Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

نموذج مورين من إصابة الشبكية الإقفارية الناجمة عن الشريان السباتي المشترك الثنائي العابر

Published: November 12, 2020 doi: 10.3791/61865
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,4, 1,2
1Laboratory of Photobiology, Keio University School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, Keio University School of Medicine, 3Animal eye care, Tokyo Animal Eye Clinic, 4Tsubota Laboratory, Inc.
* These authors contributed equally

Summary

هنا، ونحن وصف نموذج الماوس من الإقفاري الشبكية عن طريق انسداد الشريان السباتي المشترك الثنائية العابرة باستخدام خياطة بسيطة ومشابك. يمكن أن يكون هذا النموذج مفيدًا لفهم الآليات المرضية لتروية الشبكية الناجمة عن تشوهات القلب والأوعية الدموية.

Abstract

يمكن أن تؤدي أمراض الأوعية الدموية المتنوعة مثل اعتلال الشبكية السكري، وانسداد الأوردة الشبكية أو الشرايين ومتلازمة نقص التروية العينية إلى نقص التروية الشبكية. من أجل تحري الآليات المرضية لاقفارية الشبكية، يجب تطوير نماذج تجريبية ذات صلة. تشريحيا، والأوعية الرئيسية لتوريد الدم الشبكية هو الشريان العيني (OpA) و OpA ينبع من الشريان السباتي الداخلي من الشريان السباتي المشترك (CCA). وهكذا، يمكن أن يسبب اضطراب CCA فعلياً نقص التروية الشبكية. هنا، أنشأنا نموذج الماوس من الإقفاري الشبكية عن طريق انسداد الشريان السباتي المشترك الثنائي العابر (tBCCAO) لربط CCA اليمنى مع خياطة الحرير 6-0 وocclude CCA اليسار عابرة لمدة 2 ثانية عن طريق المشبك، وأظهرت أن tBCCAO يمكن أن تحفز هتكيمي الشبكية الحادة مما يؤدي إلى خلل الشبكية. الطريقة الحالية يقلل الاعتماد على الأدوات الجراحية فقط باستخدام الإبر الجراحية والمشبك، ويختصر الوقت انسداد للحد من الموت الحيواني غير متوقع، والذي غالبا ما ينظر في نماذج الماوس من انسداد الشريان الدماغي الأوسط، ويحافظ على قابلية التكاثر من النتائج التروية الشبكية الشائعة. ويمكن استخدام هذا النموذج للتحقيق في الفيزيولوجيا المرضية من اعتلال الشبكية الإقفي في الفئران ، ويمكن استخدامها كذلك في فحص المخدرات في الجسم الحي.

Introduction

الشبكية هي نسيج عصبي للبصر. منذ هناك حاجة إلى كمية كبيرة من الأوكسجين لوظيفة بصرية، ومن المعروف شبكية العين باعتبارها واحدة من أعلى الأوكسجين تطالب الأنسجة في الجسم1. الشبكية عرضة لأمراض الأوعية الدموية كما يتم تسليم الأكسجين من خلال الأوعية الدموية. أنواع مختلفة من أمراض الأوعية الدموية، مثل اعتلال الشبكية السكري والأوعية الدموية الشبكية (الأوردة أو الشرايين) انسداد، يمكن أن تحفز الإقفاريات الشبكية. للتحقيق في الآليات المرضية لاقفية الشبكية ، تعتبر النماذج التجريبية القابلة للتكاثر والملاءمة سريريًا من نقص التروية الشبكية ضرورية. انسداد الشريان الدماغي الوسطى (MCAO) عن طريق إدراج خيوط داخل الغدد هو الأسلوب الأكثر استخداما عموما لتطوير في نماذج القوارض في الجسم الحي من الإقفاريات الدماغية التجريبية2،3. نظرا لقرب الشريان العيني (OpA) إلى MCA، وتستخدم أيضا نماذج MCAO في وقت واحد لفهم الفيزيولوجيا المرضية من الإقفاري الشبكية4،5،6. للحث على نقص التروية الدماغية جنبا إلى جنب مع الإقفار الشبكية، وعادة ما يتم إدراج خيوط طويلة من خلال شق الشريان السباتي المشترك (CCA) أو الشريان السباتي الخارجي (ECA). هذه الطرق صعبة الأداء، تتطلب وقتا طويلا لإكمال الجراحة (أكثر من 60 دقيقة ماوس واحد)، وتؤدي إلى تباينات عالية في النتائج بعد الجراحة7. ولا يزال من المهم وضع نموذج أفضل لتحسين هذه الشواغل.

في هذه الدراسة، استخدمنا ببساطة قصيرة عابرة CCA الانسداد الثنائي (tBCCAO) مع الإبر ومشببك للحث على نقص التروية الشبكية في الفئران وتحليل النتائج النموذجية لإصابات الإقفاري في شبكية العين. في هذا الفيديو، سوف نقدم مظاهرة من الإجراء tBCCAO.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد تمت الموافقة على جميع الأساليب المذكورة هنا من قبل لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) من جامعة كيو كلية الطب.

1. إعداد الأدوات الجراحية والحيوانات

  1. الأوتوكلاف الأدوات الجراحية والاحتفاظ بها في 70٪ الكحول الإيثيل. قبل كل إجراء جراحي جديد، أدوات جراحية نظيفة بعناية باستخدام 70٪ الكحول الإيثيل.
  2. إعداد ذكور BALB / cAJc1 الفئران (6 أسابيع من العمر، 26-28 كجم) في غرفة محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF) للحفاظ على الظروف العقيمة قبل وأثناء وبعد الجراحة.

2. عابرة الثنائية المشتركة انسداد الشريان السباتي (tBCCAO)

  1. وضع الماوس تحت التخدير عن طريق الحقن داخل الصفاق مع مزيج من ميدازولام (40 ميكروغرام/100 ميكرولتر)، medetomidine (7.5 ميكروغرام/100 ميكرولتر) وبوتورفانول ترترات (50 ميكروغرام/100 ميكرولتر)، الذي يطلق عليه "MMB"، كما سبق وصفه8،9. عقد جلود الماوس الخلفي للحفاظ على الماوس بعيدا عن الاهتزاز عينيه حتى يتم تخدير الماوس تماما.
    1. الحكم على عمق التخدير عن طريق معسر إصبع قدم الماوس حتى لا يكون لديه استجابة، من الذي يستخدم أسلوب عادة للتحقق من التخدير الكامل10.
      ملاحظة: عموما، أقل من 5 دقائق مطلوبة للفئران لتغفو. وصفات مناسبة للتخدير العام قد تكون مختلفة من قبل المؤسسات.
  2. تطبيق قطرة واحدة من 0.1٪ تنقية الصوديوم هيالوونت حل قطرة العين إلى العينين لمنع جفاف على العينين تحت التخدير.
  3. وضع الماوس على ظهره وإصلاح الكفوف الماوس باستخدام أشرطة لاصقة.
  4. تطهير منطقة الرقبة من الماوس باستخدام 70٪ ايثيل الكحول قبل الجراحة.
    ملاحظة: لم يتم تنفيذ لقطة إضافية من الفراء لأن هذا قد يسبب التهاب الجلداللاحقة 11,12.
  5. أداء شق القوس من الرقبة مع شفرة (الشكل 1).
    ملاحظة: يجب إجراء شق على خط الوسط بين الرقبة والقص والقص الهوائية.
  6. فصل كلا الغدد اللعابية بعناية باستخدام اثنين من ملقط وتعبئة لهم لتصور CCAs الكامنة.
  7. عزل CCA الحق بعناية من الأعصاب المغالى ذات الصلة والأوردة المصاحبة دون الإضرار هياكلها، ووضع اثنين من خياطة الحرير 6-0 تحت CCA. ربط العلاقات اثنين بإحكام لمنع تدفق الدم (الشكل 1).
    ملاحظة: أثناء الإجراء، قد تتلف الأوردة الصغيرة. إذا كان النزيف هو رؤية، ومسح مطلوب لتصور CCAs بوضوح.
  8. العثور على CCA اليسار بعناية من الأعصاب المغالى ذات الصلة والأوردة المصاحبة دون الإضرار هياكلها، و occlude CCA اليسار لمدة 2 ثانية بواسطة المشبك (الشكل 1).
    ملاحظة: هناك حاجة إلى إبرة خياطة الحرير 6-0 ليتم وضعها تحت CCA اليسار لوضع علامة على موقع لقط.
  9. بعد إعادة فتح CCA اليسار، جروح خياطة الرقبة بواسطة خياطة الحرير 6-0 وتطبيق الداب من المضادات الحيوية (50 ميكرولتر) على الرقبة لمنع العدوى البكتيرية.
    ملاحظة: إزالة بهدوء المشبك لتجنب إتلاف جدار الشريان عند إعادة فتح CCA اليسار.
  10. حقن 0.75 ملغ/كغ من اتيباميزولي هيدروكلوريد intraperitoneally إلى الماوس لمساعدة الماوس تعافى من التخدير العميق بسرعة. ارجع الماوس إلى قفص الماوس مع منصات ساخنة مسبقًا.
    ملاحظة: لا تدع الماوس ترك دون مراقبة حتى الماوس يستعيد الوعي كافية للحفاظ على إعادة شغل القص.
  11. حقن 0.4 ملغ / كغ من الترطرات بوتورفانول إلى الماوس لإدارة الألم عندما يستيقظ الماوس.
    ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. كتلميح الأول لـ tBCCAO ناجحة، يمكن ملاحظة تدلي الجفن من الماوس (الشكل 2).
  12. للقتل الرحيم، حقن 3x من خليط MMB للفئران والتضحية بها من أجل التجارب.

3- ملاحظات عامة (معدلات البقاء على قيد الحياة وتدلية الجفن)

  1. بعد الجراحة، تحقق من معدلات البقاء على قيد الحياة لجميع أسباب الوفاة في اليوم 0 (بعد الجراحة) و1 و3 و7.
  2. تقييم تدلي الجفن من قبل مقياس تصنيف 4 نقاط: 1 = لا تدلى، 2 = تدلى معتدل (~ 50٪)، 3 = تدلى شديد (أكثر من 50٪)، و 4 = تدلى شديد مع إفرازات العين.

4. سفك الدم الشبكية

  1. حقن 200 ميكرولتر من FITC-dextran (25 ملغ / مل) في البطين الأيسر من الماوس، والذي يستخدم عادة لمراقبة ضخ الدم في الأوعية الشبكية الماوس13،14.
  2. 2 دقائق بعد الدورة الدموية، enucleate العينين وإصلاح في 4٪ شبهformaldehyde لمدة 1 ساعة. تم الحصول على شبكية العين بعناية ومسطحة محمولة، كما وصفت سابقا15، وفحصها عن طريق المجهر الفلوري.
  3. التقاط صور من الشبكية كله يتصاعد في التكبير 4x ودمجها في واحد باستخدام محلل دمج، وصفت سابقا16.
  4. قياس المناطق المُغرّمة عن طريق أداة تحليل السفن في برنامج NIH Fiji/ImageJ.

5. لطخة غربية

  1. بعد 3 و 6 ساعات من tBCCAO ، احصل على عيون الفئران ونقلها على الفور إلى طبق بيتري يحتوي على PBS البارد لعزل شبكية العين.
  2. بعد عزل شبكية العين، أداء النشاف الغربية، كما سبق وصفه9.
  3. احتضان مع الأجسام المضادة لخافض الأكسجة-عامل غير قابل للاجك -1α (HIF-1α؛ علامة نقص الأكسجة العامة) و β-Actin (مراقبة التحميل الداخلية) بين عشية وضحاها تليها حضانة الأجسام المضادة الثانوية لمعالجة هكف. تصور الإشارات عبر chemiluminescence.

6. كمية PCR (qPCR)

  1. 6, 12 و 24 ساعة بعد tBCCAO, معالجة شبكية العين التي تم الحصول عليها لqPCR, كما سبق وصفها17.
  2. تنفيذ qPCR عن طريق نظام PCR في الوقت الحقيقي. يتم سرد التمهيديات المستخدمة في الجدول 1. حساب التغييرات أضعاف بين مستويات من النصوص المختلفة من قبلالأسلوب T ΔC.

7. الكيمياء المناعية (IHC)

  1. بعد 3 أيام من tBCCAO ، احصل على عيون الفئران وتضمين البارافين.
  2. قطع العينين البارافين جزءا لا يتجزأ من قبل microtome للحصول على أقسام العين.
  3. de-paraffinize وتلطيخ أقسام العين من 5 μm سمك كما هو موضح سابقا13.
  4. احتضان مع جسم مضاد للبروتين حمضي الرجالية الزليبية (GFAP؛ علامة موثوقة للخلايا الفلكية وخلايا مولر في شبكية العين) بين عشية وضحاها تليها حضانة اليكسا فلور 555-مترافق الأجسام المضادة الثانوية.
  5. استخدام DAPI (4′, 6-diamidino-2-فينيليندول) لتلوين النواة في شبكية العين. تصور الإشارات عبر مجهر الفلوريسانس.
  6. تقييم التشكل الذي يسجل بمقياس تصنيف من 4 نقاط، كما سبق وصفه13،18:0 = لا إشارة، 1 = بضعة أقدام ضئيلة إيجابية في طبقة خلايا العقدة (GCL)، 2 = عدد قليل من العمليات التي تصل من GCL إلى الطبقة النووية الخارجية (ONL)، و 3 = معظم العمليات ذات العلامات التي تصل من GCL إلى ONL.

8. التصوير الكهربائي (ERG)

  1. بعد 3 و 7 أيام tBCCAO، تنفيذ ERG باستخدام قبة Ganzfeld، ونظام اقتناء ومحفزات LED، كما سبق وصفها9.
  2. بعد التكيف الظلام بين عشية وضحاها، تخدير الفئران مع مزيج من MMB تحت ضوء أحمر خافت.
  3. استخدام حل مختلط من 0.5٪ تروبيكاميد و 0.5٪ فينيليفرين لتمدد التلاميذ.
  4. ضع الأقطاب النشطة على العدسات اللاصقة ووضع القطب المرجعي في الفم.
  5. الحصول على استجابات ERG من كلتا العينين لكل.
  6. سجل ردود scotopic تحت التكيف الظلام مع مختلف المحفزات.
  7. قياس السعات من موجة من خط الأساس إلى أدنى نقطة من موجة.
  8. قياس السعات من موجة ب من أدنى نقطة من موجة إلى ذروة موجة ب.
  9. الحفاظ على جميع الفئران الحارة أثناء الإجراء باستخدام منصات الحرارة.

9- التصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT)

  1. 2 أسابيع بعد tBCCAO، أداء OCT باستخدام نظام SD-OCT، كما ذكرت سابقا8،9.
  2. للقياس، تخضع الفئران إلى داء الداء المتضام عن طريق محلول مختلط من 0.5٪ تروبيكاميد و 0.5٪ فينيليفرين، وإلى التخدير العام عن طريق مزيج من MMB.
  3. الحصول على صور المسح الضوئي B من شرائح الاستوائية من مسح الوجه.
  4. فحص شبكية العين في 0.2، 0.4 و 0.6 ملم من رأس العصب البصري.
  5. قياس سمك الشبكية من طبقة الألياف العصبية الشبكية (NFL) إلى الغشاء الخارجي المحدد (ELM)، والنظر في متوسط القيم المقاسة كما سمك شبكية العين من الماوس الفردية.
  6. رسم النتائج كـ رسومات تخطيطية عنكبوتية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بعد الدورة الدموية الجهازية من FITC-dextran لمدة 2 دقيقة، وفحص الأوعية الدموية الشبكية من شبكية العين اليسرى والأيمن في الفئران التي تعمل صوريا والفئران التي تديرها tBCCAO(الشكل التكميلي 1). كان فيتك-ديكستران مرئيًا تمامًا في شبكية العين في الفئران التي تعمل بالجهابات والشبكية اليسرى في الفئران التي تعمل بها tBCCAO ، في حين أنه كان قابلًا للكشف جزئيًا في شبكية العين اليمنى في الفئران التي تديرها tBCCAO.

بعد tBCCAO، تم فحص تدلي الجفن (الشكل 2). وأظهرت العيون اليمنى خفيفة (النتيجة 2؛ 75٪) والجفن الشديد (نقاط 3 و 4؛ 25٪) تدلى، في حين أن العينين اليسرى لم يكن لها تدلى (درجة 1؛ 93.75٪) باستثناء ماوس واحد (النتيجة 2؛ 6.25٪). على الرغم من أن التدلي الجفن الشديد مع إفرازات العين لم يلاحظ إلى حد كبير في الفئران التي تديرها tBCCAO ، يمكننا أن نرى فأرة واحدة لهذا النمط الظاهري (النتيجة 4 ؛ 6.25٪).

انخفاض حالة الأكسجين في الأنسجة يؤدي إلى تثبيت HIF-1α والحث على عدد من الجينات التي تستجيب لنقص الأكسجة مثل EPO، VEGF و BNIP319،20،21. أولا وقبل كل شيء، تم تقييم نقص الأكسجة البيولوجية الجزيئية باستخدام علامة نقص الأكسجة العامة HIF-1α عن طريق النشاف الغربي(الشكل 3). لوحظت زيادة في التعبير HIF-1α بشكل ملحوظ في شبكية العين اليمنى بعد 3 و 6 ساعات من tBCCAO. بعد ذلك، تم تقييم تعبيرات الجينات المتجاوبة مع نقص الأكسجة عن طريق qPCR(الشكل التكميلي 2). لم يكن هناك أي تغيير كبير في التعبيرات الجينية استجابة لنقص الأكسجة 6 ساعات بعد tBCCAO. بعد 12 ساعة من tBCCAO ، وجدنا التعبير Binp3 زيادة كبيرة وظهرت زيادة طفيفة في تعبير Epo في شبكية العين اليمنى. بعد 24 ساعة من tBCCAO ، يمكننا أيضًا العثور على زيادة طفيفة في تعبير Epo في شبكية العين الصحيحة على الرغم من أنه لم يكن مهمًا إحصائيًا. لم يتم تغيير تعبير Vegf من 6 إلى 24 ساعة في الفئران التي تديرها tBCCAO.

تم فحص gliosis الشبكية التفاعلية بعد 3 أيام tBCCAO (الشكل 4)، كما glia مثل الخلايا الفلكية وخلايا مولر قد ارتبطت ارتباطا وثيقا مع الإقفاري الشبكية22. وقد تم استخدام GFAP على نطاق واسع للكشف عن الخلايا الفلكية وخلايا مولر في شبكية العين23. وكان متوسط درجات مورفولوجيا لوضع العلامات GFAP في شبكية العين اليمنى أعلى بين كل من شبكية العين في الفئران التي تعمل بشكل صوري وشبكية العين اليسرى في الفئران التي تديرها tBCCAO. استناداً إلى توطين تعبير GFAP، يعتبر تغيير في مورفولوجيا في وضع العلامات GFAP يعكس تنشيط خلايا مولر.

تم استخدام ERG لفحص الخلل الشبكي بعد tBCCAO (الشكل 5). انخفضت السعات من ب موجة في العين اليمنى بشكل كبير 3 و 7 أيام بعد tBCCAO. ومع ذلك، لم تتغير إلى حد كبير السعات من موجة في العين اليمنى. عندما يتعلق الأمر بالعين اليسرى، لم نتمكن من رؤية أي تغييرات في السعات من a- وb-موجات(الشكل التكميلي 3).

قمنا به OCT لتحديد تغيير في سمك الشبكية بعد tBCCAO (الشكل 6). سمك الشبكية في العين اليمنى زيادة كبيرة 2 أسابيع بعد tBCCAO، في حين لم يكن هناك فرق في سمك الشبكية في العين اليسرى بين tBCCAO- والفئران التي تديرها صورية.

Figure 1
الشكل 1: التخطيطي للإجراء النموذجي والدورة الدموية في دائرة ويليس. وأظهر رسم توضيحي تخطيطي إجراء نموذج الماوس الإقفاري الناجم عن شبكية العين والدورة الدموية إلى الشبكية. CCA, ECA, ICA, PCA وOpa تمثل الشريان السباتي المشترك, الشريان السباتي الخارجي, الشريان السباتي الداخلي, الشريان الخلفي الاتصال والشريان العيني, على التوالي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تدلي الجفن بعد tBCCAO. تم تقييم شدة تدلي الجفن من خلال تصنيف 4 نقاط استنادًا إلى الصور المرجعية: 1 = لا تدلى ، 2 = تدلى خفيف (~ 50٪ تدلى) ، 3 = تدلى شديد (أكثر من 50٪ تدلى) ، و 4 = تدلى شديد مع إفرازات العين. ولوحظ تدلي الجفن بعد tBCCAO وتم الحفاظ عليه أثناء الملاحظة التجريبية. النتائج (صور: ن = 10، tBCCAO: n = 16) تم رسمها كمؤامرة نقطة مبعثرة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: HIF-1α تثبيت بعد tBCCAO. مناعة تمثيلية وتحليلات كمية (مجموعات للساعة 3؛ صورية: ن = 3، tBCCAO: n = 6 ومجموعات للساعة 6؛ صورية و tBCCAO: n = 6) لHIF-1α و β-Actin أظهرت أن HIF-1α استقرت في شبكية العين اليمنى بعد 3 و 6 ساعات من tBCCAO. *P < 0.05. تم تحليل البيانات باستخدام اختبار الطالب t-test وقدمت على أنها متوسطة مع الانحراف القياسي ±. L و R الوقوف إلى شبكية العين اليمنى واليسرى، على التوالي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: gliosis التفاعلية بعد tBCCAO. وأظهرت أقسام القوس التمثيلية لشبكية العين (صور: n = 4, tBCCAO: n = 4) والتحليلات الكمية لوضع العلامات GFAP (أحمر) بواسطة سجل مورفولوجيا (0-3) أن وضع العلامات GFAP، المقيدة في الغالب في NFL + GCL، تم توسيعه إلى الطبقة الداخلية بأكملها، من GCL إلى ONL (الأسهم البيضاء) في شبكية العين اليمنى بعد tBCCAO. أشرطة المقياس، 50 ميكرومتر. DAPI (الأزرق) كان يستخدم لتلوين النواة في شبكية العين. اتحاد كرة القدم الأميركي، GCL، IPL، INL و ONL تمثل طبقة الألياف العصبية، وطبقة الخلية العقدية، طبقة شبكية داخلية، وطبقة نووية داخلية وطبقة نووية الخارجي، على التوالي. تم تحليل البيانات باستخدام اختبار Tللطالب وقدمت على أنها متوسطة مع نطاق بين الربعين ، والمئين 25 و 75. *P < 0.05. L و R الوقوف إلى شبكية العين اليمنى واليسرى، على التوالي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: الخلل البصري في العين اليمنى بعد tBCCAO. (أ)الطول الموجي التمثيلي لـ ERG المتكيفة مع الظلام أجريت بعد 3 و 7 أيام من tBCCAO. التحفيز كثافة (cd.s/m2):0.005. (ب)أظهرت التحليلات الكمية أن هناك انخفاضًا في السعات من b-wave في العين اليمنى (صور: n = 5, tBCCAO: n = 6) في حين لم تتغير السعات من موجة. *P < 0.05، **P < 0.01. تم تحليل البيانات باستخدام اختبار الطالب t-test وقدمت على أنها متوسطة مع الانحراف القياسي ±. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: تغيير في سمك الشبكية بعد tBCCAO. وأظهرت الصور النائب OCT في الشبكية الصورية و tBCCAO التي تديرها التحليلات الكمية أن هناك زيادة في سمك الشبكية في شبكية العين اليمنى (صور: ن = 4، tBCCAO: ن = 8). لم يكن هناك أي تغيير في سمك الشبكية في شبكية العين اليسرى (صور: ن = 4، tBCCAO: ن = 8). أشرطة مقياس 200 (العلوي) و 100 (أقل) μm، على التوالي. *P < 0.05. وتمثل القيم في المحور الأفقي للمخططات 0.2 و0.4 و0.6 مم بعيداً عن رأس العصب البصري (0) الذي تم اكتشافه بواسطة الخط الأخضر. تم تحليل البيانات باستخدام ANOVA في اتجاهين تليها اختبار Bonferroni بعد المخصص. وقُدّمت مخططات العنكبوت على أنها متوسطة مع ± الانحراف المعياري. اتحاد كرة القدم الأميركي، INL، ONL و ELM هي طبقة الألياف العصبية، الطبقة النووية الداخلية، الطبقة النووية الخارجية والغشاء الخارجي الحد، على التوالي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: ضخ الدم الشبكية بعد tBCCAO. ممثل شبكية العين جبل مسطح الصور (مع أعلى التكبير من كل صورة) بعد 2 دقيقة من تداول فيتC-دكستران والتحليلات الكمية أظهرت أن الضخ الكامل كان ملحوظ في كل من شبكية العين في الفئران التي تديرها الصورية والشبكية اليسرى في الفئران التي تديرها tBCCAO. ومع ذلك ، أظهرت شبكية العين اليمنى في الفئران التي تديرها tBCCAO ضخًا جزئيًا في الدم. تم تحليل البيانات باستخدام اختبار الطالب t-test وقدمت على أنها متوسطة مع الانحراف القياسي ±. L و R الوقوف إلى شبكية العين اليمنى واليسرى، على التوالي. أشرطة مقياس 800 و 400 μm، على التوالي. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 2: تعبيرات الجينات المتجاوبة مع نقص الأكسجة بعد tBCCAO. وأظهرت التحليلات الكمية زيادة عابرة في التعبير Bnip3 مرنا في الشبكية اليمنى مع أهمية إحصائية 12 ساعة بعد tBCCAO. أظهر تعبير Epo mRNA اتجاهًا متزايدًا في شبكية العين اليمنى لمدة 24 ساعة بعد tBCCAO ، على الرغم من أن قيمه لم تكن مختلفة بشكل كبير مقارنة بشبكية العين اليمنى التي تعمل صورًا. **P < 0.01. تم تحليل البيانات باستخدام اختبار الطالب t-test وقدمت على أنها متوسطة مع الانحراف القياسي ±. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 3: وظيفة بصرية في العين اليسرى بعد tBCCAO. وأظهرت التحليلات الكمية أنه لم يكن هناك أي تغيير في السعات من a- و b-موجات في العين اليسرى (صور: ن = 5، tBCCAO: n = 6). P > 0.05. تم تحليل البيانات باستخدام اختبار الطالب t-test وقدمت على أنها متوسطة مع الانحراف القياسي ±. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 4: معدلات البقاء على قيد الحياة بعد tBCCAO في C57BL6 و BALB. كابلان ماير منحنيات البقاء على قيد الحياة أظهرت أن جميع الفئران تقريبا توفي في غضون 3 أيام بعد tBCCAO في الفئران C57BL6. عندما يتعلق الأمر بالفئران BALB، أطول وقت لقط في tBCCAO يؤدي إلى الموت الحيواني المفاجئ والشادة (معدلات البقاء على قيد الحياة في اليوم 7، 20 ثانية: 10٪، 10 ثانية: 20٪، 2 ثانية: 81٪، و 0 ثانية: 95٪). الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 5: تحقيق الاستقرار من HIF-1α بعد مركز التنسيق من جانب واحد. أظهر تحليل تمثيلي للمناعة والكمية (صور: n = 3، CCAO أحادي الجانب: n = 3) لـ HIF-1α و β hif-1α وhif-Actin أن HIF-1α لم تستقر في شبكية العين بعد 3 ساعات من CCAO أحادية الجانب. P > 0.05. تم تحليل البيانات باستخدام اختبار الطالب t -testوقدمت على أنها متوسطة مع انحراف ± قياسي. L و R الوقوف إلى شبكية العين اليمنى واليسرى، على التوالي. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 6: تدلي الجفن الشديد بعد tBCCAO مع وقت طويل لقط. 10 ثانية من tBCCAO تسبب تدلي الجفن الشديد، الذي تم تقييمه من قبل مقياس تصنيف 4 نقاط: 1 = لا تدلى، 2 = تدلى معتدل (~ 50٪)، 3 = تدلى شديد (أكثر من 50٪)، و 4 = تدلى شديد مع إفرازات العين، كما هو موضح في الشكل 2. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في الدراسة، وقد أظهرنا أن tBCCAO، وذلك باستخدام الغرز البسيطة ومشابك، يمكن أن تحفز الإقفاري الشبكية والخلل الوظيفي الشبكي المصاحبة. وعلاوة على ذلك، فقد أثبتنا لدينا بروتوكول الحالي لتطوير نموذج الماوس من الإقفاري الشبكية هو أسهل وأسرع بالمقارنة مع البروتوكولات السابقة الأخرى لتطوير نماذج إصابة العينيةالإقفاري 2،3،7.

تشريحيا, يمكن توصيل الشرايين الدماغية اليمنى واليسرى عبر الشرايين الخلفية التواصل (PCAs) التي توفر الدورة الدموية الجانبية في دائرة ويليس للحفاظ على إمدادات كافية من الدم إلى الجهاز العصبي المركزي ضد انقطاع تدفق من انسداد أو تضيق من السفن الفردية24,25 ( الشكل1). لي وآخرون أظهرت ضخ الدم الشبكية يمكن أن يكون 10 دقيقة تأخير (الذي ليس حصار كامل من ضخ الدم الشبكي في شبكية العين) من قبل CCAO أحادية دائمة في C57BL6 الفئران13. وهذا يعني أن تحريض الإقفاري الشبكية من قبل CCAO يرتبط ارتباطا وثيقا مع ظروف التداول الجانبية في دائرة ويليس. ومن المعروف أن C57BL6 أن تكون سلالة الماوس الأكثر عرضة ل نقص التروية الدماغية من قبل BCCAO بين سبع سلالات الفئران بما في ذلك سلالة الماوس دراستنا الحالية BALB26. بسبب دائرة غير مكتملة من ويليس في C57BL6, انقطاع إمدادات الدم في الدماغ من كل من CCAs يؤدي إلى أضرار جسيمة في الجهاز العصبي المركزي, مما يؤدي في النهاية إلى الموت. بالإضافة إلى ذلك ، في دراستنا الأولية ، فشلنا في حث tBCCAO في C57BL6 ككل الفئران تقريبًا (حوالي 80٪) توفي في غضون 3 أيام بعد الجراحة (الشكل التكميلي 4). ولذلك، قمنا بتطبيق tBCCAO على سلالة أخرى من الماوس BALB لدراستنا الحالية.

للحث على إصابات التهاب الشبكية الحاد في نموذج BALB لدينا ، تم ربط CCA الأيمن بشكل دائم وتم تطبيق CCA الأيسر لتعزيز الإجهاد الإقفاري الحاد في الشبكية من خلال الانسداد العابر. وذلك لأن الفئران لا يمكن أن تتسامح مع الإجهاد الإقفاري الناجم عن BCCAO دائمة على عكس الفئران الذين لديهم دائرة كاملة من ويليس27. بعد ذلك، حاولنا تحسين وقت الانسداد: غادر CCAO (0-20 ثانية)، كما تم اعتبار وقت الانسداد أحد العوامل الرئيسية التي تؤثر على إصابات الإقفاري في الجهاز العصبي المركزي ويربط مباشرة مع معدلات البقاء على قيد الحياة من النماذج التجريبية28،29. وجدنا أن معدلات البقاء على قيد الحياة من الفئران BALB انخفض بطريقة الانسداد التي تعتمد على الوقت(الشكل التكميلي 4). وأظهرت الانسداد من CCA اليسار أكثر من 10 ثانية معدلات الوفيات أعلى بشدة (أكثر من 50 ٪) ، في حين أن انسداد CCA اليسار لمدة 2 ثانية أو لا انسداد (أو CCAO أحادية الجانب) أظهرت معدلات البقاء على قيد الحياة أعلى نسبيا (أكثر من 80 ٪). لذلك، استبعدنا المجموعات (من وقت الانسداد الذي هو 10 و 20 ثانية) للتجارب الأخرى كما لا يمكن أن تكون تجارب فعالة وفعالة من حيث التكلفة. بعد ذلك ، فحصنا ما إذا كان انسداد CCA الأيسر لمدة 2 ثانية أو لا انسداد (أو CCAO أحادي الجانب) يمكن أن تحفز نقص الأكسجة الشبكية. HIF-1α هو منظم رئيسي يعمل في الاستجابات نقص الأكسجة، واستقر في ظل ظروف نقص الأكسجة30. وفي هذا الصدد، تم استخدام تثبيت HIF-1α كعلامة بيولوجية جزيئية عامة لنقص الأكسجة. لم نتمكن من الكشف عن HIF-1α تثبيت في شبكية العين في مجموعة من CCAO أحادية الجانب(الشكل التكميلي 5). ومن المثير للاهتمام، ونحن يمكن الكشف عن الاستقرار HIF-1α في مجموعة من 2 ثانية من tBCCAO(الشكل 3). وهذا يعني أن الإجهاد hypoxic الشبكية يمكن أن يكون ناجما عن 2 ثانية من tBCCAO في الفئران BALB. لذلك، تم اختيار ثانيتين من وقت اللقط في النهاية لدراستنا بناءً على معدلات البقاء العالية بعد الجراحة وتحريض الإقفاريات الشبكية عن طريق تثبيت HIF-1α.

على الرغم من أن CCA الحق كان مُكدَسَ بشكل دائم في الفئران التي تعمل TBCCAO ، تم اكتشاف رسو الدم جزئيًا في شبكية العين اليمنى بعد دقيقتين من الدورة الدموية الجهازية لـ FITC-dextran (الشكل التكميلي 1). علاوة على ذلك، وجدنا أن تغييرًا في تثبيت HIF-1α لم يتم اكتشافه في شبكية العين اليمنى في فئران BALB أحادية الجانب التي تديرها CCAO. ويمكن تفسير هذه الظاهرة من آثار التداول الجانبية من خلال دائرة ويليس للحفاظ على إمدادات الدم إلى شبكية العين (الشكل 1). على الرغم من أننا لا يمكن أن نفهم بوضوح آثار CCAO عابرة اليسار على ضخ الدم إلى شبكية العين اليمنى, سيتاو اليسرى العابرة جنبا إلى جنب مع CCAO اليمين الدائم قد تعزز الشتائم نقص الأكسجة الحادة في شبكية العين اليمنى كما يتضح من تغير كبير في التعبير HIF-1α في الشبكية اليمنى بعد tBCCAO(الشكل 3). وبالإضافة إلى ذلك، كانت معدلات البقاء على قيد الحياة من الفئران تعتمد على وقت انسداد CCA اليسار. معا، يمكن السيطرة على شدة الإجهاد التروية الشبكية عن طريق CCAO اليسار.

وقد اقترح النمط الظاهري للجفن متدلي كعلامة تقديم أو أعراض المرضي من الحالات العصبية الحادة, السكتة الدماغية وخاصةالإقفي 31,32. العضلات المرتبطة جفن متدلي هو ليفتور بالكبري superioris33. يتم توفير هذه العضلات من قبل الشريان الجانبي palpebral الذي هو واحد من الفروع المستمدة من OpA. وبالتالي ، عندما يتأثر OpA ، الذي يزود الشبكية ، يمكن رؤية تدلي الجفن. ولوحظ التدلي الجفن في نماذج الماوس MCAO34، والتي كانت مستنسخة أيضا في نموذجنا tBCCAO. وعلاوة على ذلك، وصفنا أن جفن تدلى يصبح شديد عندما الوقت انسداد من CCA اليسار وقتا أطول(الشكل 2 والشكل التكميلي 6). وهذا يعني أن شدة تدلي الجفن (يشار إليها بشكل غير مباشر باسم شدة الإجهاد الإقفاري في الشبكية) يمكن أن تعتمد على وقت انسداد CCA اليسار.

خلل الشبكية هو واحد من النتائج التي شوهدت في اعتلال الشبكية التروية بما في ذلك تضيق BCCA في الفئران35 و BCCAO في الفئران36. وجدنا أن السعات من موجة B انخفضت في الفئران التي تديرها tBCCAO. أظهرت العديد من الدراسات السابقة أن MCAO تسبب أيضا في انخفاض في سعة ب موجة بعد الجراحة37,38. ب الموجة يعكس حالة فسيولوجية من الخلايا في الطبقات الداخلية الشبكية، بما في ذلك الخلايا الثنائية القطب وخلايا مولر39. وعلاوة على ذلك، تم الكشف عن gliosis التفاعلية من قبل خلايا مولر في طبقة الشبكية الداخلية بعد tBCCAO. وترد هذه النتيجة أيضا في نماذج MCAO40،41 ونماذج CCAO أخرى13،42. معا, فإنه يعني أن الخلل الشبكية الداخلية يمكن أن يسببها tBCCAO. وقد تم الإبلاغ عن سمك الشبكية لزيادة عابرة في نقص التروية الشبكية الحاد43,44. كما قمنا بإعادة إنتاج هذه النتيجة في الفئران التي تديرها tBCCAO. هذه البيانات تبين أن ضعف الدورة الدموية من قبل tBCCAO يمكن أن تصل إلى شبكية العين وتؤثر في النهاية طبقات الشبكية.

لنتائج متسقة، وينبغي توحيد وقت التخدير وطول العمليات الجراحية، فضلا عن عوامل أخرى مثل الأوزان وأعمار النماذج التجريبية ودرجات حرارة الجسم أثناء وبعد الجراحة45. وعلى وجه الخصوص، هناك حاجة إلى الاهتمام للحفاظ على درجة حرارة الجسم من الفئران طوال فترة المراقبة التجريبية. وذلك لأن انخفاض حرارة الجسم يمكن أن يكون لها تأثير شرط مسبق وتتدخل مع الآثار الإقفاري من قبل tBCCAO46. على الرغم من أننا لا يمكن قياس درجة حرارة الجسم الدقيقة للفئران في تجاربنا، استخدمنا منصات التدفئة لتدفئة الفئران حتى الفئران استعادت الوعي الكافي. وعلاوة على ذلك، قارنا الفئران التي تديرها tBCCAO مع الفئران التي تديرها صورية للسيطرة على الآثار المحتملة الخلط من العوامل التي لا يمكن السيطرة عليها.

يمكن أن تكون سلالات الماوس عاملاً متغيرًا هامًا إضافيًا للحث على إصابة الشبكية الإقفارية بواسطة tBCCAO. يمكن أن يؤدي اختلاف كبير من دائرة ويليس في سلالات الماوس في تخفيض غير مرغوب فيه أو تحريض على الإقفاريات الدماغية بما في ذلك الإزداحالشبكية 47 وبالتالي يمكن أن يؤدي إلى تقلبات النتائج. ويوصى تعديل الوقت لقط لالتلال الشبكي الناجم عن tBCCAO ناجحة عندما سلالات أخرى من الفئران مطلوب لتطبيقها.

بشكل عام، حوادث السكتة الدماغية أو إصابات الدماغ الأخرى دائماً مصحوبة بخسارة فيسون مؤقتة أو دائمة48. حتى الآن، يستخدم نموذج الماوس MCAO على نطاق واسع لدراسات السكتة الدماغية. كما OpA تنشأ قريبة من أصل MCA, أي عائق في تدفق الدم في MCA يعوق تدفق إلى شبكية العين. وقد أظهرت أولا الإقفاري الشبكية في الفئران من قبل MCAO37. في وقت لاحق، تم تطبيق نفس نموذج التروية الشبكية على الفئران49. ومع ذلك ، لهذا الإجراء ، يأخذ الانسداد أكثر من 60 دقيقة ، ومن الصعب للغاية العثور على موقع الانسداد حيث يتم دفن MCA في عمق الدماغ. وعلاوة على ذلك، فإن حجم خيوط ومدة الإدراج لMCAO تقرر كثيرا نجاح الجراحة. هذه العوامل المتغيرة إضافية تحفز تذبذب النتائج الإقفاري بعد الجراحة. على الرغم من أن هناك حاجة إلى دراسات المقارنة المباشرة بين tBCCAO وMCAO ، وصفنا الميزات المفيدة لنماذجنا التجريبية في هذه الدراسة: وقت الانسداد القصير ، الإجراء التجريبي البسيط ومواقع الانسداد التي يمكن الوصول إليها للغاية. قد يحل هذا النموذج المخاوف التي تظهر في نماذج MCAO.

في حين أن استخدام نموذج الماوس من الإقفاري الشبكية له فوائد كبيرة لدراسة إصابة الشبكية الإقفاري ، لا تزال هناك قيود على هذا النهج. منذ شق الجراحية في الرقبة، وفصل الغدد اللعابية والانسداد في CCA الحق مع الغرز يجب أن تطبق على الإجراء، اضطرابات الأنسجة المصاحبة يمكن أن تثير التهاب المرتبطة بها بشكل نظامي أو على الأقل محليا. وقد تم التصدي لهذه المخاوف جزئيا باستخدام الفئران التي تعمل بشكل صوري، حيث يتم إجراء جميع الخطوات الجراحية دون tBCCAO. وثمة مشكلة أخرى هي شرط إدارة الألم الذي يحدث أثناء وبعد الجراحة. في دراستنا، تم تطبيق إدارة الألم لمنع معاناة الفئران من خلال حقن محلول الترتارات البوتوفانول، وهو مسكن ناهض خصم الأفيونية المشتقة صناعيًا من سلسلة phenanthrene. قد يكون من المهم أن تكون على علم بأن استخدام أنواع مختلفة من التخدير والمسكنات يمكن أن تعطل آثار tBCCAO على التروية الشبكية. وثمة قيد آخر على هذا النهج (جنبا إلى جنب مع نهج نماذج أخرى مستخدمة حاليا) هو أنه لا يوفر محاكاة مثالية من الأمراض المرتبطة اضطرابات شبكية العين القلب والأوعية الدموية الإنسان. حتى الآن، نماذج الماوس المستخدمة لمثل هذه التجارب لا تعاني من الأمراض المشتركة التي تكمن وراء اعتلالات الشبكية في البشر، وذلك أساسا مع متلازمة الأيض مثل مرض السكري50. يمكن أن يكون لهذه المضاعفات التي لا توجد في نماذج الماوس الحالية آثار تآزرية سلبية على المسارات المرضية لتطوير اعتلال الشبكية الإقفي. لذلك، ينبغي أن يؤخذ ذلك في الاعتبار عند تفسير النتائج من النماذج التجريبية المستخدمة حاليا بما في ذلك نموذج الماوس tBCCAO لدينا. لفهم أفضل الآليات الفيزيولوجية من اعتلالات الشبكية الإقفارية في البشر، يمكن الجمع بين نموذجنا مع عوامل مرضية أخرى مثل حقن ستروبتوزوتوسين51 أو تكملة النظام الغذائي عالي الدهون52 لتطوير اعتلال الشبكية السكري الإقفائي. في الماضي، على الرغم من أننا أظهر انخفاض ضخ الدم في شبكية العين في الفئران التي تديرها tBCCAO، لم نتمكن من فهم واضح آثار CCAO عابرة اليسار على ضخ الدم إلى شبكية العين اليمنى. ويمكن معالجة هذه المسألة باستخدام الليزر دوبلر الذي يستخدم عادة لتأكيد أن الانسداد قد حدث وschemia قد حدث في الجسم الحي في الوقت الحقيقي53,54. ويمكن استخدام هذه التقنية لفهم أفضل لاقفوية الشبكية في الماوس الذي يشغله tBCCAO الفردية، فيما يتعلق بالدوران الجانبي في دائرة ويليس.

على الرغم من هذه القيود، يمثل أسلوبنا tBCCAO الموصوف هنا نهجًا فعالًا لإنتاج نقص التروية في شبكية العين في الفئران. دراسة تغيرات الشبكية من قبل tBCCAO يساعد على كشف الآليات المرضية من اعتلال الشبكية الإقفارية في البشر. وعلاوة على ذلك، نأمل أن يمكن استخدام نموذج الماوس tBCCAO لفي فحص المخدرات في الجسم الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل من خلال المنح في المعونة للبحث العلمي (KAKENHI) (18K09424 إلى Toshihide Kurihara و20K18393 إلى يوكيهيرو ميوا) من وزارة التعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا (MEXT).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atipamezole hydrochloride Zenoaq Antisedan For anti-anesthesia
Applied Biosystems 7500 Fast Applied Biosystems - For qPCR
Butorphanol tartrate Meiji Seika Pharma Vetorphale For anesthesia
BZ-II Analyzer KEYENCE - For an image merge
BALB/cAJc1 CLEA - Mouse strain
β-Actin (8H10D10) Mouse mAb CST 3700 For western blot
Clamp Forcep World Precision Instruments WPI 500451 For surgery
Dumont forceps #5 Fine Science Tools 11251-10 For surgery
DAPI solution Dojindo 340-07971 For IHC
Envisu SD-OCT system Leica R4310 For OCT
FITC-dextran Merk FD2000S For retinal blood perfusion
Fluorescence microscope KEYENCE BZ-9000 For fluorescence detection
Gatifloxacin hydrate Senju Pharmaceutical Gachifuro For anti-bacterial infection
GFAP Monoclonal Antibody (2.2B10) Thermo 13-0300 For IHC
Heating pad Marukan RH-200 For surgery
HIF-1α (D1S7W) XP Rabbit mAb CST 36169 For western blot
ImageQuant LAS 4000 mini GE Healthcare - For chemiluminescence
Midazolam Sandoz K.K SANDOZ For anesthesia
Microtome Tissue-Tek TEC 6 Sakura - For sectioning
Medetomidine Orion Corporation Domitor For anesthesia
Needle holder Handaya HS-2307 For surgery
PuREC MAYO Corporation - For ERG
Scissor Fine Science Tools 91460-11 For surgery
Sodium hyaluronate Santen Pharmaceutical Hyalein For eye lubrication
Tropicamide/Penylephrine hydrochloride Santen Pharmaceutical Mydrin-P For mydriasis
6-0 silk suture Natsume E12-60N2 For surgery

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, B. Ocular effects of changes in oxygen and carbon dioxide tension. Transactions of the American Ophthalmological Society. 66, 423-474 (1968).
  2. Ingberg, E., Dock, H., Theodorsson, E., Theodorsson, A., Ström, J. O. Method parameters' impact on mortality and variability in mouse stroke experiments: a meta-analysis. Scientific Reports. 6 (1), 21086 (2016).
  3. Atochin, D. N., Clark, J., Demchenko, I. T., Moskowitz, M. A., Huang, P. L. Rapid Cerebral Ischemic Preconditioning in Mice Deficient in Endothelial and Neuronal Nitric Oxide Synthases. Stroke. 34 (5), 1299-1303 (2003).
  4. Allen, R. S., et al. Severity of middle cerebral artery occlusion determines retinal deficits in rats. Experimental Neurology. 254, 206-215 (2014).
  5. Steele, E. C., Guo, Q., Namura, S. Filamentous Middle Cerebral Artery Occlusion Causes Ischemic Damage to the Retina in Mice. Stroke. 39 (7), 2099-2104 (2008).
  6. Minhas, G., Morishita, R., Anand, A. Preclinical models to investigate retinal ischemia: advances and drawbacks. Frontiers in Neurology. 3, 75 (2012).
  7. McColl, B. W., Carswell, H. V., McCulloch, J., Horsburgh, K. Extension of cerebral hypoperfusion and ischaemic pathology beyond MCA territory after intraluminal filament occlusion in C57Bl/6J mice. Brain Res. 997 (1), 15-23 (2004).
  8. Jiang, A. X., et al. Inducement and Evaluation of a Murine Model of Experimental Myopia. Journal of Visualized Experiments. (143), e58822 (2019).
  9. Miwa, Y., et al. Pharmacological HIF inhibition prevents retinal neovascularization with improved visual function in a murine oxygen-induced retinopathy model. Neurochemistry International. 128, 21-31 (2019).
  10. Adams, S., Pacharinsak, C. Mouse Anesthesia and Analgesia. Current Protocols in Mouse Biology. 5 (1), 51-63 (2015).
  11. Speetzen, L. J., Endres, M., Kunz, A. Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia. Journal of Visualized Experiments. (75), e4387 (2013).
  12. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments. (47), e2423 (2011).
  13. Lee, D., Kang, H., Yoon, K. Y., Chang, Y. Y., Song, H. B. A mouse model of retinal hypoperfusion injury induced by unilateral common carotid artery occlusion. Experimental Eye Research. 201, 108275 (2020).
  14. Li, S., et al. Retro-orbital injection of FITC-dextran is an effective and economical method for observing mouse retinal vessels. Molecular Vision. 17, 3566-3573 (2011).
  15. Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo. Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).
  16. Lee, D., et al. A Fairy Chemical Suppresses Retinal Angiogenesis as a HIF Inhibitor. Biomolecules. 10 (10), (2020).
  17. Tomita, Y., et al. Pemafibrate Prevents Retinal Pathological Neovascularization by Increasing FGF21 Level in a Murine Oxygen-Induced Retinopathy Model. International Journal of Molecular Sciences. 20 (23), 5878 (2019).
  18. Yamamoto, H., Schmidt-Kastner, R., Hamasaki, D. I., Yamamoto, H., Parel, J. M. Complex neurodegeneration in retina following moderate ischemia induced by bilateral common carotid artery occlusion in Wistar rats. Experimental Eye Research. 82 (5), 767-779 (2006).
  19. Cheng, L., Yu, H., Yan, N., Lai, K., Xiang, M. Hypoxia-Inducible Factor-1α Target Genes Contribute to Retinal Neuroprotection. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 20 (2017).
  20. Mole, D. R., et al. Genome-wide association of hypoxia-inducible factor (HIF)-1alpha and HIF-2alpha DNA binding with expression profiling of hypoxia-inducible transcripts. The Journal of Biological Chemistry. 284 (25), 16767-16775 (2009).
  21. Majmundar, A. J., Wong, W. J., Simon, M. C. Hypoxia-Inducible Factors and the Response to Hypoxic Stress. Molecular Cell. 40 (2), 294-309 (2010).
  22. Newman, E. A. Glial cell regulation of neuronal activity and blood flow in the retina by release of gliotransmitters. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370 (1672), (2015).
  23. Vecino, E., Rodriguez, F. D., Ruzafa, N., Pereiro, X., Sharma, S. C. Glia-neuron interactions in the mammalian retina. Progress in Retinal and Eye Research. 51, 1-40 (2016).
  24. Symonds, C. The Circle of Willis. British Medical Journal. 1 (4906), 119 (1955).
  25. Lo, W. B., Ellis, H. The circle before willis: a historical account of the intracranial anastomosis. Neurosurgery. 66 (1), 7-18 (2010).
  26. Yang, G., et al. C57BL/6 strain is most susceptible to cerebral ischemia following bilateral common carotid occlusion among seven mouse strains: selective neuronal death in the murine transient forebrain ischemia. Brain Research. 752 (1), 209-218 (1997).
  27. Farkas, E., Luiten, P. G. M., Bari, F. Permanent, bilateral common carotid artery occlusion in the rat: A model for chronic cerebral hypoperfusion-related neurodegenerative diseases. Brain Research Reviews. 54 (1), 162-180 (2007).
  28. Morris, G. P., et al. A Comparative Study of Variables Influencing Ischemic Injury in the Longa and Koizumi Methods of Intraluminal Filament Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice. PLOS ONE. 11 (2), 0148503 (2016).
  29. Tsuchiya, D., Hong, S., Kayama, T., Panter, S. S., Weinstein, P. R. Effect of suture size and carotid clip application upon blood flow and infarct volume after permanent and temporary middle cerebral artery occlusion in mice. Brain Research. 970 (1-2), 131-139 (2003).
  30. Kaelin, W. G., Ratcliffe, P. J. Oxygen Sensing by Metazoans: The Central Role of the HIF Hydroxylase Pathway. Molecular Cell. 30 (4), 393-402 (2008).
  31. Pauly, M., Sruthi, R. Ptosis: evaluation and management. Kerala Journal of Ophthalmolgy. 31 (1), 11-16 (2019).
  32. Averbuch-Heller, L., Leigh, R. J., Mermelstein, V., Zagalsky, L., Streifler, J. Y. Ptosis in patients with hemispheric strokes. Neurology. 58 (4), 620 (2002).
  33. Dutton, J. Atlas of clinical and surgical orbital anatomy, second edition. 113, 1364 (2011).
  34. Ritzel, R. M., et al. Early retinal inflammatory biomarkers in the middle cerebral artery occlusion model of ischemic stroke. Molecular Vision. 22, 575-588 (2016).
  35. Crespo-Garcia, S., et al. Individual and temporal variability of the retina after chronic bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO). PLOS ONE. 13 (3), 0193961 (2018).
  36. Qin, Y., et al. Functional and morphologic study of retinal hypoperfusion injury induced by bilateral common carotid artery occlusion in rats. Scientific Reports. 9 (1), 80 (2019).
  37. Block, F., Grommes, C., Kosinski, C., Schmidt, W., Schwarz, M. Retinal ischemia induced by the intraluminal suture method in rats. Neuroscience Letters. 232 (1), 45-48 (1997).
  38. Allen, R. S., et al. Progesterone Treatment in Two Rat Models of Ocular Ischemia. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (5), 2880-2891 (2015).
  39. Miller, R. F., Dowling, J. E. Intracellular responses of the Müller (glial) cells of mudpuppy retina: their relation to b-wave of the electroretinogram. Journal of Neurophysiology. 33 (3), 323-341 (1970).
  40. Block, F., Grommes, C., Kosinski, C., Schmidt, W., Schwarz, M. Retinal ischemia induced by the intraluminal suture method in rats. Neuroscience Letters. 232 (1), 45-48 (1997).
  41. Lee, J. H., Shin, J. M., Shin, Y. J., Chun, M. H., Oh, S. J. Immunochemical changes of calbindin, calretinin and SMI32 in ischemic retinas induced by increase of intraocular pressure and by middle cerebral artery occlusion. Anatomy & Cell Biology. 44 (1), 25-34 (2011).
  42. Li, S. Y., et al. Lycium barbarum polysaccharides reduce neuronal damage, blood-retinal barrier disruption and oxidative stress in retinal ischemia/reperfusion injury. PLOS ONE. 6 (1), 16380 (2011).
  43. Furashova, O., Matthé, E. Retinal Changes in Different Grades of Retinal Artery Occlusion: An Optical Coherence Tomography Study. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (12), 5209-5216 (2017).
  44. Zadeh, J. K., et al. Short-Time Ocular Ischemia Induces Vascular Endothelial Dysfunction and Ganglion Cell Loss in the Pig Retina. International Journal of Molecular Sciences. 20 (19), (2019).
  45. Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. Rodent stroke model guidelines for preclinical stroke trials (1st edition). Journal of Experimental Stroke & Translational Medicine. 2 (2), 2-27 (2009).
  46. Tang, Y., et al. Hypothermia-induced ischemic tolerance is associated with Drp1 inhibition in cerebral ischemia-reperfusion injury of mice. Brain Research. 1646, 73-83 (2016).
  47. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 13 (4), 683-692 (1993).
  48. Pula, J. H., Yuen, C. A. Eyes and stroke: the visual aspects of cerebrovascular disease. Stroke and Vascular Neurology. 2 (4), 210 (2017).
  49. Steele, E. C., Guo, Q., Namura, S. Filamentous middle cerebral artery occlusion causes ischemic damage to the retina in mice. Stroke. 39 (7), 2099-2104 (2008).
  50. Sim, D. A., et al. The Effects of Macular Ischemia on Visual Acuity in Diabetic Retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 2353-2360 (2013).
  51. Wu, K. K., Huan, Y. Streptozotocin-induced diabetic models in mice and rats. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 5, Unit 5.47 (2008).
  52. Mubarak, A., Hodgson, J. M., Considine, M. J., Croft, K. D., Matthews, V. B. Supplementation of a high-fat diet with chlorogenic acid is associated with insulin resistance and hepatic lipid accumulation in mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61 (18), 4371-4378 (2013).
  53. Ansari, S., Azari, H., McConnell, D. J., Afzal, A., Mocco, J. Intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke with laser doppler flowmetry guidance in mice. Journal of Visualized Experiments. (51), e2879 (2011).
  54. Hedna, V. S., et al. Validity of Laser Doppler Flowmetry in Predicting Outcome in Murine Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion Stroke. Journal of Vascular and Interventional Neurology. 8 (3), 74-82 (2015).

Tags

الطب العدد 165 انسداد الشريان السباتي تخطيط كهربائي نماذج تجريبية نقص الأكسجة الإقكيمية التصوير المقطعي التناسق البصري شبكية العين Reperfusion
نموذج مورين من إصابة الشبكية الإقفارية الناجمة عن الشريان السباتي المشترك الثنائي العابر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, D., Miwa, Y., Jeong, H., Ikeda, … More

Lee, D., Miwa, Y., Jeong, H., Ikeda, S. i., Katada, Y., Tsubota, K., Kurihara, T. A Murine Model of Ischemic Retinal Injury Induced by Transient Bilateral Common Carotid Artery Occlusion. J. Vis. Exp. (165), e61865, doi:10.3791/61865 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter