Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Geçici Bilateral Ortak Karotid Arter Tıkanması sonucu İndüklenen İskemik Retina Yaralanmasının Murine Modeli

Published: November 12, 2020 doi: 10.3791/61865
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,4, 1,2
1Laboratory of Photobiology, Keio University School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, Keio University School of Medicine, 3Animal eye care, Tokyo Animal Eye Clinic, 4Tsubota Laboratory, Inc.
* These authors contributed equally

Summary

Burada, basit dikişler ve bir kelepçe kullanarak geçici bilateral ortak karotis arter tıkanma ile retina iskemisinin bir fare modelini tarif ediyoruz. Bu model, kardiyovasküler anormalliklerin neden olduğu retina iskemisinin patolojik mekanizmalarını anlamak için yararlı olabilir.

Abstract

Diyabetik retinopati, retinal damarların veya arterlerin tıkanması ve oküler iskemik sendrom gibi çeşitli damar hastalıkları retina iskemisine yol açabilir. Retina iskemisinin patolojik mekanizmalarını araştırmak için ilgili deneysel modellerin geliştirilmesi gerekir. Anatomik olarak, ana retina kan sağlayan bir damar oftalmik arterdir (OpA) ve OpA yaygın karotis arterin (CCA) iç karotis arterinden kaynaklanır. Bu nedenle, CCA'nın bozulması etkili bir şekilde retina iskemisi neden olabilir. Burada, sağ CCA'yı 6-0 ipek dikişlerle bağlamak ve sol CCA'yı bir kelepçe ile 2 saniye boyunca geçici olarak tıkamak için geçici bilateral ortak karotis arter tıkanıklığı (tBCCAO) ile retina iskemisinin bir fare modelini kurduk ve tBCCAO'nun retina disfonksiyonuna yol açan akut retina iskemisine neden olabileceğini gösterdik. Mevcut yöntem, sadece cerrahi iğneler ve bir kelepçe kullanarak cerrahi aletlere olan güveni azaltır, genellikle orta serebral arter tıkanıklığının fare modellerinde görülen beklenmedik hayvan ölümünü en aza indirmek için tıkanma süresini kısaltır ve yaygın retina iskemik bulgularının tekrarlanabilirliğini korur. Model, farelerde iskemik retinopatilerin patofizyolojisini araştırmak için kullanılabilir ve in vivo ilaç taraması için daha fazla kullanılabilir.

Introduction

Retina görme fonksiyonu için nörosensör bir dokudur. Görme fonksiyonu için önemli miktarda oksijen gerektiğinden, retina vücuttaki en yüksek oksijen talep eden dokulardan biri olarak bilinir1. Oksijen kan damarlarından iletilirken retina damar hastalıklarına karşı hassastır. Diyabetik retinopati ve retinal kan damarı (damarlar veya arterler) tıkanıklığı gibi çeşitli damar hastalıkları retina iskemisine neden olabilir. Retina iskemisinin patolojik mekanizmalarını araştırmak için retina iskemisinin tekrarlanabilir ve klinik olarak ilgili deneysel modelleri gerekli kabul edilir. Orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO) intralüminal filament takılarak deneysel serebral iskemi2,3in vivo kemirgen modellerinin geliştirilmesi için en genel olarak kullanılan yöntemdir. Oftalmik arterin (OpA) MCA'ya yakınlığı nedeniyle, MCAO modelleri retina iskemisinin patofizyolojisini anlamak için aynı anda da kullanılır4,5,6. Retina iskemisi ile birlikte serebral iskemiyi teşvik etmek için, uzun filamentler tipik olarak ortak karotis arterin (CCA) veya dış karotid arterin (ECA) kesisi yoluyla yerleştirilir. Bu yöntemlerin yapılması zordur, ameliyatı tamamlamak için uzun bir süre gerektirir (bir fare için 60 dakikadan fazla) ve ameliyattan sonraki sonuçlarda yüksek farklılıklara yol açar7. Bu endişeleri iyileştirmek için daha iyi bir model geliştirmek önemli olmaya devam ediyor.

Bu çalışmada, farelerde retina iskemisini indük etmek için iğneler ve bir kelepçe ile kısa geçici bilateral CCA tıkanıklığı (tBCCAO) kullandık ve retinadaki iskemik yaralanmaların tipik sonuçlarını analiz ettik. Bu videoda, tBCCAO prosedürünün bir gösterisini vereceğiz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Burada açıklanan tüm yöntemler Keio Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Cerrahi aletlerin ve hayvanların hazırlanması

  1. Cerrahi aletleri otoklavlayın ve% 70 etil alkolde saklayın. Her yeni cerrahi işlemden önce cerrahi aletleri %70 etil alkol kullanarak dikkatlice temizleyin.
  2. Ameliyattan önce, ameliyat sırasında ve sonrasında steril koşulları korumak için erkek BALB/cAJc1 farelerini (6 haftalık, 26-28 kg) belirli patojensiz (SPF) bir odada hazırlayın.

2. Geçici bilateral ortak karotis arter tıkanma (tBCCAO)

  1. Daha önceaçıklandığıgibi "MMB" olarak adlandırılan midazolam (40 μg/100 μL), medetomidin (7,5 μg/100 μL) ve butorphanol tartrate (50 μg/100 μL) kombinasyonu ile intraperitoneal enjeksiyon yoluyla bir fareyi anestezi altınaalın. Fare tamamen uyuşturulana kadar farenin gözlerini çarpmamasını önlemek için farenin arka kaplamalarını tutun.
    1. Tam anesteziyi kontrol etmek için yaygın olarak kullanılan yöntem olan yanıt alıncaya kadar fare baş parmağına sıkıştırarak anestezinin derinliğini yargılayın10.
      NOT: Farelerin uykuya dalmasına genellikle 5 dakikadan az bir süre gerekir. Genel anestezi için uygun tarifler kurumlar tarafından farklı olabilir.
  2. Anestezi altında gözlerde kuruluğu önlemek için gözlere % 0.1 saflaştırılmış sodyum hyaluronat göz damlası çözeltisi uygulayın.
  3. Fareyi arkasına yerleştirin ve yapışkan bantlar kullanarak farenin pençelerini sabitleyin.
  4. Ameliyattan önce %70 etil alkol kullanarak farenin boyun bölgesini dezenfekte edin.
    NOT: Kürkün ek kupürü, sonraki cilt iltihabına neden olabileceğinden yapılmamıştır11,12.
  5. Boynun sagittal kesisini bir bıçakla gerçekleştirin (Şekil 1).
    NOT: Boyun, sternum ve trakea arasındaki orta hatta kesi yapılması gerekir.
  6. Her iki tükürük bezini de iki forseps kullanarak dikkatlice ayırın ve alttaki CCA'ları görselleştirmek için harekete geçirin.
  7. Doğru CCA'yı ilgili vagal sinirlerden ve eşlik eden damarlardan yapılarına zarar vermeden dikkatlice izole edin ve CCA'nın altına iki adet 6-0 ipek dikiş yerleştirin. Kan akışını engellemek için iki bağı sıkıca bağlayın (Şekil 1).
    NOT: İşlem sırasında küçük damarlar zarar görmüş olabilir. Kanama görülürse, CDA'ları net bir şekilde görselleştirmek için silme gereklidir.
  8. Sol CCA'yı ilgili vagal sinirlerden ve eşlik eden damarlardan yapılarına zarar vermeden dikkatlice bulun ve sol CCA'yı bir kelepçe ile 2 saniye boyunca tıkayın (Şekil 1).
    NOT: Bir yeri sıkıştırmak için sol CCA'nın altına 6-0 ipek dikiş iğnesi yerleştirilmesi gerekir.
  9. Sol CCA'nın yeniden açılmasından sonra, boynun dikiş yaraları 6-0 ipek dikiş ile ve bakteriyel enfeksiyonu inhibe etmek için boyuna bir dab antibiyotik (50 μL) uygulayın.
    NOT: Sol CCA'nın yeniden açılması sırasında arteriyel duvara zarar vermemek için bir kelepçeyi yavaşça çıkarın.
  10. Farenin derin anesteziden hızlı bir şekilde kurtulmasına yardımcı olmak için fareye intraperitoneal olarak 0,75 mg/kg atipamezole hidroklorür enjekte edin. Fareyi önceden ısıtılmış pedlere sahip bir fare kafesine geri döndürün.
    NOT: Fare sternal recumbency korumak için yeterli bilinci kazanana kadar farenin başıboş kalmasına izin vermeyin.
  11. Fare uyandığında ağrının yönetimi için fareye 0,4 mg / kg butorphanol tartrate enjekte edin.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Başarılı tBCCAO için ilk ipucu olarak, farenin göz kapağı sarkması gözlenebilir (Şekil 2).
  12. Ötenazi için, farelere 3x MMB karışımı enjekte edin ve deneyler için kurban edin.

3. Genel gözlemler (sağkalım oranları ve göz kapağı sarkması)

  1. Ameliyattan sonra, 0 (ameliyattan sonra), 1, 3 ve 7.
  2. Göz kapağı sarkması 4 puanlık bir derecelendirme ölçeği ile değerlendirin: 1 = sarkma yok, 2 = hafif sarkıklık (~%50), 3 = şiddetli sarkıklık (%50'nin üzerinde) ve 4 = göz akıntısı ile şiddetli sarkıklık.

4. Retina kanı perfüzyonu

  1. Fare retina damarlarında kan perfüzyonunun gözlemlenmesi için yaygın olarak kullanılan farenin sol ventrikülüne 200 μL FITC-dektran (25 mg/mL) enjekte edin13,14.
  2. Dolaşımdan 2 dakika sonra, gözleri enükle edin ve 1 saat boyunca% 4 paraformaldehitte sabitleyin. Retinalar, daha önce15olarak tanımlandığı gibi dikkatlice elde edildi ve düz monte edildi ve floresan mikroskobu ile incelendi.
  3. Retina bütün montajlarının fotoğraflarını 4x büyütmede çekin ve daha önce açıklanan bir birleştirme çözümleyicisi kullanarak tek bir tanede birleştirin16.
  4. NIH Fiji/ImageJ yazılımındaki bir gemi analiz aracıyla perfüzyon alanlarını ölçün.

5. Batı lekesi

  1. TBCCAO'dan 3 ve 6 saat sonra, farelerin gözlerini elde edin ve retinaları izole etmek için hemen soğuk PBS içeren bir Petri kabına aktarın.
  2. Retinaların izolasyonundan sonra, daha önce açıklandığı gibi batı şişkinliği gerçekleştirin9.
  3. Hipoksi-indükleyici faktör-1α (HIF-1α; genel bir hipoksi belirteci) ve β-Actin (iç yükleme kontrolü) için bir gecede antikorlarla kuluçkaya yatırın ve ardından HRP konjuge sekonder antikorların inkübasyonu. Sinyalleri chemiluminescence ile görselleştirin.

6. Nicel PCR (qPCR)

  1. tBCCAO'dan 6, 12 ve 24 saat sonra, daha önce açıklandığı gibi qPCR için elde edilen retinaları işleyin17.
  2. QPCR'ı gerçek zamanlı PCR sistemi ile gerçekleştirin. Kullanılan astarlar Tablo 1'de listelenmiştir. ΔΔCT yöntemi ile farklı transkript seviyeleri arasındaki kat değişimlerini hesaplayın.

7. İmmünohistokimya (IHC)

  1. TBCCAO'dan 3 gün sonra farelerin gözlerini elde edin ve parafin içine gömün.
  2. Göz bölümlerini elde etmek için parafin gömülü gözleri bir mikrotom ile kesin.
  3. Daha önce açıklandığı gibi 5 μm kalınlığındaki göz bölümlerini renksizleştirin ve lekelendirin13.
  4. Glial fibril asidik protein (GFAP; retinadaki astrositler ve Müller hücreler için güvenilir bir belirteç) için bir antikor ile kuluçkaya yatır ve ardından Alexa Fluor 555 konjuge sekonder antikor inkübasyonu.
  5. Retinadaki çekirdeği boyamak için DAPI (4′, 6-diamidino-2-fenylindole) kullanın. Sinyalleri floresan mikroskopla görselleştirin.
  6. Morfoloji puanlamasını daha önce açıklandığı gibi 4 puanlık bir derecelendirme ölçeğiyle değerlendirin13,18: 0 = sinyal yok, 1 = ganglion hücre katmanında (GCL) birkaç pozitif glial son ayak, 2 = GCL'den dış nükleer katmana (ONL) ulaşan birkaç etiketli süreç ve GCL'den ONL'ye ulaşan en etiketli süreçler.

8. Elektroretinografi (ERG)

  1. tBCCAO'dan 3 ve 7 gün sonra, daha önce açıklandığı gibi bir Ganzfeld kubbesi, satın alma sistemi ve LED uyarıcılar kullanarak ERG gerçekleştirin9.
  2. Bir gecede karanlık adaptasyonu takiben, fareleri loş kırmızı ışık altında MMB kombinasyonu ile uyuşturun.
  3. Gözbebeklerini genişletmek için %0,5 tropikamid ve %0,5 fenilefrin gibi karışık bir çözelti kullanın.
  4. Aktif elektrotları kontakt lense yerleştirin ve referans elektrotları ağız içine yerleştirin.
  5. Her hayvanın her iki gözünden ERG yanıtları alın.
  6. Çeşitli uyaranlarla karanlık adaptasyon altında scotopik yanıtları kaydedin.
  7. Bir dalganın genliklerini taban çizgisine ve en düşük dalga noktasına kadar ölçün.
  8. B dalgasının genliklerini bir dalganın en düşük noktasından b dalgasının zirvesine kadar ölçün.
  9. İşlem sırasında ısı pedlerini kullanarak tüm fareleri sıcak tutun.

9. Optik tutarlılık tomografisi (OCT)

  1. tBCCAO'dan 2 hafta sonra, daha önce bildirildiği gibi SD-OCT sistemini kullanarak OCTgerçekleştirin8,9.
  2. Ölçüm için, fareleri% 0.5 tropikamid ve% 0.5 fenilefrin karışımı ile midriasis'e ve MMB karışımı ile genel anesteziye tabi edin.
  3. Ekvatoral en-face tarama dilimlerinden B tarama görüntüleri elde edin.
  4. Retinaları optik sinir kafasından 0.2, 0.4 ve 0.6 mm'de inceleyin.
  5. Retina sinir lifi tabakasından (NFL) dış sınırlayıcı zara (ELM) kadar retina kalınlığını ölçün ve ölçülen değerlerin ortalamasını tek bir farenin retina kalınlığı olarak düşünün.
  6. Sonuçları örümcek diyagramları olarak çizin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

FITC-dektranın 2 dakika boyunca sistemik dolaşımından sonra, sham ile çalışan farelerde ve tBCCAO tarafından işletilen farelerde sol ve sağ retinaların retinal vaskülatları incelendi (Ek Şekil 1). FITC-dektran, sham tarafından işletilen farelerde hem retinalarda hem de tBCCAO tarafından işletilen farelerde sol retinada tamamen görünürken, tBCCAO tarafından işletilen farelerde sağ retinada kısmen tespit edilebilirdi.

TBCCAO'dan sonra göz kapağı sarkması incelendi (Şekil 2). Sağ gözler hafif gösterdi (skor 2; 75%) ve şiddetli göz kapağı (skor 3 ve 4; %25) sol gözlerinde sarkıklık yokken sarkma (puan 1; %93,75) bir fare hariç (puan 2; 6.25%). TBCCAO tarafından işletilen farelerde göz akıntısı ile şiddetli göz kapağı sarkması önemli ölçüde gözlenmemese de, bu fenotip için bir fare görebiliyorduk (skor 4; %6.25).

Dokulardaki oksijen durumunun azalması HIF-1α'nın stabilizasyonuna ve EPO, VEGF ve BNIP319, 20,21gibi hipoksiye duyarlı genlerin indüksiyonedilmesineyol açar. Her şeyden önce, hif-1α genel hipoksik belirteç kullanılarak moleküler biyolojik hipoksi batı şişkinliği ile değerlendirildi (Şekil 3). TBCCAO'dan 3 ve 6 saat sonra sağ retinada artmış HIF-1α ekspresyonu anlamlı olarak gözlendi. Daha sonra, hipoksiye duyarlı genlerin ekspresyonları qPCR(Ek Şekil 2)ile değerlendirildi. TBCCAO'dan 6 saat sonra hipoksiye duyarlı gen ifadelerinde anlamlı bir değişiklik olmadı. TBCCAO'dan 12 saat sonra Binp3 ekspresyonunda önemli bir artış tespit ettik ve sağ retinada Epo ekspresyonunda hafif bir artış gösterildi. TBCCAO'dan 24 saat sonra, istatistiksel olarak anlamlı olmasa da sağ retinada Epo ifadesinde de hafif bir artış bulabiliriz. TBCCAO tarafından işletilen farelerde vegf ekspresyonu 6 saatten 24 saate değiştirilmedi.

Retina reaktif glioz tBCCAO'dan 3 gün sonra incelendi (Şekil 4), astrositler ve Müller hücreler gibi glia retina iskemisi ile yakından ilişkili olduğuiçin 22. GFAP retina23astrositlerin ve Müller hücrelerinin tespiti için yaygın olarak kullanılmaktadır. Sağ retinada GFAP etiketlemesi için morfoloji puanlarının ortalaması, sham-operated farelerde hem retina hem de tBCCAO tarafından işletilen farelerde sol retina arasında en yüksekti. GFAP ekspresyonunun lokalizasyonuna dayanarak, GFAP etiketlemesinde morfolojideki bir değişikliğin Müller hücrelerinin aktivasyonunu yansıttığı düşünülmektedir.

TBCCAO sonrası retina disfonksiyonu incelemek için ERG kullanılmıştır(Şekil 5). Sağ gözdeki b-dalgası genlikleri tBCCAO'dan 3 ve 7 gün sonra önemli ölçüde azaldı. Bununla birlikte, sağ gözdeki a-dalga genlikleri önemli ölçüde değiştirilmedi. Sol göz söz konusu olduğunda, a ve b dalgalarının genliklerinde herhangi bir değişiklik göremedik (Tamamlayıcı Şekil 3).

TBCCAO'dan sonra retina kalınlığında bir değişiklik belirlemek için OCT gerçekleştirdik (Şekil 6). Sağ gözdeki retina kalınlığı tBCCAO'dan 2 hafta sonra önemli ölçüde artarken, sol gözde tBCCAO ve sham ile çalışan fareler arasında retina kalınlığında bir fark yoktu.

Figure 1
Şekil 1: Willis çemberinde model prosedürünün ve kan dolaşımının şeması. Şematik bir çizimde tBCCAO kaynaklı retina iskemik fare modeli prosedürü ve retinaya kan dolaşımı gösterildi. CCA, ECA, ICA, PCA ve OpA sırasıyla ortak şahdamarını, dış şahdamarını, iç şahdamarını, posterior iletişim arterini ve oftalmik arteri temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: TBCCAO'dan sonra göz kapağı sarkması. Göz kapağı sarkıklığının şiddeti referans görüntülere göre 4 puanlık derecelendirme ile değerlendirildi: 1 = sarkma yok, 2 = hafif sarkıklık (~% 50 sarkma), 3 = şiddetli sarkıklık (%50'nin üzerinde sarkma) ve 4 = göz akıntısı ile şiddetli sarkma. TBCCAO'dan sonra göz kapağı sarkması gözlendi ve deneysel gözlem sırasında korundu. Sonuçlar (sham: n = 10, tBCCAO: n = 16) dağılım nokta grafiği olarak çizilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: TBCCAO sonrası HIF-1α stabilizasyonu. HIF-1α ve β-Actin için temsili immünoblotlar ve nicel analizler (saat 3 için gruplar; sham: n = 3, tBCCAO: n = 6 ve saat 6 için gruplar; sham ve tBCCAO: n = 6) HIF-1α'nın tBCCAO'dan 3 ve 6 saat sonra sağ retinada stabilize edildiğini göstermiştir. *P < 0,05. Veriler Student's t-test kullanılarak analiz edildi ve ± sapma ile ortalama olarak sunuldu. L ve R sırasıyla sol ve sağ retinayı oluşturur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: TBCCAO sonrası reaktif glioz. Retinaların temsili sagittal bölümleri (sham: n = 4, tBCCAO: n = 4) ve GFAP etiketlemesinin nicel analizleri (kırmızı) morfoloji puanlaması (0–3), çoğunlukla NFL + GCL'de kısıtlanan GFAP etiketlemesinin, tBCCAO'dan sonra sağ retinada GCL'den ONL'ye (beyaz oklar) kadar tüm iç katmana genişletildiğini göstermiştir. Ölçek çubukları, 50 μm. Retinadaki çekirdeği boyamak için DAPI (mavi) kullanıldı. NFL, GCL, IPL, INL ve ONL sırasıyla sinir lifi tabakasını, ganglion hücre tabakasını, iç pleksiform tabakayı, iç nükleer katmanı ve dış nükleer katmanı temsil eder. Veriler Student's t-test kullanılarak analiz edildi ve yüzde 25 ve 75'inci yüzdelik olmak üzere interquartile aralığı ile ortanca olarak sunuldu. *P < 0,05. L ve R sırasıyla sol ve sağ retinayı oluşturur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: TBCCAO sonrası sağ gözde görme bozukluğu. (A) Koyuya uyarlanmış ERG'nin temsili dalga formları tBCCAO'dan 3 ve 7 gün sonra gerçekleştirildi. Stimülasyon yoğunluğu (cd.s/m2): 0.005. (B) Nicel analizler sağ gözde b-dalgası genliklerinde azalma olduğunu göstermiştir (sham: n = 5, tBCCAO: n = 6) a-dalga genlikleri değişmemiştir. *P < 0,05, **P < 0,01. Veriler Student's t-test kullanılarak analiz edildi ve ± sapma ile ortalama olarak sunuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: TBCCAO sonrası retina kalınlığında bir değişiklik. Sham ve tBCCAO ile çalışan retinalardaki temsili OCT görüntüleri ve nicel analizler sağ retinada retina kalınlığında artış olduğunu göstermiştir (sham: n = 4, tBCCAO: n = 8). Sol retinada retina kalınlığında bir değişiklik olmadı (sham: n = 4, tBCCAO: n = 8). Ölçek çubukları sırasıyla 200 (üst) ve 100 (alt) μm'dir. *P < 0,05. Diyagramların yatay eksenindeki değerler, yeşil çizgi tarafından tespit edilen optik sinir başlığından (0) 0,2, 0,4 ve 0,6 mm uzaklıktadır. Veriler iki yönlü ANOVA ve ardından Bonferroni post hoc testi kullanılarak analiz edildi. Örümcek diyagramları standart ± sapma ile ortalama olarak sunulmuştur. NFL, INL, ONL ve ELM sırasıyla sinir lifi tabakası, iç nükleer tabaka, dış nükleer tabaka ve dış sınırlayıcı membrandır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: TBCCAO sonrası retinal kan perfüzyonu. 2 dakikalık FITC-dektran sirkülasyonundan ve nicel analizlerden sonra temsili retina düz montaj görüntüleri (her görüntünün daha yüksek büyütmesi ile), sham-operated farelerde hem retinalarda hem de tBCCAO tarafından işletilen farelerde sol retinada tam perfüzyonun gözlenebilir olduğunu göstermiştir. Ancak tBCCAO ile çalışan farelerde sağ retinada kısmi kan perfüzyonu saptandı. Veriler Student's t-test kullanılarak analiz edildi ve ± sapma ile ortalama olarak sunuldu. L ve R sırasıyla sol ve sağ retinayı oluşturur. Ölçek çubukları sırasıyla 800 ve 400 μm'dir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 2: tBCCAO sonrası hipoksiye duyarlı genlerin ekspresyonları. Kantitatif analizler, tBCCAO'dan 12 saat sonra istatistiksel önemi olan sağ retinada Bnip3 mRNA ekspresyonunda geçici bir artış olduğunu göstermiştir. Epo mRNA ekspresyonu, tBCCAO'dan sonra 24 saat boyunca sağ retinada artan bir eğilim gösterdi, ancak değerleri sham-operated sağ retina ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde farklı değildi. **P < 0,01. Veriler Student's t-test kullanılarak analiz edildi ve ± sapma ile ortalama olarak sunuldu. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 3: tBCCAO sonrası sol gözde görme fonksiyonu. Nicel analizler sol gözdeki a ve b dalgalarının genliklerinde bir değişiklik olmadığını göstermiştir (sham: n = 5, tBCCAO: n = 6). P > 0.05. Veriler Student's t-test kullanılarak analiz edildi ve ± sapma ile ortalama olarak sunuldu. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 4: C57BL6 ve BALB'de tBCCAO'dan sonra sağkalım oranları. Kaplan-Meier sağkalım eğrileri, C57BL6 farelerde tBCCAO'dan sonra neredeyse tüm farelerin 3 gün içinde öldüğünü gösterdi. BALB fareleri söz konusu olduğunda, tBCCAO'da daha uzun sıkma süresi ani ve şiddetli hayvan ölümlerine neden olur (7, 20 sn: % 10, 10 sn: % 20, 2 sn: % 81 ve 0 sn: % 95) hayatta kalma oranları). Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 5: Tek taraflı CCAO sonrası HIF-1α stabilizasyonu. HIF-1α ve β-Actin için temsili immünoblot ve nicel analiz (sham: n = 3, tek taraflı CCAO: n = 3), HIF-1α'nın tek taraflı CCAO'dan 3 saat sonra retinalarda stabilize olmadığını gösterdi. P > 0.05. Veriler Student's t-test kullanılarak analiz edildi ve standart ± sapma ile ortalama olarak sunuldu. L ve R sırasıyla sol ve sağ retinayı oluşturur. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 6: TBCCAO'dan sonra uzun sıkma süresi ile şiddetli göz kapağı sarkması. 4 puanlık bir derecelendirme ölçeği ile değerlendirilen 10 saniyelik tBCCAO indüklenen şiddetli göz kapağı sarkması: 1 = sarkıklık yok, 2 = hafif sarkıklık (~%50), 3 = şiddetli sarkıklık (%50'nin üzerinde) ve 4 = şekil 2'deaçıklandığı gibi göz akıntısı ile şiddetli sarkma. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Çalışmada, tBCCAO'nun basit dikişler ve bir kelepçe kullanarak retina iskemisini ve eşlik eden retina disfonksiyonu indükleyebileceğini gösterdik. Ayrıca, retina iskemisinin bir fare modelinin geliştirilmesi için mevcut protokolümüzü gösterdik retina iskemisinin geliştirilmesi için önceki protokollere kıyasla daha kolay ve hızlıdır retinal iskemik yaralanma modelleri2,3,7.

Anatomik olarak, sol ve sağ serebral arterler, bireysel damarların tıkanıklıklarından veya darlığından kaynaklanan akış kesintisine karşı merkezi sinir sistemine yeterli kan akışını sağlamak için Willis çemberinde kollateral dolaşım sağlayan posterior iletişim arterleri (PTA' lar) ile bağlanabilir24,25 (Şekil 1). Lee ve arkadaşları, C57BL6farelerdekalıcı tek taraflı CCAO tarafından retina kan perfüzyonunun 10 dakika gecikmeli (ipsilateral retinada retina kanı perfüzyonunun tamamı değildir) olabileceğini göstermiştir. Bu, retina iskemisinin CCAO tarafından indüksiyonunun Willis çemberindeki kollateral dolaşım koşullarıyla yakından ilişkili olduğu anlamına gelir. C57BL6, mevcut çalışmamızın fare zorlanması BALB26da dahil olmak üzere yedi fare türü arasında BCCAO tarafından serebral iskemiye en duyarlı fare suşu olarak bilinmektedir. C57BL6'daki Willis'in tamamlanmamış çemberi nedeniyle, her iki CCA'dan beyin kan akışının kesilmesi merkezi sinir sisteminde ciddi hasarlara neden olur ve sonunda ölüme yol meydana gelir. Buna ek olarak, ön çalışmamızda, farelerin neredeyse tamamı (%80 civarında) olarak C57BL6'da tBCCAO'yu teşvik edemedik. ameliyattan sonraki 3 gün içinde öldü (Ek Şekil 4). Bu nedenle, mevcut çalışmamız için başka bir fare zorlanması BALB'ye tBCCAO uyguladık.

BALB modelimizde akut retina iskemik yaralanmalarına neden olmak için, sağ CCA kalıcı olarak lige alındı ve sol CCA geçici tıkanıklık yoluyla akut retinal iskemik stresi artırmak için uygulandı. Bunun nedeni, farelerin Willis27'nintam çemberine sahip sıçanların aksine kalıcı BCCAO tarafından indüklenen iskemik stresi tolere edememeleridir. Daha sonra, tıkanıklık süresini optimize etmeye çalıştık: sol CCAO (0-20 saniye), tıkanıklık süresi merkezi sinir sistemindeki iskemik yaralanmaları etkileyen ve deneysel modellerin hayatta kalma oranlarıyla doğrudan bağlantı kuran önemli faktörlerden biri olarak kabul edildi28,29. BALB farelerinin sağkalım oranlarının tıkanma süresine bağlı bir şekilde azaldığını tespit ettik(Ek Şekil 4). Sol CCA'nın 10 saniye boyunca tıkanması ciddi şekilde daha yüksek ölüm oranları (%50'nin üzerinde), sol CCA'nın 2 saniye boyunca tıkanması veya tıkanma olmaması (veya tek taraflı CCAO) nispeten daha yüksek sağkalım oranları (%80'in üzerinde) göstermiştir. Bu nedenle, verimli ve uygun maliyetli deneyler mevcut olamayacağından, daha sonraki deneyler için grupları (10 ve 20 saniye olan tıkanma süresi) hariç tuttuk. Daha sonra, sol CCA'nın 2 saniye boyunca tıkanması veya tıkanıklık olmamasının (veya tek taraflı CCAO'nun) retina hipoksisine neden olup olmadığını inceledik. HIF-1α hipoksik yanıtlarda çalışan önemli bir düzenleyicidir ve hipoksik koşullar altında stabilize edilir30. Bu bağlamda HIF-1α stabilizasyonu hipoksi için genel moleküler biyolojik belirteç olarak kullanılmıştır. Tek taraflı CCAO grubunda retinada HIF-1α stabilizasyonu tespit edemedik(Ek Şekil 5). İlginçtir ki, 2 saniyelik tBCCAO grubunda HIF-1α stabilizasyonunu tespit edebiliriz (Şekil 3). Bu, BALB farelerinde retinal hipoksik stresin 2 saniye tBCCAO ile indüklenebileceği anlamına gelir. Bu nedenle, hif-1α stabilizasyon yoluyla retina iskemisinin ameliyatı ve indüksiyonu sonrası yüksek sağkalım oranlarına dayanarak çalışmamız için nihayet 2 saniyelik sıkma süresi seçildi.

TBCCAO tarafından işletilen farelerde sağ CCA kalıcı olarak tıkanmış olmasına rağmen, FITC-dektranın sistemik dolaşımından 2 dakika sonra sağ retinada kısmen kan perfüzyonu tespit edildi(Ek Şekil 1). Ayrıca, tek taraflı CCAO ile çalışan BALB farelerinde sağ retinada HIF-1α stabilizasyonunda bir değişiklik tespit edildiğini tespit ettik. Bu fenomen, retinaya kan akışını sağlamak için Willis çemberi boyunca ikincil dolaşımın etkileri ile açıklanabilir (Şekil 1). Sol geçici CCAO'nun sağ retinaya kan perfüzyonu üzerindeki etkilerini net olarak anlayamamamıza rağmen, kalıcı sağ CCAO ile birlikte geçici sol CCAO, tBCCAO'dan sonra sağ retinada HIF-1α ifadesinde önemli bir değişiklik olduğu için sağ retinada akut hipoksik hakaretleri artırabilir (Şekil 3). Ek olarak, farelerin hayatta kalma oranları sol CCA'nın tıkanma süresine bağlıydı. Birlikte ele alındığında, retina iskemik stresinin yoğunluğu sol CCAO ile kontrol edilebilir.

Sarkık bir göz kapağının fenotipi, özellikle iskemik inme31,32olmak üzere ağır nörolojik durumların bir sunum işareti veya patofizyolojik bir semptomu olarak öne sürülmemiştir. Sarkık bir göz kapağı ile ilişkili kas levator palpebrae superioris33' dir. Bu kas OpA'dan elde edilen dallardan biri olan lateral palpebral arter tarafından sağlanır. Bu nedenle, retinayı sağlayan OpA etkilendiğinde, göz kapağı sarkması görülebilir. Göz kapağı sarkması gözlendi MCAO fare modellerinde34TBCCAO modelimizde de çoğaltıldı. Ayrıca, sol CCA'nın tıkanma süresi daha uzun sürdüğünde göz kapağı sarkması şiddetli hale geldiğini açıkladık(Şekil 2 ve Tamamlayıcı Şekil 6). Bu, göz kapağı sarkmasının şiddetinin (dolaylı olarak retina iskemik stresinin yoğunluğu olarak adlandırılır) sol CCA'nın tıkanma süresine bağlı olabileceği anlamına gelir.

Retina disfonksiyonu, farelerde BCCA darlığı35 ve sıçanlarda BCCAO dahil retina iskemik retinopatilerinde görülen sonuçlardan biridir36. TBCCAO tarafından işletilen farelerde b dalgası genliklerinin azaldığını tespit ettik. Daha önceki birkaç çalışma, MCAO'nun ameliyattan sonra b-dalgası genliğinde de bir azalmaya neden olduğunugöstermiştir 37,38. b-dalgası, bipolar hücreler ve Müller hücreleri de dahil olmak üzere retinal iç katmanlardaki hücrelerin fizyolojik durumunu yansıtır39. Ayrıca tBCCAO sonrası iç retina tabakasında Müller hücreler tarafından reaktif glioz saptanmıştır. Bu sonuç ayrıca MCAO modellerinde40,41 ve diğer CCAO modellerinde13,42. Birlikte ele alındığında, iç retina disfonksiyonu tBCCAO tarafından indüklenebilir anlamına gelir. Akut retina iskemisinde retina kalınlığının geçici olarak arttığı bildirilmiştir43,44. Bu bulguyu tBCCAO tarafından işletilen farelerde de çoğalttık. Bu veriler, tBCCAO tarafından kan dolaşımının bozulmasının retinaya ulaşabileceğini ve son olarak retina katmanlarını etkileyebileceğini göstermektedir.

Tutarlı sonuçlar için anestezik zaman ve cerrahi işlemlerin uzunluğunun yanı sıra deneysel modellerin ağırlıkları ve yaşları ve ameliyat sırasında ve sonrasında vücut ısıları gibi diğer faktörler standart hale getirilmelidir45. Özellikle, deneysel gözlem süresi boyunca farelerin vücut sıcaklığını korumak için dikkat gereklidir. Bunun nedeni hipotermi önkoşul etkisine sahip olabilir ve tBCCAO46ile iskemik etkilere müdahale edebilir. Deneylerimizde farelerin tam vücut sıcaklığını ölçemesek de, fareler yeterli bilinci kazanana kadar fareleri ısıtmak için ısıtma pedleri kullandık. Ayrıca, kontrol edilemeyen faktörlerin potansiyel şaşırtıcı etkilerini kontrol etmek için tBCCAO tarafından işletilen fareleri sham-operated farelerle karşılaştırdık.

Fare suşları, tBCCAO tarafından retinal iskemik yaralanmaya neden olan ek bir önemli değişken faktör olabilir. Fare suşlarında Willis çemberinin önemli bir varyasyonu, retina ishcemia47 de dahil olmak üzere serebral iskemide istenmeyen bir azalmaya veya indüksiyona neden olabilir ve böylece sonuçların değişkenliklerine yol açabilir. Diğer fare suşlarının uygulanması gerektiğinde başarılı bir tBCCAO kaynaklı iskemik retinopati için sıkıştırma süresinin ayarlanması önerilir.

Genel olarak, inme veya diğer beyin yaralanmaları olaylarına her zaman geçici veya kalıcı vison kaybı eşlik eder48. Bugüne kadar, MCAO fare modeli inme çalışmaları için yaygın olarak kullanılmaktadır. OpA, MCA'nın kökenine proksimal olarak kaynaklandığından, MCA'daki kan akışındaki herhangi bir engel retinaya akışı engeller. Retina iskemisi ilk olarak MCAO37tarafından sıçanlarda gösterilmiştir. Daha sonra, aynı retina iskemik modeli farelere uygulandı49. Bununla birlikte, işlem için tıkanıklık 60 dakikadan fazla sürer ve MCA beynin derinliklerine gömüldüğü için bir tıkanıklık bölgesi bulmak son derece zordur. Ayrıca, MCAO için filament boyutu ve ekleme uzunluğu ameliyatın başarısına büyük ölçüde karar verir. Bu ek değişken faktörler ameliyattan sonra iskemik sonuçların değişkenliklerine neden olur. TBCCAO ve MCAO arasında doğrudan karşılaştırma çalışmalarına ihtiyaç duyulsa da, bu çalışmada deneysel modellerimizin faydalı özelliklerini tanımladık: kısa tıkanıklık süresi, basit deneysel prosedür ve yüksek erişilebilir tıkanıklık bölgeleri. Bu model MCAO modellerinde görülen endişeleri çözebilir.

Retina iskemisinin fare modelinin kullanımının retina iskemik yaralanmasını incelemek için büyük faydaları olsa da, bu yaklaşımın sınırlamaları devam etmektedir. Boyuna cerrahi kesi, tükürük bezlerinin ayrılması ve sağ CCA'daki tıkanıklık dikişlerle uygulanmalıdır, eşlik eden doku bozulmaları ilişkili iltihabı sistemik veya en azından lokal olarak çağrıştırabilir. Bu endişeler, tüm cerrahi adımların tBCCAO olmadan gerçekleştirildiği sham-operated fareler kullanılarak kısmen ele alındı. Bir diğer konu ise ameliyat sırasında ve sonrasında ortaya çıkan ağrıyı yönetme zorunluluğudur. Çalışmamızda, farelerin acı çekmesini önlemek için ağrı yönetimi, fenanthrene serisinin sentetik olarak türetilmiş bir opioid agonist-antagonist analjezik olan butorphanol tartrate çözeltisinin enjeksiyonu ile uygulandı. Farklı anestetik ve analjezik türlerinin kullanımının tBCCAO'nun retina iskemisi üzerindeki etkilerini bozabileceğinin farkında olmak önemli olabilir. Bu yaklaşımın bir başka sınırlaması (şu anda kullanılan diğer modellerin yaklaşımlarıyla birlikte), insan kardiyovasküler retina bozukluklarıyla ilişkili patolojilerin mükemmel bir simülasyonu sağlamamasıdır. Bugüne kadar, bu tür deneyler için kullanılan fare modelleri, insanlarda iskemik retinopatilerin altında yatan yardımcı morbiditelerden muzdarip değildir, özellikle diyabet gibi metaboliksendromlarla 50. Mevcut fare modellerinde bulunmayan bu tür komplikasyonlar, iskemik retinopatilerin gelişimi için patolojik yollar üzerinde olumsuz sinerjik etkilere sahip olabilir. Bu nedenle, tBCCAO fare modelimiz de dahil olmak üzere şu anda kullanılan deneysel modellerden elde edilen sonuçları yorumlarken bu dikkate alınmalıdır. İnsanlarda iskemik retinopatilerin patofizyolojik mekanizmalarını daha iyi anlamak için modelimiz, iskemik diyabetik retinopati gelişimi için streptozotosin enjeksiyonu51 veya yüksek yağlı diyet takviyesi52 gibi diğer patolojik faktörlerle birleştirilebilir. Sonunda, tBCCAO tarafından işletilen farelerde retina kan perfüzyonunda azalma göstermiş olsak da, sol geçici CCAO'nun sağ retinadaki kan perfüzyonu üzerindeki etkilerini net olarak anlayamadık. Bu konu, tipik olarak tıkanıklık gerçekleştiğini ve iskemi in vivo gerçek zamanlı olarak meydana geldiğini doğrulamak için kullanılan lazer-Doppler kullanılarak ele alınabilir53,54. Bu teknik, Willis çemberindeki kollateral dolaşımla ilgili olarak, tBCCAO tarafından işletilen bireysel bir farede retina iskemisinin daha iyi anlaşılması için kullanılabilir.

Bu sınırlamalara rağmen, burada açıklanan tBCCAO yöntemimiz farelerde retina iskemisi üretmek için etkili bir yaklaşımı temsil eder. TBCCAO tarafından retina değişikliklerinin incelenmesi, insanlarda iskemik retinopatilerin patolojik mekanizmalarının çözülmesine yardımcı olur. Ayrıca, tBCCAO fare modelinin in vivo ilaç taraması için kullanılabileceğini umuyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma, Eğitim, Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı'ndan (MEXT) Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (Toshihide Kurihara'ya 18K09424 ve Yukihiro Miwa'ya 20K18393) tarafından desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atipamezole hydrochloride Zenoaq Antisedan For anti-anesthesia
Applied Biosystems 7500 Fast Applied Biosystems - For qPCR
Butorphanol tartrate Meiji Seika Pharma Vetorphale For anesthesia
BZ-II Analyzer KEYENCE - For an image merge
BALB/cAJc1 CLEA - Mouse strain
β-Actin (8H10D10) Mouse mAb CST 3700 For western blot
Clamp Forcep World Precision Instruments WPI 500451 For surgery
Dumont forceps #5 Fine Science Tools 11251-10 For surgery
DAPI solution Dojindo 340-07971 For IHC
Envisu SD-OCT system Leica R4310 For OCT
FITC-dextran Merk FD2000S For retinal blood perfusion
Fluorescence microscope KEYENCE BZ-9000 For fluorescence detection
Gatifloxacin hydrate Senju Pharmaceutical Gachifuro For anti-bacterial infection
GFAP Monoclonal Antibody (2.2B10) Thermo 13-0300 For IHC
Heating pad Marukan RH-200 For surgery
HIF-1α (D1S7W) XP Rabbit mAb CST 36169 For western blot
ImageQuant LAS 4000 mini GE Healthcare - For chemiluminescence
Midazolam Sandoz K.K SANDOZ For anesthesia
Microtome Tissue-Tek TEC 6 Sakura - For sectioning
Medetomidine Orion Corporation Domitor For anesthesia
Needle holder Handaya HS-2307 For surgery
PuREC MAYO Corporation - For ERG
Scissor Fine Science Tools 91460-11 For surgery
Sodium hyaluronate Santen Pharmaceutical Hyalein For eye lubrication
Tropicamide/Penylephrine hydrochloride Santen Pharmaceutical Mydrin-P For mydriasis
6-0 silk suture Natsume E12-60N2 For surgery

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, B. Ocular effects of changes in oxygen and carbon dioxide tension. Transactions of the American Ophthalmological Society. 66, 423-474 (1968).
  2. Ingberg, E., Dock, H., Theodorsson, E., Theodorsson, A., Ström, J. O. Method parameters' impact on mortality and variability in mouse stroke experiments: a meta-analysis. Scientific Reports. 6 (1), 21086 (2016).
  3. Atochin, D. N., Clark, J., Demchenko, I. T., Moskowitz, M. A., Huang, P. L. Rapid Cerebral Ischemic Preconditioning in Mice Deficient in Endothelial and Neuronal Nitric Oxide Synthases. Stroke. 34 (5), 1299-1303 (2003).
  4. Allen, R. S., et al. Severity of middle cerebral artery occlusion determines retinal deficits in rats. Experimental Neurology. 254, 206-215 (2014).
  5. Steele, E. C., Guo, Q., Namura, S. Filamentous Middle Cerebral Artery Occlusion Causes Ischemic Damage to the Retina in Mice. Stroke. 39 (7), 2099-2104 (2008).
  6. Minhas, G., Morishita, R., Anand, A. Preclinical models to investigate retinal ischemia: advances and drawbacks. Frontiers in Neurology. 3, 75 (2012).
  7. McColl, B. W., Carswell, H. V., McCulloch, J., Horsburgh, K. Extension of cerebral hypoperfusion and ischaemic pathology beyond MCA territory after intraluminal filament occlusion in C57Bl/6J mice. Brain Res. 997 (1), 15-23 (2004).
  8. Jiang, A. X., et al. Inducement and Evaluation of a Murine Model of Experimental Myopia. Journal of Visualized Experiments. (143), e58822 (2019).
  9. Miwa, Y., et al. Pharmacological HIF inhibition prevents retinal neovascularization with improved visual function in a murine oxygen-induced retinopathy model. Neurochemistry International. 128, 21-31 (2019).
  10. Adams, S., Pacharinsak, C. Mouse Anesthesia and Analgesia. Current Protocols in Mouse Biology. 5 (1), 51-63 (2015).
  11. Speetzen, L. J., Endres, M., Kunz, A. Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia. Journal of Visualized Experiments. (75), e4387 (2013).
  12. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments. (47), e2423 (2011).
  13. Lee, D., Kang, H., Yoon, K. Y., Chang, Y. Y., Song, H. B. A mouse model of retinal hypoperfusion injury induced by unilateral common carotid artery occlusion. Experimental Eye Research. 201, 108275 (2020).
  14. Li, S., et al. Retro-orbital injection of FITC-dextran is an effective and economical method for observing mouse retinal vessels. Molecular Vision. 17, 3566-3573 (2011).
  15. Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo. Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).
  16. Lee, D., et al. A Fairy Chemical Suppresses Retinal Angiogenesis as a HIF Inhibitor. Biomolecules. 10 (10), (2020).
  17. Tomita, Y., et al. Pemafibrate Prevents Retinal Pathological Neovascularization by Increasing FGF21 Level in a Murine Oxygen-Induced Retinopathy Model. International Journal of Molecular Sciences. 20 (23), 5878 (2019).
  18. Yamamoto, H., Schmidt-Kastner, R., Hamasaki, D. I., Yamamoto, H., Parel, J. M. Complex neurodegeneration in retina following moderate ischemia induced by bilateral common carotid artery occlusion in Wistar rats. Experimental Eye Research. 82 (5), 767-779 (2006).
  19. Cheng, L., Yu, H., Yan, N., Lai, K., Xiang, M. Hypoxia-Inducible Factor-1α Target Genes Contribute to Retinal Neuroprotection. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 20 (2017).
  20. Mole, D. R., et al. Genome-wide association of hypoxia-inducible factor (HIF)-1alpha and HIF-2alpha DNA binding with expression profiling of hypoxia-inducible transcripts. The Journal of Biological Chemistry. 284 (25), 16767-16775 (2009).
  21. Majmundar, A. J., Wong, W. J., Simon, M. C. Hypoxia-Inducible Factors and the Response to Hypoxic Stress. Molecular Cell. 40 (2), 294-309 (2010).
  22. Newman, E. A. Glial cell regulation of neuronal activity and blood flow in the retina by release of gliotransmitters. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370 (1672), (2015).
  23. Vecino, E., Rodriguez, F. D., Ruzafa, N., Pereiro, X., Sharma, S. C. Glia-neuron interactions in the mammalian retina. Progress in Retinal and Eye Research. 51, 1-40 (2016).
  24. Symonds, C. The Circle of Willis. British Medical Journal. 1 (4906), 119 (1955).
  25. Lo, W. B., Ellis, H. The circle before willis: a historical account of the intracranial anastomosis. Neurosurgery. 66 (1), 7-18 (2010).
  26. Yang, G., et al. C57BL/6 strain is most susceptible to cerebral ischemia following bilateral common carotid occlusion among seven mouse strains: selective neuronal death in the murine transient forebrain ischemia. Brain Research. 752 (1), 209-218 (1997).
  27. Farkas, E., Luiten, P. G. M., Bari, F. Permanent, bilateral common carotid artery occlusion in the rat: A model for chronic cerebral hypoperfusion-related neurodegenerative diseases. Brain Research Reviews. 54 (1), 162-180 (2007).
  28. Morris, G. P., et al. A Comparative Study of Variables Influencing Ischemic Injury in the Longa and Koizumi Methods of Intraluminal Filament Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice. PLOS ONE. 11 (2), 0148503 (2016).
  29. Tsuchiya, D., Hong, S., Kayama, T., Panter, S. S., Weinstein, P. R. Effect of suture size and carotid clip application upon blood flow and infarct volume after permanent and temporary middle cerebral artery occlusion in mice. Brain Research. 970 (1-2), 131-139 (2003).
  30. Kaelin, W. G., Ratcliffe, P. J. Oxygen Sensing by Metazoans: The Central Role of the HIF Hydroxylase Pathway. Molecular Cell. 30 (4), 393-402 (2008).
  31. Pauly, M., Sruthi, R. Ptosis: evaluation and management. Kerala Journal of Ophthalmolgy. 31 (1), 11-16 (2019).
  32. Averbuch-Heller, L., Leigh, R. J., Mermelstein, V., Zagalsky, L., Streifler, J. Y. Ptosis in patients with hemispheric strokes. Neurology. 58 (4), 620 (2002).
  33. Dutton, J. Atlas of clinical and surgical orbital anatomy, second edition. 113, 1364 (2011).
  34. Ritzel, R. M., et al. Early retinal inflammatory biomarkers in the middle cerebral artery occlusion model of ischemic stroke. Molecular Vision. 22, 575-588 (2016).
  35. Crespo-Garcia, S., et al. Individual and temporal variability of the retina after chronic bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO). PLOS ONE. 13 (3), 0193961 (2018).
  36. Qin, Y., et al. Functional and morphologic study of retinal hypoperfusion injury induced by bilateral common carotid artery occlusion in rats. Scientific Reports. 9 (1), 80 (2019).
  37. Block, F., Grommes, C., Kosinski, C., Schmidt, W., Schwarz, M. Retinal ischemia induced by the intraluminal suture method in rats. Neuroscience Letters. 232 (1), 45-48 (1997).
  38. Allen, R. S., et al. Progesterone Treatment in Two Rat Models of Ocular Ischemia. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (5), 2880-2891 (2015).
  39. Miller, R. F., Dowling, J. E. Intracellular responses of the Müller (glial) cells of mudpuppy retina: their relation to b-wave of the electroretinogram. Journal of Neurophysiology. 33 (3), 323-341 (1970).
  40. Block, F., Grommes, C., Kosinski, C., Schmidt, W., Schwarz, M. Retinal ischemia induced by the intraluminal suture method in rats. Neuroscience Letters. 232 (1), 45-48 (1997).
  41. Lee, J. H., Shin, J. M., Shin, Y. J., Chun, M. H., Oh, S. J. Immunochemical changes of calbindin, calretinin and SMI32 in ischemic retinas induced by increase of intraocular pressure and by middle cerebral artery occlusion. Anatomy & Cell Biology. 44 (1), 25-34 (2011).
  42. Li, S. Y., et al. Lycium barbarum polysaccharides reduce neuronal damage, blood-retinal barrier disruption and oxidative stress in retinal ischemia/reperfusion injury. PLOS ONE. 6 (1), 16380 (2011).
  43. Furashova, O., Matthé, E. Retinal Changes in Different Grades of Retinal Artery Occlusion: An Optical Coherence Tomography Study. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (12), 5209-5216 (2017).
  44. Zadeh, J. K., et al. Short-Time Ocular Ischemia Induces Vascular Endothelial Dysfunction and Ganglion Cell Loss in the Pig Retina. International Journal of Molecular Sciences. 20 (19), (2019).
  45. Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. Rodent stroke model guidelines for preclinical stroke trials (1st edition). Journal of Experimental Stroke & Translational Medicine. 2 (2), 2-27 (2009).
  46. Tang, Y., et al. Hypothermia-induced ischemic tolerance is associated with Drp1 inhibition in cerebral ischemia-reperfusion injury of mice. Brain Research. 1646, 73-83 (2016).
  47. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 13 (4), 683-692 (1993).
  48. Pula, J. H., Yuen, C. A. Eyes and stroke: the visual aspects of cerebrovascular disease. Stroke and Vascular Neurology. 2 (4), 210 (2017).
  49. Steele, E. C., Guo, Q., Namura, S. Filamentous middle cerebral artery occlusion causes ischemic damage to the retina in mice. Stroke. 39 (7), 2099-2104 (2008).
  50. Sim, D. A., et al. The Effects of Macular Ischemia on Visual Acuity in Diabetic Retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 2353-2360 (2013).
  51. Wu, K. K., Huan, Y. Streptozotocin-induced diabetic models in mice and rats. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 5, Unit 5.47 (2008).
  52. Mubarak, A., Hodgson, J. M., Considine, M. J., Croft, K. D., Matthews, V. B. Supplementation of a high-fat diet with chlorogenic acid is associated with insulin resistance and hepatic lipid accumulation in mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61 (18), 4371-4378 (2013).
  53. Ansari, S., Azari, H., McConnell, D. J., Afzal, A., Mocco, J. Intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke with laser doppler flowmetry guidance in mice. Journal of Visualized Experiments. (51), e2879 (2011).
  54. Hedna, V. S., et al. Validity of Laser Doppler Flowmetry in Predicting Outcome in Murine Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion Stroke. Journal of Vascular and Interventional Neurology. 8 (3), 74-82 (2015).

Tags

Tıp Sayı 165 Karotis arter tıkanma Elektroretinografi Deneysel modeller Hipoksi İskemi Optik tutarlılık tomografisi Retina Reperfüzyon
Geçici Bilateral Ortak Karotid Arter Tıkanması sonucu İndüklenen İskemik Retina Yaralanmasının Murine Modeli
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, D., Miwa, Y., Jeong, H., Ikeda, … More

Lee, D., Miwa, Y., Jeong, H., Ikeda, S. i., Katada, Y., Tsubota, K., Kurihara, T. A Murine Model of Ischemic Retinal Injury Induced by Transient Bilateral Common Carotid Artery Occlusion. J. Vis. Exp. (165), e61865, doi:10.3791/61865 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter