de la retina en el ojo derecho aumentó dramáticamente 2 semanas después de tBCCAO, mientras que no hubo diferencia en el grosor de la retina en el ojo izquierdo entre los ratones operados por tBCCAO y sham.

Figure 1
Figura 1: Esquema del procedimiento modelo y circulación sanguínea en el círculo de Willis. Una ilustración esquemática mostró el procedimiento del modelo de ratón isquémico retiniano inducido por la tBCCAO y la circulación sanguínea a la retina. CCA, ECA, ICA, PCA y OpA representan la arteria carótida común, arteria carótida externa, arteria carótida interna, arteria comunicante posterior y arteria oftálmica, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Caída del párpado después de tBCCAO. La gravedad de la caída del párpado se evaluó mediante una clasificación de 4 puntos basada en las imágenes de referencia: 1 = sin caída, 2 = caída leve (~50% caída), 3 = caída severa (más del 50% caído) y 4 = caída grave con secreción ocular. El caída de párpados se observó después de tBCCAO y se mantuvo durante la observación experimental. Los resultados (sham: n = 10, tBCCAO: n = 16) fueron trazados como una gráfica de puntos de dispersión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Estabilización HIF-1α después de tBCCAO. Inmunoblots representativos y análisis cuantitativos (grupos para la hora 3; sham: n = 3, tBCCAO: n = 6 y grupos para la hora 6; sham y tBCCAO: n = 6) para HIF-1α y β-Actin mostraron que HIF-1α fue estabilizado en la retina derecha 3 y 6 horas después de tBCCAO. *P < 0.05. Los datos fueron analizados usando la prueba tdel estudiante y presentados como media con ± desviación estándar. L y R representan la retina izquierda y derecha, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Gliosis reactiva después de tBCCAO. Secciones sagitales representativas de las retinas (sham: n = 4, tBCCAO: n = 4) y análisis cuantitativos del etiquetado GFAP (rojo) por una puntuación de morfología (0-3) mostraron que el etiquetado GFAP, en su mayoría restringido en NFL + GCL, se amplió a toda la capa interna, desde GCL a ONL (flechas blancas) en la retina derecha después de tBCCAO. Barras de escala, 50 μm. DAPI (azul) se utilizó para manchar el núcleo en la retina. NFL, GCL, IPL, INL y ONL representan la capa de fibra nerviosa, capa de células gangliosas, capa plexiforme interna, capa nuclear interna y capa nuclear externa, respectivamente. Los datos fueron analizados usando la prueba tdel estudiante y presentados como mediana con rango intercuartil, el percentil 25 y 75. *P < 0.05. L y R representan la retina izquierda y derecha, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Disfunción visual en el ojo derecho después de tBCCAO. (A) Formas de onda representativas de ERG adaptadas a la oscuridad realizadas 3 y 7 días después de tBCCAO. Intensidad de estimulación (cd.s/m2):0,005. B) Los análisis cuantitativos mostraron que había una disminución en las amplitudes de la onda b en el ojo derecho (sham: n = 5, tBCCAO: n = 6) mientras que las amplitudes de una onda no se cambiaron. *P < 0.05, **P < 0.01. Los datos fueron analizados usando la prueba tdel estudiante y presentados como media con ± desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Un cambio en el grosor de la retina después de tBCCAO. Las imágenes representativas de OCT en las retinas operadas por sham y tBCCAO y los análisis cuantitativos mostraron que había un aumento en el grosor de la retina en la retina derecha (sham: n = 4, tBCCAO: n = 8). No hubo ningún cambio en el grosor de la retina en la retina izquierda (sham: n = 4, tBCCAO: n = 8). Las barras de escala son de 200 (superior) y 100 (inferior) μm, respectivamente. *P < 0.05. Los valores en el eje horizontal de los diagramas representan 0,2, 0,4 y 0,6 mm de distancia del cabezal nervioso óptico (0) que fue detectado por la línea verde. Los datos fueron analizados utilizando ANOVA bidireccional seguido de una prueba post hoc de Bonferroni. Los diagramas de arañas se presentaron como medias con ± desviación estándar. NFL, INL, ONL y ELM son la capa de fibra nerviosa, capa nuclear interna, capa nuclear externa y membrana limitante externa, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria 1: Perfusión de sangre retiniana después de la tBCCAO. Imágenes representativas de montaje plano retiniano (con mayor aumento de cada imagen) después de 2 minutos de circulación FITC-dextran y análisis cuantitativos mostraron que la perfusión completa era observable en las dos retinas en los ratones operados por sham y la retina izquierda en los ratones operados por tBCCAO. Sin embargo, la retina derecha en los ratones operados por tBCCAO mostró perfusión parcial de sangre. Los datos fueron analizados usando la prueba tdel estudiante y presentados como media con ± desviación estándar. L y R representan la retina izquierda y derecha, respectivamente. Las barras de escala son de 800 y 400 μm, respectivamente. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura suplementaria 2: Expresiones de genes sensibles a la hipoxia después de tBCCAO. Los análisis cuantitativos mostraron un aumento transitorio de la expresión de ARNm Bnip3 en la retina derecha con significado estadístico 12 horas después de la tBCCAO. La expresión de ARNM epo mostró una tendencia creciente en la retina derecha durante 24 horas después de la tBCCAO, aunque sus valores no fueron significativamente diferentes en comparación con la retina derecha operada por la farsa. **P < 0.01. Los datos fueron analizados usando la prueba tdel estudiante y presentados como media con ± desviación estándar. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura complementaria 3: Función visual en el ojo izquierdo después de tBCCAO. Los análisis cuantitativos mostraron que no hubo ningún cambio en las amplitudes de las ondas a y b en el ojo izquierdo (sham: n = 5, tBCCAO: n = 6). P > 0.05. Los datos fueron analizados usando la prueba tdel estudiante y presentados como media con ± desviación estándar. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura complementaria 4: Tasas de supervivencia después de tBCCAO en C57BL6 y BALB. Las curvas de supervivencia kaplan-meier demostraron que casi todos los ratones murieron dentro de los 3 días después de tBCCAO en ratones C57BL6. Cuando se trata de ratones BALB, el tiempo de sujeción más largo en tBCCAO induce la muerte súbita y grave de los animales (tasas de supervivencia en el día 7, 20 seg: 10%, 10 seg: 20%, 2 s: 81%, y 0 seg: 95%). Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura complementaria 5: Estabilización HIF-1α después de la CCAO unilateral. Un análisis representativo de inmunoblot y cuantitativo (sham: n = 3, CCAO unilateral: n = 3) para HIF-1α y β-Actin demostró que HIF-1α no se estabilizó en las retinas 3 horas después de la CCAO unilateral. P > 0.05. Los datos se analizaron utilizando la prueba tdel estudiante y se presentaron como media con ± desviación estándar. L y R representan la retina izquierda y derecha, respectivamente. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura suplementaria 6: Caída severa del párpado después de tBCCAO con tiempo de sujeción largo. 10 segundos de caída grave inducida por tBCCAO en el párpado severo, que fue evaluado por una escala de clasificación de 4 puntos: 1 = sin caída, 2 = caída leve (~50%), 3 = caída grave (más del 50%), y 4 = caída grave con secreción ocular, como se describe en la Figura 2. Haga clic aquí para descargar esta figura.

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Discussion

En el estudio, hemos demostrado que la tBCCAO, utilizando suturas simples y una abrazadera, podría inducir isquemia retiniana y disfunción retiniana que lo acompaña. Además, hemos demostrado que nuestro protocolo actual para el desarrollo de un modelo de ratón de isquemia retiniana es más fácil y rápido en comparación con otros protocolos anteriores para el desarrollo de modelos de lesiones isquémicas retinianas2,3,7.

Anatómicamente, las arterias cerebrales izquierda y derecha se pueden conectar a través de arterias comunicantes posteriores (PCA) que proporcionan circulación colateral en el círculo de Willis para mantener un suministro adecuado de sangre al sistema nervioso central contra la interrupción del flujo de oclusiones o estenosis de vasos individuales24,25 (Figura 1). Lee y otros demostraron que la perfusión de sangre retiniana podría retrasarse 10 minutos (lo que no es un bloqueo completo de la perfusión de sangre retiniana en la retina ipsilateral) por CCAO unilateral permanente en ratones C57BL613. Esto implica que la inducción de isquemia retiniana por CCAO está estrechamente asociada con condiciones de circulación colateral en el círculo de Willis. C57BL6 es conocido por ser la cepa de ratón más susceptible a la isquemia cerebral por BCCAO entre siete cepas de ratón incluyendo la cepa de ratón balb26de nuestro estudio actual. Debido al círculo incompleto de Willis en C57BL6, la interrupción del suministro de sangre cerebral de ambos CCAs induce daños severos en el sistema nervioso central, lo que finalmente conduce a la muerte. Además, en nuestro estudio preliminar, no inducimos tBCCAO en C57BL6 como casi todos los ratones (alrededor del 80%) murió dentro de los 3 días posteriores a la cirugía(Figura Suplementaria 4). Por lo tanto, aplicamos tBCCAO a otra cepa del ratón BALB para nuestro estudio actual.

Para inducir lesiones isquémicas agudas de la retina en nuestro modelo BALB, la CCA derecha estaba permanentemente ligada y la CCA izquierda se aplicó para aumentar el estrés isquémico retiniano agudo a través de la oclusión transitoria. Esto se debe a que los ratones no podían tolerar el estrés isquémico inducido por la BCCAO permanente a diferencia de las ratas que tienen el círculo completo de Willis27. A continuación, intentamos optimizar el tiempo de oclusión: izquierda CCAO (0-20 segundos), ya que el tiempo de oclusión ha sido considerado uno de los factores clave que impacta lesiones isquémicas en el sistema nervioso central y se conecta directamente con las tasas de supervivencia de los modelos experimentales28,29. Encontramos que las tasas de supervivencia de los ratones BALB disminuyeron de una manera dependiente del tiempo de oclusión(Figura Suplementaria 4). La oclusión de la CCA izquierda durante 10 segundos mostró tasas de mortalidad severamente más altas (más del 50%), mientras que la oclusión de la CCA izquierda durante 2 segundos o ninguna oclusión (o CCAO unilateral) mostró tasas de supervivencia relativamente más altas (más del 80%). Por lo tanto, excluimos los grupos (de tiempo de oclusión que es de 10 y 20 segundos) para los experimentos posteriores, ya que no se pueden disponer de experimentos eficientes y rentables. A continuación, examinamos si la oclusión de la CCA izquierda durante 2 segundos o ninguna oclusión (o CCAO unilateral) podría inducir hipoxia retiniana. HIF-1α es un regulador importante que funciona en respuestas hipoxicas y se estabiliza en condiciones hipoxis30. En este sentido, la estabilización hif-1α se ha utilizado como un marcador biológico molecular general para la hipoxia. No pudimos detectar la estabilización HIF-1α en la retina en el grupo de CCAO unilateral(Figura Suplementaria 5). Curiosamente, podríamos detectar la estabilización HIF-1α en el grupo de 2 segundos de tBCCAO (Figura 3). Esto implica que el estrés hipoxico retiniano podría ser inducido por 2 segundos de tBCCAO en ratones BALB. Por lo tanto, 2 segundos de tiempo de sujeción fueron finalmente seleccionados para nuestro estudio basado en altas tasas de supervivencia después de la cirugía y la inducción de isquemia retiniana a través de la estabilización HIF-1α.

Aunque la CCA derecha fue ocluida permanentemente en ratones operados por tBCCAO, la perfusión de sangre se detectó parcialmente en la retina derecha 2 minutos después de la circulación sistémica de FITC-dextran(Figura Suplementaria 1). Además, encontramos que no se detectó una alteración en la estabilización hif-1α en la retina derecha en los ratones BALB operados por la CCAO unilateral. Este fenómeno podría explicarse por los efectos de la circulación colateral a través del círculo de Willis para mantener el suministro de sangre a la retina(Figura 1). A pesar de que no podíamos entender claramente los efectos de la CCAO transitoria izquierda en la perfusión de sangre a la retina derecha, la CCAO izquierda transitoria junto con la CCAO derecha permanente pueden aumentar los insultos hipoxicos agudos en la retina derecha como lo demuestra un cambio significativo en la expresión HIF-1α en la retina derecha después de tBCCAO (Figura 3). Además, las tasas de supervivencia de los ratones dependían del tiempo de oclusión de la CCA izquierda. En conjunto, la intensidad del estrés isquémico retiniano podría controlarse a través de la CCAO izquierda.

El fenotipo de un párpado caído se ha sugerido como un signo de presentación o un síntoma fisiológico de afecciones neurológicas graves, especialmente accidente cerebrovascular isquémico31,32. El músculo asociado con un párpado caído es levator palpebrae superioris33. Este músculo es suministrado por la arteria palpebral lateral que es una de las ramas derivadas de OpA. Por lo tanto, cuando OpA, que suministra la retina, se ve afectada, se podía ver caída de párpados. El caída de párpados se observó en los modelos34 delratón MCAO, que también se reprodujo en nuestro modelo tBCCAO. Además, describimos que el caída de párpados se vuelve grave cuando el tiempo de oclusión de la CCA izquierda toma más tiempo(Figura 2 y Figura Suplementaria 6). Esto implica que la gravedad de la caída del párpado (indirectamente conocida como la intensidad del estrés isquémico retiniano) podría depender del tiempo de oclusión de la CCA izquierda.

La disfunción retiniana es uno de los resultados observados en retinopatías isquémicas retinianas incluyendo estenosis de BCCA en ratones35 y BCCAO en ratas36. Encontramos que las amplitudes de la onda b disminuyeron en los ratones operados por tBCCAO. Varios estudios previos demostraron que mcao también causó una reducción en la amplitud de la onda b después de la cirugía37,38. b-onda refleja una condición fisiológica de las células en las capas internas de la retina, incluyendo células bipolares y células Müller39. Además, se detectó gliosis reactiva por células de Müller en la capa retiniana interna después de tBCCAO. Este resultado también se reproduce en los modelos40, 41 y otros modelosCCAO 13,42. En conjunto, implica que la disfunción retiniana interna podría ser inducida por tBCCAO. Se ha notificado que el grosor de la retina aumenta transitoriamente en la isquemia aguda de la retina43,44. También reproducimos este hallazgo en ratones operados por tBCCAO. Estos datos muestran que el deterioro de la circulación sanguínea por tBCCAO podría llegar a la retina y finalmente afectar a las capas de retina.

Para resultados consistentes, el tiempo anestésico y la duración de los procedimientos quirúrgicos, así como otros factores como pesos y edades de los modelos experimentales y sus temperaturas corporales durante y después de la cirugía deben estandarizarse45. Particularmente, se necesita atención para mantener la temperatura corporal de los ratones durante todo el período de observación experimental. Esto se debe a que la hipotermia podría tener un efecto de preacondicionamiento e interferir con los efectos isquémicos por tBCCAO46. A pesar de que no pudimos medir la temperatura corporal exacta de los ratones en nuestros experimentos, usamos almohadillas de calentamiento para calentar a los ratones hasta que los ratones recuperaron suficiente conciencia. Además, comparamos a los ratones operados por tBCCAO con los ratones operados por sham para controlar posibles efectos confusos de factores incontrolables.

Las cepas del ratón podrían ser un factor variable importante adicional para inducir lesiones isquémicas retinianas por tBCCAO. La variación sustancial del círculo de Willis en cepas de ratón podría resultar en una reducción o inducción no deseada de isquemia cerebral incluyendo ishcemia retiniana47 y por lo tanto podría conducir a variabilidades de los resultados. Se recomienda ajustar el tiempo de sujeción para una retinopatía isquémica inducida por tBCCAO con éxito cuando se requieren otras cepas de ratones para ser aplicadas.

En general, los incidentes de accidente cerebrovascular u otras lesiones cerebrales se acompañan invariablemente con pérdida temporal o permanente de visón48. Hasta la fecha, el modelo de ratón MCAO es ampliamente utilizado para estudios de trazo. A medida que OpA se origina proximal al origen del MCA, cualquier obstáculo en el flujo sanguíneo en MCA obstruye el flujo a la retina. La isquemia retiniana fue demostrada en primer lugar en ratas por MCAO37. Más tarde, se aplicó el mismo modelo isquémico retiniano a ratones49. Sin embargo, para el procedimiento, la oclusión toma más de 60 minutos y encontrar un sitio de oclusión es extremadamente difícil ya que mca está enterrado en lo profundo del cerebro. Además, el tamaño del filamento y la duración de inserción para MCAO deciden en gran medida el éxito de la cirugía. Esos factores variables adicionales inducen las variabilidades de los resultados isquémicos después de la cirugía. Aunque se necesitan estudios de comparación directa entre tBCCAO y MCAO, describimos las características beneficiosas de nuestros modelos experimentales en este estudio: corto tiempo de oclusión, procedimiento experimental simple y sitios de oclusión altamente accesibles. Este modelo puede resolver las preocupaciones que se ven en los modelos MCAO.

Mientras que el uso del modelo de ratón de isquemia retiniana tiene grandes beneficios para el estudio de lesiones isquémicas retinianas, todavía hay limitaciones a este enfoque. Dado que la incisión quirúrgica en el cuello, la separación de las glándulas salivales y la oclusión en la CCA derecha con suturas deben aplicarse para el procedimiento, las alteraciones del tejido que lo acompañan pueden evocar la inflamación asociada sistémica o al menos localmente. Estas preocupaciones se abordaron parcialmente utilizando los ratones operados por sham, donde todos los pasos quirúrgicos se llevan a cabo sin tBCCAO. Otro problema es el requisito de controlar el dolor que ocurre durante y después de la cirugía. En nuestro estudio, el manejo del dolor para prevenir el sufrimiento de los ratones se aplicó a través de la inyección de solución de tartrato de butorphanol, un analgésico agonista-antagonista opioide de origen sintético de la serie de fenantema. Podría ser importante tener en cuenta que el uso de diferentes tipos de anestésicos y analgésicos puede interrumpir los efectos de la tBCCAO en la isquemia retiniana. Otra limitación a este enfoque (junto con los enfoques de otros modelos utilizados actualmente) es que no proporciona una simulación perfecta de patologías asociadas con trastornos cardiovasculares de la retina humana. Hasta la fecha, los modelos de ratón utilizados para este tipo de experimentos no sufren de co-morbilidades que subyacen a las retinopatías isquémicas en los seres humanos, principalmente con síndrome metabólico como la diabetes50. Tales complicaciones que no están presentes en los modelos actuales de ratón podrían tener efectos sinérgicos negativos en las vías patológicas para el desarrollo de retinopatías isquémicas. Por lo tanto, esto debe tenerse en cuenta al interpretar los resultados de los modelos experimentales utilizados actualmente, incluido nuestro modelo de ratón tBCCAO. Para entender mejor los mecanismos fisiopatológicos de las retinopatías isquémicas en los seres humanos, nuestro modelo se puede combinar con otros factores patológicos como la inyección de estreptozotocina51 o el suplemento de dieta alta engrasas 52 para el desarrollo de retinopatía diabética isquémica. Por fin, a pesar de que mostramos una reducción de la perfusión de sangre retiniana en los ratones operados por tBCCAO, no podíamos entender claramente los efectos de la CCAO transitoria izquierda en la perfusión de sangre a la retina derecha. Este asunto podría abordarse utilizando láser-Doppler que se utiliza normalmente para confirmar que se ha producido oclusión e isquemia se ha producido in vivo en tiempo real53,54. Esta técnica podría utilizarse para una mejor comprensión de la isquemia retiniana en un ratón operado por tBCCAO individual, con respecto a la circulación colateral en el círculo de Willis.

A pesar de estas limitaciones, nuestro método tBCCAO descrito aquí representa un enfoque eficaz para producir isquemia retiniana en ratones. El estudio de los cambios en la retina por tBCCAO ayuda a desentrañar los mecanismos patológicos de las retinopatías isquémicas en los seres humanos. Además, esperamos que el modelo de ratón tBCCAO pueda utilizarse para la detección in vivo de fármacos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por grants-in-aid for Scientific Research (KAKENHI) (18K09424 a Toshihide Kurihara y 20K18393 a Yukihiro Miwa) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología (MEXT).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atipamezole hydrochloride Zenoaq Antisedan For anti-anesthesia
Applied Biosystems 7500 Fast Applied Biosystems - For qPCR
Butorphanol tartrate Meiji Seika Pharma Vetorphale For anesthesia
BZ-II Analyzer KEYENCE - For an image merge
BALB/cAJc1 CLEA - Mouse strain
β-Actin (8H10D10) Mouse mAb CST 3700 For western blot
Clamp Forcep World Precision Instruments WPI 500451 For surgery
Dumont forceps #5 Fine Science Tools 11251-10 For surgery
DAPI solution Dojindo 340-07971 For IHC
Envisu SD-OCT system Leica R4310 For OCT
FITC-dextran Merk FD2000S For retinal blood perfusion
Fluorescence microscope KEYENCE BZ-9000 For fluorescence detection
Gatifloxacin hydrate Senju Pharmaceutical Gachifuro For anti-bacterial infection
GFAP Monoclonal Antibody (2.2B10) Thermo 13-0300 For IHC
Heating pad Marukan RH-200 For surgery
HIF-1α (D1S7W) XP Rabbit mAb CST 36169 For western blot
ImageQuant LAS 4000 mini GE Healthcare - For chemiluminescence
Midazolam Sandoz K.K SANDOZ For anesthesia
Microtome Tissue-Tek TEC 6 Sakura - For sectioning
Medetomidine Orion Corporation Domitor For anesthesia
Needle holder Handaya HS-2307 For surgery
PuREC MAYO Corporation - For ERG
Scissor Fine Science Tools 91460-11 For surgery
Sodium hyaluronate Santen Pharmaceutical Hyalein For eye lubrication
Tropicamide/Penylephrine hydrochloride Santen Pharmaceutical Mydrin-P For mydriasis
6-0 silk suture Natsume E12-60N2 For surgery

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Medicina Número 165 Oclusión arterial carotídica Electroretinografía Modelos experimentales Hipoxia Isquemia Tomografía de coherencia óptica Retina Reperfusión
Un modelo murino de lesión retiniana isquémica inducida por la oclusión bilateral transfronteriza de la arteria carótida común
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Lee, D., Miwa, Y., Jeong, H., Ikeda, S. i., Katada, Y., Tsubota, K., Kurihara, T. A Murine Model of Ischemic Retinal Injury Induced by Transient Bilateral Common Carotid Artery Occlusion. J. Vis. Exp. (165), e61865, doi:10.3791/61865 (2020).

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