Summary
ここでは、単純な縫合糸とクランプを用いた一過性両側共通頸動脈閉塞によるレチナル虚血のマウスモデルについて述べている。このモデルは、心血管異常によって引き起こされる虚血の病的メカニズムを理解するのに有用である。
Abstract
糖尿病性網膜症、網膜静脈または動脈の閉塞、眼性虚血症候群などの多様な血管疾患は、網膜虚血を引き起こす可能性があります。レチナル虚血の病理的メカニズムを調べるには、関連する実験モデルを開発する必要がある。解剖学的に、主な眼の血液供給血管は眼動脈(OpA)であり、OpAは一般的な頸動脈(CCA)の内頚動脈に由来する。したがって、CCAの破壊は効果的に、虚血の原因となりうる。ここでは、一過性両側性一般的な頸動脈閉塞(tBCCAO)によるレチナル虚血のマウスモデルを確立し、右CCAを6-0シルク縫合糸で結び付け、クランプを介して左CCAを一時的に2秒間閉塞させ、tBCCAOが急性レチナル虚血を誘発し、性間機能障害を引き起こす可能性があることを示した。現在の方法は、手術針とクランプのみを使用することによって手術器具への依存を減らし、中大脳動脈閉塞のマウスモデルによく見られる予期せぬ動物の死を最小限に抑えるために閉塞時間を短縮し、一般的な再発性虚血所見の再現性を維持する。このモデルは、マウスにおける虚血性網膜症の病態生理を調べるのに利用でき、さらにインビボ薬物スクリーニングに使用することができる。
Introduction
このレティナは、視覚機能のための神経感覚組織である。視覚機能には相当量の酸素が必要であるため、このレティナは体内で最も酸素要求の多い組織の1つとして知られている。このレティナは、酸素が血管を介して送達される血管疾患の影響を受けやすい。糖尿病性網膜症や網膜血管(静脈または動脈)閉塞などの血管疾患の様々なタイプは、網膜虚血を誘発することができます。レチナル虚血の病理的メカニズムを調べるには、再現性と臨床的に関連する、レチナル虚血の実験モデルが必要と考えられる。中大脳動脈閉塞(MCAO)は、インビボ歯止め薬の実験用虚血2,3の開発に最も一般的に利用される方法である内無血フィラメントの挿入による。MCAに対する眼動脈(OpA)の近接性のために、MCAOモデルは、網膜虚血4、5、6の病態生理を理解するために同時に使用される。脳虚血を、レチナル虚血と共に誘導するために、長いフィラメントは通常、一般的な頸動脈(CCA)または外頸動脈(ECA)の切開を通して挿入される。これらの方法は、実行するのが困難であり、手術を完了するのに長い時間(1つのマウスで60分以上)を必要とし、手術後の結果に高い変動性をもたらす7。これらの懸念を改善するために、より良いモデルを開発することが依然として重要です。
本研究では、短い一過性の両側CCA閉塞(tBCCAO)を針とクランプで使用してマウスの裂精虚血を誘導し、陰部における虚血性傷害の典型的な結果を分析した。このビデオでは、tBCCAO の手順のデモンストレーションを行います。
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Protocol
ここに記載されている方法はすべて、慶應義塾大学医学部のIACUC(IACUC)の教育機関で承認されています。
1. 手術器具・動物の準備
- オートクレーブ手術器具を70%エチルアルコールに保ちます。新しい外科手術の前に、70%のエチルアルコールを使用して慎重に外科用器具を洗浄する。
- 雄BALB/cAJc1マウス(生後6週、26~28kg)を、手術前、手術中、手術後の無菌状態を維持するために、特異的病原体フリー(SPF)の部屋に準備します。
2. 一過性両側性大動脈閉塞(tBCCAO)
- ミダゾラム(40μg/100 μL)、メデトミジン(7.5 μg/100 μL)およびブトルファンノール酒石酸塩(50μg/100 μL)の組み合わせで腹腔内注射を介して麻酔下にマウスを入れて、前述の8,9と呼ばれる「MMB」と呼ばれる。マウスの背中のスキンを保持して、マウスが完全に麻酔状態になるまでマウスが目をぶつけないようにします。
- 麻酔の深さを判断するには、マウスのつま先を応答がなくなるまでつまんで、その方法は完全な麻酔10をチェックするために一般的に使用される。
注:一般的に、マウスが眠りに落ちるためには5分未満が必要です。全身麻酔のための適切なレシピは、機関によって異なる場合があります。
- 麻酔の深さを判断するには、マウスのつま先を応答がなくなるまでつまんで、その方法は完全な麻酔10をチェックするために一般的に使用される。
- 麻酔下で目の乾燥を防ぐために、0.1%精製したヒアルロン酸ナトリウムアイドロップ溶液を1滴ずつ目に塗布します。
- 背中にマウスを置き、粘着テープを使用してマウスの足を固定します。
- 手術前に70%エチルアルコールを使用してマウスの首の領域を消毒する。
注:毛皮の追加のクリッピングは、これが原因で、その後の皮膚の炎症11、12を引き起こす可能性があるため、実行されませんでした。 - 首の矢状切開をブレードで行う(図1)。
注意:切開は首、胸骨、気管の間の正中線で行う必要があります。 - 唾液腺を慎重に2つの鉗子を使って分離し、それらを動員して基礎となるCCAを視覚化する。
- 右のCCAをそれぞれの迷走神経とそれに付随する静脈から慎重に分離し、その構造を損なうことなく、CCAの下に2つの6-0シルク縫合糸を置きます。2つのネクタイをしっかりと結び、血流を遮断します(図1)。
注:手順中に、小さな静脈が損傷する可能性があります。出血が見られる場合は、CCAを明確に可視化するために拭き取る必要があります。 - 左のCCAを構造に害を与えることなく、それぞれの迷走神経とそれに付随する静脈から注意深く見つけ、クランプで2秒間左CCAを閉塞させる(図1)。
注:クランプ用の部位をマークするには、左CCAの下に6-0シルク縫合針を配置する必要があります。 - 左CCAを再開した後、6-0シルク縫合糸による首の縫合傷を、細菌感染を阻害するために、頸部に抗生物質(50μL)のダブを適用する。
注:左CCAを再開するときに動脈壁を損傷しないようにクランプを柔らかく取り外します。 - マウスをマウスに0.75mg/kg注入し、深部麻酔から回復したマウスを助けます。マウスをプリヒーテッドパッドでマウスケージに戻します。
注:マウスが胸骨の不備を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、マウスを放置しないでください。 - マウスが目を覚ますときの痛みの管理のために、マウスに0.4mg/kgのブトルファンノール酒を注入します。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。tBCCAOを成功させるための最初のヒントとして、マウスの眼瞼垂動が観察される(図2)。 - 安楽死のために、マウスにMMB混合物の3倍を注入し、実験のためにそれらを犠牲にする。
3. 一般的な観測(生存率と眼瞼下垂)
- 手術後、0日目(手術後)、1、3、7のすべての死因の生存率を確認してください。
- 4点の評価スケールで眼瞼垂れを評価する:1 = 垂れ下がらない、2 = 軽度の垂れ下がり(〜50%)、3 = 重度の垂れ下がり(50%以上)、4 = 眼の排出による重度の垂れ下がり。
4. レチン血性輸血
- マウスの左心室にFITC-dextran(25mg/mL)の200μLを注入し、マウスの眼科の血管13,14における輸血の観察に一般的に使用される。
- 循環後2分、目を欠核化し、4%パラホルムアルデヒドに1時間固定する。このレティナを注意深く得て平らに取り付け、先に説明した15を、蛍光顕微鏡を介して調べた。
- 4倍の倍率でレティナルマウント全体の写真を撮り、マージアナライザを使用して単一にマージします。
- NIH フィジー/ImageJ ソフトウェアの容器分析ツールを使用して、浸透した領域を測定します。
5. ウェスタンブロット
- tBCCAOの3時間及び6時間後、マウスの目を得て、すぐに冷たいPBSを含むペトリ皿に移して、レチナを単離する。
- レティナを分離した後、前述の9のようにウェスタンブロッティングを行う。
- 低酸素誘導因子-1α(HIF-1α;一般的な低酸素マーカー)およびβアクチン(内部ローディングコントロール)に対する抗体を一晩インキュベートし、続いてHRP共役二次抗体をインキュベートする。化学発光を介して信号を可視化.
6. 定量PCR (qPCR)
- 6、12および24時間後に、qPCRについて得られたレチナを処理し、前述の17.
- リアルタイム PCR システムを介して qPCR を実行します。使用するプライマーを 表 1に示します。ΔΔCT 法により、異なるトランスクリプトのレベル間の折り畳み変化を計算します。
7. 免疫検査(IHC)
- tBCCAOの3日後、マウスの目を得てパラフィンに埋め込む。
- パラフィン埋め込んだ目をミクロトームで切り、目の切片を得る。
- 前に説明した5μmの厚さの目の切片を脱パラフィン化し、染色する13.
- グリア線維性酸性タンパク質(GFAP;レチナにおけるアストロサイトおよびミュラー細胞の信頼できるマーカー)に対する抗体と一晩のインキュベート、続いてアレクサフルオール555結合二次抗体のインキュベーション。
- DAPI(4′,6-ジミジノ-2-フェニリンドール)を使用して、レチナの核を染色します。蛍光顕微鏡で信号を可視化。
- 前述の13、18:0=信号なし、1 = ガングリオン細胞層(GCL)の正のグリア端フィートの少ない、GCLから外核層(ONL)に到達する標識されたプロセスの数が少なく、3 = GCLからONLに到達する最もラベル付きされたプロセスで、4点の評価スケールでの形態スコア付けを評価する。
8. 電解法(ERG)
- tBCCAOの3日と7日後に、ガンツフェルトドーム、取得システムおよびLED刺激装置を用いてERGを行う、前述の9.
- 一晩の暗い適応の後、薄暗い赤色光の下でMMBの組み合わせでマウスを麻酔する。
- 0.5%のトロピックアミドと0.5%フェニレフリンの混合溶液を使用して瞳孔を拡張する。
- アクティブ電極をコンタクトレンズに置き、参照電極を口に入れます。
- 各動物の両眼からERG応答を得る。
- 様々な刺激で暗い適応の下でスコトピック応答を記録する。
- ベースラインから波の最低点までの波の振幅を測定します。
- 波の最も低い点からb波のピークまでのb波の振幅を測定します。
- ヒートパッドを使用して手順中にすべてのマウスを暖かく保ちます。
9. 光コハレンス断層撮影(OCT)
- tBCCAO の 2 週間後に、前に報告された8,9のように、SD-OCT システムを使用して OCTを実行します。
- 測定のために、対象マウスは0.5%のトロピックアミドと0.5%フェニレフリンの混合溶液によりマイドリア症を、MMBの混合物による全身麻酔にする。
- 赤道スライスのen-faceスキャンからBスキャン画像を取得します。
- 視神経の頭部から0.2、0.4および0.6mmのレティナを調べてください。
- レチナル神経繊維層(NFL)から外部制限膜(ELM)までのレチナル厚さを測定し、個々のマウスのレチナル厚として測定値の平均を考える。
- 結果をスパイダー ダイアグラムとしてプロットします。
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Representative Results
2分間のFITC-dextranの全身循環後、恥動マウスおよびtBCCAO操作マウスにおける左右のレチナの眼管切開を調べた(補足図1)。FITC-dextranは、tBCCAO操作マウスのシャム操作マウスと左レチナの両方で完全に見えるが、tBCCAO操作マウスの右左部内で部分的に検出可能であった。
tBCCAOの後、眼瞼垂れを調べた(図2)。右目は軽度(スコア2;75%)を示したと重度のまぶた (スコア 3 と 4; 25%)左目は垂れ下がっていない間、垂れ下がった(スコア1;93.75%)1つのマウス(スコア2;6.25%)を除く。tBCCAO操作マウスでは眼の排出による眼下垂がかなり認められなかったが、この表現型(スコア4;6.25%)のマウスが1匹見られた。
組織における酸素状態の低下は、HIF-1αの安定化とEPO、VEGFおよびBNIP319、20、21のような多くの低酸素応答性遺伝子の誘導をもたらす。 まず、一般的な低酸素マーカーHIF-1αを用いた分子生物学的低酸素症を、ウェスタンブロッティングを介して評価した(図3)。HIF-1α発現の増加は、tBCCAOの3時間及び6時間後の右レティナにおいて有意に観察された。次に、低酸素応答性遺伝子の式をqPCRを介して評価した(補足図2)。tBCCAOの6時間後に低酸素応答性遺伝子発現に有意な変化はなかった。tBCCAOの12時間後に、Binp3発現が大幅に増加し、右のレティナにEpo発現のわずかな増加が示されていることがわかりました。tBCCAOの24時間後、統計的に有意ではなかったが、右のレティナにおけるEpo発現のわずかな増加を見つけることができた。tBCCAO作動マウスではVegf発現が6~24時間変化しなかった。
tBCCAOの3日後にレチナル反応性グリオーシスを調べ(図4)、アストロサイトやミュラー細胞などのグリアが筋虚血22と密接に関連しているとして。GFAPは、レティナ23におけるアストロサイトおよびミュラー細胞の検出に広く使用されている。右レティナにおけるGFAP標識の形態スコアの平均は、恥動マウスのレティナとtBCCAO操作マウスの左レティナの両方の中で最も高かった。GFAP発現の局在化に基づいて、GFAPラベリングにおける形態の変化は、ミュラー細胞の活性化を反映すると考えられる。
ERGは、tBCCAO後のレチン機能障害を調べるために使用された(図5)。右目のb波の振幅は、tBCCAOの3日と7日後に劇的に減少した。しかし、右目の波の振幅は大きく変化しなかった。左目に関しては、a波とb波の振幅の変化は見えなかった(補足図3)。
OCT を実行して、tBCCAO の後のレチンの厚さの変化を決定しました (図 6)。右目のレチンの厚さはtBCCAOの2週間後に劇的に増加したが、tBCCAO-と恥を手術したマウスの間には左目のレチンの厚さに違いはなかった。
図1:ウィリスの円中におけるモデル手順と血液循環の模式図。模式図は、tBCCAO誘導性眼血管性マウスモデル手順およびレチナへの血液循環を示した。CCA、ECA、ICA、PCAおよびOpAは、共通の頸動脈、外頚動脈、内頚動脈、後頸動脈および眼動脈をそれぞれ表す。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:tBCCAO後に眼瞼が垂れ下がった。眼瞼垂れ下がりの重症度は、参照画像に基づいて4点の評価で評価された:1 = 垂れ下がりなし、2 = 軽度の垂れ下がり(〜50%垂れ下がり)、3=重度の垂れ(50%以上の垂れ下がり)、4= 眼の排出による重度の垂れ下がり。tBCCAO後に瞼垂れ下がって観察し、実験観察中に維持した。結果(sham: n = 10,tBCCAO: n =16)を散布ドットプロットとしてプロットした。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:tBCCAO後のHIF-1α安定化代表的な免疫ブロットおよび定量分析(時間3のグループ;シャム:n=3、tBCCAO:n=6および時間6;シャムおよびtBCCAO:n=6)のHIF-1αおよびβアクチンの場合、HIF-1αがtBCCAOの3時間および6時間後に右の無菌状態で安定化されたことを示した。*P < 0.05.データはスチューデントの t-testを用いて分析され、平均値として提示され、±標準偏差が示された。LとRは、それぞれ左右のレティナを表す。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4 tBCCAO後の反応性神経膠痛レチナの代表的な矢状部分(恥:n = 4、tBCCAO:n = 4)および形態スコアリングによるGFAPラベリング(赤)の定量分析(0–3)は、主にNFL+GCLで制限されているGFAPラベリングが、GCLからONL(白矢印)に拡張されたことを示した。スケールバー、50 μm。DAPI(青)は、レティナ内の核を染色するために使用した。NFL、GCL、IPL、INLおよびONLは、それぞれ神経線維層、神経節細胞層、内神経叢層、内核層および外核層を表す。データは Student の t-testを使用して分析され、四分位範囲である 25 パーセンタイルと 75 パーセンタイルの中央値として表示されます。*P < 0.05.LとRは、それぞれ左右のレティナを表す。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:tBCCAO後の右目の視覚障害(A) 暗黒化ERGの代表的な波形は、tBCCAOの3日と7日後に行った。刺激強度(cd.s/m2):0.005(B)定量分析は、右目のB波の振幅が減少していることを示した(sham:n = 5,tBCCAO:n=6)、波の振幅は変化しなかった。*P < 0.05, **P < 0.01.データはスチューデントの t-testを用いて分析され、平均値として提示され、±標準偏差が示された。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:tBCCAO後のレチンの厚さの変化偽およびtBCCAO作動性のレティナおよび定量分析における代表的なOCT画像は、右のレティナにおけるレチンの厚さの増加があったことを示した(sham: n = 4, tBCCAO: n = 8)。左口のレティナの厚さに変化はなかった(恥: n = 4,tBCCAO: n=8)。スケールバーは、それぞれ200(上)と100(下)μmです。*P < 0.05.図の横軸の値は、緑色の線で検出された視神経ヘッド(0)から0.2、0.4、0.6 mm離れた位置を表します。データは、双方向のANOVAを用いて、ボンフェローニ後ホックテストを使用して分析した。スパイダー図は、±標準偏差を持つ平均として提示されました。NFL、INL、ONLおよびELMは、それぞれ神経繊維層、内核層、外核層および外部制限膜である。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補助図1:tBCCAO後の腎血中灌流 FITC-dextran循環および定量分析の2分後の代表的なレチナルフラットマウント画像(各画像の高倍率)は、恥操作マウスのレチナとtBCCAO操作マウスの左レチナの両方で完全な灌流が観察可能であることを示した。しかし、tBCCAO作動マウスにおける右のレティナは部分的な輸血を示した。データはスチューデントの t-testを用いて分析され、平均値として提示され、±標準偏差が示された。LとRは、それぞれ左右のレティナを表す。スケールバーはそれぞれ800と400 μmです。 こちらをダウンロードしてください。
図2:tBCCAO後の低酸素応答性遺伝子の表現 定量的分析は、tBCCAOの12時間後に統計的有意性を有する右レチナにおける Bnip3 mRNA発現の一時的な増加を示した。 EPO mRNA発現は、tBCCAO後24時間右のレティナで増加傾向を示したが、その値は、偽作動性右レティナと比較して有意に異なっていなかった。**P < 0.01.データはスチューデントの t-testを用いて分析され、平均値として提示され、±標準偏差が示された。 こちらをダウンロードしてください。
補助図3:tBCCAO後の左目の視覚機能 定量的分析は、左目のa波とb波の振幅に変化がないことを示した(sham: n = 5, tBCCAO: n = 6)。P > 0.05.データはスチューデントの t-testを用いて分析され、平均値として提示され、±標準偏差が示された。 こちらをダウンロードしてください。
補足図4:C57BL6およびBALBにおけるtBCCAO後の生存率。 カプランマイヤー生存曲線は、C57BL6マウスでtBCCAOの後にほぼすべてのマウスが3日以内に死亡したことを示した。BALBマウスに関しては、tBCCAOのクランプ時間が長いと、突然および重度の動物死亡(7日目、20秒の生存率:10%、10秒:20%、2秒:81%、0秒:95%)が突然かつ重度の動物死亡を誘発する。 こちらをダウンロードしてください。
補足図5:一方的CCAO後のHIF-1α安定化 HIF-1αおよびβアクチンに対する代表的な免疫ブロットおよび定量分析(sham:n = 3、一方的CCAO:n=3)は、一方的なCCAOの3時間後にHIF-1αがレチナで安定していないことを示した。P > 0.05.データはスチューデントの t-testを用いて分析され、平均値として±標準偏差で提示された。LとRは、それぞれ左右のレティナを表す。 こちらをダウンロードしてください。
補助図6:長いクランプ時間でtBCCAO後に激しい眼瞼が垂れ下がった。 tBCCAOの10秒間は、4点の評価尺度で評価された重度の眼瞼垂れ下がりを誘発した:1=下垂なし、2=軽度の垂れ下がり(〜50%)、3=重度の垂れ(50%以上)、および4= 図2に記載されているように、眼の排出による重度の垂れ下がり。 こちらをダウンロードしてください。
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Discussion
この研究では、単純な縫合糸とクランプを使用したtBCCAOが、眼科虚血およびそれに伴う筋機能障害を引き起こす可能性があることを示している。さらに、我々は、レチナル虚血のマウスモデルの開発のための我々の現在のプロトコルは、2、3、7の陰部虚血損傷モデルの開発のための他の以前のプロトコルと比較してより簡単かつ迅速であることを実証した。
解剖学的には、左右の大脳動脈は、個々の血管24,25の閉塞または狭窄からの流れの中断に対して中枢神経系への十分な血液供給を維持するためにウィリスの円中に副循環を提供する後部伝達動脈(PCA)を介して接続することができる(図1)。Leeら. 示されたレチナル血中灌流は、C57BL6マウス13における永久一方的なCCAOによる10分遅延(これは、20分のレチナラにおける失血の全遮断ではない)であり得る。これは、CCAOによる虚血の再発の誘導が、ウィリスの円中の副循環の条件と密接に関連していることを意味する。C57BL6は、現在の研究のマウス株BALB26を含む7つのマウス株の中でBCCAOによって脳虚血に最も影響を受けやすいマウス株であることが知られている。C57BL6のウィリスの不完全なサークルのために、両方のCCAからの脳の血液供給の中断は、最終的に死につながる中枢神経系に深刻な損傷を誘発する。さらに、我々の予備研究では、ほぼすべてのマウス(約80%)としてC57BL6でtBCCAOを誘導することができなかった手術後3日以内に死亡した(補足図4)。そこで、現在の研究のために別のマウス株BALBにtBCCAOを適用しました。
BALBモデルで急性のレチナル虚血性傷害を誘発するために、右CCAは永久に結紮され、左CCAは一過性閉塞を通して急性の陰性虚血性ストレスを高めるために適用された。これは、マウスがウィリス27の完全な円を持つラットとは異なり、永久的なBCCAOによって誘発される虚血性ストレスを許容できなかったためです。次に、閉塞時間を最適化しようとしました:左CCAO(0-20秒)、閉塞時間は中枢神経系への虚血性損傷に影響を与え、実験モデル28、29の生存率と直接接続する重要な要因の1つと考えられています。BALBマウスの生存率は閉塞時間依存的に減少することがわかった(補足図4)。10秒にわたる左CCAの閉塞は死亡率が著しく高く(50%以上)、左CCAの閉塞は2秒間または一方的なCCAO(または一方的なCCAO)は比較的高い生存率(80%以上)を示した。そこで、効率的で費用対効果の高い実験が利用できないため、さらなる実験のためにグループ(10秒と20秒の閉塞時間)を除外しました。次に、左CCAの閉塞を2秒間または閉塞なし(または一方的なCCAO)が無口低酸素症を誘発しうるかどうかを調べた。HIF−1αは、低酸素応答において機能する主要な調節因子であり、低酸素状態30の下で安定化される。この点に関して、HIF−1α安定化は低酸素症の一般的な分子生物学的マーカーとして用いられている。一方的なCCAOのグループのレチナにおけるHIF-1α安定化を検出できなかった(補足図5)。興味深いことに、tBCCAOの2秒の群でHIF-1α安定化を検出することができた(図3)。これは、BALBマウスにおけるtBCCAOの2秒によって陰部低酸素ストレスが誘発される可能性があることを意味する。そこで、HIF-1α安定化によるレチナル虚血の手術および誘導後の高い生存率に基づいて、クランプ時間の2秒が最終的に選択されました。
右CCAはtBCCAO作動マウスで永久に閉塞していたが、FITC-dextranの全身循環の2分後に右のレティナで血中灌流が部分的に検出された(補足図1)。さらに、一方的なCCAO操作BALBマウスでは、右のレティナではHIF-1α安定化の変化が検出されないことがわかりました。この現象は、ウィリスの円を通る副循環が、遺失症への血液供給を維持する効果によって説明することができる(図1)。左一過性CCAOが右口への輸血に及ぼす影響を明確に理解できなかったにもかかわらず、一過性の左CCAOと永久右CCAOは、tBCCAO後の右口のHIF-1α発現の有意な変化によって証明されるように、右口の急性低酸素性侮辱を後押しする可能性がある(図3)。また、マウスの生存率は、左CCAの閉塞時間に依存していた。一緒に考えて、左CCAOを介して、眼科虚血性ストレスの強度を制御することができます。
下垂眼瞼の表現型は、重度の神経学的状態の提示徴候または病態生理学的症状として示唆されているが、特に虚血性脳卒中31,32。下垂眼瞼に関連する筋肉は、浮上性パルペブレーの上司33である。この筋肉は、OpA由来の枝の一つである側側の手動動脈によって供給される。したがって、眼炎を供給するOpAが影響を受けると、まぶたの垂れ下がって見ることができました。MCAOマウスモデル34では瞼垂れ下がったが、これは当社のtBCCAOモデルでも再現された。また、左CCAの閉塞時間が長くなると眼瞼の垂れ下がりが激しくなることを説明した(図2および補足図6)。これは、眼瞼垂れ下がりの重症度(間接的に、眼性虚血性ストレスの強度と呼ばれる)が、左CCAの閉塞時間に依存する可能性があることを意味する。
網膜機能障害は、ラット36におけるマウス35およびBCCAOにおけるBCCAの狭窄を含む網膜虚血性網膜症に見られる結果の一つである。tBCCAO操作マウスではb波の振幅が減少することがわかりました。いくつかの以前の研究は、MCAOも手術後のb波の振幅の減少を引き起こしたことを示しました 37,38.b波は、双極細胞およびミュラー細胞39を含む、内層の細胞の生理学的状態を反映する。さらに、ミュラー細胞による反応性グリオシスは、tBCCAO後の内皮性筋層で検出された。この結果は、MCAOモデル40、41および他のCCAOモデル13、42でも再現される。まとめると、内性筋機能障害がtBCCAOによって誘発される可能性があることを意味します。レチナル厚さは急性の虚血43,44において一過性に増加すると報告されている。また、この発見をtBCCAO操作マウスでも再現した。このデータは、tBCCAOによる血液循環の障害が、残線に到達し、最終的に、残線層に影響を与える可能性があることを示しています。
一貫した結果のために、麻酔の時間と手術の長さだけでなく、実験モデルの重量や年齢、および手術中および手術後の体温などの他の要因を標準化する必要があります45.特に、実験観察期間を通じてマウスの体温を維持するために注意が必要である。これは、低体温症が予備調整効果を有し、tBCCAO46によって虚血効果を妨げる可能性があるためである。実験ではマウスの正確な体温を測定できませんでしたが、マウスが十分な意識を取り戻すまで、加熱パッドを使用してマウスを温めました。さらに、tBCCAOが操作するマウスをシャム操作マウスと比較して、制御不能な因子の潜在的な交交する影響を制御した。
マウス株は、tBCCAOによって陰性虚血性損傷を誘発する追加の重要な可変因子であり得る。マウス株におけるウィリスの円のかなりの変動は、レチナル虚血47 を含む脳虚血の望ましくない減少または誘導をもたらし、それによって結果の変動につながる可能性がある。他のマウス株を適用する必要がある場合、tBCCAO誘発性虚血性網膜症を成功させるためにクランプ時間の調整が推奨される。
一般に、脳卒中または他の脳損傷の事件は、常に一時的または永久的なビザン損失48を伴う。現在までに、MCAOマウスモデルは脳卒中研究に広く使用されています。OpAはMCAの起源に近い発端となるため、MCAの血流の障害は、失尿への流れを妨げる。レチナル虚血は、まずMCAO37によってラットで実証された。その後、同じレチナル虚血モデルをマウス49に適用した。しかし、この処置では、閉塞は60分以上かかり、MCAが脳の奥深くに埋もれているため、閉塞部位を見つけることは非常に困難である。さらに、MCAOのフィラメントサイズと挿入長が手術の成功を大きく決定します。これらの追加の可変因子は、手術後の虚血性転帰の変動を誘発する。tBCCAOとMCAOの間で直接比較研究が必要であるが、我々は、この研究で我々の実験モデルの有益な特徴を説明した:短い閉塞時間、簡単な実験手順および高度にアクセス可能な閉塞部位。このモデルは、MCAO モデルで見られる懸念を解決する可能性があります。
マウスモデルのレチナル虚血の使用は、胎児性虚血性損傷を研究するための大きな利点を有するが、このアプローチには限界がある。外科的に頸部に切開するので、唾液腺および右CCAの閉塞の縫合糸の分離を縫合物に適用しなければならないので、付随する組織の破壊は、全身的に、または少なくとも局所的に関連する炎症を呼び起こす可能性がある。これらの懸念は、すべての外科的ステップがすべてtBCCAOなしで行われるシャム操作マウスを使用して部分的に対処された。もう一つの問題は、手術中および手術後に発生する痛みを管理する要件です。我々の研究では、マウスの苦しみを防ぐための疼痛管理は、フェナンテレン系列の合成由来のオピオイドアゴニスト拮抗薬鎮痛薬であるブトルファノール酒石酸溶液の注射を通じて適用された。異なるタイプの麻酔薬や鎮痛薬を使用すると、tBCCAOが性虚血に及ぼす影響を混乱させる可能性があることに注意することが重要かもしれません。このアプローチのもう一つの制限(現在使用されている他のモデルのアプローチと共に)は、ヒト心血管性疾患に関連する病理の完全なシミュレーションを提供しないことである。現在までに、このような実験に用いられるマウスモデルは、主に糖尿病50などのメタボリックシンドロームを中心にヒトにおける虚血性網膜症の根下にある共罹患症に苦しんでいない。現在のマウスモデルには存在しないこのような合併症は、虚血性網膜症の発症のための病理学的経路に対して否定的な相乗効果を有する可能性がある。したがって、このことを考慮して、現在使用されている実験モデル (tBCCAO マウスモデルを含む) の結果を解釈する際に考慮する必要があります。ヒトにおける虚血性網膜症の病態生理学的メカニズムをよりよく理解するために、我々のモデルは、虚血性糖尿病性網膜症の発症のためのストレプトゾトシン注射51または高脂肪食サプリメント52のような他の病理学的要因と組み合わせることができる。ついに、tBCCAO操作マウスで腎血中灌流の減少を示したにもかかわらず、左一過性CCAOが右の腎への輸血に及ぼす影響を明確に理解できませんでした。この問題は、通常、閉塞が起こり、リアルタイム53、54で生体内で虚血が発生したことを確認するために使用されるレーザードップラーを使用して対処することができる。この技術は、ウィリスの円の中の副循環に関して、個々のtBCCAO操作マウスにおける虚血のレチナルの理解を深める目的で利用することができる。
これらの制限にもかかわらず、ここで説明する我々のtBCCAO法は、マウスでの眼性虚血を産生する有効なアプローチを表している。tBCCAOによる網膜変化を研究することは、ヒトにおける虚血性網膜症の病理学的メカニズムを解明するのに役立つ。さらに、tBCCAOマウスモデルが生体内薬物スクリーニングに使用されることを期待しています。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、文部科学省(MEXT)から科学研究助成(KAKENHI)(18K09424から栗原敏秀、20K18393から三輪幸宏)の支援を受けた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atipamezole hydrochloride | Zenoaq | Antisedan | For anti-anesthesia |
| Applied Biosystems 7500 Fast | Applied Biosystems | - | For qPCR |
| Butorphanol tartrate | Meiji Seika Pharma | Vetorphale | For anesthesia |
| BZ-II Analyzer | KEYENCE | - | For an image merge |
| BALB/cAJc1 | CLEA | - | Mouse strain |
| β-Actin (8H10D10) Mouse mAb | CST | 3700 | For western blot |
| Clamp Forcep | World Precision Instruments | WPI 500451 | For surgery |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11251-10 | For surgery |
| DAPI solution | Dojindo | 340-07971 | For IHC |
| Envisu SD-OCT system | Leica | R4310 | For OCT |
| FITC-dextran | Merk | FD2000S | For retinal blood perfusion |
| Fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-9000 | For fluorescence detection |
| Gatifloxacin hydrate | Senju Pharmaceutical | Gachifuro | For anti-bacterial infection |
| GFAP Monoclonal Antibody (2.2B10) | Thermo | 13-0300 | For IHC |
| Heating pad | Marukan | RH-200 | For surgery |
| HIF-1α (D1S7W) XP Rabbit mAb | CST | 36169 | For western blot |
| ImageQuant LAS 4000 mini | GE Healthcare | - | For chemiluminescence |
| Midazolam | Sandoz K.K | SANDOZ | For anesthesia |
| Microtome Tissue-Tek TEC 6 | Sakura | - | For sectioning |
| Medetomidine | Orion Corporation | Domitor | For anesthesia |
| Needle holder | Handaya | HS-2307 | For surgery |
| PuREC | MAYO Corporation | - | For ERG |
| Scissor | Fine Science Tools | 91460-11 | For surgery |
| Sodium hyaluronate | Santen Pharmaceutical | Hyalein | For eye lubrication |
| Tropicamide/Penylephrine hydrochloride | Santen Pharmaceutical | Mydrin-P | For mydriasis |
| 6-0 silk suture | Natsume | E12-60N2 | For surgery |
References
- Anderson, B. Ocular effects of changes in oxygen and carbon dioxide tension. Transactions of the American Ophthalmological Society. 66, 423-474 (1968).
- Ingberg, E., Dock, H., Theodorsson, E., Theodorsson, A., Ström, J. O. Method parameters' impact on mortality and variability in mouse stroke experiments: a meta-analysis. Scientific Reports. 6 (1), 21086 (2016).
- Atochin, D. N., Clark, J., Demchenko, I. T., Moskowitz, M. A., Huang, P. L. Rapid Cerebral Ischemic Preconditioning in Mice Deficient in Endothelial and Neuronal Nitric Oxide Synthases. Stroke. 34 (5), 1299-1303 (2003).
- Allen, R. S., et al. Severity of middle cerebral artery occlusion determines retinal deficits in rats. Experimental Neurology. 254, 206-215 (2014).
- Steele, E. C., Guo, Q., Namura, S. Filamentous Middle Cerebral Artery Occlusion Causes Ischemic Damage to the Retina in Mice. Stroke. 39 (7), 2099-2104 (2008).
- Minhas, G., Morishita, R., Anand, A. Preclinical models to investigate retinal ischemia: advances and drawbacks. Frontiers in Neurology. 3, 75 (2012).
- McColl, B. W., Carswell, H. V., McCulloch, J., Horsburgh, K. Extension of cerebral hypoperfusion and ischaemic pathology beyond MCA territory after intraluminal filament occlusion in C57Bl/6J mice. Brain Res. 997 (1), 15-23 (2004).
- Jiang, A. X., et al. Inducement and Evaluation of a Murine Model of Experimental Myopia. Journal of Visualized Experiments. (143), e58822 (2019).
- Miwa, Y., et al. Pharmacological HIF inhibition prevents retinal neovascularization with improved visual function in a murine oxygen-induced retinopathy model. Neurochemistry International. 128, 21-31 (2019).
- Adams, S., Pacharinsak, C.
- Speetzen, L. J., Endres, M., Kunz, A. Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia. Journal of Visualized Experiments. (75), e4387 (2013).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments. (47), e2423 (2011).
- Lee, D., Kang, H., Yoon, K. Y., Chang, Y. Y., Song, H. B. A mouse model of retinal hypoperfusion injury induced by unilateral common carotid artery occlusion. Experimental Eye Research. 201, 108275 (2020).
- Li, S., et al. Retro-orbital injection of FITC-dextran is an effective and economical method for observing mouse retinal vessels. Molecular Vision. 17, 3566-3573 (2011).
- Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo. Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).
- Lee, D., et al. A Fairy Chemical Suppresses Retinal Angiogenesis as a HIF Inhibitor. Biomolecules. 10 (10), (2020).
- Tomita, Y., et al. Pemafibrate Prevents Retinal Pathological Neovascularization by Increasing FGF21 Level in a Murine Oxygen-Induced Retinopathy Model. International Journal of Molecular Sciences. 20 (23), 5878 (2019).
- Yamamoto, H., Schmidt-Kastner, R., Hamasaki, D. I., Yamamoto, H., Parel, J. M. Complex neurodegeneration in retina following moderate ischemia induced by bilateral common carotid artery occlusion in Wistar rats. Experimental Eye Research. 82 (5), 767-779 (2006).
- Cheng, L., Yu, H., Yan, N., Lai, K., Xiang, M. Hypoxia-Inducible Factor-1α Target Genes Contribute to Retinal Neuroprotection. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 20 (2017).
- Mole, D. R., et al. Genome-wide association of hypoxia-inducible factor (HIF)-1alpha and HIF-2alpha DNA binding with expression profiling of hypoxia-inducible transcripts. The Journal of Biological Chemistry. 284 (25), 16767-16775 (2009).
- Majmundar, A. J., Wong, W. J., Simon, M. C. Hypoxia-Inducible Factors and the Response to Hypoxic Stress. Molecular Cell. 40 (2), 294-309 (2010).
- Newman, E. A. Glial cell regulation of neuronal activity and blood flow in the retina by release of gliotransmitters. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370 (1672), (2015).
- Vecino, E., Rodriguez, F. D., Ruzafa, N., Pereiro, X., Sharma, S. C.
- Symonds, C.
- Lo, W. B., Ellis, H. The circle before willis: a historical account of the intracranial anastomosis. Neurosurgery. 66 (1), 7-18 (2010).
- Yang, G., et al. C57BL/6 strain is most susceptible to cerebral ischemia following bilateral common carotid occlusion among seven mouse strains: selective neuronal death in the murine transient forebrain ischemia. Brain Research. 752 (1), 209-218 (1997).
- Farkas, E., Luiten, P. G. M., Bari, F. Permanent, bilateral common carotid artery occlusion in the rat: A model for chronic cerebral hypoperfusion-related neurodegenerative diseases. Brain Research Reviews. 54 (1), 162-180 (2007).
- Morris, G. P., et al. A Comparative Study of Variables Influencing Ischemic Injury in the Longa and Koizumi Methods of Intraluminal Filament Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice. PLOS ONE. 11 (2), 0148503 (2016).
- Tsuchiya, D., Hong, S., Kayama, T., Panter, S. S., Weinstein, P. R. Effect of suture size and carotid clip application upon blood flow and infarct volume after permanent and temporary middle cerebral artery occlusion in mice. Brain Research. 970 (1-2), 131-139 (2003).
- Kaelin, W. G., Ratcliffe, P. J. Oxygen Sensing by Metazoans: The Central Role of the HIF Hydroxylase Pathway. Molecular Cell. 30 (4), 393-402 (2008).
- Pauly, M., Sruthi, R.
- Averbuch-Heller, L., Leigh, R. J., Mermelstein, V., Zagalsky, L., Streifler, J. Y. Ptosis in patients with hemispheric strokes. Neurology. 58 (4), 620 (2002).
- Dutton, J. Atlas of clinical and surgical orbital anatomy, second edition. 113, 1364 (2011).
- Ritzel, R. M., et al. Early retinal inflammatory biomarkers in the middle cerebral artery occlusion model of ischemic stroke. Molecular Vision. 22, 575-588 (2016).
- Crespo-Garcia, S., et al. Individual and temporal variability of the retina after chronic bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO). PLOS ONE. 13 (3), 0193961 (2018).
- Qin, Y., et al. Functional and morphologic study of retinal hypoperfusion injury induced by bilateral common carotid artery occlusion in rats. Scientific Reports. 9 (1), 80 (2019).
- Block, F., Grommes, C., Kosinski, C., Schmidt, W., Schwarz, M. Retinal ischemia induced by the intraluminal suture method in rats. Neuroscience Letters. 232 (1), 45-48 (1997).
- Allen, R. S., et al. Progesterone Treatment in Two Rat Models of Ocular Ischemia. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (5), 2880-2891 (2015).
- Miller, R. F., Dowling, J. E. Intracellular responses of the Müller (glial) cells of mudpuppy retina: their relation to b-wave of the electroretinogram. Journal of Neurophysiology. 33 (3), 323-341 (1970).
- Block, F., Grommes, C., Kosinski, C., Schmidt, W., Schwarz, M. Retinal ischemia induced by the intraluminal suture method in rats. Neuroscience Letters. 232 (1), 45-48 (1997).
- Lee, J. H., Shin, J. M., Shin, Y. J., Chun, M. H., Oh, S. J. Immunochemical changes of calbindin, calretinin and SMI32 in ischemic retinas induced by increase of intraocular pressure and by middle cerebral artery occlusion. Anatomy & Cell Biology. 44 (1), 25-34 (2011).
- Li, S. Y., et al. Lycium barbarum polysaccharides reduce neuronal damage, blood-retinal barrier disruption and oxidative stress in retinal ischemia/reperfusion injury. PLOS ONE. 6 (1), 16380 (2011).
- Furashova, O., Matthé, E. Retinal Changes in Different Grades of Retinal Artery Occlusion: An Optical Coherence Tomography Study. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (12), 5209-5216 (2017).
- Zadeh, J. K., et al. Short-Time Ocular Ischemia Induces Vascular Endothelial Dysfunction and Ganglion Cell Loss in the Pig Retina. International Journal of Molecular Sciences. 20 (19), (2019).
- Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. Rodent stroke model guidelines for preclinical stroke trials (1st edition). Journal of Experimental Stroke & Translational Medicine. 2 (2), 2-27 (2009).
- Tang, Y., et al. Hypothermia-induced ischemic tolerance is associated with Drp1 inhibition in cerebral ischemia-reperfusion injury of mice. Brain Research. 1646, 73-83 (2016).
- Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 13 (4), 683-692 (1993).
- Pula, J. H., Yuen, C. A. Eyes and stroke: the visual aspects of cerebrovascular disease. Stroke and Vascular Neurology. 2 (4), 210 (2017).
- Steele, E. C., Guo, Q., Namura, S. Filamentous middle cerebral artery occlusion causes ischemic damage to the retina in mice. Stroke. 39 (7), 2099-2104 (2008).
- Sim, D. A., et al. The Effects of Macular Ischemia on Visual Acuity in Diabetic Retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 2353-2360 (2013).
- Wu, K. K., Huan, Y. Streptozotocin-induced diabetic models in mice and rats. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 5, Unit 5.47 (2008).
- Mubarak, A., Hodgson, J. M., Considine, M. J., Croft, K. D., Matthews, V. B. Supplementation of a high-fat diet with chlorogenic acid is associated with insulin resistance and hepatic lipid accumulation in mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61 (18), 4371-4378 (2013).
- Ansari, S., Azari, H., McConnell, D. J., Afzal, A., Mocco, J. Intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke with laser doppler flowmetry guidance in mice. Journal of Visualized Experiments. (51), e2879 (2011).
- Hedna, V. S., et al. Validity of Laser Doppler Flowmetry in Predicting Outcome in Murine Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion Stroke. Journal of Vascular and Interventional Neurology. 8 (3), 74-82 (2015).
