Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

क्षणिक द्विपक्षीय आम कैरोटिड धमनी Occlusion द्वारा प्रेरित इस्कीमिक रेटिना चोट का एक मुरीन मॉडल

Published: November 12, 2020 doi: 10.3791/61865
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,4, 1,2
1Laboratory of Photobiology, Keio University School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, Keio University School of Medicine, 3Animal eye care, Tokyo Animal Eye Clinic, 4Tsubota Laboratory, Inc.
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम सरल टांके और एक क्लैंप का उपयोग करके क्षणिक द्विपक्षीय आम कैरोटिड धमनी ऑक्क्लुज़ेशन द्वारा रेटिना इस्केमिया के माउस मॉडल का वर्णन करते हैं। यह मॉडल हृदय असामान्यताओं के कारण रेटिना इस्केमिया के रोग तंत्र को समझने के लिए उपयोगी हो सकता है।

Abstract

मधुमेह रेटिनोपैथी, रेटिना नसों या धमनियों के ऑक्सक्यूशन और नेत्र इस्केमिक सिंड्रोम जैसे विविध संवहनी रोग रेटिना इस्केमिया का कारण बन सकते हैं। रेटिना इस्केमिया के रोग तंत्र की जांच करने के लिए, प्रासंगिक प्रयोगात्मक मॉडल विकसित करने की आवश्यकता है। शारीरिक रूप से, एक मुख्य रेटिना रक्त आपूर्ति पोत नेत्र धमनी (ओपीए) है और ओपीए आम कैरोटिड धमनी (सीसीए) की आंतरिक कैरोटिड धमनी से निकलती है। इस प्रकार, सीसीए के व्यवधान प्रभावी रूप से रेटिना इस्केमिया का कारण बन सकता है । यहां, हमने क्षणिक द्विपक्षीय आम कैरोटिड धमनी ऑक्क्लूज़ियन (tBCCAO) द्वारा रेटिना इस्केमिया का एक माउस मॉडल स्थापित किया ताकि 6-0 रेशम टांके के साथ सही सीसीए को बांधा जा सके और बाएं सीसीए को एक क्लैंप के माध्यम से 2 सेकंड के लिए क्षणिक रूप से occlude किया जा सके, और पता चला कि tBCCAO तीव्र रेटिना इस्केमिया को प्रेरित कर सकता है जिससे रेटिन बेकार हो सकता है। वर्तमान विधि केवल शल्य सुई और एक क्लैंप का उपयोग करके सर्जिकल उपकरणों पर निर्भरता को कम करती है, अप्रत्याशित पशु मृत्यु को कम करने के लिए ऑक्सीक्लयूजन समय को छोटा करती है, जो अक्सर मध्य मस्तिष्क धमनी ऑक्सीलसेशन के माउस मॉडल में देखा जाता है, और आम रेटिना इस्कीमिक निष्कर्षों की प्रजनन क्षमता बनाए रखता है। मॉडल का उपयोग चूहों में इस्कीमिक रेटिनोपैथी के रोगविज्ञान की जांच करने के लिए किया जा सकता है और आगे वीवो दवा स्क्रीनिंग में इसका उपयोग किया जा सकता है।

Introduction

रेटिना दृश्य समारोह के लिए एक न्यूरोसेंसरी ऊतक है। चूंकि दृश्य कार्य के लिए पर्याप्त मात्रा में ऑक्सीजन की आवश्यकता होती है, इसलिए रेटिना को शरीर में उच्चतम ऑक्सीजन की मांग करने वाले ऊतकों में से एक के रूप में जाना जाता है1। रेटिना संवहनी रोगों के लिए अतिसंवेदनशील होता है क्योंकि ऑक्सीजन रक्त वाहिकाओं के माध्यम से वितरित की जाती है। विभिन्न प्रकार के संवहनी रोग, जैसे मधुमेह रेटिनोपैथी और रेटिना रक्त वाहिका (नसों या धमनियों) ऑक्लूजन, रेटिना इस्केमिया को प्रेरित कर सकते हैं। रेटिना इस्केमिया के रोग तंत्र की जांच करने के लिए, रेटिना इस्केमिया के प्रजनन योग्य और चिकित्सकीय प्रासंगिक प्रयोगात्मक मॉडल आवश्यक माने जाते हैं। इंट्राल्यूमिनल फिलामेंट के सम्मिलन द्वारा मध्य मस्तिष्क धमनी ऑक्क्लुस (एमसीएओ) प्रयोगात्मक सेरेब्रल इस्केमिया2,3के वीवो कृंतक मॉडल के विकास के लिए सबसे आम तौर पर उपयोग की जाने वाली विधि है। एमसीए के लिए नेत्र धमनी (ओपा) की निकटता के कारण, एमसीएओ मॉडल का उपयोग रेटिना इस्केमिया4, 5, 6के रोगविज्ञान को समझने के लिए भी एक साथ कियाजाताहै। रेटिना इस्केमिया के साथ सेरेब्रल इस्केमिया को प्रेरित करने के लिए, लंबे तंतुओं को आम कैरोटिड धमनी (सीसीए) या बाहरी कैरोटिड धमनी (ईसीए) के चीरा के माध्यम से आम तौर पर डाला जाता है। इन तरीकों को प्रदर्शन करना मुश्किल है, सर्जरी (एक माउस के लिए 60 मिनट से अधिक) को पूरा करने के लिए लंबे समय की आवश्यकता होती है, और सर्जरी7के बाद परिणामों में उच्च वेरिबिलिटीओं का कारण बनती है। इन चिंताओं को बेहतर बनाने के लिए एक बेहतर मॉडल विकसित करना महत्वपूर्ण रहता है ।

इस अध्ययन में, हमने चूहों में रेटिना इस्केमिया को प्रेरित करने के लिए सुइयों और एक क्लैंप के साथ लघु क्षणिक द्विपक्षीय सीसीए ऑक्क्यूज़ेशन (tBCCAO) का उपयोग किया और रेटिना में इस्कीमिक चोटों के विशिष्ट परिणामों का विश्लेषण किया। इस वीडियो में हम टीबीसीएओ प्रक्रिया का प्रदर्शन देंगे।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

यहां वर्णित सभी तरीकों को कीओ यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन की इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (आईएसीयूसी) ने मंजूरी दे दी है ।

1. सर्जिकल उपकरणों और जानवरों की तैयारी

  1. ऑटोक्लेव सर्जिकल उपकरणों और उन्हें 70% एथिल अल्कोहल में रखें। प्रत्येक नई शल्य प्रक्रिया से पहले, 70% एथिल अल्कोहल का उपयोग करके शल्य चिकित्सा उपकरणों को ध्यान से साफ करें।
  2. सर्जरी से पहले, दौरान और बाद में बाँझ स्थितियों को बनाए रखने के लिए एक विशिष्ट रोगजनक मुक्त (एसपीएफ) कमरे में पुरुष BALB/cAJc1 चूहों (6 सप्ताह पुराने, 26-28 किलो) तैयार करें ।

2. क्षणिक द्विपक्षीय आम कैरोटिड धमनी ऑक्क्लुस (tBCCAO)

  1. मिडाजोलम (40 माइक्रोग्राम/100 माइक्रोन), मेडेटामोडीाइन (7.5 माइक्रोग्राम/100 माइक्रोन) और बुटोफेनॉल टैरट्रेट (50 माइक्रोग्राम/100 माइक्रोन) के संयोजन के साथ इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से संज्ञाहरण के नीचे एक माउसरखें,जैसा कि पहलेवर्णितथा माउस की पीठ की खाल को पकड़ें माउस को अपनी आंखों को टक्कर देने से दूर रखने के लिए जब तक माउस पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड न हो जाए।
    1. माउस के पंजे को पिंच करके संज्ञाहरण की गहराई को आंकें जब तक कि इसमें कोई प्रतिक्रिया नहीं होती है, जिसमें से विधि का उपयोग आमतौर पर पूर्ण संज्ञाहरण10की जांच के लिए किया जाता है।
      नोट: आम तौर पर, चूहों के सो जाने के लिए 5 मिनट से कम की आवश्यकता होती है। सामान्य संज्ञाहरण के लिए उचित व्यंजनों संस्थानों द्वारा अलग हो सकता है।
  2. संज्ञाहरण के तहत आंखों पर सूखापन को रोकने के लिए आंखों के लिए 0.1% शुद्ध सोडियम हाइलुरोनेट आई ड्रॉप समाधान की एक बूंद लागू करें।
  3. माउस को अपनी पीठ पर रखें और चिपकने वाले टेप का उपयोग करके माउस के पंजे को ठीक करें।
  4. सर्जरी से पहले 70% एथिल अल्कोहल का उपयोग करके माउस के गर्दन क्षेत्र को कीटाणुरहित करें।
    नोट: फर की अतिरिक्त क्लिपिंग नहीं की गई क्योंकि इससे बाद में त्वचा में सूजन हो सकती है11,12.
  5. एक ब्लेड(चित्रा 1)के साथ गर्दन के sagittal चीरा प्रदर्शन करते हैं ।
    नोट: चीरा गर्दन, उरोस्थि और श्वासनली के बीच मिडलाइन पर किया जाना चाहिए ।
  6. दो संदंश का उपयोग करके दोनों लार ग्रंथियों को ध्यान से अलग करें और अंतर्निहित सीसीए की कल्पना करने के लिए उन्हें जुटाएं।
  7. सही सीसीए को संबंधित वागल नसों और साथ की नसों से उनकी संरचनाओं को नुकसान पहुंचाए बिना सावधानी से अलग करें, और सीसीए के तहत दो 6-0 रेशम टांके रखें। रक्त प्रवाह(चित्रा 1)को ब्लॉक करने के लिए दोनों संबंधों को कसकर बांधें।
    नोट: प्रक्रिया के दौरान, छोटी नसों को नुकसान हो सकता है। यदि रक्तस्राव देखा जाता है, तो सीसीए को स्पष्ट रूप से कल्पना करने के लिए पोंछने की आवश्यकता होती है।
  8. संबंधित वागल नसों और साथ नसों से उनकी संरचनाओं को नुकसान पहुंचाए बिना बाएं सीसीए को ध्यान से ढूंढें, और एक क्लैंप(चित्र 1)द्वारा 2 सेकंड के लिए बाएं सीसीए को ऑक्सील्यू करें।
    नोट: क्लैंपिंग के लिए एक साइट को चिह्नित करने के लिए बाएं सीसीए के नीचे रखा जाना चाहिए।
  9. बाएं सीसीए को फिर से खोलने के बाद, गर्दन के सीवन घाव 6-0 रेशम सीवन द्वारा और बैक्टीरियल संक्रमण को बाधित करने के लिए गर्दन पर एंटीबायोटिक (50 माइक्रोन) का एक थपका लागू करें।
    नोट: बाईं सीसीए को फिर से खोलते समय धमनी की दीवार को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए धीरे-धीरे एक क्लैंप हटा दें।
  10. 0.75 मिलीग्राम/किलो अतिपामजोल हाइड्रोक्लोराइड को माउस में इंजेक्ट करें ताकि गहरे संज्ञाहरण से जल्दी से बरामद माउस की मदद की जा सके। माउस को पूर्व-गर्म पैड के साथ माउस पिंजरे में लौटाएं।
    नोट: माउस को उपेक्षित न छोड़ें जब तक कि माउस स्टर्नल रेक्यूम्बेंसी बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त न करे।
  11. माउस के जागने पर दर्द के प्रबंधन के लिए माउस को 0.4 मिलीग्राम/किलो का बुटोफेनॉल टार्ट्रेट इंजेक्ट करें।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है । सफल tBCCAO के लिए एक पहले संकेत के रूप में, माउस की पलक ड्रॉपिंग(चित्रा 2)मनाया जा सकता है ।
  12. इच्छामृत्यु के लिए, चूहों को एमएमबी मिश्रण के 3x इंजेक्ट करें और प्रयोगों के लिए उनका बलिदान करें।

3. सामान्य अवलोकन (जीवित रहने की दर और पलक ड्रॉपिंग)

  1. सर्जरी के बाद, 0 दिन (सर्जरी के बाद), 1, 3 और 7 में मौत के सभी कारणों के लिए जीवित रहने की दरों की जांच करें।
  2. 4-पॉइंट रेटिंग स्केल द्वारा पलक ड्रॉपिंग का आकलन करें: 1 = कोई ड्रॉपिंग, 2 = हल्के ड्रॉपिंग (~ 50%), 3 = गंभीर ड्रॉपिंग (50%), और 4 = आंखों के निर्वहन के साथ गंभीर ड्रॉपिंग।

4. रेटिना रक्त परफ्यूजन

  1. माउस के बाएं वेंट्रिकल में फिटसी-डेक्सट्रान (25 मिलीग्राम/एमएल) के 200 माइक्रोन इंजेक्ट करें, जिसका उपयोग आमतौर पर माउस रेटिना वाहिकाओं में रक्त परफ्यूजन के अवलोकन के लिए किया जाता है13,14।
  2. सर्कुलेशन के 2 मिनट बाद आंखों को इक्वेट करें और 1 घंटे के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में ठीक करें। रेटिना को ध्यान से प्राप्त किया गया था और फ्लैट-माउंटेड किया गया था, जैसा कि पहले15वर्णित था, और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के माध्यम से जांच की गई थी।
  3. 4x आवर्धन पर रेटिना पूरे माउंट की तस्वीरें लें और एक मर्ज एनालाइजर का उपयोग करके एकल में विलय करें, पहले16वर्णित हैं।
  4. NIH फिजी/ImageJ सॉफ्टवेयर में एक पोत विश्लेषण उपकरण के माध्यम से perfused क्षेत्रों को मापने ।

5. पश्चिमी दाग

  1. tBCCAO के 3 और 6 घंटे बाद, चूहों की आंखें प्राप्त करें और रेटिना को अलग करने के लिए ठंडे पीबीएस युक्त पेट्री डिश में तुरंत स्थानांतरित करें।
  2. रेटिना के अलगाव के बाद, पश्चिमी दाग प्रदर्शन, जैसा कि पहले9वर्णित है ।
  3. हाइपोक्सिया-अशिक्षित कारक-1α (HIF-1α; एक सामान्य हाइपोक्सिया मार्कर) और β-ऐक्टिन (एक आंतरिक लोडिंग नियंत्रण) के लिए एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेटिंग रातोंरात एचआरपी-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के इनक्यूबेशन के बाद। रसायनके माध्यम से संकेतों की कल्पना करें।

6. मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर)

  1. 6, 12 और 24 घंटे tBCCAO के बाद, qPCR के लिए प्राप्त रेटिना प्रक्रिया, जैसा कि पहले17वर्णित है ।
  2. वास्तविक समय पीसीआर प्रणाली के माध्यम से क्यूपीसीआर करें। उपयोग किए जाने वाले प्राइमर तालिका 1में सूचीबद्ध हैं। 11 टी विधि द्वारा विभिन्न प्रतिलिपियों के स्तर के बीच गुना परिवर्तन की गणना करें।

7. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी)

  1. tBCCAO के 3 दिन बाद, चूहों की आंखें प्राप्त करें और पैराफिन में एम्बेड करें।
  2. आंखों के वर्गों को प्राप्त करने के लिए एक माइक्रोटॉम द्वारा पैराफिन एम्बेडेड आंखों को काटें।
  3. डी-पैराफिनाइज और 5 माइक्रोन मोटाई के आंख वर्गों दाग के रूप में पहले13वर्णित है ।
  4. ग्लियल फिब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (GFAP; रेटिना में एस्ट्रोसाइट्स और मुलर कोशिकाओं के लिए एक विश्वसनीय मार्कर) के लिए एक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट रातोंरात एलेक्सा फ्लोर 555-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के इनक्यूबेशन के बाद।
  5. रेटिना में नाभिक को धुंधला करने के लिए DAPI (4′, 6-diamidino-2-फेनीलिंडोल) का उपयोग करें। फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के माध्यम से संकेतों की कल्पना करें।
  6. 4-पॉइंट रेटिंग स्केल द्वारा आकृति विज्ञान स्कोरिंग का आकलन करें, जैसा कि पहले13,18:0 = कोई संकेत नहीं, 1 = गैंगलियन सेल लेयर (जीसीएल) में कुछ सकारात्मक ग्लियल एंड-फीट, 2 = जीसीएल से बाहरी परमाणु परत (ओएनएल) तक पहुंचने वाली कुछ लेबल वाली प्रक्रियाएं, और 3 = सबसे लेबल वाली प्रक्रियाएं जीसीएल से ओएनएल तक पहुंचती हैं।

8. इलेक्ट्रोरेटिनोग्राफी (ईआरजी)

  1. 3 और 7 दिनों के बाद tBCCAO, एक Ganzfeld गुंबद, अधिग्रहण प्रणाली और एलईडी उत्तेजक का उपयोग कर ईआरजी प्रदर्शन, के रूप में पहले9वर्णित है ।
  2. रात भर अंधेरे अनुकूलन के बाद, मंद लाल बत्ती के तहत एमएमबी के संयोजन के साथ चूहों को एनेस्थेटाइज करें।
  3. विद्यार्थियों को फैलाने के लिए 0.5% ट्रॉपिडेमाइड और 0.5% फेनिलेफ्रीन के मिश्रित समाधान का उपयोग करें।
  4. कॉन्टैक्ट लेंस पर एक्टिव इलेक्ट्रोड रखें और रेफरेंस इलेक्ट्रोड को मुंह में रखें।
  5. प्रत्येक जानवर की दोनों आंखों से ईआरजी प्रतिक्रियाएं प्राप्त करें।
  6. विभिन्न उत्तेजनाओं के साथ अंधेरे अनुकूलन के तहत स्कोटोपिक प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करें।
  7. बेसलाइन से एक लहर के आयामों को मापने के लिए एक लहर के सबसे निचले बिंदु ।
  8. बी-वेव के शिखर तक ए-वेव के सबसे निचले बिंदु से बी-वेव के आयामों को मापें।
  9. हीट पैड का उपयोग करके प्रक्रिया के दौरान सभी चूहों को गर्म रखें।

9. ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (OCT)

  1. tBCCAO के 2 सप्ताह बाद, एसडी-OCT सिस्टम का उपयोग करके अक्टूबर करें, जैसा कि पहले8,9बताया गया था।
  2. माप के लिए, 0.5% ट्रॉपिकेमाइड और 0.5% फेनिलेफ्रीन के मिश्रित समाधान द्वारा मायड्रिसिस के अधीन चूहों और एमएमबी के मिश्रण से सामान्य संज्ञाहरण के लिए।
  3. एन-फेस स्कैन के भूमध्य रेखीय स्लाइस से बी स्कैन छवियों को प्राप्त करें।
  4. ऑप्टिक नर्व हेड से 0.2, 0.4 और 0.6 मिमी पर रेटिना की जांच करें।
  5. रेटिना तंत्रिका फाइबर परत (एनएफएल) से बाहरी सीमित झिल्ली (ईएलएम) तक रेटिना मोटाई को मापें, और एक व्यक्तिगत माउस की रेटिना मोटाई के रूप में मापा मूल्यों के औसत पर विचार करें।
  6. मकड़ी के आरेख के रूप में परिणामों की साजिश करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

2 मिनट के लिए फिटसी-डेक्सट्रान के प्रणालीगत परिसंचरण के बाद, नकली संचालित चूहों और टीबीसीसीएओ संचालित चूहों में बाएं और दाएं रेटिना के रेटिना वैक्यूल्चर की जांच की गई(अनुपूरक चित्रा 1)। फिटसी-डेक्सट्रान को दोनों रेटिना में नकली संचालित चूहों और टीबीसीएओ संचालित चूहों में बाएं रेटिना में पूरी तरह से दिखाई दिया था, जबकि यह टीबीसीएओ संचालित चूहों में सही रेटिना में आंशिक रूप से पता लगाने योग्य था ।

टीबीसीएओ के बाद पलक ड्रॉपिंग की जांच की गई(चित्रा 2)। दाहिनी आंखें हल्की दिखाई दीं (स्कोर 2; 75%) और गंभीर पलक (स्कोर 3 और 4; 25%) ड्रॉपिंग, जबकि बाईं आंखों में कोई ड्रॉपिंग नहीं थी (स्कोर 1; ९३.७५%) एक माउस को छोड़कर (स्कोर 2; 6.25%)। हालांकि टीबीसीएओ संचालित चूहों में आंखों के निर्वहन के साथ गंभीर पलक ड्रॉपिंग काफी नहीं देखी गई थी, लेकिन हम इस फेनोटाइप (स्कोर 4; 6.25%) के लिए एक माउस देख सकते थे।

ऊतकों में ऑक्सीजन की स्थिति कम होने से एचआईएफ-1α का स्थिरीकरण होता है और ईपीओ, वीजीएफ और बीएनआईपी 319,20,21जैसे कई हाइपोक्सिया-उत्तरदायी जीन शामिल होते हैं। सबसे पहले, एक सामान्य हाइपोक्सिक मार्कर HIF-1α का उपयोग करके आणविक जैविक हाइपोक्सिया का मूल्यांकन पश्चिमी ब्लॉटिंग(चित्र 3)के माध्यम से किया गया था। बढ़ी हुई HIF-1α अभिव्यक्ति काफी सही रेटिना 3 और 6 घंटे tBCCAO के बाद में मनाया गया था। इसके बाद, हाइपोक्सिया-उत्तरदायी जीन की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन क्यूपीसीआर(अनुपूरक चित्रा 2) केमाध्यम से किया गया । टीबीसीएओ के 6 घंटे बाद हाइपोक्सिया-उत्तरदायी जीन एक्सप्रेशन में कोई खास बदलाव नहीं आया। tBCCAO के 12 घंटे बाद, हमने पाया कि Binp3 अभिव्यक्ति में काफी वृद्धि हुई है और ईपीओ अभिव्यक्ति में थोड़ी वृद्धि सही रेटिना में दिखाई गई थी। tBCCAO के 24 घंटे बाद, हम भी सही रेटिना में Epo अभिव्यक्ति में थोड़ी वृद्धि मिल सकती है, हालांकि यह सांख्यिकीय महत्वपूर्ण नहीं था । TBCCAO संचालित चूहों में 6 से 24 घंटे तक Vegf अभिव्यक्ति नहीं बदली गई थी।

रेटिना रिएक्टिव ग्लियोसिस की जांच 3 दिन बाद टीबीसीएओ(चित्रा 4)के रूप में की गई थी , क्योंकि ग्लिया जैसे एस्ट्रोसाइट्स और मुलर कोशिकाओं का रेटिना इस्केमिया22से गहरा नाता रहा है । जीएफएपी का व्यापक रूप से रेटिना23में एस्ट्रोसाइट्स और मुलर कोशिकाओं का पता लगाने के लिए उपयोग किया गया है । सही रेटिना में GFAP लेबलिंग के लिए आकृति विज्ञान स्कोर का औसत नकली संचालित चूहों में दोनों रेटिना और tBCCAO संचालित चूहों में बाएं रेटिना के बीच सबसे अधिक था । GFAP अभिव्यक्ति के स्थानीयकरण के आधार पर, GFAP लेबलिंग में आकृति विज्ञान में परिवर्तन Müller कोशिकाओं की सक्रियण को प्रतिबिंबित करने के लिए माना जाता है ।

ईआरजी का उपयोग टीबीसीएओ(चित्रा 5)के बाद रेटिना शिथिलता की जांच करने के लिए किया गया था। दाईं आंख में बी-वेव के आयाम नाटकीय रूप से tBCCAO के बाद 3 और 7 दिनों में कमी आई । हालांकि, दाईं आंख में एक लहर के आयामों को काफी नहीं बदला गया था। जब बाईं आंख की बात आती है, तो हम ए-और बी-वेव्स(अनुपूरक चित्र 3)के आयामों में कोई परिवर्तन नहीं देख सकते थे ।

हमने TBCCAO(चित्रा 6)के बाद रेटिना मोटाई में परिवर्तन निर्धारित करने के लिए अक्टूबर का प्रदर्शन किया। दाईं आंख में रेटिना मोटाई नाटकीय रूप से tBCCAO के बाद 2 सप्ताह में वृद्धि हुई है, जबकि tBCCAO-और नकली संचालित चूहों के बीच बाईं आंख में रेटिना मोटाई में कोई अंतर नहीं था ।

Figure 1
चित्रा 1: मॉडल प्रक्रिया और Willis के सर्कल में रक्त परिसंचरण की योजनाबद्ध । एक योजनाबद्ध उदाहरण ने टीबीसीसीएओ-प्रेरित रेटिना इस्कीमिक माउस मॉडल प्रक्रिया और रेटिना को रक्त परिसंचरण दिखाया। सीसीए, ईसीए, आईसीए, पीसीए और ओपा क्रमशः आम कैरोटिड धमनी, बाहरी कैरोटिड धमनी, आंतरिक कैरोटिड धमनी, पीछे संवाद धमनी और नेत्र धमनी का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: tBCCAO के बाद पलक ड्रॉपिंग । संदर्भ छवियों के आधार पर पलक ड्रॉपिंग की गंभीरता का मूल्यांकन संदर्भ छवियों के आधार पर 4-पॉइंट रेटिंग द्वारा किया गया था: 1 = कोई ड्रॉपिंग, 2 = हल्के ड्रॉपिंग (~ 50% ड्रॉपिंग), 3 = गंभीर ड्रॉपिंग (50% से अधिक ड्रॉपिंग), और 4 = आंखों के निर्वहन के साथ गंभीर ड्रॉपिंग। टीबीसीएओ के बाद पलक ड्रॉपिंग देखी गई और प्रायोगिक अवलोकन के दौरान इसे बनाए रखा गया। परिणाम (नकली: एन = 10, tBCCAO: n = 16) एक तितर बितर डॉट साजिश के रूप में साजिश रची गई । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: TBCCAO के बाद HIF-1α स्थिरीकरण। प्रतिनिधि इम्यूनोब्लॉट्स और मात्रात्मक विश्लेषण (घंटे 3 के लिए समूह; दिखावा: एन = 3, tBCCAO: n = 6 और समूहों के लिए 6 घंटे; दिखावा और tBCCAO: n = 6) HIF-1α और β-Actin के लिए पता चला कि HIF-1α tBCCAO के बाद सही रेटिना 3 और 6 घंटे में स्थिर था । * पी एंड एलटी; 0.05। डेटा छात्र टीपरीक्षण का उपयोग कर विश्लेषण किया गया और ±मानसमान विचलन के साथ मतलब के रूप में प्रस्तुत किया । एल और आर क्रमशः बाएं और दाएं रेटिना के लिए खड़े हो जाओ । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: tBCCAO के बाद प्रतिक्रियाशील ग्लियोसिस। रेटिना के प्रतिनिधि sagittal वर्गों (नकली: एन = 4, tBCCAO: n = 4) और GFAP लेबलिंग के मात्रात्मक विश्लेषण (लाल) एक आकृति विज्ञान स्कोरिंग (0-3) द्वारा पता चला है कि GFAP लेबलिंग, ज्यादातर एनएफएल + GCL में प्रतिबंधित, पूरे भीतरी परत के लिए विस्तार किया गया था, जीसीएल से ओएनएल (सफेद तीर) के लिए सही रेटिना में स्केल बार, 50 माइक्रोन। रेटिना में नाभिक को धुंधला करने के लिए दापी (नीला) का उपयोग किया जाता था। एनएफएल, जीसीएल, आईपीएल, आईएनएल और ओएनएल क्रमशः तंत्रिका फाइबर परत, गैंगलियन सेल लेयर, इनर प्लेक्सीफॉर्म लेयर, इनर न्यूक्लियर लेयर और बाहरी परमाणु परत का प्रतिनिधित्व करते हैं। डेटा छात्र टीपरीक्षण का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था और इंटरक्वार्टिकल रेंज, 25 वीं और 75 वें शतमक के साथ औसत के रूप में प्रस्तुत किया । * पी एंड एलटी; 0.05। एल और आर क्रमशः बाएं और दाएं रेटिना के लिए खड़े हो जाओ । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: tBCCAO के बाद दाईं आंख में दृश्य रोग । (A)डार्क-अडॉप्टेड ईआरजी के प्रतिनिधि तरंग ने टीबीसीएओ के 3 और 7 दिन बाद प्रदर्शन किया । उत्तेजना तीव्रता (सीडी एस/एम2):0.005। (ख)मात्रात्मक विश्लेषणों से पता चला है कि दाईं आंख में बी-वेव के आयामों में कमी आई थी (नकली: एन = 5, tBCCAO: n = 6) जबकि ए-वेव के आयामों को नहीं बदला गया था। * पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.05, **पी एंड एलटी; 0.01। डेटा छात्र टीपरीक्षण का उपयोग कर विश्लेषण किया गया और ±मानसमान विचलन के साथ मतलब के रूप में प्रस्तुत किया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: tBCCAO के बाद रेटिना मोटाई में एक परिवर्तन । प्रतिनिधि OCT छवियों में नकली-और tBCCAO संचालित रेटिना और मात्रात्मक विश्लेषण से पता चला है कि सही रेटिना में रेटिना मोटाई में वृद्धि हुई थी (नकली: एन = 4, tBCCAO: n = 8) । बाएं रेटिना में रेटिना मोटाई में कोई परिवर्तन नहीं था (नकली: एन = 4, tBCCAO: n = 8)। स्केल बार क्रमशः 200 (ऊपरी) और 100 (निचले) माइक्रोन हैं। * पी एंड एलटी; 0.05। आरेखों की क्षैतिज धुरी में मान ऑप्टिक तंत्रिका सिर (0) से 0.2, 0.4 और 0.6 मिमी दूर प्रतिनिधित्व करते हैं जो हरे रंग की रेखा से पता लगाया गया था। डेटा दो तरह से ANOVA का उपयोग कर विश्लेषण किया गया एक Bonferroni पोस्ट हॉक परीक्षण के बाद । स्पाइडर आरेखों को ± मानक विचलन के साथ मतलब के रूप में प्रस्तुत किया गया था। एनएफएल, आईएनएल, ओएनएल और ईएलएम क्रमशः तंत्रिका फाइबर परत, आंतरिक परमाणु परत, बाहरी परमाणु परत और बाहरी सीमित झिल्ली हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 1: टीबीसीएओ के बाद रेटिना रक्त परफ्यूजन। फिटसी-डेक्सट्रान परिसंचरण और मात्रात्मक विश्लेषणों के 2 मिनट के बाद प्रतिनिधि रेटिना फ्लैट माउंट छवियों (प्रत्येक छवि के उच्च-आवर्धन के साथ) से पता चला कि नकली-संचालित चूहों में दोनों रेटिना में पूर्ण परफ्यूजन नमूदार था और टीबीसीएओ संचालित चूहों में बाएं रेटिना। हालांकि, टीबीसीएओ संचालित चूहों में सही रेटिना में आंशिक रक्त परफ्यूजन दिखाई दिया । डेटा छात्र टीपरीक्षण का उपयोग कर विश्लेषण किया गया और ±मानसमान विचलन के साथ मतलब के रूप में प्रस्तुत किया । एल और आर क्रमशः बाएं और दाएं रेटिना के लिए खड़े हो जाओ । स्केल बार क्रमशः 800 और 400 माइक्रोन हैं। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 2: tBCCAO के बाद हाइपोक्सिया-उत्तरदायी जीन की अभिव्यक्ति। मात्रात्मक विश्लेषणों ने टीबीसीसीएओ के 12 घंटे बाद सांख्यिकीय महत्व के साथ सही रेटिना में Bnip3 mRNA अभिव्यक्ति में क्षणिक वृद्धि दिखाई । ईपीओ एमआरएनए अभिव्यक्ति ने tBCCAO के बाद 24 घंटे के लिए सही रेटिना में बढ़ती प्रवृत्ति दिखाई, हालांकि इसके मूल्य नकली-संचालित सही रेटिना की तुलना में काफी अलग नहीं थे। **पी एंड एलटी; 0.01। डेटा छात्र टीपरीक्षण का उपयोग कर विश्लेषण किया गया और ±मानसमान विचलन के साथ मतलब के रूप में प्रस्तुत किया । इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्र 3: tBCCAO के बाद बाईं आंख में दृश्य समारोह। मात्रात्मक विश्लेषणों से पता चला है कि बाईं आंख में ए-और बी-तरंगों के आयामों में कोई परिवर्तन नहीं हुआ (नकली: एन = 5, tBCCAO: n = 6)। पी और जीटी; 0.05। डेटा छात्र टीपरीक्षण का उपयोग कर विश्लेषण किया गया और ±मानसमान विचलन के साथ मतलब के रूप में प्रस्तुत किया । इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 4: C57BL6 और BALB में tBCCAO के बाद जीवित रहने की दर। Kaplan-Meier अस्तित्व घटता है कि लगभग सभी चूहों C57BL6 चूहों में tBCCAO के बाद 3 दिनों के भीतर मर गया । जब बाल्ब चूहों की बात आती है, तो टीबीसीसीएओ में लंबे समय तक क्लैंपिंग समय अचानक और गंभीर पशु मृत्यु (7, 20 सेकंड पर जीवित रहने की दर: 10%, 10 सेकंड: 20%, 2 सेकंड: 81%, और 0 सेकंड: 95%)। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 5: एकतरफा सीसीएओ के बाद एचआईएफ-1α स्थिरीकरण। एक प्रतिनिधि इम्यूनोब्लॉट और मात्रात्मक विश्लेषण (नकली: एन = 3, एकतरफा सीसीएओ: एन = 3) HIF-1α और β-Actin के लिए पता चला है कि HIF-1α एकतरफा CCAO के बाद 3 घंटे रेटिना में स्थिर नहीं था । पी और जीटी; 0.05। डेटा छात्र टीपरीक्षण का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था और ±मानसमान विचलन के साथ मतलब के रूप में प्रस्तुत किया । एल और आर क्रमशः बाएं और दाएं रेटिना के लिए खड़े हो जाओ । इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्र 6: लंबे क्लैंपिंग समय के साथ टीबीसीएओ के बाद गंभीर पलक ड्रॉपिंग। tBCCAO के 10 सेकंड गंभीर पलक ड्रॉपिंग, जो एक 4 सूत्री रेटिंग पैमाने से मूल्यांकन किया गया था प्रेरित: 1 = कोई ड्रॉपिंग, 2 = हल्के ड्रॉपिंग (~50%), 3 = गंभीर ड्रॉपिंग (50%), और 4 = आंखों के निर्वहन के साथ गंभीर ड्रॉपिंग, जैसा कि चित्रा 2में वर्णित है। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

अध्ययन में, हमने दिखाया है कि tBCCAO, सरल टांके और एक क्लैंप का उपयोग कर, रेटिना इस्केमिया और रेटिना रोग के साथ प्रेरित कर सकता है । इसके अलावा, हमने रेटिना इस्केमिया के माउस मॉडल के विकास के लिए अपने वर्तमान प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया है रेटिना इस्कीमिया चोट मॉडल 2 ,3,7के विकास के लिए अन्य पिछले प्रोटोकॉलों की तुलना में आसान और तेज है।

शारीरिक रूप से, बाएं और दाएं मस्तिष्क धमनियों को पीछे की संचार धमनियों (पीसीए) के माध्यम से जोड़ा जा सकता है जो विलिस के सर्कल में संपाश्र्वक परिसंचरण प्रदान करते हैं ताकि व्यक्तिगत जहाजों के प्रवाह में रुकावट या व्यक्तिगत जहाजों के स्टेनोसिस के खिलाफ केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को पर्याप्त रक्त आपूर्ति बनाए रखा जा सके24,25 (चित्रा 1)। ली एट अल का प्रदर्शन रेटिना रक्त परफ्यूजन 10 मिनट देरी हो सकती है (जो ipsilateral रेटिना में रेटिना रक्त परफ्यूजन की एक पूरी नाकाबंदी नहीं है) C57BL6 चूहों में स्थाई एकतरफा CCAO द्वारा13। इसका तात्पर्य यह है कि सीसीएओ द्वारा रेटिना इस्केमिया को शामिल करना विलीस के सर्कल में कोलैटरल सर्कुलेशन की स्थितियों से निकटता से जुड़ा हुआ है । C57BL6 हमारे वर्तमान अध्ययन के माउस तनाव BALB26सहित सात माउस उपभेदों के बीच BCCAO द्वारा मस्तिष्क इस्केमिया के लिए सबसे अतिसंवेदनशील माउस तनाव के रूप में जाना जाता है । C57BL6 में Willis के अधूरे सर्कल के कारण, दोनों CCAs से मस्तिष्क रक्त की आपूर्ति में रुकावट केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में गंभीर नुकसान लाती है, अंत में मौत के लिए अग्रणी । इसके अलावा, हमारे प्रारंभिक अध्ययन में, हम लगभग सभी चूहों (लगभग 80%) सर्जरी(सप्लीमेंट्री फिगर 4)के बाद 3 दिनों के भीतर मृत्यु हो गई । इसलिए, हमने अपने वर्तमान अध्ययन के लिए एक और माउस तनाव बाल्ब पर tBCCAO लागू किया।

हमारे बाल्ब मॉडल में तीव्र रेटिना इस्कीमिक चोटों को प्रेरित करने के लिए, सही सीसीए को स्थायी रूप से लिगाट किया गया था और क्षणिक ऑक्सीलसेशन के माध्यम से तीव्र रेटिना इस्कीमिक तनाव को बढ़ावा देने के लिए बाएं सीसीए को लागू किया गया था। इसका कारण यह है कि चूहे इस्कीमिक तनाव को सहन नहीं कर सकते थे जो चूहों के विपरीत स्थायी बीसीसीएओ द्वारा प्रेरित होते हैं , जिनके पास विलीस27का पूरा चक्र है । इसके बाद, हमने ऑक्सक्लूज़न समय को अनुकूलित करने का प्रयास किया: बाएं सीसीएओ (0-20 सेकंड), क्योंकि ऑक्सक्लूशन समय को प्रमुख कारकों में से एक माना जाता है जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र पर इस्कीमिक चोटों को प्रभावित करता है और सीधे प्रायोगिक मॉडल28,29की जीवित रहने की दरों से जोड़ता है। हमने पाया कि बाल्ब चूहों की जीवित रहने की दर एक ऑक्सक्लूशन समय पर निर्भर तरीके से कम हो गई(अनुपूरक चित्रा 4)। 10 सेकंड से अधिक बाएं सीसीए के ऑक्क्यूशन ने गंभीर रूप से उच्च मृत्यु दर (50% से अधिक) दिखाया, जबकि 2 सेकंड या कोई ऑक्सक्लूशन (या एकतरफा सीसीएओ) के लिए बाएं सीसीए के ऑक्सयूनियन ने अपेक्षाकृत अधिक जीवित रहने की दर (80% से अधिक) दिखाई। इसलिए, हमने समूहों (ऑक्सक्लूशन समय जो 10 और 20 सेकंड है) को कुशल और लागत प्रभावी प्रयोगों के रूप में आगे के प्रयोगों के लिए बाहर रखा है। इसके बाद, हमने जांच की कि क्या 2 सेकंड के लिए बाएं सीसीए का ऑक्सक्लूशन या कोई ऑक्सक्लयूशन (या एकतरफा सीसीएओ) रेटिना हाइपोक्सिया को प्रेरित नहीं कर सकता है। HIF-1α एक प्रमुख नियामक हाइपोक्सिक प्रतिक्रियाओं में काम कर रहा है और हाइपोक्सिक शर्तों30के तहत स्थिर है । इस संबंध में, एचआईएफ-1α स्थिरीकरण हाइपोक्सिया के लिए एक सामान्य आणविक जैविक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया है। हम एकतरफा सीसीएओ(अनुपूरक चित्रा 5)के समूह में रेटिना में HIF-1α स्थिरीकरण का पता नहीं लगा सके । दिलचस्प बात यह है कि हम टीबीसीसीएओ(चित्रा 3)के 2 सेकंड के समूह में HIF-1α स्थिरीकरण का पता लगा सकते हैं। इसका मतलब है रेटिना हाइपोक्सिक तनाव बाल्ब चूहों में tBCCAO के 2 सेकंड से प्रेरित किया जा सकता है । इसलिए, क्लैंपिंग समय के 2 सेकंड अंततः सर्जरी और HIF-1α स्थिरीकरण के माध्यम से रेटिना इस्केमिया के शामिल होने के बाद उच्च जीवित रहने की दरों के आधार पर हमारे अध्ययन के लिए चुना गया ।

यद्यपि सही सीसीए को टीबीसीएओ-संचालित चूहों में स्थायी रूप से स्थाई रूप से डॉक्लेड किया गया था, लेकिन फिटसी-डेक्सट्रान(अनुपूरक चित्रा 1)के प्रणालीगत परिसंचरण के 2 मिनट बाद सही रेटिना में रक्त परफ्यूजन का आंशिक रूप से पता चला। इसके अलावा, हमने पाया कि HIF-1α स्थिरीकरण में एक बदलाव एकतरफा CCAO संचालित BALB चूहों में सही रेटिना में पता नहीं चला था । रेटिना(चित्रा 1)को रक्त की आपूर्ति बनाए रखने के लिए विलीस के सर्कल के माध्यम से कोलैटरल सर्कुलेशन के प्रभावों से इस घटना को समझाया जा सकता है। हालांकि हम स्पष्ट रूप से सही रेटिना के लिए रक्त परफ्यूजन पर छोड़ दिया क्षणिक CCAO के प्रभाव को समझ नहीं सका, क्षणिक स्थाई सही CCAO के साथ CCAO सही रेटिना में तीव्र हाइपोक्सिक अपमान को बढ़ावा देने के रूप में HIF में एक महत्वपूर्ण परिवर्तन का सबूत हो सकता है-1α अभिव्यक्ति में सही रेटिना में tBCCAO(चित्रा 3)के बाद । इसके अलावा, चूहों की जीवित रहने की दर बाएं सीसीए के ऑक्सक्यूशन समय पर निर्भर थी। एक साथ लिया, रेटिना इस्कीमिक तनाव की तीव्रता को बाएं CCAO के माध्यम से नियंत्रित किया जा सकता है ।

एक ड्रोपी पलक के फेनोटाइप को एक प्रस्तुत हस्ताक्षर या गंभीर न्यूरोलॉजिकल स्थितियों के रोगविज्ञानी लक्षण, विशेष रूप से इस्कीमिक स्ट्रोक31,32के रूप में सुझाया गया है। एक द्रोपी पलक से जुड़ी मांसपेशी लेवेटर पालपेब्रे सुपीरियर33है । इस मांसपेशी को पार्श्व पालपेब्रल धमनी द्वारा आपूर्ति की जाती है जो ओपीए से प्राप्त शाखाओं में से एक है। इसलिए, जब ओपा, जो रेटिना की आपूर्ति करता है, प्रभावित होता है, तो पलक ड्रॉपिंग देखी जा सकती है। पलक ड्रॉपिंग एमसीएओ माउस मॉडल34में देखा गया था, जिसे हमारे टीबीसीएओ मॉडल में भी पुन: पेश किया गया था। इसके अलावा, हमने बताया कि पलक ड्रॉपिंग गंभीर हो जाती है जब बाईं सीसीए के ऑक्सक्लूशन समय में अधिक समय लगता है(चित्रा 2 और अनुपूरक चित्रा 6)। इसका मतलब यह है कि पलक ड्रॉपिंग की गंभीरता (अप्रत्यक्ष रूप से रेटिना इस्कीमिक तनाव की तीव्रता के रूप में संदर्भित) बाएं सीसीए के ऑक्सीक्यूशन समय पर निर्भर हो सकती है।

रेटिना रोग चूहों में बीसीसीए के स्टेनोसिस सहित रेटिना इस्कीमिक रेटिनोपैथी में देखा गया परिणाम35 और चूहों में बीसीसीएओ36है। हमने पाया कि टीबीसीएओ संचालित चूहों में बी-वेव के आयामों में कमी आई। पिछले कई अध्ययनों से पता चला है कि एमसीएओ ने सर्जरी37, 38के बाद बी-वेव के आयाम में भी कमी की। बी-वेव रेटिना आंतरिक परतों में कोशिकाओं की एक शारीरिक स्थिति को दर्शाता है, जिसमें द्विध्रुवी कोशिकाएं और मुलर कोशिकाएं39शामिल हैं । इसके अलावा, Müller कोशिकाओं द्वारा प्रतिक्रियाशील ग्लियोसिस tBCCAO के बाद आंतरिक रेटिना परत में पाया गया था। एमसीएओ मॉडल 40 ,41और अन्य सीसीएओ मॉडल13,42 में भी इसका परिणाम पुन: उत्पन्नहोताहै . एक साथ लिया, इसका मतलब है कि आंतरिक रेटिना रोग tBCCAO द्वारा प्रेरित किया जा सकता है । रेटिना की मोटाई में क्षणिक वृद्धि हुई है. हमने टीबीसीएओ संचालित चूहों में इस खोज को पुन: पेश किया। इस डेटा से पता चलता है कि tBCCAO द्वारा रक्त परिसंचरण की हानि रेटिना तक पहुंच सकता है और अंत में रेटिना परतों को प्रभावित करते हैं ।

लगातार परिणामों के लिए, शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के एनेस्थेटिक समय और लंबाई के साथ-साथ अन्य कारक जैसे वजन और प्रायोगिक मॉडल की उम्र और सर्जरी के दौरान और बाद में उनके शरीर के तापमान को45मानकीकृत किया जाना चाहिए। विशेष रूप से, प्रयोगात्मक अवलोकन अवधि के दौरान चूहों के शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए ध्यान देने की आवश्यकता है। इसका कारण यह है कि हाइपोथर्मिया का पूर्वकंडीशनिंग प्रभाव हो सकता है और टीबीसीसीएओ46द्वारा इस्कीमिक प्रभावों में हस्तक्षेप हो सकता है। हालांकि हम अपने प्रयोगों में चूहों के सटीक शरीर के तापमान को मापने नहीं कर सका, हम चूहों गर्म करने के लिए हीटिंग पैड का इस्तेमाल किया जब तक चूहों पर्याप्त चेतना आ गया । इसके अलावा, हमने बेकाबू कारकों के संभावित भ्रामक प्रभावों को नियंत्रित करने के लिए नकली-संचालित चूहों के साथ tBCCAO-संचालित चूहों की तुलना की।

माउस उपभेदों tBCCAO द्वारा रेटिना इस्कीमिक चोट प्रेरित करने के लिए एक अतिरिक्त महत्वपूर्ण चर कारक हो सकता है । माउस उपभेदों में विलिस के सर्कल की पर्याप्त भिन्नता के परिणामस्वरूप रेटिना इश्सेमिया47 सहित सेरेब्रल इस्केमिया में अवांछित कमी या प्रेरण हो सकता है और इस प्रकार परिणामों की वेरिबिलिटी हो सकती है। चूहों के अन्य उपभेदों को लागू करने की आवश्यकता होने पर एक सफल टीबीसीसीएओ-प्रेरित इस्कीमिक रेटिनोपैथी के लिए क्लैंपिंग समय के समायोजन की सिफारिश की जाती है।

सामान्य तौर पर, स्ट्रोक या अन्य मस्तिष्क चोटों की घटनाओं को हमेशा अस्थायी या स्थायी विसन हानि48के साथ किया जाता है। आज तक, एमसीएओ माउस मॉडल का व्यापक रूप से स्ट्रोक अध्ययन के लिए उपयोग किया जाता है। चूंकि ओपा एमसीए की उत्पत्ति के लिए समीपस्थ उत्पन्न होता है, एमसीए में रक्त प्रवाह में कोई बाधा रेटिना के प्रवाह को बाधित करती है। रेटिना इस्केमिया को सबसे पहले एमसीएओ37द्वारा चूहों में प्रदर्शित किया गया था। बाद में, चूहों49पर एक ही रेटिना इस्कीमिक मॉडल लागू किया गया था। हालांकि, प्रक्रिया के लिए, ऑक्सक्लूज़न में 60 मिनट से अधिक समय लगता है और एक ऑक्सक्लूज़न साइट ढूंढना बेहद मुश्किल है क्योंकि एमसीए मस्तिष्क के अंदर गहरा दफन है। इसके अलावा, एमसीएओ के लिए फिलामेंट आकार और प्रविष्टि लंबाई सर्जरी की सफलता का बहुत फैसला करती है। वे अतिरिक्त चर कारक सर्जरी के बाद इस्कीमिक परिणामों की वेरिबिलिटीज को प्रेरित करते हैं। हालांकि tBCCAO और MCAO के बीच प्रत्यक्ष तुलना अध्ययन की जरूरत है, हम इस अध्ययन में हमारे प्रयोगात्मक मॉडल की लाभकारी सुविधाओं का वर्णन: कम occlusion समय, सरल प्रयोगात्मक प्रक्रिया और अत्यधिक सुलभ occlusion साइटों । यह मॉडल एमसीएओ मॉडल में देखी गई चिंताओं को हल कर सकता है।

जबकि रेटिना इस्केमिया के माउस मॉडल के उपयोग रेटिना इस्कीमिक चोट का अध्ययन करने के लिए महान लाभ है, इस दृष्टिकोण के लिए सीमाएं बनी हुई हैं। गर्दन में शल्य चिकित्सा चीरा के बाद से, लार ग्रंथियों के जुदाई और टांके के साथ सही सीसीए में ऑक्स्यूलेशन प्रक्रिया के लिए लागू किया जाना चाहिए, साथ ऊतक अवरोधों से संबंधित सूजन व्यवस्थित रूप से या कम से कम स्थानीय रूप से पैदा कर सकते हैं। इन चिंताओं को आंशिक रूप से नकली संचालित चूहों का उपयोग करके संबोधित किया गया था, जहां सभी शल्य चिकित्सा कदम सभी tBCCAO के बिना आयोजित किए जाते हैं । एक और मुद्दा दर्द के प्रबंधन की आवश्यकता है जो सर्जरी के दौरान और बाद में होती है। हमारे अध्ययन में, चूहों के दुख को रोकने के लिए दर्द प्रबंधन को बुटोफेनॉल टार्ट्रेट समाधान के इंजेक्शन के माध्यम से लागू किया गया था, जो फेनथहरीन श्रृंखला के कृत्रिम रूप से व्युत्पन्न ओपिओइड एगोनिस्ट-विरोधी एनाल्जेसिक था। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण हो सकता है कि विभिन्न प्रकार के एनेस्थेटिक्स और एनाल्जेसिक का उपयोग रेटिना इस्केमिया पर टीबीसीएओ के प्रभावों को बाधित कर सकता है। इस दृष्टिकोण के लिए एक और सीमा (वर्तमान में उपयोग किए गए अन्य मॉडलों के दृष्टिकोण के साथ) यह है कि यह मानव हृदय रेटिना विकारों से जुड़ी विकृतियों का एक आदर्श अनुकरण प्रदान नहीं करता है। आज तक, इस तरह के प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले माउस मॉडल सह-रुग्णताओं से पीड़ित नहीं होते हैं जो मनुष्यों में इस्कीमिक रेटिनोपैथी को रेखांकित करते हैं, मुख्य रूप से मधुमेह50जैसे मेटाबोलिक सिंड्रोम के साथ। ऐसी जटिलताएं जो वर्तमान माउस मॉडल में मौजूद नहीं हैं, इस्कीमिक रेटिनोपैथी के विकास के लिए रोग मार्गों पर नकारात्मक सहक्रियात्मक प्रभाव हो सकती हैं। इसलिए, हमारे tBCCAO माउस मॉडल सहित वर्तमान में उपयोग किए गए प्रयोगात्मक मॉडलों से परिणामों की व्याख्या करते समय इसे ध्यान में रखा जाना चाहिए। मनुष्यों में इस्कीमिक रेटिनोपैथी के रोगविज्ञान तंत्र को बेहतर ढंग से समझने के लिए, हमारे मॉडल को इस्कीमिक डायबिटिक रेटिनोपैथी के विकास के लिए स्ट्रेप्टोज़ोटोसिन इंजेक्शन51 या उच्च वसा आहार पूरक52 जैसे अन्य रोग कारकों के साथ जोड़ा जा सकता है। अंत में, भले ही हम tBCCAO संचालित चूहों में कम रेटिना रक्त perfusion दिखाया, हम स्पष्ट रूप से सही रेटिना के लिए रक्त परफ्यूजन पर छोड़ दिया क्षणिक CCAO के प्रभाव को समझ नहीं सका । इस मामले को लेजर-डॉप्लर का उपयोग करके संबोधित किया जा सकता है जिसका उपयोग आमतौर पर इस बात की पुष्टि करने के लिए किया जाता है कि ऑक्क्यूलेशन हुआ है और इस्केमिया वास्तविक समय53,54में वीवो में हुआ है। इस तकनीक का उपयोग एक व्यक्तिगत tBCCAO-संचालित माउस में रेटिना इस्केमिया की बेहतर समझ के लिए किया जा सकता है, जो कि विलिस के सर्कल में संपाश्र्वक परिसंचरण के बारे में है।

इन सीमाओं के बावजूद, यहां वर्णित हमारी tBCCAO विधि चूहों में रेटिना इस्केमिया का उत्पादन करने के लिए एक प्रभावी दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करती है। tBCCAO द्वारा रेटिना परिवर्तन का अध्ययन मनुष्यों में इस्कीमिक रेटिनोपैथी के रोग तंत्र को जानने में मदद करता है। इसके अलावा, हमें उम्मीद है कि tBCCAO माउस मॉडल वीवो दवा स्क्रीनिंग में के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (MEXT) से वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए अनुदान-सहायता (KAKENHI) (18K09424 to Toshihide Kurihara और 20K18393 Yukihiro Miwa) द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atipamezole hydrochloride Zenoaq Antisedan For anti-anesthesia
Applied Biosystems 7500 Fast Applied Biosystems - For qPCR
Butorphanol tartrate Meiji Seika Pharma Vetorphale For anesthesia
BZ-II Analyzer KEYENCE - For an image merge
BALB/cAJc1 CLEA - Mouse strain
β-Actin (8H10D10) Mouse mAb CST 3700 For western blot
Clamp Forcep World Precision Instruments WPI 500451 For surgery
Dumont forceps #5 Fine Science Tools 11251-10 For surgery
DAPI solution Dojindo 340-07971 For IHC
Envisu SD-OCT system Leica R4310 For OCT
FITC-dextran Merk FD2000S For retinal blood perfusion
Fluorescence microscope KEYENCE BZ-9000 For fluorescence detection
Gatifloxacin hydrate Senju Pharmaceutical Gachifuro For anti-bacterial infection
GFAP Monoclonal Antibody (2.2B10) Thermo 13-0300 For IHC
Heating pad Marukan RH-200 For surgery
HIF-1α (D1S7W) XP Rabbit mAb CST 36169 For western blot
ImageQuant LAS 4000 mini GE Healthcare - For chemiluminescence
Midazolam Sandoz K.K SANDOZ For anesthesia
Microtome Tissue-Tek TEC 6 Sakura - For sectioning
Medetomidine Orion Corporation Domitor For anesthesia
Needle holder Handaya HS-2307 For surgery
PuREC MAYO Corporation - For ERG
Scissor Fine Science Tools 91460-11 For surgery
Sodium hyaluronate Santen Pharmaceutical Hyalein For eye lubrication
Tropicamide/Penylephrine hydrochloride Santen Pharmaceutical Mydrin-P For mydriasis
6-0 silk suture Natsume E12-60N2 For surgery

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, B. Ocular effects of changes in oxygen and carbon dioxide tension. Transactions of the American Ophthalmological Society. 66, 423-474 (1968).
  2. Ingberg, E., Dock, H., Theodorsson, E., Theodorsson, A., Ström, J. O. Method parameters' impact on mortality and variability in mouse stroke experiments: a meta-analysis. Scientific Reports. 6 (1), 21086 (2016).
  3. Atochin, D. N., Clark, J., Demchenko, I. T., Moskowitz, M. A., Huang, P. L. Rapid Cerebral Ischemic Preconditioning in Mice Deficient in Endothelial and Neuronal Nitric Oxide Synthases. Stroke. 34 (5), 1299-1303 (2003).
  4. Allen, R. S., et al. Severity of middle cerebral artery occlusion determines retinal deficits in rats. Experimental Neurology. 254, 206-215 (2014).
  5. Steele, E. C., Guo, Q., Namura, S. Filamentous Middle Cerebral Artery Occlusion Causes Ischemic Damage to the Retina in Mice. Stroke. 39 (7), 2099-2104 (2008).
  6. Minhas, G., Morishita, R., Anand, A. Preclinical models to investigate retinal ischemia: advances and drawbacks. Frontiers in Neurology. 3, 75 (2012).
  7. McColl, B. W., Carswell, H. V., McCulloch, J., Horsburgh, K. Extension of cerebral hypoperfusion and ischaemic pathology beyond MCA territory after intraluminal filament occlusion in C57Bl/6J mice. Brain Res. 997 (1), 15-23 (2004).
  8. Jiang, A. X., et al. Inducement and Evaluation of a Murine Model of Experimental Myopia. Journal of Visualized Experiments. (143), e58822 (2019).
  9. Miwa, Y., et al. Pharmacological HIF inhibition prevents retinal neovascularization with improved visual function in a murine oxygen-induced retinopathy model. Neurochemistry International. 128, 21-31 (2019).
  10. Adams, S., Pacharinsak, C. Mouse Anesthesia and Analgesia. Current Protocols in Mouse Biology. 5 (1), 51-63 (2015).
  11. Speetzen, L. J., Endres, M., Kunz, A. Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia. Journal of Visualized Experiments. (75), e4387 (2013).
  12. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments. (47), e2423 (2011).
  13. Lee, D., Kang, H., Yoon, K. Y., Chang, Y. Y., Song, H. B. A mouse model of retinal hypoperfusion injury induced by unilateral common carotid artery occlusion. Experimental Eye Research. 201, 108275 (2020).
  14. Li, S., et al. Retro-orbital injection of FITC-dextran is an effective and economical method for observing mouse retinal vessels. Molecular Vision. 17, 3566-3573 (2011).
  15. Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo. Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).
  16. Lee, D., et al. A Fairy Chemical Suppresses Retinal Angiogenesis as a HIF Inhibitor. Biomolecules. 10 (10), (2020).
  17. Tomita, Y., et al. Pemafibrate Prevents Retinal Pathological Neovascularization by Increasing FGF21 Level in a Murine Oxygen-Induced Retinopathy Model. International Journal of Molecular Sciences. 20 (23), 5878 (2019).
  18. Yamamoto, H., Schmidt-Kastner, R., Hamasaki, D. I., Yamamoto, H., Parel, J. M. Complex neurodegeneration in retina following moderate ischemia induced by bilateral common carotid artery occlusion in Wistar rats. Experimental Eye Research. 82 (5), 767-779 (2006).
  19. Cheng, L., Yu, H., Yan, N., Lai, K., Xiang, M. Hypoxia-Inducible Factor-1α Target Genes Contribute to Retinal Neuroprotection. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 20 (2017).
  20. Mole, D. R., et al. Genome-wide association of hypoxia-inducible factor (HIF)-1alpha and HIF-2alpha DNA binding with expression profiling of hypoxia-inducible transcripts. The Journal of Biological Chemistry. 284 (25), 16767-16775 (2009).
  21. Majmundar, A. J., Wong, W. J., Simon, M. C. Hypoxia-Inducible Factors and the Response to Hypoxic Stress. Molecular Cell. 40 (2), 294-309 (2010).
  22. Newman, E. A. Glial cell regulation of neuronal activity and blood flow in the retina by release of gliotransmitters. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370 (1672), (2015).
  23. Vecino, E., Rodriguez, F. D., Ruzafa, N., Pereiro, X., Sharma, S. C. Glia-neuron interactions in the mammalian retina. Progress in Retinal and Eye Research. 51, 1-40 (2016).
  24. Symonds, C. The Circle of Willis. British Medical Journal. 1 (4906), 119 (1955).
  25. Lo, W. B., Ellis, H. The circle before willis: a historical account of the intracranial anastomosis. Neurosurgery. 66 (1), 7-18 (2010).
  26. Yang, G., et al. C57BL/6 strain is most susceptible to cerebral ischemia following bilateral common carotid occlusion among seven mouse strains: selective neuronal death in the murine transient forebrain ischemia. Brain Research. 752 (1), 209-218 (1997).
  27. Farkas, E., Luiten, P. G. M., Bari, F. Permanent, bilateral common carotid artery occlusion in the rat: A model for chronic cerebral hypoperfusion-related neurodegenerative diseases. Brain Research Reviews. 54 (1), 162-180 (2007).
  28. Morris, G. P., et al. A Comparative Study of Variables Influencing Ischemic Injury in the Longa and Koizumi Methods of Intraluminal Filament Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice. PLOS ONE. 11 (2), 0148503 (2016).
  29. Tsuchiya, D., Hong, S., Kayama, T., Panter, S. S., Weinstein, P. R. Effect of suture size and carotid clip application upon blood flow and infarct volume after permanent and temporary middle cerebral artery occlusion in mice. Brain Research. 970 (1-2), 131-139 (2003).
  30. Kaelin, W. G., Ratcliffe, P. J. Oxygen Sensing by Metazoans: The Central Role of the HIF Hydroxylase Pathway. Molecular Cell. 30 (4), 393-402 (2008).
  31. Pauly, M., Sruthi, R. Ptosis: evaluation and management. Kerala Journal of Ophthalmolgy. 31 (1), 11-16 (2019).
  32. Averbuch-Heller, L., Leigh, R. J., Mermelstein, V., Zagalsky, L., Streifler, J. Y. Ptosis in patients with hemispheric strokes. Neurology. 58 (4), 620 (2002).
  33. Dutton, J. Atlas of clinical and surgical orbital anatomy, second edition. 113, 1364 (2011).
  34. Ritzel, R. M., et al. Early retinal inflammatory biomarkers in the middle cerebral artery occlusion model of ischemic stroke. Molecular Vision. 22, 575-588 (2016).
  35. Crespo-Garcia, S., et al. Individual and temporal variability of the retina after chronic bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO). PLOS ONE. 13 (3), 0193961 (2018).
  36. Qin, Y., et al. Functional and morphologic study of retinal hypoperfusion injury induced by bilateral common carotid artery occlusion in rats. Scientific Reports. 9 (1), 80 (2019).
  37. Block, F., Grommes, C., Kosinski, C., Schmidt, W., Schwarz, M. Retinal ischemia induced by the intraluminal suture method in rats. Neuroscience Letters. 232 (1), 45-48 (1997).
  38. Allen, R. S., et al. Progesterone Treatment in Two Rat Models of Ocular Ischemia. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (5), 2880-2891 (2015).
  39. Miller, R. F., Dowling, J. E. Intracellular responses of the Müller (glial) cells of mudpuppy retina: their relation to b-wave of the electroretinogram. Journal of Neurophysiology. 33 (3), 323-341 (1970).
  40. Block, F., Grommes, C., Kosinski, C., Schmidt, W., Schwarz, M. Retinal ischemia induced by the intraluminal suture method in rats. Neuroscience Letters. 232 (1), 45-48 (1997).
  41. Lee, J. H., Shin, J. M., Shin, Y. J., Chun, M. H., Oh, S. J. Immunochemical changes of calbindin, calretinin and SMI32 in ischemic retinas induced by increase of intraocular pressure and by middle cerebral artery occlusion. Anatomy & Cell Biology. 44 (1), 25-34 (2011).
  42. Li, S. Y., et al. Lycium barbarum polysaccharides reduce neuronal damage, blood-retinal barrier disruption and oxidative stress in retinal ischemia/reperfusion injury. PLOS ONE. 6 (1), 16380 (2011).
  43. Furashova, O., Matthé, E. Retinal Changes in Different Grades of Retinal Artery Occlusion: An Optical Coherence Tomography Study. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (12), 5209-5216 (2017).
  44. Zadeh, J. K., et al. Short-Time Ocular Ischemia Induces Vascular Endothelial Dysfunction and Ganglion Cell Loss in the Pig Retina. International Journal of Molecular Sciences. 20 (19), (2019).
  45. Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. Rodent stroke model guidelines for preclinical stroke trials (1st edition). Journal of Experimental Stroke & Translational Medicine. 2 (2), 2-27 (2009).
  46. Tang, Y., et al. Hypothermia-induced ischemic tolerance is associated with Drp1 inhibition in cerebral ischemia-reperfusion injury of mice. Brain Research. 1646, 73-83 (2016).
  47. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 13 (4), 683-692 (1993).
  48. Pula, J. H., Yuen, C. A. Eyes and stroke: the visual aspects of cerebrovascular disease. Stroke and Vascular Neurology. 2 (4), 210 (2017).
  49. Steele, E. C., Guo, Q., Namura, S. Filamentous middle cerebral artery occlusion causes ischemic damage to the retina in mice. Stroke. 39 (7), 2099-2104 (2008).
  50. Sim, D. A., et al. The Effects of Macular Ischemia on Visual Acuity in Diabetic Retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 2353-2360 (2013).
  51. Wu, K. K., Huan, Y. Streptozotocin-induced diabetic models in mice and rats. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 5, Unit 5.47 (2008).
  52. Mubarak, A., Hodgson, J. M., Considine, M. J., Croft, K. D., Matthews, V. B. Supplementation of a high-fat diet with chlorogenic acid is associated with insulin resistance and hepatic lipid accumulation in mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61 (18), 4371-4378 (2013).
  53. Ansari, S., Azari, H., McConnell, D. J., Afzal, A., Mocco, J. Intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke with laser doppler flowmetry guidance in mice. Journal of Visualized Experiments. (51), e2879 (2011).
  54. Hedna, V. S., et al. Validity of Laser Doppler Flowmetry in Predicting Outcome in Murine Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion Stroke. Journal of Vascular and Interventional Neurology. 8 (3), 74-82 (2015).

Tags

मेडिसिन अंक 165 कैरोटिड धमनी ऑक्क्लुसियन इलेक्ट्रोरेटिनोग्राफी प्रायोगिक मॉडल हाइपोक्सिया इस्केमिया ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी रेटिना रिप्रफ्यूजन
क्षणिक द्विपक्षीय आम कैरोटिड धमनी Occlusion द्वारा प्रेरित इस्कीमिक रेटिना चोट का एक मुरीन मॉडल
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, D., Miwa, Y., Jeong, H., Ikeda, … More

Lee, D., Miwa, Y., Jeong, H., Ikeda, S. i., Katada, Y., Tsubota, K., Kurihara, T. A Murine Model of Ischemic Retinal Injury Induced by Transient Bilateral Common Carotid Artery Occlusion. J. Vis. Exp. (165), e61865, doi:10.3791/61865 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter