Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

דגם מורין של פגיעה איסכמית ברשתית הנגרמת על ידי חסימת עורקים דו-צדדית משותפת חולפת

Published: November 12, 2020 doi: 10.3791/61865
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,4, 1,2
1Laboratory of Photobiology, Keio University School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, Keio University School of Medicine, 3Animal eye care, Tokyo Animal Eye Clinic, 4Tsubota Laboratory, Inc.
* These authors contributed equally

Summary

כאן, אנו מתארים דגם עכבר של איסכמיה רשתית על ידי חסימת עורקים דו-צדדית נפוצה חולפת באמצעות תפרים פשוטים ומהדק. מודל זה יכול להיות שימושי להבנת המנגנונים הפתולוגיים של איסכמיה ברשתית הנגרמת על ידי מומים קרדיווסקולריים.

Abstract

מחלות כלי דם מגוונות כגון רטינופתיה סוכרתית, חסימה של ורידים ברשתית או עורקים ותסמונת איסכמית עינית יכול להוביל איסכמיה ברשתית. כדי לחקור מנגנונים פתולוגיים של איסכמיה ברשתית, יש לפתח מודלים ניסיוניים רלוונטיים. מבחינה אנטומית, כלי אספקת דם רשתית עיקרי הוא עורק עיניים (OpA) ו OpA מקורו בעורק הראשי הפנימי של העורק הראשי המשותף (CCA). לכן, שיבוש של CCA יכול לגרום ביעילות איסכמיה ברשתית. כאן, הקמנו מודל העכבר של איסכמיה רשתית על ידי חסימה חולפת של עורק ראשי משותף דו-צדדי (tBCCAO) כדי לקשור את CCA הימני עם 6-0 תפרי משי ולחסום את CCA שמאל לזמן חולף במשך 2 שניות באמצעות מהדק, והראה כי tBCCAO יכול לגרום איסכמיה רשתית חריפה המובילה לתפקוד רשתית. השיטה הנוכחית מפחיתה את ההסתמכות על מכשירים כירורגיים רק באמצעות מחטים כירורגיות ומהדק, מקצרת את זמן החסימה כדי למזער מוות בלתי צפוי של בעלי חיים, אשר נתפס לעתים קרובות במודלים של עכבר של חסימת עורק המוח האמצעי, ושומר על יכולת רבייה של ממצאים איסכמיים ברשתית נפוצה. המודל יכול להיות מנוצל כדי לחקור את הפתופיזיולוגיה של רטינופתיות איסכמי בעכברים, עוד יותר יכול לשמש הקרנת סמים vivo.

Introduction

הרשתית היא רקמה נוירו-חושית לתפקוד חזותי. מאז כמות משמעותית של חמצן נדרש לתפקוד חזותי, הרשתית ידועה כאחת הרקמות תובעניות חמצן הגבוה ביותר בגוף1. הרשתית רגישה למחלות כלי דם כמו חמצן מועבר דרך כלי הדם. סוגים שונים של מחלות כלי דם, כגון רטינופתיה סוכרתית וכלי דם ברשתית (ורידים או עורקים) חסימה, יכול לגרום איסכמיה ברשתית. כדי לחקור מנגנונים פתולוגיים של איסכמיה ברשתית, מודלים ניסיוניים לשחזור ורלוונטיים קלינית של איסכמיה ברשתית נחשבים הכרחיים. חסימת עורק המוח התיכון (MCAO) על ידי החדרת חוט תוך-אלומיניום היא השיטה הנפוצה ביותר לפיתוח מודלים מכרסמים vivo של איסכמיה מוחית ניסיונית2,3. בשל הקרבה של עורק העיניים (OpA) ל MCA, מודלים MCAO משמשים גם בו זמנית כדי להבין את הפתופיזיולוגיה של איסכמיה ברשתית4,5,6. כדי לגרום איסכמיה מוחית יחד עם איסכמיה ברשתית, חוטים ארוכים מוכנסים בדרך כלל באמצעות חתך של העורק הראשי המשותף (CCA) או עורק הראשי החיצוני (ECA). שיטות אלה קשות לביצוע, דורשות זמן רב כדי להשלים את הניתוח (מעל 60 דקות עבור עכבר אחד), ולהוביל שונות גבוהה בתוצאות לאחר הניתוח7. זה עדיין חשוב לפתח מודל טוב יותר כדי לשפר את החששות האלה.

במחקר זה, פשוט השתמשנו בחסימת CCA דו-צדדית חולפת קצרה (tBCCAO) עם מחטים ומהדק כדי לגרום לאיסכמיה ברשתית בעכברים וניתחנו תוצאות אופייניות של פציעות איסכמיות ברשתית. בסרטון זה, אנו נותנים הדגמה של הליך tBCCAO.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת קיו.

1. הכנת מכשירים כירורגיים ובעלי חיים

  1. אוטוקלאב מכשירים כירורגיים ולשמור אותם 70% אלכוהול אתיל. לפני כל הליך כירורגי חדש, לנקות מכשירים כירורגיים בזהירות באמצעות 70% אלכוהול אתיל.
  2. הכינו עכברי BALB/cAJc1 זכרים (בני 6 שבועות, 26-28 ק"ג) בחדר ספציפי ללא פתוגן (SPF) לשמירה על מצבים סטריליים לפני הניתוח, במהלכו ואחריו.

2. חסימת עורקים דו-צדדית דו-צדדית משותפת (tBCCAO)

  1. שים עכבר תחת הרדמה באמצעות הזרקה תוך-אישית עם שילוב של midazolam (40 מיקרוגרם /100 μL), medetomidine (7.5 מיקרוגרם / 100 μL) ו טרטרט butorphanol (50 מיקרוגרם / 100 μL), המכונה "MMB", כפי שתואר קודם לכן8,9. החזק את עורות הגב של העכבר כדי להרחיק את העכבר מלהתנגש בעיניו עד שהעכבר מורדם לחלוטין.
    1. לשפוט את עומק ההרדמה על ידי צביטה בוהן העכבר עד שאין לו תגובה, של איזו שיטה משמשת בדרך כלל לבדיקת הרדמה מלאה10.
      הערה: בדרך כלל, פחות מ 5 דקות נדרשים עכברים להירדם. מתכונים מתאימים להרדמה כללית עשויים להיות שונים על ידי מוסדות.
  2. החל טיפה אחת של 0.1% מטוהרים נתרן hyaluronate טיפת עיניים פתרון לעיניים כדי למנוע יובש על העיניים תחת הרדמה.
  3. הנח את העכבר על גבו ותקן את כפותיו של העכבר באמצעות קלטות דבק.
  4. לחטא את אזור הצוואר של העכבר באמצעות 70% אלכוהול אתיל לפני הניתוח.
    הערה: גזיר נוסף של הפרווה לא בוצע מכיוון שהדבר עלול לגרום לדלקת עורעוקבת 11,12.
  5. בצע חתך קשתי בצוואר באמצעות להב (איור 1).
    הערה: חתך צריך להתבצע על קו האמצע בין הצוואר, עצם החזה וקנה הנשימה.
  6. להפריד את שתי בלוטות הרוק בזהירות באמצעות שני מלקחיים לגייס אותם כדי לדמיין את CCAs הבסיסית.
  7. לבודד את CCA הנכון בזהירות מן העצבים vagal בהתאמה ואת הוורידים הנלווים מבלי לפגוע במבנים שלהם, ומניחים שני תפרים משי 6-0 תחת CCA. קשרו את שני הקשרים בחוזקה כדי לחסום את זרימת הדם (איור 1).
    הערה: במהלך ההליך, ורידים קטנים עלולים להיפגע. אם דימום נראה, ניגוב נדרש כדי לדמיין את CCAs בבירור.
  8. מצא את CCA השמאלי בזהירות מן העצבים vagal בהתאמה ואת הוורידים הנלווים מבלי לפגוע במבנים שלהם, ולחסן את CCA שמאל במשך 2 שניות על ידי מהדק(איור 1).
    הערה: יש צורך להציב מחט תפר משי 6-0 מתחת ל- CCA השמאלי כדי לסמן אתר להידוק.
  9. לאחר פתיחה מחדש של CCA השמאלי, פצעי תפר של הצוואר על ידי תפר משי 6-0 ולהחיל טיפה של אנטיביוטיקה (50 μL) על הצוואר כדי לעכב זיהום חיידקי.
    הערה: הסר בעדינות מלחציים כדי למנוע פגיעה בקיר העורקים בעת פתיחה מחדש של CCA השמאלי.
  10. להזריק 0.75 מ"ג/ק"ג של atipamezole הידרוכלוריד תוך-אופייני לעכבר כדי לעזור לעכבר התאושש מהרדמה עמוקה במהירות. להחזיר את העכבר לכלוב עכבר עם רפידות מחוממות מראש.
    הערה: אל תתנו לעכבר להישאר ללא השגחה עד שהעכבר יחזור להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה קשה.
  11. להזריק 0.4 מ"ג/ק"ג של טרטרט butorphanol לעכבר לניהול הכאב כאשר העכבר מתעורר.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. כרמז ראשון ל-tBCCAO מוצלח, ניתן לראות ריר עפעפיים של העכבר (איור 2).
  12. עבור המתת חסד, להזריק 3x של תערובת MMB לעכברים להקריב אותם לניסויים.

3. תצפיות כלליות (שיעורי הישרדות וצניחת עפעפיים)

  1. לאחר הניתוח, בדוק את שיעורי ההישרדות של כל סיבות המוות ביום 0 (לאחר הניתוח), 1, 3 ו -7.
  2. הערכת צניחת עפעפיים בסולם דירוג של 4 נקודות: 1 = ללא ריר, 2 = צניחה קלה (~ 50%), 3 = ריר חמור (מעל 50%), ו- 4 = צניחה חמורה עם הפרשות עיניים.

4. זלוף דם ברשתית

  1. הזרק 200 μL של FITC-dextran (25 מ"ג / מ"ל) לתוך החדר השמאלי של העכבר, אשר משמש בדרך כלל לתצפית על זלוף הדם בכלי רשתית העכבר13,14.
  2. 2 דקות לאחר זרימת הדם, לאכוף את העיניים ולתקן 4% paraformaldehyde במשך שעה אחת. הרשתיות הושגו בקפידה ורכובות שטוחות, כפי שתואר קודם לכן15, ונבדקו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
  3. צלם את כל תושבות הרשתית בהגדלה פי 4 והתמזג ליחיד באמצעות מנתח מיזוג, שתואר בעבר16.
  4. למדוד את האזורים perfused באמצעות כלי ניתוח כלי בתוכנת NIH פיג'י / ImageJ.

5. כתם מערבי

  1. 3 ו 6 שעות לאחר tBCCAO, לקבל את העיניים של עכברים ומיד להעביר צלחת פטרי המכיל PBS קר כדי לבודד את הרשתית.
  2. לאחר בידוד הרשתיות, בצעו כתמים מערביים, כפי שתואר קודםלכן 9.
  3. דגירה עם נוגדנים לגורם היפוקסיה-1α (HIF-1α; סמן היפוקסיה כללי) ועבור β-אקטין (בקרת טעינה פנימית) לילה ואחריו דגירה של נוגדנים משניים מצומדים HRP. דמיין את האותות באמצעות צ'מילומינציה.

6. PCR כמותי (qPCR)

  1. 6, 12 ו 24 שעות לאחר tBCCAO, לעבד את הרשתית שהושגה עבור qPCR, כפי שתואר קודם לכן17.
  2. בצע qPCR באמצעות מערכת PCR בזמן אמת. פריימנים המשמשים מפורטים בטבלה 1. חשב שינויי קיפול בין רמות של תעתיקים שונים על-ידישיטת T ΔΔC.

7. אימונוהיסטוכימיה (IHC)

  1. 3 ימים לאחר tBCCAO, לקבל את העיניים של עכברים להטביע פרפין.
  2. חותכים את העיניים משובצות פרפין על ידי microtome כדי לקבל את חלקי העין.
  3. דה-פרפין ולהכתים את חלקי העין של 5 מיקרומטר עובי כפי שתואר קודםלכן 13.
  4. דגירה עם נוגדן לחלבון חומצי פרפור גלי (GFAP; סמן אמין עבור אסטרוציטים ותאי מולר ברשתית) לילה ואחריו דגירה של אלקסה פלואור 555-מצומד נוגדן משני.
  5. השתמש DAPI (4′,6-diamidino-2-פנילינדול) עבור הכתמת הגרעין ברשתית. דמיין אותות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
  6. הערכת ניקוד מורפולוגיה על ידי סולם דירוג של 4 נקודות, כפי שתואר קודם לכן13,18: 0 = אין אות, 1 = כמה רגלי קצה גליה חיוביות בשכבת תא הגנגליון (GCL), 2 = כמה תהליכים מתויגים המגיעים מ- GCL לשכבה הגרעינית החיצונית (ONL), ו - 3 = התהליכים המסומנים ביותר המגיעים מ- GCL ל- ONL.

8. אלקטרורטינוגרפיה (ERG)

  1. 3 ו 7 ימים לאחר tBCCAO, לבצע ERG באמצעות כיפת Ganzfeld, מערכת רכישה וממריצים LED, כפי שתואר קודםלכן 9.
  2. לאחר הסתגלות כהה בן לילה, הרדמה עכברים עם שילוב של MMB תחת אור אדום עמום.
  3. השתמש בתמיסה מעורבת של 0.5% טרופיקמיד ו 0.5% פנילפרין כדי להרחיב את האישונים.
  4. מניחים את האלקטרודות הפעילות על עדשת מגע ומניחים את אלקטרודת הייחוס בפה.
  5. קבל תגובות ERG משתי העיניים של כל בעל חיים.
  6. רשום תגובות סקוטיות תחת הסתגלות כהה עם גירויים שונים.
  7. למדוד את משרעת של גל מקו הבסיס לנקודה הנמוכה ביותר של גל.
  8. למדוד את משרעת של b-wave מהנקודה הנמוכה ביותר של גל לשיא של b-wave.
  9. שמור על כל העכברים חמים במהלך ההליך באמצעות רפידות חום.

9. טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT)

  1. 2 שבועות לאחר tBCCAO, לבצע OCT באמצעות מערכת SD-OCT, כפי שדווח בעבר8,9.
  2. למדידה, נושא עכברים mydriasis על ידי פתרון מעורב של 0.5% טרופיקמיד ו 0.5% פנילפרין, ולהרדמה כללית על ידי תערובת של MMB.
  3. השג תמונות סריקה B מפרוסות קו המשווה של סריקות en-face.
  4. בדוק את הרשתית ב 0.2, 0.4 ו 0.6 מ"מ מראש עצב הראייה.
  5. למדוד עובי הרשתית משכבת סיבי העצב ברשתית (NFL) לקרום המגביל החיצוני (ELM), ולשקול את הממוצע של ערכים נמדדים כעובי הרשתית של עכבר בודד.
  6. התווה את התוצאות כדיאגרמות עכביש.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לאחר תפוצה מערכתית של FITC-dextran במשך 2 דקות, נבדקו כלי דם ברשתית הרשתית הימנית והשמאלית בעכברים המופעלים על ידי תרמית ועכברים המופעלים באמצעות tBCCAO (איור משלים 1). FITC-dextran היה גלוי לחלוטין בשני הרשתית בעכברים המופעלים על ידי זיוף ואת הרשתית השמאלית בעכברים המופעלים tBCCAO, בעוד זה היה מזוהה חלקית ברשתית הימנית בעכברים המופעלים tBCCAO.

לאחר TBCCAO, נבדקו ריר עפעפיים (איור 2). העיניים הימניות הראו מתון (ציון 2; 75%) ועפעף חמור (ציון 3 ו-4; 25%) בעוד העיניים השמאליות לא צנחו (ציון 1; 93.75%) למעט עכבר אחד (ציון 2; 6.25%). למרות עפעפיים חמורים מזיל ריר עם הפרשות עיניים לא נצפתה במידה ניכרת בעכברים המופעלים tBCCAO, יכולנו לראות עכבר אחד עבור פנוטיפ זה (ציון 4; 6.25%).

מצב חמצן מופחת ברקמות מוביל לייצוב HIF-1α אינדוקציה של מספר גנים מגיבים היפוקסיה כגון EPO, VEGF ו BNIP319,20,21. ראשית, היפוקסיה ביולוגית מולקולרית באמצעות סמן היפוקסי כללי HIF-1α הוערכה באמצעות כתמים מערביים(איור 3). ביטוי HIF-1α מוגבר נצפתה באופן משמעותי ברשתית הימנית 3 ו 6 שעות לאחר tBCCAO. לאחר מכן, ביטויים של גנים מגיבים היפוקסיה הוערכו באמצעות qPCR (איור משלים 2). לא היה שינוי משמעותי בביטויי גנים מגיבים היפוקסיה 6 שעות לאחר tBCCAO. 12 שעות לאחר tBCCAO, מצאנו ביטוי Binp3 גדל באופן משמעותי עלייה קלה ביטוי Epo הוצג ברשתית הימנית. 24 שעות לאחר tBCCAO, אנו יכולים גם למצוא עלייה קלה ביטוי Epo ברשתית הימנית למרות שזה לא היה מובהק סטטיסטית. ביטוי Vegf לא השתנה מ 6 עד 24 שעות בעכברים המופעלים tBCCAO.

גליוזיס תגובתי ברשתית נבדק 3 ימים לאחר tBCCAO (איור 4), כמו גליה כגון אסטרוציטים ותאי מולר קושרו קשר הדוק עם איסכמיה רשתית22. GFAP היה בשימוש נרחב לגילוי של אסטרוציטים ותאי מולר ברשתית23. ממוצע ציוני המורפולוגיה עבור תיוג GFAP ברשתית הימנית היה הגבוה ביותר בין שתי הרשתית בעכברים המופעלים על ידי תרמית והרשתית השמאלית בעכברים המופעלים על ידי TBCCAO. בהתבסס על לוקליזציה של ביטוי GFAP, שינוי במורפולוגיה בתיוג GFAP נחשב לשקף הפעלה של תאי מולר.

ERG שימש לבחינת תפקוד הרשתית לאחר tBCCAO (איור 5). משרעת של b-wave בעין ימין ירד באופן דרמטי 3 ו 7 ימים לאחר tBCCAO. עם זאת, משרעת של גל בעין ימין לא השתנו באופן משמעותי. כשמדובר בעין שמאל, לא יכולנו לראות שינויים במשרעת של גלי a ו-b(איור משלים 3).

ביצענו OCT כדי לקבוע שינוי בעובי הרשתית לאחר tBCCAO(איור 6). עובי הרשתית בעין ימין גדל באופן דרמטי 2 שבועות לאחר tBCCAO, בעוד לא היה הבדל בעובי הרשתית בעין השמאלית בין העכברים tBCCAO- ו- sham המופעלים.

Figure 1
איור 1: סכמטי של הליך המודל ומחזור הדם במעגל ויליס. איור סכמטי הראה את הליך מודל העכבר איסכמי רשתית הנגרמת על ידי tBCCAO ואת זרימת הדם לרשתית. CCA, ECA, ICA, PCA ו- OpA מייצגים את עורק העורק הראשי המשותף, עורק ראשי חיצוני, עורק עורק ראשי פנימי, עורק תקשורת אחורי ועורק עיניים, בהתאמה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: עפעפיים נופלים לאחר tBCCAO. חומרת צניחת העפעפיים הוערכה על ידי דירוג של 4 נקודות בהתבסס על תמונות הייחוס: 1 = ללא צניחה, 2 = צניחה קלה (~ 50% צניחה), 3 = ריר חמור (מעל 50% ריר), ו 4 = ריר חמור עם הפרשות עיניים. צניחת עפעפיים נצפתה לאחר tBCCAO והיא נשמרה במהלך התצפית הניסיונית. התוצאות (sham: n = 10, tBCCAO: n = 16) הותוו כמזימה של נקודה מפוזרת. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ייצוב HIF-1α לאחר tBCCAO. כשל חיסוני מייצג וניתוחים כמותיים (קבוצות לשעה 3; בלום: n = 3, tBCCAO: n = 6 וקבוצות לשעה 6; sham ו- tBCCAO: n = 6) עבור HIF-1α ו- β-Actin הראו כי HIF-1α התייצב ברשתית הימנית 3 ו -6 שעות לאחר tBCCAO. *P < 0.05. הנתונים נותחו באמצעות מבחן tשל סטודנט והוצגו כאכזריים עם סטייה ± תקנית. L ו- R לעמוד על הרשתית הימנית והשמאלית, בהתאמה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: גליוזיס תגובתי לאחר tBCCAO. קטעים קשתיים מייצגים של הרשתיות (sham: n = 4, tBCCAO: n = 4) וניתוחים כמותיים של תיוג GFAP (אדום) על ידי ניקוד מורפולוגיה (0-3) הראו כי תיוג GFAP, מוגבל בעיקר ב- NFL + GCL, הורחב לשכבה הפנימית כולה, מ- GCL ל- ONL (חצים לבנים) ברשתית הימנית לאחר tBCCAO. סרגלי קנה מידה, 50 מיקרומטר. DAPI (כחול) שימש להכתמת הגרעין ברשתית. NFL, GCL, IPL, INL ו- ONL מייצגים את שכבת סיבי העצב, שכבת תא הגנגליון, שכבת plexiform הפנימית, שכבה גרעינית פנימית ושכבה גרעינית החיצונית, בהתאמה. הנתונים נותחו באמצעות מבחן tשל סטודנט והוצגו כחציון עם טווח interquartile, האחוזון ה -25 וה -75. *P < 0.05. L ו- R לעמוד על הרשתית הימנית והשמאלית, בהתאמה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: תפקוד לקוי של הראייה בעין ימין לאחר tBCCAO. (A)צורות גל מייצגות של ERG מותאם כהה ביצע 3 ו 7 ימים לאחר tBCCAO. עוצמת גירוי (cd.s/m2): 0.005. (B)ניתוחים כמותיים הראו כי חלה ירידה במשרעת של גל b בעין ימין (sham: n = 5, tBCCAO: n = 6) בעוד משרעת של גל לא השתנו. *P < 0.05, **P < 0.01. הנתונים נותחו באמצעות מבחן tשל סטודנט והוצגו כאכזריים עם סטייה ± תקנית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: שינוי בעובי הרשתית לאחר tBCCAO. תמונות OCT מייצגות ברשתית המופעלת על ידי Sham ו- tBCCAO וניתוחים כמותיים הראו כי חלה עלייה בעובי הרשתית ברשתית הימנית (sham: n = 4, tBCCAO: n = 8). לא חל שינוי בעובי הרשתית ברשתית השמאלית (sham: n = 4, tBCCAO: n = 8). סרגלי קנה המידה הם 200 (עליון) ו 100 (נמוך יותר) מיקרומטר, בהתאמה. *P < 0.05. הערכים בציר האופקי של הדיאגרמות מייצגים 0.2, 0.4 ו- 0.6 מ"מ הרחק מראש עצב הראייה (0) שזוהה על-ידי הקו הירוק. הנתונים נותחו באמצעות ANOVA דו כיווני ואחריו מבחן בונפרוני פוסט הוק. דיאגרמות עכביש הוצגו כאכזריות עם סטיית תקן ±. NFL, INL, ONL ו- ELM הם שכבת סיבי העצב, שכבה גרעינית פנימית, שכבה גרעינית חיצונית וממברנה מגבילה חיצונית, בהתאמה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: זלוף דם ברשתית לאחר tBCCAO. תמונות הרכבה שטוחה ברשתית נציג (עם הגדלה גבוהה יותר של כל תמונה) לאחר 2 דקות של זרימת FITC-dextran וניתוחים כמותיים הראו כי זלוף מלא היה נצפה בשתי הרשתיות בעכברים המופעלים על ידי תרמית ואת הרשתית השמאלית בעכברים המופעלים tBCCAO. עם זאת, הרשתית הימנית בעכברים המופעלים על ידי tBCCAO הראתה זלוף דם חלקי. הנתונים נותחו באמצעות מבחן tשל סטודנט והוצגו כאכזריים עם סטייה ± תקנית. L ו- R לעמוד על הרשתית הימנית והשמאלית, בהתאמה. פסים בקנה מידה הם 800 ו 400 מיקרומטר, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

איור משלים 2: ביטויים של גנים מגיבים היפוקסיה לאחר tBCCAO. ניתוחים כמותיים הראו עלייה חולפת בביטוי Bnip3 mRNA ברשתית הימנית עם מובהקות סטטיסטית 12 שעות לאחר tBCCAO. ביטוי Epo mRNA הראה נטייה גוברת ברשתית הימנית במשך 24 שעות לאחר tBCCAO, אם כי ערכיה לא היו שונים באופן משמעותי בהשוואה לרשתית הימנית המופעלת על ידי זיוף. **P < 0.01. הנתונים נותחו באמצעות מבחן tשל סטודנט והוצגו כאכזריים עם סטייה ± תקנית. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

איור משלים 3: פונקציה חזותית בעין שמאל לאחר tBCCAO. ניתוחים כמותיים הראו כי לא חל שינוי במשרעת של גלי a ו- b בעין שמאל (sham: n = 5, tBCCAO: n = 6). P > 0.05. הנתונים נותחו באמצעות מבחן tשל סטודנט והוצגו כאכזריים עם סטייה ± תקנית. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

איור משלים 4: שיעורי ההישרדות לאחר tBCCAO ב- C57BL6 וב- BALB. עקומות ההישרדות קפלן-מאייר הראו כי כמעט כל העכברים מתו בתוך 3 ימים לאחר tBCCAO בעכברים C57BL6. כשמדובר עכברי BALB, זמן הידוק ארוך יותר tBCCAO גורם למוות פתאומי וחמור של בעלי חיים (שיעורי ההישרדות ביום 7, 20 שניות: 10%, 10 שניות: 20%, 2 שניות: 81%, ו 0 שניות: 95%). אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

איור משלים 5: ייצוב HIF-1α לאחר CCAO חד צדדי. כשל חיסוני מייצג וניתוח כמותי (sham: n = 3, חד צדדי CCAO: n = 3) עבור HIF-1α ו- β-Actin הראה כי HIF-1α לא התייצב ברשתית 3 שעות לאחר CCAO חד צדדי. P > 0.05. הנתונים נותחו באמצעות מבחן tשל סטודנט והוצגו כאכזריים עם סטייה ± תקנית. L ו- R לעמוד על הרשתית הימנית והשמאלית, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

איור משלים 6: ריר עפעפיים חמור לאחר tBCCAO עם זמן הידוק ארוך. 10 שניות של tBCCAO גרמו להזיל ריר עפעפיים חמור, אשר הוערך בסולם דירוג של 4 נקודות: 1 = ללא צניחה, 2 = צניחה קלה (~ 50%), 3 = ריר חמור (מעל 50%), ו - 4 = ריר חמור עם הפרשות עיניים, כמתואר באיור 2. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במחקר, הראינו כי tBCCAO, באמצעות תפרים פשוטים מהדק, יכול לגרום איסכמיה רשתית נלווית תפקוד הרשתית. יתר על כן, הוכחנו את הפרוטוקול הנוכחי שלנו לפיתוח מודל עכבר של איסכמיה רשתית קל ומהיר יותר בהשוואה לפרוטוקולים קודמים אחרים לפיתוח מודלים של פגיעה איסכמית ברשתית2,3,7.

מבחינה אנטומית, העורקים המוחיים השמאליים והימניים יכולים להיות מחוברים באמצעות עורקים מתקשרים אחוריים (PCAs) המספקים מחזור בטחונות במעגל ויליס כדי לשמור על אספקת דם נאותה למערכת העצבים המרכזית מפני הפרעה לזרימה מן החסימות או היצרות של כלי בודדים24,25 ( איור1). לי ואח '. הפגינו זלוף דם ברשתית יכול להיות 10 דקות מתעכב (וזה לא מצור שלם של זלוף דם ברשתית ipsilateral) על ידי CCAO חד צדדי קבוע ב C57BL6 עכברים13. משמעות הדבר היא כי אינדוקציה של איסכמיה רשתית על ידי CCAO קשורה קשר הדוק עם תנאים של מחזור בטחונות במעגל של ויליס. C57BL6 ידוע להיות זן העכבר הרגישים ביותר איסכמיה מוחית על ידי BCCAO בין שבעה זנים העכבר כולל זן העכבר של המחקר הנוכחי שלנו BALB26. בשל המעגל הלא שלם של ויליס ב C57BL6, הפרעה של אספקת הדם במוח משני CCAs גורם נזקים חמורים במערכת העצבים המרכזית, סוף סוף מוביל למוות. בנוסף, במחקר הראשוני שלנו, לא הצלחנו לגרום tBCCAO ב C57BL6 כמו כמעט כל העכברים (כ 80%) נפטר בתוך 3 ימים לאחר הניתוח (איור משלים 4). לכן, החלנו tBCCAO על עכבר אחר זן BALB למחקר הנוכחי שלנו.

כדי לגרום לפציעות איסכמיות רשתית חריפות במודל BALB שלנו, CCA הימני היה קשור לצמיתות ואת CCA השמאלי הוחל כדי להגביר את הלחץ איסכמי רשתית חריפה באמצעות חסימה חולפת. הסיבה לכך היא כי עכברים לא יכלו לסבול מתח איסכמי המושרה על ידי BCCAO קבוע שלא כמו חולדות שיש להם את המעגל השלם של ויליס27. לאחר מכן, ניסינו לייעל את זמן החסימה: CCAO שמאל (0-20 שניות), כמו זמן חסימה נחשב לאחד הגורמים העיקריים המשפיעים על פציעות איסכמיות למערכת העצבים המרכזית ומתחבר ישירות עם שיעורי ההישרדות של מודלים ניסיוניים28,29. מצאנו ששיעורי ההישרדות של עכברי BALB ירדו באופן תלוי זמן חסימה(איור משלים 4). חסימה של CCA השמאלי מעל 10 שניות הראה שיעורי תמותה גבוהים יותר באופן חמור (מעל 50%), בעוד חסימה של CCA השמאלי במשך 2 שניות או ללא חסימה (או CCAO חד צדדי) הראה שיעורי הישרדות גבוהים יחסית (מעל 80%). לכן, לא כללנו את הקבוצות (של זמן חסימה שהוא 10 ו -20 שניות) לניסויים נוספים כמו ניסויים יעילים וחסכוניים לא יכול להיות זמין. לאחר מכן, בדקנו אם חסימה של CCA השמאלי למשך 2 שניות או ללא חסימה (או CCAO חד צדדית) יכולה לגרום להיפוקסיה ברשתית. HIF-1α הוא וסת מרכזי המתפקד בתגובות היפוקסיות ומיוצב בתנאים היפוקסיים30. בהקשר זה, ייצוב HIF-1α שימש כסמן ביולוגי מולקולרי כללי להיפוקסיה. לא הצלחנו לזהות ייצוב HIF-1α ברשתית בקבוצה של CCAO חד צדדי(איור משלים 5). באופן מעניין, נוכל לזהות ייצוב HIF-1α בקבוצה של 2 שניות של tBCCAO(איור 3). זה מרמז על מתח היפוקסי ברשתית יכול להיגרם על ידי 2 שניות של tBCCAO בעכברי BALB. לכן, 2 שניות של זמן הידוק נבחרו סוף סוף למחקר שלנו בהתבסס על שיעורי הישרדות גבוהים לאחר הניתוח אינדוקציה של איסכמיה ברשתית באמצעות ייצוב HIF-1α.

למרות שה-CCA הימני היה סגור לצמיתות בעכברים המופעלים על ידי tBCCAO, זלוף הדם זוהה חלקית ברשתית הימנית 2 דקות לאחר זרימת הדם המערכתית של FITC-dextran (איור משלים 1). יתר על כן, מצאנו כי שינוי בייצוב HIF-1α לא זוהה ברשתית הימנית בעכברי BALB חד צדדיים המופעלים על ידי CCAO. תופעה זו יכולה להיות מוסברת על ידי השפעות של זרימת בטחונות דרך המעגל של ויליס כדי לשמור על אספקת הדם לרשתית (איור 1). למרות שלא הצלחנו להבין בבירור את ההשפעות של CCAO חולף שמאל על זלוף הדם לרשתית הימנית, CCAO שמאל חולף יחד עם CCAO ימין קבוע עשוי להגביר עלבונות היפוקסיים חריפים ברשתית הימנית כפי שמעיד שינוי משמעותי בביטוי HIF-1α ברשתית הימנית לאחר tBCCAO (איור 3). בנוסף, שיעורי ההישרדות של עכברים היו תלויים בזמן החסימה של CCA השמאלי. יחד, את עוצמת הלחץ איסכמי ברשתית יכול להיות נשלט באמצעות CCAO שמאל.

פנוטיפ של עפעף רפוי הוצע כסימן מציג או סימפטום פתופיזיולוגי של מצבים נוירולוגיים חמורים, במיוחד שבץ איסכמי31,32. השריר המשויך עפעף רפוי הוא levator palpebrae superioris33. שריר זה מסופק על ידי עורק palpebral לרוחב שהוא אחד הענפים הנגזרים OpA. לפיכך, כאשר OpA, המספק את הרשתית, מושפע, ריר עפעפיים ניתן לראות. ריר עפעפיים נצפתה בדגמי העכבר MCAO34, אשר שוחזר גם במודל tBCCAO שלנו. יתר על כן, תיארנו כי ריר עפעפיים הופך חמור כאשר זמן החסימה של CCA השמאלי לוקח יותר זמן (איור 2 ואיור משלים 6). משמעות הדבר היא כי חומרת העפעף נופל (בעקיפין המכונה עוצמת הלחץ איסכמי ברשתית) יכול להיות תלוי בזמן חסימה של CCA שמאל.

תפקוד רשתית היא אחת התוצאות לראות רטינופתיות איסכמי ברשתית כולל היצרות של BCCA בעכברים35 ו BCCAO בחולדות36. מצאנו כי משרעת של b-wave ירד בעכברים המופעלים tBCCAO. מספר מחקרים קודמים הראו כי MCAO גם גרם לירידה משרעת של b-wave לאחר הניתוח37,38. גל b משקף מצב פיזיולוגי של תאים בשכבות הפנימיות ברשתית, כולל תאים דו קוטביים ותאי מולר39. יתר על כן, גליוזיס תגובתי על ידי תאי מולר זוהה בשכבת הרשתית הפנימית לאחר tBCCAO. תוצאה זו משוחזרת גם בדגמי MCAO40,41 ודגמי CCAO אחרים13,42. נלקח יחד, זה מרמז כי תפקוד הרשתית הפנימית יכול להיגרם על ידי tBCCAO. עובי הרשתית דווחה כדי להגדיל באופן ארעי איסכמיה רשתית חריפה43,44. אנחנו גם לשכפל ממצא זה בעכברים המופעלים tBCCAO. נתונים אלה מראים כי הפגיעה במחזור הדם על ידי tBCCAO יכול להגיע הרשתית ולבסוף להשפיע על שכבות הרשתית.

לקבלת תוצאות עקביות, זמן הרדמה ואורך של הליכים כירורגיים, כמו גם גורמים אחרים כגון משקולות וגילאים של מודלים ניסיוניים ואת טמפרטורות הגוף שלהם במהלך ואחרי הניתוח צריך להיות מתוקנן45. במיוחד, תשומת לב נדרשת כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של עכברים לאורך כל תקופת התצפית הניסיונית. הסיבה לכך היא כי היפותרמיה יכולה להיות השפעה תנאי מראש להפריע השפעות איסכמיות על ידי tBCCAO46. למרות שלא הצלחנו למדוד את טמפרטורת הגוף המדויקת של העכברים בניסויים שלנו, השתמשנו ברפידות חימום כדי לחמם את העכברים עד שהעכברים חזרו להכרה מספקת. יתר על כן, השווינו את העכברים המופעלים על ידי tBCCAO עם העכברים המופעלים על ידי זיוף כדי לשלוט בהשפעות מבלבלות פוטנציאליות של גורמים בלתי נשלטים.

זני עכבר יכול להיות גורם משתנה חשוב נוסף כדי לגרום פגיעה איסכמית ברשתית על ידי tBCCAO. וריאציה משמעותית של המעגל של ויליס זנים העכבר יכול לגרום הפחתה לא רצויה או אינדוקציה של איסכמיה מוחית כולל ishcemia רשתית47 ובכך יכול להוביל שונות של התוצאות. התאמה של זמן הידוק מומלץ עבור רטינופתיה איסכמית הנגרמת על ידי tBCCAO מוצלחת כאשר זנים אחרים של עכברים נדרשים להיות מיושמים.

באופן כללי, מקרים של שבץ או פגיעות מוחיות אחרות מלווים תמיד עם אובדן ויזונים זמני או קבוע48. עד כה, מודל העכבר MCAO נמצא בשימוש נרחב למחקרי שבץ. כמו OpA מקורו קרוב למקור של MCA, כל מכשול בזרימת הדם ב MCA חוסם את הזרימה לרשתית. איסכמיה רשתית הודגמה לראשונה בחולדות על ידי MCAO37. מאוחר יותר, אותו מודל איסכמי ברשתית הוחל על עכברים49. עם זאת, עבור ההליך, חסימה לוקח יותר מ 60 דקות ומציאת אתר חסימה קשה מאוד כמו MCA קבור עמוק בתוך המוח. יתר על כן, גודל חוט ואורך החדרה עבור MCAO מאוד מחליט על ההצלחה של הניתוח. גורמים משתנים נוספים אלה גורמים למגוון התוצאות האיסכמיות לאחר הניתוח. למרות שיש צורך במחקרי השוואה ישירה בין tBCCAO ל- MCAO, תיארנו את התכונות המועילות של המודלים הניסיוניים שלנו במחקר זה: זמן חסימה קצר, הליך ניסיוני פשוט ואתרי חסימה נגישים ביותר. מודל זה עשוי לפתור את החששות שנראו בדגמי MCAO.

בעוד השימוש במודל העכבר של איסכמיה ברשתית יש יתרונות גדולים ללימוד פגיעה איסכמית ברשתית, יש עדיין מגבלות לגישה זו. מאז חתך כירורגי לתוך הצוואר, הפרדת בלוטות הרוק ואת החסימה ב CCA הנכון עם תפרים יש להחיל על ההליך, שיבושים הרקמה הנלווית יכול לעורר דלקת הקשורים באופן מערכתי או לפחות מקומי. חששות אלה טופלו חלקית באמצעות עכברים המופעלים על ידי זיוף, שבו כל הצעדים הכירורגיים מתבצעים ללא tBCCAO. בעיה נוספת היא דרישה לניהול כאב המתרחש במהלך הניתוח ולאחרו. במחקר שלנו, ניהול כאב כדי למנוע סבל של העכברים יושם באמצעות הזרקה של פתרון טרטרט butorphanol, משכך כאבים אגוניסט-אנטגוניסט אופיואידים נגזר סינתטי של סדרת phenanthrene. זה יכול להיות חשוב להיות מודע כי השימוש בסוגים שונים של הרדמה ומשככי כאבים יכול לשבש את ההשפעות של tBCCAO על איסכמיה ברשתית. מגבלה נוספת לגישה זו (יחד עם הגישות של מודלים אחרים המשמשים כיום) היא שהיא אינה מספקת סימולציה מושלמת של פתולוגיות הקשורות להפרעות רשתית קרדיווסקולריות אנושיות. עד כה, מודלים של עכבר המשמשים לניסויים כאלה אינם סובלים מתחלואה משותפת העומדת בבסיס רטינופתיות איסכמיות בבני אדם, בעיקר עם תסמונת מטבולית כגון סוכרת50. סיבוכים כאלה שאינם קיימים במודלים הנוכחיים של העכבר יכולים להיות השפעות סינרגטיות שליליות על המסלולים הפתולוגיים להתפתחות רטינופתיות איסכמיות. לכן, יש לקחת זאת בחשבון בעת פירוש התוצאות של המודלים הניסיוניים הנמצאים בשימוש כיום, כולל מודל העכבר tBCCAO שלנו. כדי להבין טוב יותר מנגנונים פתופיזיולוגיים של רטינופתיות איסכמי בבני אדם, המודל שלנו יכול להיות משולב עם גורמים פתולוגיים אחרים כגון הזרקת סטרפטוזוטוצין51 או תוספת דיאטה עתירת שומן52 להתפתחות רטינופתיה סוכרתית איסכמית. לבסוף, למרות שהראינו זלוף דם ברשתית מופחת בעכברים המופעלים על ידי tBCCAO, לא יכולנו להבין בבירור את ההשפעות של CCAO חולף שמאל על זלוף הדם לרשתית הימנית. עניין זה יכול להיות מטופל באמצעות לייזר דופלר אשר משמש בדרך כלל כדי לאשר כי חסימה התרחשה איסכמיה התרחשה vivo בזמן אמת53,54. טכניקה זו יכולה להיות מנוצלת להבנה טובה יותר של איסכמיה ברשתית בעכבר המופעל על ידי tBCCAO בודדים, לגבי זרימת הערבות במעגל ויליס.

למרות מגבלות אלה, שיטת tBCCAO שלנו המתוארת כאן מייצגת גישה יעילה לייצור איסכמיה ברשתית בעכברים. לימוד שינויים ברשתית על ידי tBCCAO מסייע לפענח מנגנונים פתולוגיים של רטינופתיות איסכמי בבני אדם. יתר על כן, אנו מקווים כי מודל העכבר tBCCAO יכול לשמש הקרנת סמים vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים בסיוע למחקר מדעי (KAKENHI) (18K09424 כדי Toshihide Kurihara ו 20K18393 כדי Yukihiro Miwa) ממשרד החינוך, תרבות, ספורט, מדע וטכנולוגיה (MEXT).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atipamezole hydrochloride Zenoaq Antisedan For anti-anesthesia
Applied Biosystems 7500 Fast Applied Biosystems - For qPCR
Butorphanol tartrate Meiji Seika Pharma Vetorphale For anesthesia
BZ-II Analyzer KEYENCE - For an image merge
BALB/cAJc1 CLEA - Mouse strain
β-Actin (8H10D10) Mouse mAb CST 3700 For western blot
Clamp Forcep World Precision Instruments WPI 500451 For surgery
Dumont forceps #5 Fine Science Tools 11251-10 For surgery
DAPI solution Dojindo 340-07971 For IHC
Envisu SD-OCT system Leica R4310 For OCT
FITC-dextran Merk FD2000S For retinal blood perfusion
Fluorescence microscope KEYENCE BZ-9000 For fluorescence detection
Gatifloxacin hydrate Senju Pharmaceutical Gachifuro For anti-bacterial infection
GFAP Monoclonal Antibody (2.2B10) Thermo 13-0300 For IHC
Heating pad Marukan RH-200 For surgery
HIF-1α (D1S7W) XP Rabbit mAb CST 36169 For western blot
ImageQuant LAS 4000 mini GE Healthcare - For chemiluminescence
Midazolam Sandoz K.K SANDOZ For anesthesia
Microtome Tissue-Tek TEC 6 Sakura - For sectioning
Medetomidine Orion Corporation Domitor For anesthesia
Needle holder Handaya HS-2307 For surgery
PuREC MAYO Corporation - For ERG
Scissor Fine Science Tools 91460-11 For surgery
Sodium hyaluronate Santen Pharmaceutical Hyalein For eye lubrication
Tropicamide/Penylephrine hydrochloride Santen Pharmaceutical Mydrin-P For mydriasis
6-0 silk suture Natsume E12-60N2 For surgery

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, B. Ocular effects of changes in oxygen and carbon dioxide tension. Transactions of the American Ophthalmological Society. 66, 423-474 (1968).
  2. Ingberg, E., Dock, H., Theodorsson, E., Theodorsson, A., Ström, J. O. Method parameters' impact on mortality and variability in mouse stroke experiments: a meta-analysis. Scientific Reports. 6 (1), 21086 (2016).
  3. Atochin, D. N., Clark, J., Demchenko, I. T., Moskowitz, M. A., Huang, P. L. Rapid Cerebral Ischemic Preconditioning in Mice Deficient in Endothelial and Neuronal Nitric Oxide Synthases. Stroke. 34 (5), 1299-1303 (2003).
  4. Allen, R. S., et al. Severity of middle cerebral artery occlusion determines retinal deficits in rats. Experimental Neurology. 254, 206-215 (2014).
  5. Steele, E. C., Guo, Q., Namura, S. Filamentous Middle Cerebral Artery Occlusion Causes Ischemic Damage to the Retina in Mice. Stroke. 39 (7), 2099-2104 (2008).
  6. Minhas, G., Morishita, R., Anand, A. Preclinical models to investigate retinal ischemia: advances and drawbacks. Frontiers in Neurology. 3, 75 (2012).
  7. McColl, B. W., Carswell, H. V., McCulloch, J., Horsburgh, K. Extension of cerebral hypoperfusion and ischaemic pathology beyond MCA territory after intraluminal filament occlusion in C57Bl/6J mice. Brain Res. 997 (1), 15-23 (2004).
  8. Jiang, A. X., et al. Inducement and Evaluation of a Murine Model of Experimental Myopia. Journal of Visualized Experiments. (143), e58822 (2019).
  9. Miwa, Y., et al. Pharmacological HIF inhibition prevents retinal neovascularization with improved visual function in a murine oxygen-induced retinopathy model. Neurochemistry International. 128, 21-31 (2019).
  10. Adams, S., Pacharinsak, C. Mouse Anesthesia and Analgesia. Current Protocols in Mouse Biology. 5 (1), 51-63 (2015).
  11. Speetzen, L. J., Endres, M., Kunz, A. Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia. Journal of Visualized Experiments. (75), e4387 (2013).
  12. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments. (47), e2423 (2011).
  13. Lee, D., Kang, H., Yoon, K. Y., Chang, Y. Y., Song, H. B. A mouse model of retinal hypoperfusion injury induced by unilateral common carotid artery occlusion. Experimental Eye Research. 201, 108275 (2020).
  14. Li, S., et al. Retro-orbital injection of FITC-dextran is an effective and economical method for observing mouse retinal vessels. Molecular Vision. 17, 3566-3573 (2011).
  15. Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo. Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).
  16. Lee, D., et al. A Fairy Chemical Suppresses Retinal Angiogenesis as a HIF Inhibitor. Biomolecules. 10 (10), (2020).
  17. Tomita, Y., et al. Pemafibrate Prevents Retinal Pathological Neovascularization by Increasing FGF21 Level in a Murine Oxygen-Induced Retinopathy Model. International Journal of Molecular Sciences. 20 (23), 5878 (2019).
  18. Yamamoto, H., Schmidt-Kastner, R., Hamasaki, D. I., Yamamoto, H., Parel, J. M. Complex neurodegeneration in retina following moderate ischemia induced by bilateral common carotid artery occlusion in Wistar rats. Experimental Eye Research. 82 (5), 767-779 (2006).
  19. Cheng, L., Yu, H., Yan, N., Lai, K., Xiang, M. Hypoxia-Inducible Factor-1α Target Genes Contribute to Retinal Neuroprotection. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 20 (2017).
  20. Mole, D. R., et al. Genome-wide association of hypoxia-inducible factor (HIF)-1alpha and HIF-2alpha DNA binding with expression profiling of hypoxia-inducible transcripts. The Journal of Biological Chemistry. 284 (25), 16767-16775 (2009).
  21. Majmundar, A. J., Wong, W. J., Simon, M. C. Hypoxia-Inducible Factors and the Response to Hypoxic Stress. Molecular Cell. 40 (2), 294-309 (2010).
  22. Newman, E. A. Glial cell regulation of neuronal activity and blood flow in the retina by release of gliotransmitters. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370 (1672), (2015).
  23. Vecino, E., Rodriguez, F. D., Ruzafa, N., Pereiro, X., Sharma, S. C. Glia-neuron interactions in the mammalian retina. Progress in Retinal and Eye Research. 51, 1-40 (2016).
  24. Symonds, C. The Circle of Willis. British Medical Journal. 1 (4906), 119 (1955).
  25. Lo, W. B., Ellis, H. The circle before willis: a historical account of the intracranial anastomosis. Neurosurgery. 66 (1), 7-18 (2010).
  26. Yang, G., et al. C57BL/6 strain is most susceptible to cerebral ischemia following bilateral common carotid occlusion among seven mouse strains: selective neuronal death in the murine transient forebrain ischemia. Brain Research. 752 (1), 209-218 (1997).
  27. Farkas, E., Luiten, P. G. M., Bari, F. Permanent, bilateral common carotid artery occlusion in the rat: A model for chronic cerebral hypoperfusion-related neurodegenerative diseases. Brain Research Reviews. 54 (1), 162-180 (2007).
  28. Morris, G. P., et al. A Comparative Study of Variables Influencing Ischemic Injury in the Longa and Koizumi Methods of Intraluminal Filament Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice. PLOS ONE. 11 (2), 0148503 (2016).
  29. Tsuchiya, D., Hong, S., Kayama, T., Panter, S. S., Weinstein, P. R. Effect of suture size and carotid clip application upon blood flow and infarct volume after permanent and temporary middle cerebral artery occlusion in mice. Brain Research. 970 (1-2), 131-139 (2003).
  30. Kaelin, W. G., Ratcliffe, P. J. Oxygen Sensing by Metazoans: The Central Role of the HIF Hydroxylase Pathway. Molecular Cell. 30 (4), 393-402 (2008).
  31. Pauly, M., Sruthi, R. Ptosis: evaluation and management. Kerala Journal of Ophthalmolgy. 31 (1), 11-16 (2019).
  32. Averbuch-Heller, L., Leigh, R. J., Mermelstein, V., Zagalsky, L., Streifler, J. Y. Ptosis in patients with hemispheric strokes. Neurology. 58 (4), 620 (2002).
  33. Dutton, J. Atlas of clinical and surgical orbital anatomy, second edition. 113, 1364 (2011).
  34. Ritzel, R. M., et al. Early retinal inflammatory biomarkers in the middle cerebral artery occlusion model of ischemic stroke. Molecular Vision. 22, 575-588 (2016).
  35. Crespo-Garcia, S., et al. Individual and temporal variability of the retina after chronic bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO). PLOS ONE. 13 (3), 0193961 (2018).
  36. Qin, Y., et al. Functional and morphologic study of retinal hypoperfusion injury induced by bilateral common carotid artery occlusion in rats. Scientific Reports. 9 (1), 80 (2019).
  37. Block, F., Grommes, C., Kosinski, C., Schmidt, W., Schwarz, M. Retinal ischemia induced by the intraluminal suture method in rats. Neuroscience Letters. 232 (1), 45-48 (1997).
  38. Allen, R. S., et al. Progesterone Treatment in Two Rat Models of Ocular Ischemia. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (5), 2880-2891 (2015).
  39. Miller, R. F., Dowling, J. E. Intracellular responses of the Müller (glial) cells of mudpuppy retina: their relation to b-wave of the electroretinogram. Journal of Neurophysiology. 33 (3), 323-341 (1970).
  40. Block, F., Grommes, C., Kosinski, C., Schmidt, W., Schwarz, M. Retinal ischemia induced by the intraluminal suture method in rats. Neuroscience Letters. 232 (1), 45-48 (1997).
  41. Lee, J. H., Shin, J. M., Shin, Y. J., Chun, M. H., Oh, S. J. Immunochemical changes of calbindin, calretinin and SMI32 in ischemic retinas induced by increase of intraocular pressure and by middle cerebral artery occlusion. Anatomy & Cell Biology. 44 (1), 25-34 (2011).
  42. Li, S. Y., et al. Lycium barbarum polysaccharides reduce neuronal damage, blood-retinal barrier disruption and oxidative stress in retinal ischemia/reperfusion injury. PLOS ONE. 6 (1), 16380 (2011).
  43. Furashova, O., Matthé, E. Retinal Changes in Different Grades of Retinal Artery Occlusion: An Optical Coherence Tomography Study. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (12), 5209-5216 (2017).
  44. Zadeh, J. K., et al. Short-Time Ocular Ischemia Induces Vascular Endothelial Dysfunction and Ganglion Cell Loss in the Pig Retina. International Journal of Molecular Sciences. 20 (19), (2019).
  45. Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. Rodent stroke model guidelines for preclinical stroke trials (1st edition). Journal of Experimental Stroke & Translational Medicine. 2 (2), 2-27 (2009).
  46. Tang, Y., et al. Hypothermia-induced ischemic tolerance is associated with Drp1 inhibition in cerebral ischemia-reperfusion injury of mice. Brain Research. 1646, 73-83 (2016).
  47. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 13 (4), 683-692 (1993).
  48. Pula, J. H., Yuen, C. A. Eyes and stroke: the visual aspects of cerebrovascular disease. Stroke and Vascular Neurology. 2 (4), 210 (2017).
  49. Steele, E. C., Guo, Q., Namura, S. Filamentous middle cerebral artery occlusion causes ischemic damage to the retina in mice. Stroke. 39 (7), 2099-2104 (2008).
  50. Sim, D. A., et al. The Effects of Macular Ischemia on Visual Acuity in Diabetic Retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 2353-2360 (2013).
  51. Wu, K. K., Huan, Y. Streptozotocin-induced diabetic models in mice and rats. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 5, Unit 5.47 (2008).
  52. Mubarak, A., Hodgson, J. M., Considine, M. J., Croft, K. D., Matthews, V. B. Supplementation of a high-fat diet with chlorogenic acid is associated with insulin resistance and hepatic lipid accumulation in mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61 (18), 4371-4378 (2013).
  53. Ansari, S., Azari, H., McConnell, D. J., Afzal, A., Mocco, J. Intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke with laser doppler flowmetry guidance in mice. Journal of Visualized Experiments. (51), e2879 (2011).
  54. Hedna, V. S., et al. Validity of Laser Doppler Flowmetry in Predicting Outcome in Murine Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion Stroke. Journal of Vascular and Interventional Neurology. 8 (3), 74-82 (2015).

Tags

רפואה גיליון 165 חסימת עורקים ראשיים אלקטרורטינוגרפיה מודלים ניסיוניים היפוקסיה איסכמיה טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית רשתית רפרופוזיה
דגם מורין של פגיעה איסכמית ברשתית הנגרמת על ידי חסימת עורקים דו-צדדית משותפת חולפת
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, D., Miwa, Y., Jeong, H., Ikeda, … More

Lee, D., Miwa, Y., Jeong, H., Ikeda, S. i., Katada, Y., Tsubota, K., Kurihara, T. A Murine Model of Ischemic Retinal Injury Induced by Transient Bilateral Common Carotid Artery Occlusion. J. Vis. Exp. (165), e61865, doi:10.3791/61865 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter