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Medicine

由瞬态双边常见胡萝卜动脉闭塞引起的缺血性视网膜损伤的 Murine 模型

Published: November 12, 2020 doi: 10.3791/61865
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,4, 1,2
1Laboratory of Photobiology, Keio University School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, Keio University School of Medicine, 3Animal eye care, Tokyo Animal Eye Clinic, 4Tsubota Laboratory, Inc.
* These authors contributed equally

Summary

在这里，我们描述了一个鼠标模型的视网膜缺血通过瞬态的双边常见的胡萝卜动脉闭塞使用简单的缝合线和夹子。该模型可用于了解心血管异常引起的视网膜缺血的病理机制。

Abstract

多种血管疾病，如糖尿病视网膜病变、视网膜静脉或动脉闭塞以及眼缺血综合征可导致视网膜缺血。为了研究视网膜缺血的病理机制，需要开发相关的实验模型。从解剖学上讲，主要的视网膜供血血管是眼动脉 （OpA）， OpA 起源于普通胡萝卜动脉 （CCA） 的内胡萝卜动脉。因此，CCA的中断可以有效地导致视网膜缺血。在这里，我们建立了视网膜缺血的鼠标模型，通过瞬态的双边常见胡萝卜素动脉闭塞（tBCCAO），用6-0丝缝合右CCA，并通过夹子暂时将左CCA遮挡2秒，并表明tBCCAO可以诱发急性视网膜缺血，导致视网膜功能障碍。目前的方法通过仅使用手术针头和夹子来减少对手术器械的依赖，缩短了闭塞时间，以尽量减少意外的动物死亡，这在中脑动脉闭塞小鼠模型中经常看到，并保持常见视网膜缺血结果的可重复性。该模型可用于研究小鼠缺血视网膜病变的病理生理学，并进一步用于体内药物筛选。

Introduction

视网膜是一种神经感官组织，用于视觉功能。由于视觉功能需要大量的氧气，视网膜被称为身体中对氧气要求最高的组织之一。由于氧气通过血管输送，网膜易患血管疾病。各种血管疾病，如糖尿病视网膜病变和视网膜血管（静脉或动脉）闭塞，可诱发视网膜缺血。为了研究视网膜缺血的病理机制，认为有必要对视网膜缺血进行可重复和临床相关的实验模型。通过插入内脏丝进行中脑动脉闭塞（MCAO）是开发实验性脑缺血2、3体内啮齿动物模型的最普遍方法。由于眼动脉（OpA）接近MCA，MCAO模型也同时用于了解视网膜缺血的病理生理学4，5，6。为了诱导脑缺血和视网膜缺血，长丝通常通过普通胡萝卜动脉 （CCA） 或外部胡萝卜动脉 （ECA） 的切口插入。这些方法很难执行，需要很长时间才能完成手术（一只小鼠超过60分钟），并导致手术后结果的高变异性7。制定更好的模式以改善这些关切仍然很重要。

在这项研究中，我们只是使用短的瞬态双边CCA闭塞（tBCCAO）与针头和夹子诱导视网膜缺血在小鼠，并分析了视网膜缺血损伤的典型结果。在此视频中，我们将演示 tBCCAO 程序。

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Protocol

这里描述的所有方法都得到了庆应大学医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 准备手术器械和动物

  1. 高压外科手术器械，并保持他们在70%的乙醇。在每一次新的外科手术之前，清洁手术器械小心使用70%的乙醇。
  2. 在特定无病原体 （SPF） 室中准备雄性 BALB/cAJc1 小鼠（6 周大，26-28 公斤），以便在手术前、手术期间和手术后保持无菌状态。

2. 瞬态双边常见胡萝卜动脉闭塞（tBCCAO）

  1. 通过腹内注射将鼠标置于麻醉下，结合中佐兰（40微克/100微升）、梅德托米丁（7.5微克/100微升）和丁醇酸酸盐（50微克/100微升），称为"MMB"，如前述的8，9。抓住老鼠的后皮，防止老鼠撞到眼睛，直到老鼠完全麻醉。
    1. 判断麻醉的深度，捏鼠标脚趾，直到它没有反应，其中的方法通常用于检查完整的麻醉10。
      注：一般来说，小鼠入睡需要不到5分钟。适当的全身麻醉配方可能因机构而异。
  2. 将一滴0.1%纯化的透明质钠眼药水溶液涂抹在眼睛上，防止麻醉下眼睛干燥。
  3. 将鼠标放在它的背上，用胶带固定鼠标的爪子。
  4. 手术前使用70%的乙醇对老鼠的颈部区域进行消毒。
    注：毛皮的额外剪裁没有进行，因为这可能导致随后的皮肤炎症11，12。
  5. 用刀片（图1）对颈部进行下垂切口。
    注：切口需要在颈部、胸骨和气管之间的中线进行。
  6. 使用两个钳子小心地分离两个唾液腺，并动员它们来可视化潜在的CPA。
  7. 在不损害其结构的情况下，小心地将右 CCA 与各自的血管神经和伴随的静脉隔离，并将两根 6-0 丝绸缝合线置于 CCA 下。将两条领带紧紧地系住，以阻止血流（图1）。
    注：在手术过程中，小静脉可能会受损。如果看到出血，需要擦拭才能清楚地显示CCA。
  8. 从各自的血管神经和伴随的静脉中仔细查找左CCA，而不会伤害其结构，并通过夹子将左CCA遮挡 2 秒（图 1）。
    注：需要将 6-0 丝缝针放在左 CCA 下，以标记夹紧的部位。
  9. 左CCA重新打开后，用6-0丝缝合颈部的缝合伤口，并在颈部涂抹抗生素（50 μL），以抑制细菌感染。
    注：在左CCA重新打开时，请轻轻取下夹子以避免损坏动脉壁。
  10. 将0.75毫克/千克盐酸阿提帕米佐尔注射到鼠体内，帮助小鼠迅速从深度麻醉中恢复过来。将鼠标返回带预热垫的鼠标笼中。
    注意：不要让鼠标无人看管，直到鼠标恢复足够的意识，以保持体面休养。
  11. 将 0.4 毫克/千克的布托帕诺酸酸注射到鼠标上，用于管理鼠标醒来时的疼痛。
    注：协议可在此处暂停。作为成功tBCCAO的第一个提示，可以观察到鼠标的眼睑下垂（图2）。
  12. 对于安乐死，向小鼠注射3倍的MB混合物，并牺牲它们进行实验。

3. 一般观察（存活率和眼睑下垂）

  1. 手术后，检查所有死因的存活率在第0天（手术后），1，3和7。
  2. 评估眼睑下垂 4 点评级尺度： 1 = 无下垂， 2 = 轻度下垂 （约 50%）， 3 = 严重下垂 （超过 50%）， 4 = 眼睛放电严重下垂。

4. 视网膜输血

  1. 注射200μL的FITC-dextran（25毫克/mL）到小鼠的左心室，这是通常用于观察血液灌注小鼠视网膜血管13，14。
  2. 循环后2分钟，将眼睛核化，固定在4%的准甲醛中1小时。视网膜被仔细获得和平装，如先前描述的15，并通过荧光显微镜检查。
  3. 以 4 倍的放大倍率拍摄视网膜整个坐骑的照片，并使用合并分析仪合并成一个单个，以前描述的16。
  4. 通过 NIH 斐济/ImageJ 软件中的容器分析工具测量注入区域。

5. 西方污点

  1. 3和6小时后，tBCCAO，获得小鼠的眼睛，并立即转移到含有冷PBS的培养皿，以隔离视网膜。
  2. 视网膜隔离后，进行西印，如先前描述的9。
  3. 与抗体一起孵化，用于缺氧诱发因子-1+（HIF-1+;一般缺氧标记）和β-Actin（内部负荷控制），然后孵化HRP结合的次要抗体。通过化学发光可视化信号。

6. 定量 PCR （qPCR）

  1. 6，12和24小时后tBCCAO，处理获得的视网膜qPCR，如先前描述的17。
  2. 通过实时PCR系统执行qPCR。所使用的底漆列在 表 1中。通过ΔΔCT 方法计算不同成绩单水平之间的折叠变化。

7. 免疫化学（IHC）

  1. 3天后tBCCAO，获得小鼠的眼睛，并嵌入石蜡。
  2. 用微切除术切割石蜡嵌入的眼睛，以获得眼部。
  3. 去石蜡和染色眼睛部分的5μm厚度，如先前描述的13。
  4. 与胶质纤维酸性蛋白（GFAP;星形细胞和网膜中的穆勒细胞的可靠标记）的抗体一起孵化过夜，然后孵化亚历克萨氟555结合二次抗体。
  5. 使用DAPI（4+，6-迪亚米迪诺-2-苯丙酮）染色视网膜中的细胞核。通过荧光显微镜可视化信号。
  6. 按 4 分评级等级评估形态评分，如之前描述的 13、18：0 = 无信号、1 = 在胶质细胞层 （GCL） 中很少有正胶质端脚、2 = 从 GCL 到外核层 （ONL） 的标记过程很少，以及从 GCL 到 ONL 的大多数标记过程。

8. 电视网膜成像（ERG）

  1. 3和7天后tBCCAO，执行ERG使用甘兹费尔德圆顶，采集系统和LED刺激器，如前所述9。
  2. 经过一夜的黑暗适应后，在昏暗的红灯下用MB组合麻醉小鼠。
  3. 使用0.5%热带酰胺和0.5%苯肾上腺素的混合溶液来延长瞳孔。
  4. 将活动电极放在隐形眼镜上，并将参考电极放置在口腔中。
  5. 从每只动物的两只眼睛获得ERG响应。
  6. 用各种刺激记录黑暗适应下的滑板反应。
  7. 测量波从基线到波的最低点的振幅。
  8. 测量 b 波的振幅，从波的最低点到 b 波的峰值。
  9. 使用热垫在手术过程中保持所有小鼠的温暖。

9. 光学连贯断层扫描 （OCT）

  1. tBCCAO后2周，使用SD-OCT系统执行OCT，如先前报道的8，9。
  2. 在测量中，通过0.5%的热带酰胺和0.5%的苯肾上腺素的混合溶液，让小鼠患上甲虫病，并通过MB的混合物进行全身麻醉。
  3. 从赤道片的面对面扫描中获取 B 扫描图像。
  4. 检查视网膜在0.2，0.4和0.6毫米从视神经头。
  5. 测量视网膜厚度从视网膜神经纤维层 （NFL） 到外部限制膜 （ELM），并将测量值的平均值视为单个鼠标的视网膜厚度。
  6. 将结果绘制为蜘蛛图。

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Representative Results

在FITC-dextran系统循环2分钟后，检查了假手术小鼠和tBCCAO手术小鼠左视网膜和右视网膜的视网膜血管（补充图1）。FITC-dextran在假手术小鼠的视网膜和tBCCAO操作的小鼠的左视网膜中完全可见，而在tBCCAO操作的小鼠的右视网膜中部分可检测到。

在tBCCAO之后，对眼睑下垂进行了检查（图2）。右眼显示温和（得分2;75%）和严重的眼睑（分数3和4：25%）下垂，而左眼没有下垂（得分1：93.75%）除了一只鼠标（分数2;6.25%）。虽然在tBCCAO手术的小鼠中没有发现眼睑严重下垂的情况，但我们可以看到一只小鼠出现这种表型（得分4;6.25%）。

组织中的氧气状态降低导致HIF-1®的稳定，并诱导一些对缺氧反应的基因，如EPO、VEGF和BNIP319、20、21。 首先，使用一般缺氧标记HIF-1®的分子生物缺氧通过西方印迹（图3）进行评估。在 tBCCAO 之后的 3 小时和 6 小时内，右网膜显著观察到 HIF-1® 表达的增加。接下来，通过qPCR（补充图2）对对缺氧反应基因的表达进行评估。在 tBCCAO 之后的 6 小时内，对缺氧反应的基因表达没有显著变化。tBCCAO 12 小时后，我们发现Binp3表达明显增加，右视网膜显示Epo表情略有增加。在 tBCCAO 之后的 24 小时内，我们还可以发现右视网膜中的Epo表情略有增加，尽管它在统计学上没有显著性。在 tBCCAO 操作的小鼠中，Vegf的表达方式在 6 到 24 小时内没有改变。

视网膜反应性胶质疏松症在tBCCAO（图4）3天后被检查，因为天体细胞和穆勒细胞等胶质疏松症与视网膜缺血症22密切相关。GFAP已被广泛用于检测星形细胞和髓膜细胞在网膜23。右视网膜中GFAP标签的形态评分在假手术小鼠的视网膜和tBCCAO操作的小鼠的左视网膜中最高。基于 GFAP 表达式的本地化，GFAP 标签的形态变化被认为反映了 Müller 细胞的激活。

ERG用于检查视网膜功能障碍后tBCCAO（图5）。右眼b波的振幅在tBCCAO后3天和7天急剧下降。但是，右眼波浪的振幅没有显著变化。说到左眼，我们看不到a波和b波的振幅有任何变化（补充图3）。

我们执行 OCT 以确定 tBCCAO （图 6）后视网膜厚度的改变。右眼视网膜厚度在 tBCCAO 后 2 周显著增加，而 tBCCAO 和假手术小鼠的左眼视网膜厚度没有差异。

Figure 1
图1：威利斯圈子中模型程序和血液循环的示意图。示意图图显示了 tBCCAO 诱导的视网膜缺血小鼠模型程序和视网膜的血液循环。CCA、ECA、ICA、PCA 和 OpA 分别代表常见的胡萝卜动脉、外部胡萝卜动脉、内胡萝卜动脉、后沟通动脉和眼动脉。 请点击这里查看此数字的较大版本。

Figure 2
图2：眼睑在tBCCAO后下垂。根据参考图像，对眼睑下垂的严重程度进行了 4 分评分评估：1 = 无下垂，2 = 轻度下垂（+50% 下垂）、3 = 严重下垂（超过 50% 下垂）和 4 = 眼睛放电严重下垂。眼睑下垂是在tBCCAO之后观察到的，并在实验观察期间保持。结果（沙姆：n=10，tBCCAO：n=16）被绘制为散点图。 请点击这里查看此数字的较大版本。

Figure 3
图3：HIF-1*在tBCCAO之后稳定。HIF-1+和β-Actin的代表性免疫和定量分析（组为小时3;假：n = 3，tBCCAO：n = 6和组为小时6;假和tBCCAO：n =6）表明HIF-1+在tBCCAO后3小时和6小时稳定在右视网膜中。*P和lt：0.05。这些数据使用学生 的t-test进行分析，并呈现为平均值±标准偏差。L 和 R 分别代表左侧和右侧网膜。 请点击这里查看此数字的较大版本。

Figure 4
图4：tBCCAO后的反应性胶质疏松症。视网膜（sham： n = 4， tBCCAO： n = 4） 的代表性下垂部分和通过形态评分 （0-3） 对 GFAP 标签 （红色） 的定量分析表明，GFAP 标签（主要限于 NFL+GCL）扩展到整个内层，从 GCL 扩展到右视网膜中的 ONL（白色箭头）。比例尺条，50μm。DAPI（蓝色）用于染色网膜中的细胞核。NFL、GCL、IPL、INL和上L分别代表神经纤维层、结石细胞层、内质层、内核层和外核层。这些数据使用学生 的t-test进行分析，并呈四分位数，即第25和第75个百分位。*P和lt：0.05。L 和 R 分别代表左侧和右侧网膜。 请点击这里查看此数字的较大版本。

Figure 5
图5：tBCCAO后右眼视觉功能障碍。（A） 黑暗适应ERG的代表波形在tBCCAO后3天和7天进行。刺激强度 （cd.s/m2）： 0.005.（B） 定量分析显示，右眼b波的振幅减少（沙姆：n = 5，tBCCAO：n = 6），而一波的振幅没有改变。*P +lt; 0.05， **P +lt; 0.01.这些数据使用学生 的t-test进行分析，并呈现为平均值±标准偏差。 请点击这里查看此数字的较大版本。

Figure 6
图6：tBCCAO后视网膜厚度的变化。假视网膜和tBCCAO操作视网膜中的代表性OCT图像和定量分析显示右视网膜视网膜厚度增加（假：n = 4，tBCCAO：n = 8）。左视网膜视网膜厚度没有变化（香：n=4，tBCCAO：n=8）。比例尺条分别为 200 （上） 和 100 （下） μm。*P和lt：0.05。图表水平轴中的值表示距离绿线检测到的视神经头 （0） 远 0.2、0.4 和 0.6 mm。数据使用双向 ANOVA 进行分析，然后进行邦费罗尼后临时测试。蜘蛛图被呈现为平均与±标准偏差。NFL、INL、ONL和ELM分别是神经纤维层、内核层、外核层和外部限制膜。 请点击这里查看此数字的较大版本。

补充图1：tBCCAO后视网膜输血。 经过2分钟的FITC-dextran循环和定量分析后，代表性视网膜平面坐骑图像（每个图像的放大率较高）表明，在假操作小鼠的视网膜和tBCCAO操作的小鼠的左视网膜中都能观察到完全的香水。然而，在tBCCAO手术的小鼠右网膜显示部分输血。这些数据使用学生 的t-test进行分析，并呈现为平均值±标准偏差。L 和 R 分别代表左侧和右侧网膜。比例尺条分别为 800 和 400 μm。 请点击这里下载此数字。

补充图2：tBCCAO后对缺氧反应基因的表达。 定量分析显示，右网膜中的 Bnip3 mRNA表达在tBCCAO后12小时出现瞬时增加，具有统计学意义。 Epo mRNA 表达在 tBCCAO 之后的 24 小时内在右视网膜中呈上升趋势，尽管其值与假操作右视网膜相比没有显著差异。**P.lt：0.01。这些数据使用学生 的t-test进行分析，并呈现为平均值±标准偏差。 请点击这里下载此数字。

补充图3：tBCCAO后左眼的视觉功能。 定量分析表明，左眼a波和b波的振幅没有变化（沙姆：n = 5，tBCCAO：n = 6）。P=0.05。这些数据使用学生 的t-test进行分析，并呈现为平均值±标准偏差。 请点击这里下载此数字。

补充图4：C57BL6和BALB中tBCCAO之后的存活率。 卡普兰-迈尔生存曲线显示，几乎所有小鼠在C57BL6小鼠的tBCCAO之后3天内死亡。当涉及到BALB小鼠时，tBCCAO中较长的夹紧时间会导致动物突然和严重死亡（第7天、20秒的存活率：10%、10秒：20%、2秒：81%和0秒：95%）。 请点击这里下载此数字。

补充图5：HIF-1*单方面CCAO后稳定。 对HIF-1+和β-Actin的代表性免疫和定量分析（沙姆：n = 3，单边CCAO：n =3）表明，HIF-1在单边CCAO3小时后没有稳定在视网膜中。P=0.05。这些数据是使用学生 的t-test进行分析的，并呈±标准偏差的均值。L 和 R 分别代表左侧和右侧网膜。 请点击这里下载此数字。

补充图 6： 长时间夹紧后严重眼睑下垂。 10秒的tBCCAO诱发严重的眼睑下垂，这是由4点评分等级评估：1 = 无下垂，2 = 轻度下垂（约50%），3 = 严重下垂（超过50%），4 = 严重下垂与眼睛放电，如 图2所述。 请点击这里下载此数字。

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Discussion

在这项研究中，我们已经表明，tBCCAO，使用简单的缝合和夹子，可以诱导视网膜缺血和伴随视网膜功能障碍。此外，我们已证明，我们目前的协议，开发视网膜缺血小鼠模型是更容易和更快相比，其他以前的协议，开发视网膜缺血损伤模型2，3，7。

从解剖学上讲，左右脑动脉可以通过后沟通动脉（PCAs）连接，这些动脉在威利斯圆圈内提供辅助循环，以维持对中枢神经系统的充足血液供应，防止单个血管24、25（图1）的闭塞或狭窄导致流量中断。李等人证明视网膜输血可能是10分钟延迟（这不是整个封锁视网膜中的视网膜输液）由永久单边CCAO在C57BL6小鼠13。这意味着，CCAO诱导视网膜缺血与威利斯圈子中的抵押流通条件密切相关。C57BL6 是 BCCAO 在七种小鼠菌株中对脑缺血最易感染的鼠株，包括我们目前研究的鼠株 BALB26。由于C57BL6中威利斯的圆圈不完整，两个CPA的脑血供应中断导致中枢神经系统严重受损，最终导致死亡。此外，在我们的初步研究中，我们未能诱导C57BL6中的tBCCAO，因为几乎所有的小鼠（约80%）手术后3天内死亡（补充图4）。因此，我们应用tBCCAO到另一个鼠菌株BALB为我们目前的研究。

为了在我们的BALB模型中诱发急性视网膜缺血损伤，右CCA被永久搁置，左CCA被应用通过瞬态闭塞来增加急性视网膜缺血应激。这是因为老鼠不能容忍由永久BCCAO引起的缺血应激不像老鼠谁拥有威利斯27的完整圆圈。接下来，我们试图优化闭合时间：左CCAO（0-20秒），因为遮挡时间被认为是影响中枢神经系统的缺血损伤的关键因素之一，并直接与实验模型28，29的存活率连接。我们发现BALB小鼠的存活率以闭塞时间依赖的方式下降（补充图4）。左CCA超过10秒的遮挡显示死亡率严重较高（超过50%），而左CCA的封闭2秒或无遮挡（或单边CCAO）显示存活率相对较高（超过80%）。因此，我们排除了进一步实验的组（10秒和20秒），因为无法进行高效和具有成本效益的实验。接下来，我们检查了左CCA的闭塞2秒或没有遮挡（或单边CCAO）是否会诱发视网膜缺氧。HIF-1®是一种主要的调节器，在缺氧反应中发挥作用，并在缺氧条件下稳定下来。在这方面，HIF-1®稳定性已被用作缺氧的一般分子生物学标记。我们无法检测到单边CCAO组的网膜HIF-1®稳定（补充图5）。有趣的是，我们可以检测到HIF-1®稳定在tBCCAO组2秒（图3）。这意味着视网膜缺氧应激可能由 BALB 小鼠的 2 秒 tBCCAO 诱导。因此，根据手术后的高存活率和通过HIF-1®稳定诱导视网膜缺血，我们最终选择了2秒的夹紧时间供我们研究。

虽然正确的CCA在tBCCAO手术的小鼠中被永久排除，但在FITC-dextran系统循环2分钟后，在右网膜中部分检测到输血（补充图1）。此外，我们发现，在单侧CCAO操作的BALB小鼠的右网膜中未发现HIF-1®稳定性的变化。这种现象可以通过威利斯圆的附带循环的影响来解释，以维持对网膜的血液供应（图1）。尽管我们无法清楚地理解左瞬态CCAO对右网膜输血的影响，但瞬态左CCAO和永久右CCAO可能会加剧右网膜急性缺氧侮辱，这从tBCCAO（图3）后右网膜HIF-1®表达的重大变化就证明了这一点。此外，小鼠的存活率取决于左CCA的闭合时间。综合起来，视网膜缺血应激的强度可以通过左CCAO控制。

下垂眼睑的表型已被建议为严重神经系统疾病的呈现迹象或病理生理症状，特别是缺血性中风31，32。与下垂的眼睑相关的肌肉是升高器苍白的优越33。这种肌肉是由横向苍白动脉提供的，这是从OpA衍生的分支之一。因此，当提供视网膜的OpA受到影响时，可以看到眼睑下垂。在 MCAO 小鼠模型34中观察到眼睑下垂，这也在我们的 tBCCAO 模型中复制。此外，我们描述了当左CCA的遮挡时间更长时眼睑下垂变得严重（图2和补充图6）。这意味着眼睑下垂的严重程度（间接称为视网膜缺血应激的强度）可能取决于左CCA的闭合时间。

视网膜功能障碍是视网膜缺血性视网膜病变的结果之一，包括35号小鼠的BCCA狭窄和36号大鼠的BCCAO。我们发现b波的振幅在tBCCAO操作的小鼠中降低。先前的几项研究表明，MCAO在手术后也导致b波振幅的降低37，38。b波反映了视网膜内层细胞的生理状况，包括双极细胞和穆勒细胞39。此外，在tBCCAO之后，在内部视网膜层中检测到穆勒细胞的活性胶质疏松症。这一结果也复制在MCAAO模型40，41和其他CCAO模型13，42。综合起来，这意味着内视网膜功能障碍可能由tBCCAO诱导。据报道，视网膜厚度暂时增加急性视网膜缺血43，44。我们还在tBCCAO操作的小鼠中复制了这一发现。这些数据表明，tBCCAO对血液循环的损害可能到达视网膜，最终影响视网膜层。

对于一致的结果，麻醉时间和手术时间，以及其他因素，如重量和年龄的实验模型及其体温在手术期间和手术后应标准化45。特别需要注意在整个实验观察期间保持小鼠的体温。这是因为体温过低可能会有先决条件的影响，并干扰缺血效应由tBCCAO46。尽管我们在实验中无法测量老鼠的确切体温，但我们使用加热垫加热老鼠，直到老鼠恢复足够的意识。此外，我们比较了tBCCAO操作的小鼠和假操作的小鼠，以控制无法控制的因素的潜在混淆效应。

小鼠菌株可能是诱发视网膜缺血损伤的一个重要可变因素。小鼠菌株中威利斯圆的显著变化可能导致脑缺血（包括视网膜缺血症47） 的意外减少或诱导，从而可能导致结果的变异。当需要应用其他小鼠菌株时，建议调整夹紧时间，以治疗成功的 tBCCAO 诱发的缺血性视网膜病变。

一般来说，中风或其他脑损伤事件总是伴随着暂时或永久的毒视损失48。迄今为止，MCAO小鼠模型被广泛用于中风研究。由于 Opa 起源于 MCA 的起源，因此 MCA 血液流动的任何障碍都阻碍了到网膜的流动。视网膜缺血首先由MCAO37在老鼠中表现出来。后来，同样的视网膜缺血模型被应用到小鼠49。然而，对于这个程序，闭塞需要超过60分钟，找到一个遮挡部位是极其困难的，因为MCA被埋在大脑深处。此外，MCAO 的灯丝尺寸和插入长度极大地决定了手术的成功。这些额外的可变因素导致手术后缺血结果的变异性。虽然 tBCCAO 和 MCAO 之间需要直接比较研究，但我们在本研究中描述了我们实验模型的有益特征：封闭时间短、实验过程简单且极易获得的遮挡点。此模型可以解决 MCAO 模型中出现的问题。

虽然使用视网膜缺血小鼠模型对研究视网膜缺血损伤有很大的益处，但这种方法仍有局限性。由于手术切口进入颈部，唾液腺的分离和在正确的CCA与缝合物的遮挡必须适用于手术，伴随的组织中断可以引起相关的炎症系统或至少在当地。这些问题部分地使用假手术小鼠解决，所有手术步骤都是在没有tBCCAO的情况下进行的。另一个问题是管理手术期间和手术后发生的疼痛的要求。在我们的研究中，通过注射丁丙醇酸酯溶液（一种合成衍生的阿片类拮抗剂镇痛剂）来预防小鼠的痛苦管理。重要的是要知道，使用不同类型的麻醉剂和镇痛药可以破坏tBCCAO对视网膜缺血的影响。这种方法的另一个局限性（连同目前使用的其他模型的方法）是，它不能提供与人类心血管视网膜疾病相关的病理学的完美模拟。迄今为止，用于此类实验的老鼠模型并不患有人类缺血性视网膜病变的共病，主要是代谢综合征，如糖尿病50。目前小鼠模型中不存在的这种并发症可能会对缺血性视网膜病变发展的病理途径产生负面的协同效应。因此，在解释当前使用的实验模型（包括我们的 tBCCAO 鼠标模型）的结果时，应考虑到这一点。为了更好地了解人类缺血性视网膜病变的病理生理机制，我们的模型可以与其他病理因素相结合，如链球菌素注射51或高脂肪饮食补充剂52，用于发展缺血性糖尿病视网膜病变。最后，即使我们在tBCCAO手术的小鼠中表现出视网膜输血减少，我们也无法清楚地理解左瞬态CCAO对右视网膜输血的影响。这个问题可以解决使用激光多普勒，这是通常用来确认，封闭已经发生，缺血已经发生在体内实时53，54。该技术可用于更好地了解单个 tBCCAO 操作的鼠标中的视网膜缺血，了解威利斯圆圈中的附带循环。

尽管有这些局限性，我们在这里描述的tBCCAO方法代表了在小鼠中产生视网膜缺血的有效方法。通过tBCCAO研究视网膜变化有助于解开人类缺血性视网膜病变的病理机制。此外，我们希望tBCCAO小鼠模型可用于体内药物筛选。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了教育、文化、体育、科学和技术部（MEXT）的科学研究援助赠款（18K09424，东芝库里原和20K18393对三和裕一郎）的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atipamezole hydrochloride Zenoaq Antisedan For anti-anesthesia
Applied Biosystems 7500 Fast Applied Biosystems - For qPCR
Butorphanol tartrate Meiji Seika Pharma Vetorphale For anesthesia
BZ-II Analyzer KEYENCE - For an image merge
BALB/cAJc1 CLEA - Mouse strain
β-Actin (8H10D10) Mouse mAb CST 3700 For western blot
Clamp Forcep World Precision Instruments WPI 500451 For surgery
Dumont forceps #5 Fine Science Tools 11251-10 For surgery
DAPI solution Dojindo 340-07971 For IHC
Envisu SD-OCT system Leica R4310 For OCT
FITC-dextran Merk FD2000S For retinal blood perfusion
Fluorescence microscope KEYENCE BZ-9000 For fluorescence detection
Gatifloxacin hydrate Senju Pharmaceutical Gachifuro For anti-bacterial infection
GFAP Monoclonal Antibody (2.2B10) Thermo 13-0300 For IHC
Heating pad Marukan RH-200 For surgery
HIF-1α (D1S7W) XP Rabbit mAb CST 36169 For western blot
ImageQuant LAS 4000 mini GE Healthcare - For chemiluminescence
Midazolam Sandoz K.K SANDOZ For anesthesia
Microtome Tissue-Tek TEC 6 Sakura - For sectioning
Medetomidine Orion Corporation Domitor For anesthesia
Needle holder Handaya HS-2307 For surgery
PuREC MAYO Corporation - For ERG
Scissor Fine Science Tools 91460-11 For surgery
Sodium hyaluronate Santen Pharmaceutical Hyalein For eye lubrication
Tropicamide/Penylephrine hydrochloride Santen Pharmaceutical Mydrin-P For mydriasis
6-0 silk suture Natsume E12-60N2 For surgery

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References

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医学， 问题 165， 胡萝卜动脉闭塞， 电视网膜学， 实验模型， 缺氧， 缺血， 光学相干断层扫描， 视网膜， 输液
由瞬态双边常见胡萝卜动脉闭塞引起的缺血性视网膜损伤的 Murine 模型
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Lee, D., Miwa, Y., Jeong, H., Ikeda, … More

Lee, D., Miwa, Y., Jeong, H., Ikeda, S. i., Katada, Y., Tsubota, K., Kurihara, T. A Murine Model of Ischemic Retinal Injury Induced by Transient Bilateral Common Carotid Artery Occlusion. J. Vis. Exp. (165), e61865, doi:10.3791/61865 (2020).

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