Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Murine Модель ишемической травмы сетчатки индуцированных переходных двусторонних общих сонной артерии окклюзии

Published: November 12, 2020 doi: 10.3791/61865
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,4, 1,2
1Laboratory of Photobiology, Keio University School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, Keio University School of Medicine, 3Animal eye care, Tokyo Animal Eye Clinic, 4Tsubota Laboratory, Inc.
* These authors contributed equally

Summary

Здесь мы описываем мышь модель ишемии сетчатки путем переходных двусторонних общих сонной артерии окклюзии с помощью простых швов и зажима. Эта модель может быть полезна для понимания патологических механизмов ишемии сетчатки, вызванной сердечно-сосудистыми аномалиями.

Abstract

Разнообразные сосудистые заболевания, такие как диабетическая ретинопатия, окклюзия вен сетчатки или артерий и ишемический синдром глаз могут привести к ишемии сетчатки. Для исследования патологических механизмов ишемии сетчатки необходимо разработать соответствующие экспериментальные модели. Анатомически основным кровоснабжающим сосудом сетчатки является офтальмологическая артерия (OpA), а ОпА происходит от внутренней сонной артерии общей сонной артерии (CCA). Таким образом, нарушение CCA может эффективно вызвать ишемию сетчатки. Здесь мы создали мышь модель ишемии сетчатки путем переходных двусторонних общих сонной артерии окклюзии (tBCCAO), чтобы связать правый CCA с 6-0 шелковых швов и окклюзии левой CCA переходный в течение 2 секунд через зажим, и показал, что tBCCAO может вызвать острую ишемию сетчатки, ведущих к дисфункции сетчатки. Нынешний метод снижает зависимость от хирургических инструментов только с помощью хирургических игл и зажима, сокращает время окклюзии, чтобы свести к минимуму неожиданную смерть животных, которая часто наблюдается в мышиных моделях окклюзии средней мозговой артерии, и поддерживает воспроизводимость общих ишемических выводов сетчатки. Модель может быть использована для исследования патофизиологии ишемической ретинопатии у мышей и далее может быть использована для скрининга препарата in vivo.

Introduction

Сетчатка является нейросенсорной тканью для зрительной функции. Так как значительное количество кислорода необходимо для зрительной функции, сетчатка известна как один из самых высоких кислорода требовательных тканей в организме1. Сетчатка подвержена сосудистым заболеваниям, так как кислород доставляется через кровеносные сосуды. Различные типы сосудистых заболеваний, таких как диабетическая ретинопатия и сетчатки кровеносных сосудов (вен или артерий) окклюзии, может вызвать ишемию сетчатки. Для исследования патологических механизмов ишемии сетчатки необходимы воспроизводимые и клинически значимые экспериментальные модели ишемии сетчатки. Окклюзия средней мозговой артерии (MCAO) путем вставки интралюминальной нити является наиболее часто используемый метод для развития виво-грызунов моделей экспериментальной ишемииголовного мозга 2,3. Из-за близости офтальмологической артерии (OpA) к MCA, модели MCAO также используются одновременно, чтобы понять патофизиологию ишемиисетчатки 4,5,6. Чтобы вызвать ишемию головного мозга наряду с ишемией сетчатки, длинные нити, как правило, вставляются через разрез общей сонной артерии (CCA) или внешней сонной артерии (ECA). Эти методы трудно выполнить, требуют длительного времени, чтобы завершить операцию (более 60 минут для одной мыши), и привести к высокой изменчивости в результатах послеоперации 7. По-прежнему важно разработать более качественую модель для улучшения этих проблем.

В этом исследовании мы просто использовали короткие переходные двусторонние окклюзии CCA (tBCCAO) с иглами и зажимом, чтобы вызвать ишемию сетчатки у мышей и проанализировали типичные результаты ишемических травм сетчатки. В этом видео мы дадим демонстрацию процедуры tBCCAO.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Медицинской школы Университета Кейо.

1. Подготовка хирургических инструментов и животных

  1. Автоклав хирургических инструментов и держать их в 70% этилового спирта. Перед каждой новой хирургической процедурой, чистые хирургические инструменты тщательно используя 70% этилового спирта.
  2. Подготовка самцов мышей BALB/cAJc1 (6 недель, 26-28 кг) в комнате, свободной от конкретных патогенов (SPF), для поддержания стерильных условий до, во время и после операции.

2. Переходные двусторонние общие окклюзии сонной артерии (tBCCAO)

  1. Поставь мышь под наркоз через внутриперитонеалевую инъекцию с сочетанием мидазолама (40 мкг/100 МКЛ), медетомидина (7,5 мкг/100 МКЛ) и буторфанола тарта (50 мкг/100 МКЛ), как описано ранее8,9. Держите спину мыши шкуры держать мышь подальше от натыкаясь глаза, пока мышь полностью анестезируется.
    1. Судите глубину анестезии, щипать мышеловку, пока она не имеет ответа, из которых метод обычно используется для проверки полной анестезии10.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, менее 5 минут, необходимых для мышей, чтобы заснуть. Правильные рецепты для общей анестезии могут быть разными по учреждениям.
  2. Нанесите одну каплю 0,1% очищенного гиалуроната натрия раствор глазной капли на глаза, чтобы предотвратить сухость на глазах под наркозом.
  3. Поместите мышь на спину и исправить лапы мыши с помощью клеевых лент.
  4. Дезинфицировать область шеи мыши с помощью 70% этилового спирта до операции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительная обрезка меха не была выполнена, так как это может привести к последующему воспалениюкожи 11,12.
  5. Выполните сагиттаальный разрез шеи лезвием(рисунок 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разрез должен быть сделан на средней линии между шеей, грудиной и трахеей.
  6. Отделяйте обе слюнные железы, тщательно используя два типса и мобилизуйте их для визуализации лежащих в основе CCAs.
  7. Изолировать право CCA тщательно от соответствующих вагальных нервов и сопровождающих вен, не нанося ущерба их структурам, и поместить два 6-0 шелковые швы под CCA. Свяжите две связи плотно, чтобы блокировать кровоток(рисунок 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время процедуры, небольшие вены могут быть повреждены. Если кровотечение видно, вытирая требуется для визуализации CCAs четко.
  8. Найти левый CCA тщательно от соответствующих вагальных нервов и сопровождающих вен, не нанося ущерба их структурам, и occlude левой CCA в течение 2 секунд зажимом (Рисунок 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: 6-0 шелковый шов иглы необходимо поместить под левой CCA, чтобы отметить сайт для зажима.
  9. После повторного открытия левой CCA, швовые раны шеи 6-0 шелковый шов и применить мазок антибиотика (50 МЛ) на шею, чтобы ингибировать бактериальную инфекцию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мягко удалить зажим, чтобы избежать повреждения артериальной стенки при повторном открытии левой CCA.
  10. Введать 0,75 мг/кг атипамизола гидрохлорид интраперитонально мыши, чтобы помочь мыши оправился от глубокой анестезии быстро. Верните мышь в клетку мыши с предварительно нагретыми прокладками.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте мыши оставить без присмотра, пока мышь не приходит достаточно сознания для поддержания стернальной лежачих.
  11. Ввесните 0,4 мг/кг тартрата буторфанола мыши для ведения боли, когда мышь просыпается.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь. В качестве первого намека на успешный tBCCAO, веки опустив мышь можно наблюдать (Рисунок 2).
  12. Для эвтаназии, вводить 3x смеси MMB для мышей и пожертвовать ими для экспериментов.

3. Общие наблюдения (выживаемость и опущение век)

  1. После операции проверьте выживаемость по всем причинам смерти в день 0 (после операции), 1, 3 и 7.
  2. Оцените опущение век по 4-очковой рейтинговой шкале: 1 - отсутствие опущения, 2 - мягкое опущение (50%), 3 - тяжелое опущение (более 50%) и 4 - тяжелое опущение с выделением глаз.

4. Перфузия крови сетчатки

  1. Ввись 200 л FITC-декстрана (25 мг/мл) в левый желудочек мыши, который обычно используется для наблюдения перфузии крови в сосудахсетчатки мыши 13,14.
  2. Через 2 минуты после кровообращения, enucleate глаза и исправить в 4% параформальдегид в течение 1 часа. Сетчатки были тщательно получены и плоские, как описано ранее15, и рассмотрены с помощью флуоресцентного микроскопа.
  3. Сфот фотографируете целые крепления сетчатки при 4x увеличении и сливайте в один с помощью анализатора слияния, ранее описанного16.
  4. Измерьте пронизанные области с помощью инструмента анализа судов в программном обеспечении NIH Fiji/ImageJ.

5. Западная помарка

  1. Через 3 и 6 часов после tBCCAO, получить глаза мышей и немедленно перейти к чашке Петри, содержащей холодный PBS изолировать сетчатку.
  2. После изоляции сетчатки, выполнять западные blotting, как ранее описано9.
  3. Инкубировать антителами для гипоксии-индуцированный фактор-1 "(HIF-1 "; общий маркер гипоксии) и для β-Actin (внутренний контроль загрузки) в одночасье следуют инкубации HRP-спряженных вторичных антител. Визуализуя сигналы с помощью химилюминесценции.

6. Количественный ПЦР (qPCR)

  1. 6, 12 и 24 часов после tBCCAO, процесс полученных сетчатки для qPCR, как описано ранее17.
  2. Выполните qPCR с помощью ПЦР-системы в режиме реального времени. Используемые праймеры перечислены в таблице 1. Рассчитайте изменения складок между уровнями различных транскриптов методомКС Т.

7. Иммуногистохимия (IHC)

  1. Через 3 дня после tBCCAO, получить глаза мышей и вставлять в парафин.
  2. Вырезать парафин-встроенные глаза микротом, чтобы получить секции глаз.
  3. Де-парафинизировать и испачкать глаз разделы толщиной 5 мкм, как описано ранее13.
  4. Инкубировать с антителом для глиального фибриллярного кислого белка (GFAP; надежный маркер для астроцитов и клеток Мюллера в сетчатке) в одночасье следуют инкубации Alexa Fluor 555-спряженных вторичных антител.
  5. Используйте DAPI (4',6-diamidino-2-фенилиндол) для окрашивания ядра в сетчатке. Визуализация сигналов с помощью флуоресцентной микроскопа.
  6. Оцените морфологию скоринга по 4-балльной рейтинговой шкале, как описаноранее 13,18: 0 - нет сигнала, 1 - несколько положительных глиальных конечных футов в слое ганглионных клеток (GCL), 2 - несколько обозначенных процессов, достигающих от GCL до внешнего ядерного слоя (ONL), и 3 - наиболее маркированные процессы, достигаемые от GCL до ONL.

8. Электроретинография (ERG)

  1. Через 3 и 7 дней после tBCCAO, выполните ERG с помощью купола Ganzfeld, системы приобретения и светодиодных стимуляторов, как описаноранее 9.
  2. После темной адаптации в одночасье, анестезировать мышей с сочетанием MMB под тусклым красным светом.
  3. Используйте смешанный раствор 0,5% тропикамида и 0,5% фенилэфрина для расширения зрачков.
  4. Поместите активные электроды на контактные линзы и поместите эталонный электрод во рту.
  5. Получите ответы ERG от обоих глаз каждого животного.
  6. Запись scotopic ответы под темной адаптации с различными стимулами.
  7. Измерьте амплитуды волны от базовой линии до самой низкой точки волны.
  8. Измерьте амплитуды b-волны от самой низкой точки а-волны до пика b-волны.
  9. Держите всех мышей в тепле во время процедуры с помощью тепловых колодок.

9. Оптическая когерентная томография (ОКТ)

  1. Через 2 недели после tBCCAO, выполнить OCT с помощью системы SD-OCT, как сообщалосьранее 8,9.
  2. Для измерения, субъект мышей к mydriasis смешанным раствором 0,5% тропикамида и 0,5% фенилэфрина, а также общей анестезии смесью MMB.
  3. Получить B сканирование изображений из экваториальных ломтиков ан-лицо сканирования.
  4. Изучите сетчатку на 0,2, 0,4 и 0,6 мм от головы зрительного нерва.
  5. Измерьте толщину сетчатки от слоя нервного волокна сетчатки (NFL) до внешней ограничивающей мембраны (ELM) и учитывайте среднее измеренное значение как толщину сетчатки отдельной мыши.
  6. Участок результаты, как паук диаграммы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

После системной циркуляции FITC-декстрана в течение 2 минут были обследованы сосуды сетчатки левой и правой сетчатки у фиктивных мышей и мышей, управляемых tBCCAO(Дополнительный рисунок 1). FITC-декстран был полностью виден в обеих сетчатках у фиктивных мышей и левой сетчатки у мышей, управляемых tBCCAO, в то время как он был частично обнаружен в правой сетчатке у мышей, управляемых tBCCAO.

После tBCCAO, опущение век было рассмотрено(рисунок 2). Правые глаза показали мягкий (оценка 2; 75%) и тяжелое веко (оценка 3 и 4; 25%) опустив, в то время как левые глаза не опустив (оценка 1; 93,75%) за исключением одной мыши (оценка 2; 6,25%). Хотя тяжелое опущение век с выделением глаз не наблюдалось у мышей, управляемых tBCCAO, мы могли видеть одну мышь для этого фенотипа (оценка 4; 6,25%).

Снижение кислородного статуса в тканях приводит к стабилизации HIF-1 и индукции ряда гипоксии-ответных генов, таких как EPO, VEGF и BNIP319,20,21. Во-первых, молекулярная биологическая гипоксия с использованием общего гипоксического маркера HIF-1 была оценена с помощью западного blotting(рисунок 3). Увеличение экспрессии HIF-1 было значительно отмечено в правой сетчатке через 3 и 6 часов после tBCCAO. Далее, выражения гипоксии-ответных генов были оценены с помощью qPCR(Дополнительный рисунок 2). Через 6 часов после tBCCAO не произошло существенных изменений в выражениях генов, реагирующих на гипоксию. Через 12 часов после tBCCAO, мы обнаружили, Binp3 выражение значительно увеличилось и небольшое увеличение экспрессии Epo было показано в правой сетчатке. Через 24 часа после tBCCAO, мы также могли бы найти небольшое увеличение экспрессии Epo в правой сетчатке, хотя это не было статистически значимым. Выражение Vegf не было изменено с 6 до 24 часов у мышей, управляемых tBCCAO.

Сетчатка реактивный глиоз был рассмотрен через 3 дня после tBCCAO (Рисунок 4), как глиа, такие как астроциты и клетки Мюллера были тесно связаны с ишемиейсетчатки 22. GFAP широко используется для обнаружения астроцитов и клеток Мюллера в сетчатке23. Средние показатели морфологии для маркировки GFAP в правой сетчатке был самым высоким среди обеих сетчатки у фиктивных мышей и левой сетчатки у мышей, управляемых tBCCAO. На основе локализации экспрессии GFAP считается, что изменение морфологии в маркировке GFAP отражает активацию клеток Мюллера.

ERG был использован для изучения дисфункции сетчатки после tBCCAO (Рисунок 5). Амплитуды b-волны в правом глазу резко снизились через 3 и 7 дней после tBCCAO. Однако амплитуды а-волны в правом глазу существенно не изменились. Когда дело доходит до левого глаза, мы не могли видеть никаких изменений в амплитуды а- и b-волн(Дополнительный рисунок 3).

Мы выполнили OCT, чтобы определить изменение толщины сетчатки после tBCCAO(рисунок 6). Толщина сетчатки в правом глазу резко увеличилась через 2 недели после tBCCAO, в то время как не было никакой разницы в толщине сетчатки в левом глазу между tBCCAO- и фиктивных мышей.

Figure 1
Рисунок 1: Схема модельной процедуры и кровообращения в кругу Уиллиса. Схематическая иллюстрация показала индуцированную tBCCAO модель модели сетчатки и кровообращение сетчатки. CCA, ECA, ICA, PCA и OpA представляют общую сонную артерию, внешнюю соонную артерию, внутреннюю соонную артерию, заднюю связуя артерию и офтальмологическую артерию, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Век опустился после tBCCAO. Тяжесть опущения век оценивалась по 4-очковому рейтингу, основанному на эталонных изображениях: 1 - отсутствие опущения, 2 - мягкое опущение (50% опущения), 3 - тяжелое опущение (более 50% опустив) и 4 - тяжелое опущение с выделением глаз. Опущение век наблюдалось после tBCCAO и поддерживалось в ходе экспериментального наблюдения. Результаты (sham: n No 10, tBCCAO: n No 16) были построены как участок рассеянной точки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Стабилизация HIF-1 после tBCCAO. Представитель иммуноблоскопов и количественных анализов (группы в течение часа 3; фиктивный: n No 3, tBCCAO: n No 6 и группы в течение часа 6; обман и tBCCAO: n No 6) для HIF-1 и β-Actin показали, что HIF-1 был стабилизирован в правой сетчатке 3 и 6 часов после tBCCAO. 0,05. Данные были проанализированы с помощью студента t-testи представлены как среднее с ± стандартных отклонений. L и R стоять для левой и правой сетчатки, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Реактивный глиоз после tBCCAO. Представитель sagittal разделы сетчатки (фиктивный: n No 4, tBCCAO: n No 4) и количественные анализы маркировки GFAP (красный) по морфологии скоринга (0-3) показали, что GFAP маркировки, в основном ограничивается в NFL-GCL, был расширен на весь внутренний слой, от GCL до ONL (белые стрелки) в правой сетчатке после tBCCAO. Шкала баров, 50 мкм. DAPI (синий) был использован для окрашивания ядра в сетчатке. NFL, GCL, IPL, INL и ONL представляют слой нервного волокна, слой ганглионных клеток, внутренний плексиформный слой, внутренний ядерный слой и внешний ядерный слой, соответственно. Данные были проанализированы с помощью студента t-testи представлены как медиана с межквартильным диапазоном, 25-м и 75-м процентильным. 0,05. L и R стоять для левой и правой сетчатки, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Визуальная дисфункция правого глаза после tBCCAO. (A)Репрезентативные волновые формы темно-адаптированной ERG выполняются через 3 и 7 дней после tBCCAO. Интенсивность стимуляции (cd.s/m2): 0.005. (B)Количественные анализы показали, что произошло снижение амплитуды b-волны в правом глазу (фиктивно: n No 5, tBCCAO: n No 6), в то время как амплитуды волны не изменились. 0,05, 0,01 л; 0,01. Данные были проанализированы с помощью студента t-testи представлены как среднее с ± стандартных отклонений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6: Изменение толщины сетчатки после tBCCAO. Репрезентативные изображения OCT в сетчатке сетчатки, работаемой в фиктивных и tBCCAO, и количественные анализы показали, что произошло увеличение толщины сетчатки в правой сетчатке (фиктивная: n No 4, tBCCAO: n No 8). Не произошло никаких изменений в толщине сетчатки левой сетчатки (фиктивно: n No 4, tBCCAO: n No 8). Шкала баров 200 (верхний) и 100 (нижний) мкм, соответственно. 0,05. Значения горизонтальной оси диаграмм представляют 0,2, 0,4 и 0,6 мм, удаленных от головы зрительного нерва (0), которая была обнаружена зеленой линией. Данные были проанализированы с помощью двухотверной ANOVA следуют Bonferroni пост-специальный тест. Диаграммы паука были представлены как средние ± стандартного отклонения. NFL, INL, ONL и ELM являются слоем нервного волокна, внутренним ядерным слоем, внешним ядерным слоем и внешней ограничивающей мембраной, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительная цифра 1: Перфузия крови сетчатки после tBCCAO. Репрезентативные изображения плоского монтажа сетчатки (с более высоким увеличением каждого изображения) после 2 мин циркуляции FITC-декстрана и количественные анализы показали, что полная перфузия наблюдается в обеих сетчатках у фиктивных мышей и левой сетчатке у мышей, управляемых tBCCAO. Тем не менее, правая сетчатка у мышей, управляемых tBCCAO, показала частичную перфузию крови. Данные были проанализированы с помощью студента t-testи представлены как среднее с ± стандартных отклонений. L и R стоять для левой и правой сетчатки, соответственно. Шкала баров составляет 800 и 400 мкм, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.

Дополнительная цифра 2: Выражение гипоксии-ответных генов после tBCCAO. Количественные анализы показали переходное увеличение экспрессии Bnip3 mRNA в правой сетчатке со статистической значимостью через 12 часов после tBCCAO. Выражение Эпо мРНК показало растущую тенденцию в правой сетчатке в течение 24 часов после tBCCAO, хотя его значения не были существенно отличаются по сравнению с фиктивной правой сетчаткой. 0,01. Данные были проанализированы с помощью студента t-testи представлены как среднее с ± стандартных отклонений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.

Дополнительная цифра 3: Визуальная функция в левом глазу после tBCCAO. Количественные анализы показали, что в левом глазу не произошло никаких изменений амплитуды а- и b-волн (фиктивно: n No 5, tBCCAO: n No 6). Пзгт; 0,05. Данные были проанализированы с помощью студента t-testи представлены как среднее с ± стандартных отклонений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.

Дополнительная цифра 4: Показатели выживаемости после tBCCAO в C57BL6 и BALB. Кривые выживаемости Каплан-Мейера показали, что почти все мыши погибли в течение 3 дней после tBCCAO у мышей C57BL6. Когда дело доходит до мышей BALB, более длительное время зажима в tBCCAO вызывает внезапную и тяжелую смерть животных (выживаемость в день 7, 20 сек: 10%, 10 сек: 20%, 2 сек: 81%, и 0 сек: 95%). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.

Дополнительная цифра 5: стабилизация HIF-1 после одностороннего ЦАО. Репрезентативный иммунобло и количественный анализ (фиктивный: n No 3, односторонний ЦАО: n No 3) для HIF-1 и β-Actin показали, что HIF-1 не стабилизировался в сетчатке через 3 часа после одностороннего CCAO. Пзгт; 0,05. Данные были проанализированы с помощью студенческого t-testи представлены как среднее с ± стандартных отклонений. L и R стоять для левой и правой сетчатки, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.

Дополнительная цифра 6: Тяжелое веко опускается после tBCCAO с длинным временем зажима. 10 секунд tBCCAO индуцированных тяжелое опущение век, который был оценен по 4-очковой рейтинговой шкале: 1 - нет опустив, 2 - мягкий опустив (50%), 3 - тяжелое опущение (более 50%), и 4 - тяжелое опущение с глазной разрядкой, как описано на рисунке 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В исследовании мы показали, что tBCCAO, используя простые швы и зажим, может вызвать ишемию сетчатки и сопутствующие дисфункции сетчатки. Кроме того, мы продемонстрировали наш текущий протокол для разработки мышиной модели ишемии сетчатки проще и быстрее по сравнению с другими предыдущими протоколами для развития ишемической травмысетчатки модели 2,3,7.

Анатомически, левые и правые мозговые артерии могут быть соединены через задние связуя артерии (PCAs) которые обеспечивают коллатерацию в круге Willis для поддержания адекватного кровоснабжения центральной нервной системы против прерывания течения от окклюзий или стеноза отдельных сосудов24,25 (Рисунок 1). Ли и др. продемонстрировали перфузии сетчатки крови может быть 10 мин задержки (что не является целой блокады перфузии крови сетчатки в ипсилатеральной сетчатке) постоянным односторонним CCAO в C57BL6мышей 13. Это означает, что индукция ишемии сетчатки ЦАО тесно связана с условиями коллатеральной циркуляции в кругу Уиллиса. C57BL6, как известно, наиболее восприимчивы штамм мыши к ишемии головного мозга BCCAO среди семи штаммов мыши, включая штамм мыши нашего нынешнего исследования BALB26. Из-за неполного круга Уиллис в C57BL6, прерывание кровоснабжения мозга от обоих CCAs вызывает серьезные повреждения в центральной нервной системе, в конечном итоге приводит к смерти. Кроме того, в нашем предварительном исследовании, мы не смогли вызвать tBCCAO в C57BL6, как почти все мыши (около 80%) умер в течение 3 дней после операции(дополнительный рисунок 4). Поэтому мы применили tBCCAO к другому штамму мыши BALB для нашего текущего исследования.

Чтобы вызвать острые ишемические травмы сетчатки в нашей модели BALB, правый CCA был постоянно ligated и левый CCA был применен для повышения острого ишемического стресса сетчатки через переходный окклюзии. Это потому, что мыши не могли терпеть ишемический стресс, вызванный постоянным BCCAO в отличие от крыс, которые имеют полный круг Уиллис27. Далее мы попытались оптимизировать время окклюзии: оставили ЦАО (0-20 секунд), так как время окклюзии считалось одним из ключевыхфакторов,влияющих на ишемические травмы центральной нервной системы и непосредственно связанных с выживаемостиэкспериментальных моделей 28,29. Мы обнаружили, что выживаемость мышей BALB снизилась в окклюзии зависимых от времени образом(Дополнительный рисунок 4). Окклюзия левого CCA в течение 10 секунд показала значительно более высокие показатели смертности (более 50%), в то время как окклюзия левого CCA в течение 2 секунд или без окклюзии (или одностороннего CCAO) показала относительно более высокие показатели выживаемости (более 80%). Поэтому мы исключили группы (время окклюзии, которое составляет 10 и 20 секунд) для дальнейших экспериментов, поскольку эффективные и экономически эффективные эксперименты не могут быть доступны. Далее, мы рассмотрели ли окклюзии левой CCA в течение 2 секунд или нет окклюзии (или одностороннее CCAO) может вызвать гипоксию сетчатки. HIF-1 является основным регулятором, функционирующим в гипоксических реакциях и стабилизируется в гипоксических условиях30. В этой связи стабилизация HIF-1 была использована в качестве общего молекулярного биологического маркера гипоксии. Мы не смогли обнаружить стабилизацию HIF-1 в сетчатке в группе одностороннего ЦАО(дополнительная цифра 5). Интересно, что мы смогли обнаружить стабилизацию HIF-1 в группе 2 секунды tBCCAO(рисунок 3). Это означает, что гипоксический стресс сетчатки может быть вызван 2 секундами tBCCAO у мышей BALB. Таким образом, 2 секунды времени зажима были, наконец, выбраны для нашего исследования на основе высоких показателей выживаемости после операции и индукции ишемии сетчатки через HIF-1 "стабилизации.

Хотя право CCA был постоянно occluded в tBCCAO-управляемых мышей, перфузия крови была частично обнаружена в правой сетчатке через 2 минуты после системной циркуляции FITC-декстран (Дополнительный рисунок 1). Кроме того, мы обнаружили, что изменение стабилизации HIF-1 не было обнаружено в правой сетчатке у односторонних мышей БАЛБ, управляемых ЦАО. Это явление можно объяснить эффектами коллатеральной циркуляции через круг Уиллиса для поддержания кровоснабжения сетчатки(рисунок 1). Несмотря на то, что мы не могли четко понять влияние левого переходного ЦАО на перфузию крови к правой сетчатке, переходный левый ЦАО вместе с постоянным правым ЦАО может повысить острые гипоксические оскорбления в правой сетчатке, о чем свидетельствует значительное изменение экспрессии HIF-1 "в правой сетчатке после tBCCAO(рисунок 3). Кроме того, выживаемость мышей зависела от времени окклюзии левого CCA. В совокупности интенсивность ишемического стресса сетчатки можно контролировать через левый ЦАО.

Фенотип опущенного века был предложен в качестве признака представления или патофизиологический симптом тяжелых неврологических заболеваний, особенно ишемического инсульта31,32. Мышцы, связанные с вялым веком levator palpebrae superioris33. Эта мышца поставляется боковой пальпебральной артерии, которая является одной из ветвей, полученных из OpA. Таким образом, когда OpA, которая поставляет сетчатки, влияет, век опустив можно было увидеть. Опустив век наблюдалось в модели мыши MCAO34, который также был воспроизведен в нашей модели tBCCAO. Кроме того, мы описали, что опущение век становится серьезным, когда время окклюзии левого CCA занимает большевремени (рисунок 2 и дополнительный рисунок 6). Это означает, что тяжесть опущения век (косвенно называют интенсивность ишемического стресса сетчатки) может зависеть от времени окклюзии левого CCA.

Дисфункция сетчатки является одним из результатов видели в сетчатке ишемической ретинопатии, включая стеноз BCCA умышей 35 и BCCAO укрыс 36. Мы обнаружили, что амплитуды b-волны уменьшились у мышей, управляемых tBCCAO. Несколько предыдущих исследований показали, что MCAO также вызвало снижение амплитуды b-волны послеоперации 37,38. b-волна отражает физиологическое состояние клеток во внутренних слоях сетчатки, включая биполярные клетки и клеткиМюллера 39. Кроме того, реактивный глиоз клеток Мюллера был обнаружен во внутреннем слое сетчатки после tBCCAO. Этот результат также воспроизводится в моделях MCAO40,41 и других моделяхЦАО 13,42. Взятые вместе, это означает, что внутренняя дисфункция сетчатки может быть вызвана tBCCAO. Сообщается, что толщина сетчатки увеличивается в острой ишемии сетчатки43,44. Мы также воспроизвели эту находку у мышей, управляемых tBCCAO. Эти данные показывают, что нарушение кровообращения tBCCAO может достичь сетчатки и, наконец, повлиять на слои сетчатки.

Для последовательных исходов, анестезии время и продолжительность хирургических процедур, а также другие факторы, такие как вес и возраст экспериментальных моделей и температуры тела во время и после операции должны бытьстандартизированы 45. В частности, внимание необходимо для поддержания температуры тела мышей на протяжении всего экспериментального периода наблюдения. Это потому, что переохлаждение может иметь предпосылки эффект и вмешиваться в ишемические эффекты tBCCAO46. Несмотря на то, что мы не могли измерить точную температуру тела мышей в наших экспериментах, мы использовали грелки для обогрева мышей, пока мыши не пришли в достаточное сознание. Кроме того, мы сравнили tBCCAO-управляемых мышей с фиктивных мышей для контроля потенциальных смешанных эффектов неконтролируемых факторов.

Штаммы мыши могут быть дополнительным важным переменным фактором, чтобы вызвать ишемическую травму сетчатки tBCCAO. Существенное изменение круга Уиллиса в штаммах мышей может привести к нежелательному сокращению или индукции ишемии головного мозга, включая ишемиюсетчатки 47 и тем самым может привести к изменчивости результатов. Корректировка времени зажима рекомендуется для успешного tBCCAO индуцированной ишемической ретинопатии, когда другие штаммы мышей должны быть применены.

В целом, случаи инсульта или других травм головного мозга неизменно сопровождаются временной или постоянной потерей визона48. На сегодняшний день модель мыши MCAO широко используется для изучения инсульта. Поскольку OpA возникает проксимальным к происхождению MCA, любое препятствие в кровотоке в MCA препятствует притоку к сетчатке. Ишемия сетчатки была впервые продемонстрирована у крыс MCAO37. Позже та же ишемическая модель сетчатки была применена к мышам49. Однако, для процедуры, окклюзия занимает более 60 минут и найти место окклюзии чрезвычайно трудно, как MCA похоронен глубоко внутри мозга. Кроме того, размер нити и длина вставки для MCAO в значительной степени решает успех операции. Эти дополнительные переменные факторы вызывают изменчивость ишемических исходов после операции. Хотя необходимы исследования прямого сравнения между tBCCAO и MCAO, мы описали полезные особенности наших экспериментальных моделей в этом исследовании: короткое время окклюзии, простая экспериментальная процедура и высокодоступные места окклюзии. Эта модель может решить проблемы, замеченные в моделях MCAO.

Хотя использование мышиной модели ишемии сетчатки имеет большие преимущества для изучения ишемической травмы сетчатки, остаются ограничения в этом подходе. Так как хирургический разрез в шею, разделение слюнных желез и окклюзии в правом CCA с швами должны быть применены для процедуры, сопутствующие нарушения ткани может вызвать связанное воспаление системно или по крайней мере локально. Эти проблемы были частично решены с помощью фиктивных мышей, где все хирургические шаги проводятся без tBCCAO. Другой проблемой является требование управления боль, которая возникает во время и после операции. В нашем исследовании, управление болью, чтобы предотвратить страдания мышей было применено путем инъекции буторфанола тартрат решение, синтетически полученных опиоидных агонист-антагонист анальгетик из серии фенантрен. Это может быть важно знать, что использование различных видов анестезии и анальгетиков может нарушить воздействие tBCCAO на ишемию сетчатки. Еще одним ограничением этого подхода (наряду с подходами используемых в настоящее время других моделей) является то, что он не обеспечивает идеального моделирования патологий, связанных с сердечно-сосудистыми нарушениями сетчатки человека. На сегодняшний день модели мышей, используемые для таких экспериментов, не страдают от со-заболеваемости, которые лежат в основе ишемической ретинопатии у людей, в основном с метаболическим синдромом,таким как диабет 50. Такие осложнения, которых нет в современных моделях мышей, могут оказать негативное синергетическое воздействие на патологические пути развития ишемической ретинопатии. Поэтому это следует учитывать при интерпретации результатов используемых в настоящее время экспериментальных моделей, включая нашу модель мыши tBCCAO. Чтобы лучше понять патофизиологические механизмы ишемической ретинопатии у человека, наша модель может быть объединена с другими патологическими факторами, такими как инъекциястрептозотоцина 51 илидиета с высоким содержанием жира дополнение 52 для развития ишемической диабетической ретинопатии. Наконец, несмотря на то, что мы показали снижение перфузии крови сетчатки у мышей, управляемых TBCCAO, мы не могли четко понять влияние левого переходного ЦАО на перфузию крови к правой сетчатке. Этот вопрос может быть решен с помощью лазерного доплера, который обычно используется для подтверждения того, что окклюзия имеет место и ишемия произошла в виво в режимереального времени 53,54. Этот метод может быть использован для лучшего понимания ишемии сетчатки в отдельных tBCCAO управляемых мыши, в отношении залогового кровообращения в кругу Уиллис.

Несмотря на эти ограничения, наш метод tBCCAO, описанный здесь, представляет собой эффективный подход к производству ишемии сетчатки у мышей. Изучение изменений сетчатки с помощью tBCCAO помогает разгадать патологические механизмы ишемической ретинопатии у человека. Кроме того, мы надеемся, что модель мыши tBCCAO может быть использована для скрининга на наркотики in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторов нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Гранты в помощь научным исследованиям (KAKENHI) (18K09424 Toshihide Kurihara и 20K18393 в Yukihiro Miwa) от Министерства образования, культуры, спорта, науки и техники (MEXT).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atipamezole hydrochloride Zenoaq Antisedan For anti-anesthesia
Applied Biosystems 7500 Fast Applied Biosystems - For qPCR
Butorphanol tartrate Meiji Seika Pharma Vetorphale For anesthesia
BZ-II Analyzer KEYENCE - For an image merge
BALB/cAJc1 CLEA - Mouse strain
β-Actin (8H10D10) Mouse mAb CST 3700 For western blot
Clamp Forcep World Precision Instruments WPI 500451 For surgery
Dumont forceps #5 Fine Science Tools 11251-10 For surgery
DAPI solution Dojindo 340-07971 For IHC
Envisu SD-OCT system Leica R4310 For OCT
FITC-dextran Merk FD2000S For retinal blood perfusion
Fluorescence microscope KEYENCE BZ-9000 For fluorescence detection
Gatifloxacin hydrate Senju Pharmaceutical Gachifuro For anti-bacterial infection
GFAP Monoclonal Antibody (2.2B10) Thermo 13-0300 For IHC
Heating pad Marukan RH-200 For surgery
HIF-1α (D1S7W) XP Rabbit mAb CST 36169 For western blot
ImageQuant LAS 4000 mini GE Healthcare - For chemiluminescence
Midazolam Sandoz K.K SANDOZ For anesthesia
Microtome Tissue-Tek TEC 6 Sakura - For sectioning
Medetomidine Orion Corporation Domitor For anesthesia
Needle holder Handaya HS-2307 For surgery
PuREC MAYO Corporation - For ERG
Scissor Fine Science Tools 91460-11 For surgery
Sodium hyaluronate Santen Pharmaceutical Hyalein For eye lubrication
Tropicamide/Penylephrine hydrochloride Santen Pharmaceutical Mydrin-P For mydriasis
6-0 silk suture Natsume E12-60N2 For surgery

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, B. Ocular effects of changes in oxygen and carbon dioxide tension. Transactions of the American Ophthalmological Society. 66, 423-474 (1968).
  2. Ingberg, E., Dock, H., Theodorsson, E., Theodorsson, A., Ström, J. O. Method parameters' impact on mortality and variability in mouse stroke experiments: a meta-analysis. Scientific Reports. 6 (1), 21086 (2016).
  3. Atochin, D. N., Clark, J., Demchenko, I. T., Moskowitz, M. A., Huang, P. L. Rapid Cerebral Ischemic Preconditioning in Mice Deficient in Endothelial and Neuronal Nitric Oxide Synthases. Stroke. 34 (5), 1299-1303 (2003).
  4. Allen, R. S., et al. Severity of middle cerebral artery occlusion determines retinal deficits in rats. Experimental Neurology. 254, 206-215 (2014).
  5. Steele, E. C., Guo, Q., Namura, S. Filamentous Middle Cerebral Artery Occlusion Causes Ischemic Damage to the Retina in Mice. Stroke. 39 (7), 2099-2104 (2008).
  6. Minhas, G., Morishita, R., Anand, A. Preclinical models to investigate retinal ischemia: advances and drawbacks. Frontiers in Neurology. 3, 75 (2012).
  7. McColl, B. W., Carswell, H. V., McCulloch, J., Horsburgh, K. Extension of cerebral hypoperfusion and ischaemic pathology beyond MCA territory after intraluminal filament occlusion in C57Bl/6J mice. Brain Res. 997 (1), 15-23 (2004).
  8. Jiang, A. X., et al. Inducement and Evaluation of a Murine Model of Experimental Myopia. Journal of Visualized Experiments. (143), e58822 (2019).
  9. Miwa, Y., et al. Pharmacological HIF inhibition prevents retinal neovascularization with improved visual function in a murine oxygen-induced retinopathy model. Neurochemistry International. 128, 21-31 (2019).
  10. Adams, S., Pacharinsak, C. Mouse Anesthesia and Analgesia. Current Protocols in Mouse Biology. 5 (1), 51-63 (2015).
  11. Speetzen, L. J., Endres, M., Kunz, A. Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia. Journal of Visualized Experiments. (75), e4387 (2013).
  12. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments. (47), e2423 (2011).
  13. Lee, D., Kang, H., Yoon, K. Y., Chang, Y. Y., Song, H. B. A mouse model of retinal hypoperfusion injury induced by unilateral common carotid artery occlusion. Experimental Eye Research. 201, 108275 (2020).
  14. Li, S., et al. Retro-orbital injection of FITC-dextran is an effective and economical method for observing mouse retinal vessels. Molecular Vision. 17, 3566-3573 (2011).
  15. Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo. Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).
  16. Lee, D., et al. A Fairy Chemical Suppresses Retinal Angiogenesis as a HIF Inhibitor. Biomolecules. 10 (10), (2020).
  17. Tomita, Y., et al. Pemafibrate Prevents Retinal Pathological Neovascularization by Increasing FGF21 Level in a Murine Oxygen-Induced Retinopathy Model. International Journal of Molecular Sciences. 20 (23), 5878 (2019).
  18. Yamamoto, H., Schmidt-Kastner, R., Hamasaki, D. I., Yamamoto, H., Parel, J. M. Complex neurodegeneration in retina following moderate ischemia induced by bilateral common carotid artery occlusion in Wistar rats. Experimental Eye Research. 82 (5), 767-779 (2006).
  19. Cheng, L., Yu, H., Yan, N., Lai, K., Xiang, M. Hypoxia-Inducible Factor-1α Target Genes Contribute to Retinal Neuroprotection. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 20 (2017).
  20. Mole, D. R., et al. Genome-wide association of hypoxia-inducible factor (HIF)-1alpha and HIF-2alpha DNA binding with expression profiling of hypoxia-inducible transcripts. The Journal of Biological Chemistry. 284 (25), 16767-16775 (2009).
  21. Majmundar, A. J., Wong, W. J., Simon, M. C. Hypoxia-Inducible Factors and the Response to Hypoxic Stress. Molecular Cell. 40 (2), 294-309 (2010).
  22. Newman, E. A. Glial cell regulation of neuronal activity and blood flow in the retina by release of gliotransmitters. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370 (1672), (2015).
  23. Vecino, E., Rodriguez, F. D., Ruzafa, N., Pereiro, X., Sharma, S. C. Glia-neuron interactions in the mammalian retina. Progress in Retinal and Eye Research. 51, 1-40 (2016).
  24. Symonds, C. The Circle of Willis. British Medical Journal. 1 (4906), 119 (1955).
  25. Lo, W. B., Ellis, H. The circle before willis: a historical account of the intracranial anastomosis. Neurosurgery. 66 (1), 7-18 (2010).
  26. Yang, G., et al. C57BL/6 strain is most susceptible to cerebral ischemia following bilateral common carotid occlusion among seven mouse strains: selective neuronal death in the murine transient forebrain ischemia. Brain Research. 752 (1), 209-218 (1997).
  27. Farkas, E., Luiten, P. G. M., Bari, F. Permanent, bilateral common carotid artery occlusion in the rat: A model for chronic cerebral hypoperfusion-related neurodegenerative diseases. Brain Research Reviews. 54 (1), 162-180 (2007).
  28. Morris, G. P., et al. A Comparative Study of Variables Influencing Ischemic Injury in the Longa and Koizumi Methods of Intraluminal Filament Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice. PLOS ONE. 11 (2), 0148503 (2016).
  29. Tsuchiya, D., Hong, S., Kayama, T., Panter, S. S., Weinstein, P. R. Effect of suture size and carotid clip application upon blood flow and infarct volume after permanent and temporary middle cerebral artery occlusion in mice. Brain Research. 970 (1-2), 131-139 (2003).
  30. Kaelin, W. G., Ratcliffe, P. J. Oxygen Sensing by Metazoans: The Central Role of the HIF Hydroxylase Pathway. Molecular Cell. 30 (4), 393-402 (2008).
  31. Pauly, M., Sruthi, R. Ptosis: evaluation and management. Kerala Journal of Ophthalmolgy. 31 (1), 11-16 (2019).
  32. Averbuch-Heller, L., Leigh, R. J., Mermelstein, V., Zagalsky, L., Streifler, J. Y. Ptosis in patients with hemispheric strokes. Neurology. 58 (4), 620 (2002).
  33. Dutton, J. Atlas of clinical and surgical orbital anatomy, second edition. 113, 1364 (2011).
  34. Ritzel, R. M., et al. Early retinal inflammatory biomarkers in the middle cerebral artery occlusion model of ischemic stroke. Molecular Vision. 22, 575-588 (2016).
  35. Crespo-Garcia, S., et al. Individual and temporal variability of the retina after chronic bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO). PLOS ONE. 13 (3), 0193961 (2018).
  36. Qin, Y., et al. Functional and morphologic study of retinal hypoperfusion injury induced by bilateral common carotid artery occlusion in rats. Scientific Reports. 9 (1), 80 (2019).
  37. Block, F., Grommes, C., Kosinski, C., Schmidt, W., Schwarz, M. Retinal ischemia induced by the intraluminal suture method in rats. Neuroscience Letters. 232 (1), 45-48 (1997).
  38. Allen, R. S., et al. Progesterone Treatment in Two Rat Models of Ocular Ischemia. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (5), 2880-2891 (2015).
  39. Miller, R. F., Dowling, J. E. Intracellular responses of the Müller (glial) cells of mudpuppy retina: their relation to b-wave of the electroretinogram. Journal of Neurophysiology. 33 (3), 323-341 (1970).
  40. Block, F., Grommes, C., Kosinski, C., Schmidt, W., Schwarz, M. Retinal ischemia induced by the intraluminal suture method in rats. Neuroscience Letters. 232 (1), 45-48 (1997).
  41. Lee, J. H., Shin, J. M., Shin, Y. J., Chun, M. H., Oh, S. J. Immunochemical changes of calbindin, calretinin and SMI32 in ischemic retinas induced by increase of intraocular pressure and by middle cerebral artery occlusion. Anatomy & Cell Biology. 44 (1), 25-34 (2011).
  42. Li, S. Y., et al. Lycium barbarum polysaccharides reduce neuronal damage, blood-retinal barrier disruption and oxidative stress in retinal ischemia/reperfusion injury. PLOS ONE. 6 (1), 16380 (2011).
  43. Furashova, O., Matthé, E. Retinal Changes in Different Grades of Retinal Artery Occlusion: An Optical Coherence Tomography Study. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (12), 5209-5216 (2017).
  44. Zadeh, J. K., et al. Short-Time Ocular Ischemia Induces Vascular Endothelial Dysfunction and Ganglion Cell Loss in the Pig Retina. International Journal of Molecular Sciences. 20 (19), (2019).
  45. Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. Rodent stroke model guidelines for preclinical stroke trials (1st edition). Journal of Experimental Stroke & Translational Medicine. 2 (2), 2-27 (2009).
  46. Tang, Y., et al. Hypothermia-induced ischemic tolerance is associated with Drp1 inhibition in cerebral ischemia-reperfusion injury of mice. Brain Research. 1646, 73-83 (2016).
  47. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 13 (4), 683-692 (1993).
  48. Pula, J. H., Yuen, C. A. Eyes and stroke: the visual aspects of cerebrovascular disease. Stroke and Vascular Neurology. 2 (4), 210 (2017).
  49. Steele, E. C., Guo, Q., Namura, S. Filamentous middle cerebral artery occlusion causes ischemic damage to the retina in mice. Stroke. 39 (7), 2099-2104 (2008).
  50. Sim, D. A., et al. The Effects of Macular Ischemia on Visual Acuity in Diabetic Retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 2353-2360 (2013).
  51. Wu, K. K., Huan, Y. Streptozotocin-induced diabetic models in mice and rats. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 5, Unit 5.47 (2008).
  52. Mubarak, A., Hodgson, J. M., Considine, M. J., Croft, K. D., Matthews, V. B. Supplementation of a high-fat diet with chlorogenic acid is associated with insulin resistance and hepatic lipid accumulation in mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61 (18), 4371-4378 (2013).
  53. Ansari, S., Azari, H., McConnell, D. J., Afzal, A., Mocco, J. Intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke with laser doppler flowmetry guidance in mice. Journal of Visualized Experiments. (51), e2879 (2011).
  54. Hedna, V. S., et al. Validity of Laser Doppler Flowmetry in Predicting Outcome in Murine Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion Stroke. Journal of Vascular and Interventional Neurology. 8 (3), 74-82 (2015).

Tags

Медицина Выпуск 165 Окклюзия сонной артерии Электроретинография Экспериментальные модели Гипоксия Ишемия Оптическая когерентная томография Сетчатка Реперфузия
Murine Модель ишемической травмы сетчатки индуцированных переходных двусторонних общих сонной артерии окклюзии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, D., Miwa, Y., Jeong, H., Ikeda, … More

Lee, D., Miwa, Y., Jeong, H., Ikeda, S. i., Katada, Y., Tsubota, K., Kurihara, T. A Murine Model of Ischemic Retinal Injury Induced by Transient Bilateral Common Carotid Artery Occlusion. J. Vis. Exp. (165), e61865, doi:10.3791/61865 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter