Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Een Murine-model van ischemisch netvliesletsel veroorzaakt door voorbijgaande bilaterale gemeenschappelijke halsslagader Occlusie

Published: November 12, 2020 doi: 10.3791/61865
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,4, 1,2
1Laboratory of Photobiology, Keio University School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, Keio University School of Medicine, 3Animal eye care, Tokyo Animal Eye Clinic, 4Tsubota Laboratory, Inc.
* These authors contributed equally

Summary

Hier beschrijven we een muismodel van retinale ischemie door voorbijgaande bilaterale gemeenschappelijke halsslagader occlusie met behulp van eenvoudige hechtingen en een klem. Dit model kan nuttig zijn voor het begrijpen van de pathologische mechanismen van retinale ischemie veroorzaakt door cardiovasculaire afwijkingen.

Abstract

Diverse vasculaire ziekten zoals diabetische retinopathie, occlusie van retinale aderen of slagaders en oculaire ischemische syndroom kunnen leiden tot retinale ischemie. Om pathologische mechanismen van retinale ischemie te onderzoeken, moeten relevante experimentele modellen worden ontwikkeld. Anatomisch gezien is een hoofdbloedtoevoervat van het netvlies de oogslagader (OpA) en opA komt voort uit de interne halsslagader van de gemeenschappelijke halsslagader (CCA). Verstoring van CCA kan dus effectief retinale ischemie veroorzaken. Hier hebben we een muismodel van retinale ischemie vastgesteld door voorbijgaande bilaterale gemeenschappelijke halsslagader occlusie (tBCCAO) om de juiste CCA te binden met 6-0 zijden hechtingen en om de linker CCA gedurende 2 seconden tijdelijk te sluiten via een klem, en toonden aan dat tBCCAO acute retinale ischemie kon veroorzaken die leidt tot netvliesdisfunctie. De huidige methode vermindert de afhankelijkheid van chirurgische instrumenten door alleen chirurgische naalden en een klem te gebruiken, verkort de occlusietijd om onverwachte diersterfte te minimaliseren, wat vaak wordt gezien in muismodellen van occlusie van de middelste hersenslagader, en behoudt de reproduceerbaarheid van veelvoorkomende retinale ischemische bevindingen. Het model kan worden gebruikt om de pathofysiologie van ischemische retinopathieën bij muizen te onderzoeken en verder kan worden gebruikt voor in vivo geneesmiddelenscreening.

Introduction

Het netvlies is een neurosensorisch weefsel voor visuele functie. Aangezien een aanzienlijke hoeveelheid zuurstof nodig is voor de visuele functie, staat het netvlies bekend als een van de hoogste zuurstofeisende weefsels in het lichaam1. Het netvlies is vatbaar voor vaatziekten omdat zuurstof via bloedvaten wordt geleverd. Verschillende soorten vasculaire ziekten, zoals diabetische retinopathie en retinale bloedvaten (aderen of slagaders) occlusie, kunnen retinale ischemie veroorzaken. Om pathologische mechanismen van retinale ischemie te onderzoeken, worden reproduceerbare en klinisch relevante experimentele modellen van retinale ischemie noodzakelijk geacht. Midden-cerebrale slagader occlusie (MCAO) door het inbrengen van een intraluminaal filament is de meest gebruikte methode voor de ontwikkeling van in vivo knaagdiermodellen van experimentele cerebrale ischemie2,3. Vanwege de nabijheid van de oogheelkundige slagader (OpA) tot MCA, worden MCAO-modellen ook tegelijkertijd gebruikt om de pathofysiologie van retinale ischemie4,5,6te begrijpen. Om cerebrale ischemie samen met retinale ischemie op te wekken, worden lange filamenten meestal ingebracht door incisie van de gemeenschappelijke halsslagader (CCA) of de externe halsslagader (ERK). Deze methoden zijn moeilijk uit te voeren, vereisen een lange tijd om de operatie te voltooien (meer dan 60 minuten voor één muis) en leiden tot hoge variabiliteiten in de resultaten na de operatie7. Het blijft belangrijk om een beter model te ontwikkelen om deze zorgen te verbeteren.

In deze studie gebruikten we eenvoudigweg korte voorbijgaande bilaterale CCA occlusie (tBCCAO) met naalden en een klem om retinale ischemie bij muizen op te wekken en analyseerden we typische resultaten van ischemische verwondingen in het netvlies. In deze video geven we een demonstratie van de tBCCAO-procedure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Keio University School of Medicine.

1. Voorbereiding van chirurgische instrumenten en dieren

  1. Autoclaaf chirurgische instrumenten en bewaar ze in 70% ethylalcohol. Maak vóór elke nieuwe chirurgische ingreep zorgvuldig chirurgische instrumenten schoon met 70% ethylalcohol.
  2. Bereid mannelijke BALB/cAJc1 muizen (6 weken oud, 26-28 kg) voor in een specifiek ziekteverwekkervrije (SPF) kamer om steriele omstandigheden te behouden voor, tijdens en na de operatie.

2. Voorbijgaande bilaterale gemeenschappelijke halsslagader occlusie (tBCCAO)

  1. Plaats een muis onder narcose via intraperitoneale injectie met een combinatie van midazolam (40 μg/100 μL), medetomidine (7,5 μg/100 μL) en butorphanoltartraat (50 μg/100 μL), "MMB" genoemd, zoals eerder beschreven8,9. Houd de rughuiden van de muis vast om te voorkomen dat de muis zijn ogen stoot totdat de muis volledig is verdoofd.
    1. Beoordeel de diepte van de anesthesie door de muisteen te knijpen totdat deze geen reactie heeft, waarvan de methode vaak wordt gebruikt voor het controleren van volledige anesthesie10.
      OPMERKING: Over het algemeen is minder dan 5 minuten nodig om muizen in slaap te laten vallen. Goede recepten voor algemene anesthesie kunnen per instelling verschillen.
  2. Breng één druppel van 0,1% gezuiverde natriumhyaluronate oogdruppeloplossing aan op de ogen om droogheid op de ogen onder narcose te voorkomen.
  3. Plaats de muis op zijn rug en bevestig de poten van de muis met plakband.
  4. Desinfecteer het nekgebied van de muis met 70% ethylalcohol vóór de operatie.
    OPMERKING: Extra knippen van de vacht werd niet uitgevoerd omdat dit daaropvolgende huidontsteking kan veroorzaken11,12.
  5. Voer sagittale incisie van de nek uit met een mes (figuur 1).
    OPMERKING: Er moet een incisie worden gemaakt op de middellijn tussen de nek, het borstbeen en de luchtpijp.
  6. Scheid beide speekselklieren zorgvuldig met behulp van twee tangen en mobiliseer ze om de onderliggende CCA's te visualiseren.
  7. Isoleer de juiste CCA zorgvuldig van de respectieve vagale zenuwen en bijbehorende aderen zonder hun structuren te beschadigen, en plaats twee 6-0 zijden hechtingen onder de CCA. Bind de twee banden stevig vast om de bloedstroom te blokkeren (figuur 1).
    OPMERKING: Tijdens de procedure kunnen kleine aderen beschadigd raken. Als er bloedingen worden waargenomen, is afvegen nodig om de CCA's duidelijk te visualiseren.
  8. Zoek de linker CCA voorzichtig van de respectievelijke vagale zenuwen en bijbehorende aderen zonder hun structuren te beschadigen, en sluit de linker CCA gedurende 2 seconden af met een klem (figuur 1).
    OPMERKING: Een 6-0 zijden hechtnaald moet onder de linker CCA worden geplaatst om een plaats voor klemmen te markeren.
  9. Na heropening van de linker CCA hechten hechtwonden van de nek door een 6-0 zijden hechting en brengen een slok antibioticum (50 μL) aan op de nek om bacteriële infectie te remmen.
    OPMERKING: Verwijder voorzichtig een klem om beschadiging van de slagaderlijke wand te voorkomen bij het heropenen van de linker CCA.
  10. Injecteer 0,75 mg/kg atipamezolehydrochloride intraperitoneaal aan de muis om de muis te helpen snel hersteld te worden van diepe anesthesie. Breng de muis terug naar een muizenkooi met voorverwarmde pads.
    OPMERKING: Laat de muis niet onbeheerd achter totdat de muis weer voldoende bij bewustzijn is om de strenge ligfiets te behouden.
  11. Injecteer 0,4 mg/kg butorphanoltartraat aan de muis voor de behandeling van pijn wanneer de muis wakker wordt.
    OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Als eerste hint voor succesvolle tBCCAO kan het hangen van het ooglid van de muis worden waargenomen (figuur 2).
  12. Injecteer voor euthanasie 3x MMB-mengsel aan de muizen en offer ze op voor experimenten.

3. Algemene waarnemingen (overlevingspercentages en hangend ooglid)

  1. Controleer na de operatie de overlevingskansen op alle doodsoorzaken op dag 0 (na de operatie), 1, 3 en 7.
  2. Beoordeel het hangen van het ooglid met een 4-punts beoordelingsschaal: 1 = geen hangende, 2 = milde hangende (~50%), 3 = ernstig hangen (meer dan 50%), en 4 = ernstig hangen met ooguitvloeiing.

4. Retinale bloedperfusie

  1. Injecteer 200 μL FITC-dextran (25 mg/ml) in de linkerventrikel van de muis, die vaak wordt gebruikt voor de observatie van bloedperfusie in de retinale vaten van de muis13,14.
  2. 2 minuten na circulatie, enucleate de ogen en fixeer in 4% paraformaldehyde gedurende 1 uur. Het netvlies werd zorgvuldig verkregen en vlak gemonteerd, zoals eerder beschreven15, en onderzocht via een fluorescentiemicroscoop.
  3. Maak foto's van de retinale hele mounts bij 4x vergroting en voeg samen in een single met behulp van een merge analyzer, eerder beschreven16.
  4. Meet de doordrenkte gebieden via een scheepsanalysetool in NIH Fiji/ImageJ-software.

5. Westelijke vlek

  1. 3 en 6 uur na tBCCAO, verkrijg de ogen van muizen en breng onmiddellijk over naar een Petrischaal met koude PBS om het netvlies te isoleren.
  2. Voer na isolatie van het netvlies western blotting uit, zoals eerder beschreven9.
  3. Incubeer met antilichamen voor hypoxie-induceerbare factor-1α (HIF-1α; een algemene hypoxiemarker) en voor β-Actin (een interne belastingsregeling) 's nachts gevolgd door incubatie van HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen. Visualiseer de signalen via chemiluminescentie.

6. Kwantitatieve PCR (qPCR)

  1. 6, 12 en 24 uur na tBCCAO, het verkregen netvlies verwerken voor qPCR, zoals eerder beschreven17.
  2. Voer qPCR uit via een real-time PCR-systeem. De gebruikte primers staan vermeld in tabel 1. Bereken vouwveranderingen tussen niveaus van verschillende transcripties volgens de ΔΔCT-methode.

7. Immunohistochemie (IHC)

  1. 3 dagen na tBCCAO, verkrijg de ogen van muizen en sluit in paraffine.
  2. Snijd de paraffine-ingebedde ogen door een microtome om de oogsecties te verkrijgen.
  3. De-paraffiniseren en beitsen van de oogsecties van 5 μm dikte zoals eerder beschreven13.
  4. Incubeer met een antilichaam voor gliafibrillair zuur eiwit (GFAP; een betrouwbare marker voor astrocyten en Müller-cellen in het netvlies) 's nachts gevolgd door incubatie van Alexa Fluor 555-geconjugeerd secundair antilichaam.
  5. Gebruik DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindole) voor het beitsen van de kern in het netvlies. Visualiseer signalen via een fluorescentiemicroscoop.
  6. Beoordeel de morfologiescore met een 4-punts ratingschaal, zoals eerder beschreven13,18: 0 = geen signaal, 1 = weinig positieve glia-eindvoeten in de ganglioncellaag (GCL), 2 = weinig gelabelde processen die van GCL tot de buitenste kernlaag (ONL) reiken, en 3 = de meest geëtiketteerde processen die van GCL tot ONL reiken.

8. Elektroretinografie (ERG)

  1. 3 en 7 dagen na tBCCAO, voer ERG uit met behulp van een Ganzfeld-koepel, acquisitiesysteem en LED-stimulatoren, zoals eerder beschreven9.
  2. Na donkere aanpassing 's nachts, verdoof muizen met een combinatie van MMB onder schemerig rood licht.
  3. Gebruik een gemengde oplossing van 0,5% tropicamide en 0,5% fenylephrine om de pupillen te verwijden.
  4. Plaats de actieve elektroden op de contactlens en plaats de referentieelektrode in de mond.
  5. Verkrijg ERG-reacties van beide ogen van elk dier.
  6. Leg scotopische reacties vast onder donkere aanpassing met verschillende stimuli.
  7. Meet de amplitudes van een golf van de basislijn tot het laagste punt van een golf.
  8. Meet de amplitudes van b-wave van het laagste punt van een golf tot de piek van b-wave.
  9. Houd alle muizen warm tijdens de procedure met behulp van warmtekussens.

9. Optische coherentietomografie (OCT)

  1. 2 weken na tBCCAO, voer OCT uit met behulp van SD-OCT-systeem, zoals eerder gemeld8,9.
  2. Voor de meting, onderwerpen muizen aan mydriasis door een gemengde oplossing van 0,5% tropicamide en 0,5% fenylephrine, en aan algemene anesthesie door een mengsel van MMB.
  3. Verkrijg B-scanafbeeldingen van equatoriale segmenten van en-face scans.
  4. Onderzoek het netvlies op 0,2, 0,4 en 0,6 mm van het oogzenuwhoofd.
  5. Meet de netvliesdikte van de retinale zenuwvezellaag (NFL) tot het externe beperkende membraan (ELM) en beschouw het gemiddelde van de gemeten waarden als netvliesdikte van een individuele muis.
  6. Plot de resultaten als spindiagrammen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Na systemische circulatie van FITC-dextran gedurende 2 minuten werden retinale vasculaturen van het linker- en rechtervlies in de schijnmuizen en tBCCAO-bediende muizen onderzocht (aanvullend figuur 1). FITC-dextran was volledig zichtbaar in beide netvliezen in de schijnmuizen en het linker netvlies in de tBCCAO-bediende muizen, terwijl het gedeeltelijk detecteerbaar was in het rechter netvlies in de tBCCAO-bediende muizen.

Na tBCCAO werd het hangen van het ooglid onderzocht (figuur 2). De rechterogen vertoonden mild (score 2; 75%) en ernstig ooglid (score 3 en 4; 25%) hangen, terwijl de linkerogen niet hangen (score 1; 93,75%) behalve één muis (score 2; 6,25%). Hoewel ernstig ooglid hangen met ooguitvloeiing niet aanzienlijk werd waargenomen bij de tBCCAO-geopereerde muizen, konden we één muis zien voor dit fenotype (score 4; 6,25%).

Verminderde zuurstofstatus in weefsels leidt tot stabilisatie van HIF-1α en inductie van een aantal hypoxie-responsieve genen zoals EPO, VEGF en BNIP319,20,21. Allereerst werd moleculaire biologische hypoxie met behulp van een algemene hypoxische marker HIF-1α geëvalueerd via western blotting (figuur 3). Verhoogde HIF-1α expressie werd significant waargenomen in het rechter netvlies 3 en 6 uur na tBCCAO. Vervolgens werden expressies van hypoxie-responsieve genen geëvalueerd via qPCR (Aanvullend figuur 2). Er was geen significante verandering in hypoxie-responsieve genexpressies 6 uur na tBCCAO. 12 uur na tBCCAO, vonden we Binp3 expressie aanzienlijk verhoogd en een lichte toename van Epo expressie werd getoond in het rechter netvlies. 24 uur na tBCCAO konden we ook een lichte toename van epo-expressie in het rechter netvlies vinden, hoewel het niet statistisch significant was. Vegf expressie werd niet gewijzigd van 6 naar 24 uur in de tBCCAO-bediende muizen.

Retinale reactieve gliosis werd 3 dagen na tBCCAO onderzocht (figuur 4), omdat glia zoals astrocyten en Müller-cellen nauw zijn geassocieerd met retinale ischemie22. GFAP is veel gebruikt voor detectie van astrocyten en Müller cellen in het netvlies23. Het gemiddelde van morfologische scores voor GFAP-etikettering in het rechter netvlies was het hoogst onder de beide netvliezen in de schijnmuizen en het linker netvlies in de tBCCAO-bediende muizen. Op basis van de lokalisatie van GFAP-expressie wordt een verandering in morfologie in GFAP-etikettering beschouwd als een weerspiegeling van de activering van Müller-cellen.

ERG werd gebruikt om netvliesdisfunctie na tBCCAO te onderzoeken (figuur 5). De amplitudes van b-wave in het rechteroog daalden dramatisch 3 en 7 dagen na tBCCAO. De amplitudes van een golf in het rechteroog werden echter niet significant veranderd. Als het gaat om het linkeroog, konden we geen veranderingen zien in de amplitudes van a- en b-golven (Aanvullend figuur 3).

We hebben OCT uitgevoerd om een verandering in netvliesdikte na tBCCAO te bepalen(figuur 6). De netvliesdikte in het rechteroog nam 2 weken na tBCCAO dramatisch toe, terwijl er geen verschil was in netvliesdikte in het linkeroog tussen de tBCCAO- en schijnmuizen.

Figure 1
Figuur 1: Schematisch van de modelprocedure en bloedcirculatie in de cirkel van Willis. Een schematische illustratie toonde de tBCCAO-geïnduceerde retinale ischemische muismodelprocedure en bloedcirculatie naar het netvlies. CCA, ERK, ICA, PCA en OpA vertegenwoordigen respectievelijk de gemeenschappelijke halsslagader, uitwendige halsslagader, interne halsslagader, posterieure communicerende slagader en oogslagader. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Oculliden hangend na tBCCAO. De ernst van het hangen van het ooglid werd beoordeeld aan de hand van 4-puntsbeoordeling op basis van de referentiebeelden: 1 = geen hangende, 2 = milde hangende (~50% hangende), 3 = ernstige hangende (meer dan 50% hangende) en 4 = ernstige hangende met ooguitvloeiing. Het hangen van het ooglid werd waargenomen na tBCCAO en het werd gehandhaafd tijdens de experimentele observatie. De resultaten (sham: n = 10, tBCCAO: n = 16) werden geplot als een scatter dot plot. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: HIF-1α stabilisatie na tBCCAO. Representatieve immunoblots en kwantitatieve analyses (groepen voor uur 3; sham: n = 3, tBCCAO: n = 6 en groepen voor uur 6; sham en tBCCAO: n = 6) voor HIF-1α en β-Actin toonden aan dat HIF-1α 3 en 6 uur na tBCCAO gestabiliseerd was in het rechter netvlies. *P < 0,05. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van student's t-test en gepresenteerd als gemiddeld met ±standaard afwijking. L en R staan respectievelijk voor het linker- en rechter netvlies. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Reactieve gliosis na tBCCAO. Representatieve sagittale delen van het netvlies (sham: n = 4, tBCCAO: n = 4) en kwantitatieve analyses van GFAP-etikettering (rood) door een morfologiescore (0–3) toonden aan dat GFAP-etikettering, meestal beperkt in NFL+GCL, werd uitgebreid tot de hele binnenlaag, van GCL tot ONL (witte pijlen) in het rechter netvlies na tBCCAO. Schaalbalken, 50 μm. DAPI (blauw) werd gebruikt voor het beitsen van de kern in het netvlies. NFL, GCL, IPL, INL en ONL vertegenwoordigen respectievelijk de zenuwvezellaag, ganglioncellaag, binnenste plexiforme laag, binnenste kernlaag en buitenste kernlaag. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van de t-testvan student en gepresenteerd als mediaan met interkwartielbereik, het 25e en 75e percentiel. *P < 0,05. L en R staan respectievelijk voor het linker- en rechter netvlies. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Visuele disfunctie in het rechteroog na tBCCAO. (A) Representatieve golfvormen van donker-aangepaste ERG uitgevoerd 3 en 7 dagen na tBCCAO. Stimulatie-intensiteit (cd.s/m2): 0,005. (B) Kwantitatieve analyses toonden aan dat er een afname was van de amplitudes van b-golf in het rechteroog (sham: n = 5, tBCCAO: n = 6) terwijl de amplitudes van een golf niet werden veranderd. *P < 0,05, **P < 0,01. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van student's t-test en gepresenteerd als gemiddeld met ±standaard afwijking. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Een verandering in netvliesdikte na tBCCAO. Representatieve OCT-beelden in het schijn- en tBCCAO-bediende netvlies en kwantitatieve analyses toonden aan dat er een toename van de netvliesdikte in het rechter netvlies was (sham: n = 4, tBCCAO: n = 8). Er was geen verandering in netvliesdikte in het linker netvlies (schijn: n = 4, tBCCAO: n = 8). Schaalbalken zijn respectievelijk 200 (boven) en 100 (onderste) μm. *P < 0,05. De waarden in de horizontale as van de diagrammen vertegenwoordigen 0,2, 0,4 en 0,6 mm afstand van de oogzenuwkop (0) die werd gedetecteerd door de groene lijn. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van tweerichtings-ANOVA gevolgd door een Bonferroni post-hoctest. Spindiagrammen werden gepresenteerd als gemiddeld met ± standaarddeviatie. NFL, INL, ONL en ELM zijn respectievelijk de zenuwvezellaag, de binnenste nucleaire laag, de buitenste nucleaire laag en het externe beperkende membraan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Retinale bloedperfusie na tBCCAO. Representatieve retinale flat mount beelden (met een hogere vergroting van elk beeld) na 2 min FITC-dextran circulatie en kwantitatieve analyses toonden aan dat volledige perfusie waarneembaar was in beide netvliezen in de schijnmuizen en het linker netvlies in de tBCCAO-bediende muizen. Het rechter netvlies in de door tBCCAO geopereerde muizen vertoonde echter gedeeltelijke bloedperfusie. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van student's t-test en gepresenteerd als gemiddeld met ±standaard afwijking. L en R staan respectievelijk voor het linker- en rechter netvlies. Schaalbalken zijn respectievelijk 800 en 400 μm. Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Expressies van hypoxie-responsieve genen na tBCCAO. Kwantitatieve analyses toonden een voorbijgaande toename van Bnip3 mRNA-expressie in het rechter netvlies met statistische significantie 12 uur na tBCCAO. Epo mRNA-expressie vertoonde een toenemende neiging in het rechter netvlies gedurende 24 uur na tBCCAO, hoewel de waarden ervan niet significant verschilden in vergelijking met het schijnbediende rechter netvlies. **P < 0,01. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van student's t-test en gepresenteerd als gemiddeld met ±standaard afwijking. Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Visuele functie in het linkeroog na tBCCAO. Kwantitatieve analyses toonden aan dat er geen verandering was in de amplitudes van a- en b-golven in het linkeroog (schijn: n = 5, tBCCAO: n = 6). P > 0,05. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van student's t-test en gepresenteerd als gemiddeld met ±standaard afwijking. Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Aanvullende figuur 4: Overlevingspercentages na tBCCAO in C57BL6 en BALB. Kaplan-Meier overlevingscurves toonden aan dat bijna alle muizen stierven binnen 3 dagen na tBCCAO bij C57BL6 muizen. Als het gaat om BALB-muizen, veroorzaakt langere klemtijd in tBCCAO plotselinge en ernstige dierensterfte (overlevingspercentages op dag 7, 20 sec: 10%, 10 sec: 20%, 2 sec: 81%, en 0 sec: 95%). Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Aanvullend figuur 5: HIF-1α stabilisatie na unilaterale CCAO. Een representatieve immunoblot en kwantitatieve analyse (sham: n = 3, unilaterale CCAO: n = 3) voor HIF-1α en β-Actin toonden aan dat HIF-1α 3 uur na unilaterale CCAO niet gestabiliseerd was in het netvlies. P > 0,05. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van student's t-test en gepresenteerd als gemiddeld met ±standaard afwijking. L en R staan respectievelijk voor het linker- en rechter netvlies. Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Aanvullende figuur 6: Ernstig ooglid hangend na tBCCAO met lange klemtijd. 10 seconden tBCCAO veroorzaakte ernstige hangende oogleden, die werd beoordeeld met een 4-punts ratingschaal: 1 = geen hangende, 2 = milde hangende (~50%), 3 = ernstige hangende (meer dan 50%), en 4 = ernstig hangen met ooguitvloeiing, zoals beschreven in figuur 2. Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In de studie hebben we aangetoond dat tBCCAO, met behulp van eenvoudige hechtingen en een klem, retinale ischemie en bijbehorende netvliesdisfunctie kan induceren. Bovendien hebben we aangetoond dat ons huidige protocol voor de ontwikkeling van een muismodel van retinale ischemie gemakkelijker en sneller is in vergelijking met andere eerdere protocollen voor de ontwikkeling van retinale ischemische letselmodellen2,3,7.

Anatomisch gezien kunnen de linker- en rechter hersenslagaders worden aangesloten via achterste communicerende slagaders (PPA's) die een bijkomende circulatie in de cirkel van Willis bieden om voldoende bloedtoevoer naar het centrale zenuwstelsel te behouden tegen stroomonderbreking door occlusies of stenose van individuele bloedvaten24,25 ( figuur1). Lee et al. toonden aan dat retinale bloedperfusie 10 minuten vertraagd kan zijn (wat geen volledige blokkade is van retinale bloedperfusie in het ipsilaterale netvlies) door permanente unilaterale CCAO bij C57BL6 muizen13. Dit houdt in dat inductie van retinale ischemie door CCAO nauw verbonden is met omstandigheden van collaterale circulatie in de cirkel van Willis. C57BL6 staat bekend als de meest gevoelige muisstam voor cerebrale ischemie door BCCAO onder zeven muisstammen, waaronder de huidige studie muisstam BALB26. Als gevolg van de onvolledige cirkel van Willis in C57BL6 veroorzaakt onderbreking van de hersenbloedtoevoer van beide CCA's ernstige schade in het centrale zenuwstelsel, wat uiteindelijk tot de dood leidt. Bovendien slaagden we er in ons vooronderzoek niet in om tBCCAO in C57BL6 op te wekken, omdat bijna alle muizen (ongeveer 80%) binnen 3 dagen na de operatie is overleden (aanvullend figuur 4). Daarom hebben we tBCCAO toegepast op een andere muisstam BALB voor onze huidige studie.

Om acute retinale ischemische verwondingen in ons BALB-model op te wekken, werd de rechter CCA permanent geligeerd en werd de linker CCA toegepast om acute retinale ischemische stress te stimuleren door voorbijgaande occlusie. Dit komt omdat muizen ischemische stress veroorzaakt door permanente BCCAO niet konden verdragen in tegenstelling tot ratten die de volledige cirkel van Willis27hebben. Vervolgens hebben we geprobeerd de occlusietijd te optimaliseren: links CCAO (0-20 seconden), omdat occlusietijd is beschouwd als een van de belangrijkste factoren die ischemische verwondingen aan het centrale zenuwstelsel beïnvloedt en rechtstreeks verband houdt met overlevingspercentages van experimentele modellen28,29. We ontdekten dat de overlevingskansen van BALB-muizen op een occlusietijdafhankelijke manier daalden (aanvullend figuur 4). Occlusie van de linker CCA gedurende 10 seconden vertoonde sterk hogere sterftecijfers (meer dan 50%), terwijl occlusie van de linker CCA gedurende 2 seconden of geen occlusie (of unilaterale CCAO) relatief hogere overlevingspercentages vertoonde (meer dan 80%). Daarom hebben we de groepen (van occlusietijd die 10 en 20 seconden is) uitgesloten voor de verdere experimenten, omdat efficiënte en kosteneffectieve experimenten niet beschikbaar kunnen zijn. Vervolgens onderzochten we of occlusie van de linker CCA gedurende 2 seconden of geen occlusie (of unilaterale CCAO) retinale hypoxie kon veroorzaken. HIF-1α is een belangrijke regelgever die functioneert in hypoxische reacties en wordt gestabiliseerd onder hypoxische omstandigheden30. In dit verband is HIF-1α stabilisatie gebruikt als een algemene moleculaire biologische marker voor hypoxie. We konden geen HIF-1α stabilisatie in het netvlies detecteren in de groep van unilaterale CCAO (Aanvullend Figuur 5). Interessant is dat we HIF-1α stabilisatie kunnen detecteren in de groep van 2 seconden tBCCAO (figuur 3). Dit impliceert dat retinale hypoxische stress kan worden veroorzaakt door 2 seconden tBCCAO bij BALB-muizen. Daarom werden uiteindelijk 2 seconden klemtijd geselecteerd voor onze studie op basis van hoge overlevingspercentages na de operatie en inductie van retinale ischemie via HIF-1α stabilisatie.

Hoewel de juiste CCA permanent werd afgesloten bij muizen die door tBCCAO werden geopereerd, werd 2 minuten na de systemische circulatie van FITC-dextran gedeeltelijk bloedperfusie in het rechter netvlies gedetecteerd (aanvullend figuur 1). Bovendien ontdekten we dat een verandering in HIF-1α stabilisatie niet werd gedetecteerd in het rechter netvlies in de unilaterale CCAO-bediende BALB-muizen. Dit fenomeen kan worden verklaard door effecten van de onderpandcirculatie door de cirkel van Willis om de bloedtoevoer naar het netvlies te behouden (figuur 1). Hoewel we de effecten van linker voorbijgaande CCAO op de bloedperfusie naar het rechter netvlies niet duidelijk konden begrijpen, kan voorbijgaande linker CCAO samen met permanente rechter CCAO acute hypoxische beledigingen in het rechter netvlies stimuleren, zoals blijkt uit een significante verandering in de HIF-1α-expressie in het rechter netvlies na tBCCAO (figuur 3). Bovendien waren de overlevingspercentages van muizen afhankelijk van de occlusietijd van de linker CCA. Tezamen kan de intensiteit van retinale ischemische stress worden gecontroleerd via linker CCAO.

Het fenotype van een hangend ooglid is voorgesteld als een presenterend teken of een pathologisch symptoom van ernstige neurologische aandoeningen, met name ischemische beroerte31,32. De spier geassocieerd met een hangend ooglid is levator palpebrae superioris33. Deze spier wordt geleverd door de laterale palpebrale slagader die een van de takken is afgeleid van OpA. Dus wanneer OpA, dat het netvlies levert, wordt aangetast, kan het hangen van het ooglid worden gezien. Het hangen van het ooglid werd waargenomen in MCAO muismodellen34, die ook in ons tBCCAO model werd gereproduceerd. Bovendien beschreven we dat het hangen van het ooglid ernstig wordt wanneer de occlusietijd van de linker CCA langer duurt (figuur 2 en aanvullend figuur 6). Dit houdt in dat de ernst van het hangen van het ooglid (indirect aangeduid als de intensiteit van retinale ischemische stress) afhankelijk kan zijn van de occlusietijd van de linker CCA.

Retinale dysfunctie is een van de resultaten die worden gezien bij retinale ischemische retinopathieën, waaronder stenose van BCCA bij muizen35 en BCCAO bij ratten36. We ontdekten dat de amplitudes van b-wave daalden in de tBCCAO-bediende muizen. Verschillende eerdere studies toonden aan dat MCAO ook een vermindering van de amplitude van b-wave veroorzaakte na de operatie37,38. b-golf weerspiegelt een fysiologische toestand van cellen in retinale binnenlagen, waaronder bipolaire cellen en Müller-cellen39. Bovendien werd reactieve gliosis door Müller-cellen gedetecteerd in de binnenste netvlieslaag na tBCCAO. Dit resultaat wordt ook gereproduceerd in MCAO-modellen40,41 en andere CCAO-modellen13,42. Alles bij elkaar genomen impliceert dit dat binnenste netvliesdisfunctie kan worden geïnduceerd door tBCCAO. Er is gemeld dat de dikte van het netvlies voorbijgaand toeneemt bij acute retinale ischemie43,44. We hebben deze bevinding ook gereproduceerd in de tBCCAO-bediende muizen. Deze gegevens tonen aan dat de aantasting van de bloedcirculatie door tBCCAO het netvlies kan bereiken en uiteindelijk de netvlieslagen kan beïnvloeden.

Voor consistente resultaten moeten de verdovingstijd en -lengte van chirurgische ingrepen, evenals andere factoren zoals gewichten en leeftijden van experimentele modellen en hun lichaamstemperatuur tijdens en na de operatie worden gestandaardiseerd45. In het bijzonder is aandacht nodig om de lichaamstemperatuur van muizen gedurende de experimentele observatieperiode te handhaven. Dit komt omdat onderkoeling een voorconditioneringseffect kan hebben en ischemische effecten door tBCCAO46kan verstoren . Hoewel we in onze experimenten de exacte lichaamstemperatuur van de muizen niet konden meten, gebruikten we verwarmingskussens om de muizen op te warmen totdat de muizen weer voldoende bij bewustzijn kwamen. Bovendien vergeleken we de tBCCAO-bediende muizen met de schijnmuizen om mogelijke verstorende effecten van oncontroleerbare factoren te beheersen.

Muizenstammen kunnen een extra belangrijke variabele factor zijn om netvlies ischemische letsel door tBCCAO op te wekken. Aanzienlijke variatie van de cirkel van Willis in muizenstammen kan leiden tot een ongewenste vermindering of inductie van cerebrale ischemie, waaronder retinale ishcemie47 en kan daardoor leiden tot variabiliteit van de resultaten. Aanpassing van de klemtijd wordt aanbevolen voor een succesvolle tBCCAO-geïnduceerde ischemische retinopathie wanneer andere muizenstammen moeten worden toegepast.

Over het algemeen gaan incidenten van beroerte of ander hersenletsel steevast gepaard met tijdelijk of permanent visonverlies48. Tot op heden wordt het MCAO-muismodel veel gebruikt voor beroertestudies. Aangezien OpA proximaal aan de oorsprong van MCA voortkomt, belemmert om het even welke belemmering in de bloedstroom in MCA de stroom aan het netvlies. Retinale ischemie werd voor het eerst aangetoond bij ratten door MCAO37. Later werd hetzelfde retinale ischemische model toegepast op muizen49. Voor de procedure duurt occlusie echter meer dan 60 minuten en het vinden van een occlusieplaats is uiterst moeilijk omdat MCA diep in de hersenen is begraven. Bovendien bepaalt de filamentgrootte en invoeglengte voor MCAO het succes van de operatie. Deze extra variabele factoren veroorzaken variabiliteiten van de ischemische uitkomsten na de operatie. Hoewel er directe vergelijkingsstudies nodig zijn tussen tBCCAO en MCAO, beschreven we de gunstige kenmerken van onze experimentele modellen in deze studie: korte occlusietijd, eenvoudige experimentele procedure en zeer toegankelijke occlusielocaties. Dit model kan de problemen in MCAO-modellen oplossen.

Hoewel het gebruik van het muismodel van retinale ischemischemie grote voordelen heeft voor het bestuderen van netvlies ischemische letsel, blijven er beperkingen aan deze aanpak. Aangezien chirurgische incisie in de nek, scheiding van de speekselklieren en occlusie in de juiste CCA met hechtingen moet worden toegepast voor de procedure, kunnen de bijbehorende weefselverstoringen de bijbehorende ontsteking systemisch of ten minste lokaal oproepen. Deze zorgen werden gedeeltelijk aangepakt met behulp van de schijnmuizen, waar alle chirurgische stappen allemaal worden uitgevoerd zonder tBCCAO. Een ander probleem is een vereiste om pijn te beheersen die optreedt tijdens en na de operatie. In onze studie werd pijnbestrijding toegepast om lijden van de muizen te voorkomen door de injectie van butorphanol tartraatoplossing, een synthetisch afgeleide opioïde agonist-antagonist analgetisch van de fenanthreenreeks. Het kan belangrijk zijn om je ervan bewust te zijn dat het gebruik van verschillende soorten anesthetica en pijnstillers de effecten van tBCCAO op retinale ischemie kan verstoren. Een andere beperking van deze benadering (samen met de benaderingen van momenteel gebruikte andere modellen) is dat het geen perfecte simulatie biedt van pathologieën geassocieerd met menselijke cardiovasculaire netvliesaandoeningen. Tot op heden lijden muismodellen die voor dergelijke experimenten worden gebruikt niet aan co-morbiditeiten die ten grondslag liggen aan ischemische retinopathieën bij mensen, voornamelijk met metabool syndroom zoals diabetes50. Dergelijke complicaties die niet aanwezig zijn in de huidige muismodellen kunnen negatieve synergetische effecten hebben op de pathologische paden voor de ontwikkeling van ischemische retinopathieën. Daarom moet hiermee rekening worden gehouden bij het interpreteren van de resultaten van de momenteel gebruikte experimentele modellen, waaronder ons tBCCAO-muismodel. Om de pathofysiologische mechanismen van ischemische retinopathieën bij mensen beter te begrijpen, kan ons model worden gecombineerd met andere pathologische factoren zoals streptozotocine-injectie51 of vetrijk voedingssupplement52 voor de ontwikkeling van ischemische diabetische retinopathie. Eindelijk, hoewel we verminderde retinale bloedperfusie vertoonden in de door tBCCAO geopereerde muizen, konden we de effecten van linker voorbijgaande CCAO op de bloedperfusie naar het rechter netvlies niet duidelijk begrijpen. Deze kwestie kan worden aangepakt met behulp van laser-Doppler, die meestal wordt gebruikt om te bevestigen dat occlusie heeft plaatsgevonden en ischemie in vivo in realtime heeft plaatsgevonden53,54. Deze techniek zou kunnen worden gebruikt voor een beter begrip van retinale ischemie in een individuele tBCCAO-bediende muis, met betrekking tot de bijkomende circulatie in de cirkel van Willis.

Ondanks deze beperkingen vertegenwoordigt onze hier beschreven tBCCAO-methode een effectieve aanpak om retinale ischemie bij muizen te produceren. Het bestuderen van netvliesveranderingen door tBCCAO helpt om pathologische mechanismen van ischemische retinopathieën bij mensen te ontrafelen. Verder hopen we dat het tBCCAO-muismodel kan worden gebruikt voor in vivo drugsscreening.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door Grants-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (18K09424 aan Toshihide Kurihara en 20K18393 aan Yukihiro Miwa) van het Ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie (MEXT).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atipamezole hydrochloride Zenoaq Antisedan For anti-anesthesia
Applied Biosystems 7500 Fast Applied Biosystems - For qPCR
Butorphanol tartrate Meiji Seika Pharma Vetorphale For anesthesia
BZ-II Analyzer KEYENCE - For an image merge
BALB/cAJc1 CLEA - Mouse strain
β-Actin (8H10D10) Mouse mAb CST 3700 For western blot
Clamp Forcep World Precision Instruments WPI 500451 For surgery
Dumont forceps #5 Fine Science Tools 11251-10 For surgery
DAPI solution Dojindo 340-07971 For IHC
Envisu SD-OCT system Leica R4310 For OCT
FITC-dextran Merk FD2000S For retinal blood perfusion
Fluorescence microscope KEYENCE BZ-9000 For fluorescence detection
Gatifloxacin hydrate Senju Pharmaceutical Gachifuro For anti-bacterial infection
GFAP Monoclonal Antibody (2.2B10) Thermo 13-0300 For IHC
Heating pad Marukan RH-200 For surgery
HIF-1α (D1S7W) XP Rabbit mAb CST 36169 For western blot
ImageQuant LAS 4000 mini GE Healthcare - For chemiluminescence
Midazolam Sandoz K.K SANDOZ For anesthesia
Microtome Tissue-Tek TEC 6 Sakura - For sectioning
Medetomidine Orion Corporation Domitor For anesthesia
Needle holder Handaya HS-2307 For surgery
PuREC MAYO Corporation - For ERG
Scissor Fine Science Tools 91460-11 For surgery
Sodium hyaluronate Santen Pharmaceutical Hyalein For eye lubrication
Tropicamide/Penylephrine hydrochloride Santen Pharmaceutical Mydrin-P For mydriasis
6-0 silk suture Natsume E12-60N2 For surgery

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, B. Ocular effects of changes in oxygen and carbon dioxide tension. Transactions of the American Ophthalmological Society. 66, 423-474 (1968).
  2. Ingberg, E., Dock, H., Theodorsson, E., Theodorsson, A., Ström, J. O. Method parameters' impact on mortality and variability in mouse stroke experiments: a meta-analysis. Scientific Reports. 6 (1), 21086 (2016).
  3. Atochin, D. N., Clark, J., Demchenko, I. T., Moskowitz, M. A., Huang, P. L. Rapid Cerebral Ischemic Preconditioning in Mice Deficient in Endothelial and Neuronal Nitric Oxide Synthases. Stroke. 34 (5), 1299-1303 (2003).
  4. Allen, R. S., et al. Severity of middle cerebral artery occlusion determines retinal deficits in rats. Experimental Neurology. 254, 206-215 (2014).
  5. Steele, E. C., Guo, Q., Namura, S. Filamentous Middle Cerebral Artery Occlusion Causes Ischemic Damage to the Retina in Mice. Stroke. 39 (7), 2099-2104 (2008).
  6. Minhas, G., Morishita, R., Anand, A. Preclinical models to investigate retinal ischemia: advances and drawbacks. Frontiers in Neurology. 3, 75 (2012).
  7. McColl, B. W., Carswell, H. V., McCulloch, J., Horsburgh, K. Extension of cerebral hypoperfusion and ischaemic pathology beyond MCA territory after intraluminal filament occlusion in C57Bl/6J mice. Brain Res. 997 (1), 15-23 (2004).
  8. Jiang, A. X., et al. Inducement and Evaluation of a Murine Model of Experimental Myopia. Journal of Visualized Experiments. (143), e58822 (2019).
  9. Miwa, Y., et al. Pharmacological HIF inhibition prevents retinal neovascularization with improved visual function in a murine oxygen-induced retinopathy model. Neurochemistry International. 128, 21-31 (2019).
  10. Adams, S., Pacharinsak, C. Mouse Anesthesia and Analgesia. Current Protocols in Mouse Biology. 5 (1), 51-63 (2015).
  11. Speetzen, L. J., Endres, M., Kunz, A. Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia. Journal of Visualized Experiments. (75), e4387 (2013).
  12. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments. (47), e2423 (2011).
  13. Lee, D., Kang, H., Yoon, K. Y., Chang, Y. Y., Song, H. B. A mouse model of retinal hypoperfusion injury induced by unilateral common carotid artery occlusion. Experimental Eye Research. 201, 108275 (2020).
  14. Li, S., et al. Retro-orbital injection of FITC-dextran is an effective and economical method for observing mouse retinal vessels. Molecular Vision. 17, 3566-3573 (2011).
  15. Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo. Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).
  16. Lee, D., et al. A Fairy Chemical Suppresses Retinal Angiogenesis as a HIF Inhibitor. Biomolecules. 10 (10), (2020).
  17. Tomita, Y., et al. Pemafibrate Prevents Retinal Pathological Neovascularization by Increasing FGF21 Level in a Murine Oxygen-Induced Retinopathy Model. International Journal of Molecular Sciences. 20 (23), 5878 (2019).
  18. Yamamoto, H., Schmidt-Kastner, R., Hamasaki, D. I., Yamamoto, H., Parel, J. M. Complex neurodegeneration in retina following moderate ischemia induced by bilateral common carotid artery occlusion in Wistar rats. Experimental Eye Research. 82 (5), 767-779 (2006).
  19. Cheng, L., Yu, H., Yan, N., Lai, K., Xiang, M. Hypoxia-Inducible Factor-1α Target Genes Contribute to Retinal Neuroprotection. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 20 (2017).
  20. Mole, D. R., et al. Genome-wide association of hypoxia-inducible factor (HIF)-1alpha and HIF-2alpha DNA binding with expression profiling of hypoxia-inducible transcripts. The Journal of Biological Chemistry. 284 (25), 16767-16775 (2009).
  21. Majmundar, A. J., Wong, W. J., Simon, M. C. Hypoxia-Inducible Factors and the Response to Hypoxic Stress. Molecular Cell. 40 (2), 294-309 (2010).
  22. Newman, E. A. Glial cell regulation of neuronal activity and blood flow in the retina by release of gliotransmitters. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370 (1672), (2015).
  23. Vecino, E., Rodriguez, F. D., Ruzafa, N., Pereiro, X., Sharma, S. C. Glia-neuron interactions in the mammalian retina. Progress in Retinal and Eye Research. 51, 1-40 (2016).
  24. Symonds, C. The Circle of Willis. British Medical Journal. 1 (4906), 119 (1955).
  25. Lo, W. B., Ellis, H. The circle before willis: a historical account of the intracranial anastomosis. Neurosurgery. 66 (1), 7-18 (2010).
  26. Yang, G., et al. C57BL/6 strain is most susceptible to cerebral ischemia following bilateral common carotid occlusion among seven mouse strains: selective neuronal death in the murine transient forebrain ischemia. Brain Research. 752 (1), 209-218 (1997).
  27. Farkas, E., Luiten, P. G. M., Bari, F. Permanent, bilateral common carotid artery occlusion in the rat: A model for chronic cerebral hypoperfusion-related neurodegenerative diseases. Brain Research Reviews. 54 (1), 162-180 (2007).
  28. Morris, G. P., et al. A Comparative Study of Variables Influencing Ischemic Injury in the Longa and Koizumi Methods of Intraluminal Filament Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice. PLOS ONE. 11 (2), 0148503 (2016).
  29. Tsuchiya, D., Hong, S., Kayama, T., Panter, S. S., Weinstein, P. R. Effect of suture size and carotid clip application upon blood flow and infarct volume after permanent and temporary middle cerebral artery occlusion in mice. Brain Research. 970 (1-2), 131-139 (2003).
  30. Kaelin, W. G., Ratcliffe, P. J. Oxygen Sensing by Metazoans: The Central Role of the HIF Hydroxylase Pathway. Molecular Cell. 30 (4), 393-402 (2008).
  31. Pauly, M., Sruthi, R. Ptosis: evaluation and management. Kerala Journal of Ophthalmolgy. 31 (1), 11-16 (2019).
  32. Averbuch-Heller, L., Leigh, R. J., Mermelstein, V., Zagalsky, L., Streifler, J. Y. Ptosis in patients with hemispheric strokes. Neurology. 58 (4), 620 (2002).
  33. Dutton, J. Atlas of clinical and surgical orbital anatomy, second edition. 113, 1364 (2011).
  34. Ritzel, R. M., et al. Early retinal inflammatory biomarkers in the middle cerebral artery occlusion model of ischemic stroke. Molecular Vision. 22, 575-588 (2016).
  35. Crespo-Garcia, S., et al. Individual and temporal variability of the retina after chronic bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO). PLOS ONE. 13 (3), 0193961 (2018).
  36. Qin, Y., et al. Functional and morphologic study of retinal hypoperfusion injury induced by bilateral common carotid artery occlusion in rats. Scientific Reports. 9 (1), 80 (2019).
  37. Block, F., Grommes, C., Kosinski, C., Schmidt, W., Schwarz, M. Retinal ischemia induced by the intraluminal suture method in rats. Neuroscience Letters. 232 (1), 45-48 (1997).
  38. Allen, R. S., et al. Progesterone Treatment in Two Rat Models of Ocular Ischemia. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (5), 2880-2891 (2015).
  39. Miller, R. F., Dowling, J. E. Intracellular responses of the Müller (glial) cells of mudpuppy retina: their relation to b-wave of the electroretinogram. Journal of Neurophysiology. 33 (3), 323-341 (1970).
  40. Block, F., Grommes, C., Kosinski, C., Schmidt, W., Schwarz, M. Retinal ischemia induced by the intraluminal suture method in rats. Neuroscience Letters. 232 (1), 45-48 (1997).
  41. Lee, J. H., Shin, J. M., Shin, Y. J., Chun, M. H., Oh, S. J. Immunochemical changes of calbindin, calretinin and SMI32 in ischemic retinas induced by increase of intraocular pressure and by middle cerebral artery occlusion. Anatomy & Cell Biology. 44 (1), 25-34 (2011).
  42. Li, S. Y., et al. Lycium barbarum polysaccharides reduce neuronal damage, blood-retinal barrier disruption and oxidative stress in retinal ischemia/reperfusion injury. PLOS ONE. 6 (1), 16380 (2011).
  43. Furashova, O., Matthé, E. Retinal Changes in Different Grades of Retinal Artery Occlusion: An Optical Coherence Tomography Study. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (12), 5209-5216 (2017).
  44. Zadeh, J. K., et al. Short-Time Ocular Ischemia Induces Vascular Endothelial Dysfunction and Ganglion Cell Loss in the Pig Retina. International Journal of Molecular Sciences. 20 (19), (2019).
  45. Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. Rodent stroke model guidelines for preclinical stroke trials (1st edition). Journal of Experimental Stroke & Translational Medicine. 2 (2), 2-27 (2009).
  46. Tang, Y., et al. Hypothermia-induced ischemic tolerance is associated with Drp1 inhibition in cerebral ischemia-reperfusion injury of mice. Brain Research. 1646, 73-83 (2016).
  47. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 13 (4), 683-692 (1993).
  48. Pula, J. H., Yuen, C. A. Eyes and stroke: the visual aspects of cerebrovascular disease. Stroke and Vascular Neurology. 2 (4), 210 (2017).
  49. Steele, E. C., Guo, Q., Namura, S. Filamentous middle cerebral artery occlusion causes ischemic damage to the retina in mice. Stroke. 39 (7), 2099-2104 (2008).
  50. Sim, D. A., et al. The Effects of Macular Ischemia on Visual Acuity in Diabetic Retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 2353-2360 (2013).
  51. Wu, K. K., Huan, Y. Streptozotocin-induced diabetic models in mice and rats. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 5, Unit 5.47 (2008).
  52. Mubarak, A., Hodgson, J. M., Considine, M. J., Croft, K. D., Matthews, V. B. Supplementation of a high-fat diet with chlorogenic acid is associated with insulin resistance and hepatic lipid accumulation in mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61 (18), 4371-4378 (2013).
  53. Ansari, S., Azari, H., McConnell, D. J., Afzal, A., Mocco, J. Intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke with laser doppler flowmetry guidance in mice. Journal of Visualized Experiments. (51), e2879 (2011).
  54. Hedna, V. S., et al. Validity of Laser Doppler Flowmetry in Predicting Outcome in Murine Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion Stroke. Journal of Vascular and Interventional Neurology. 8 (3), 74-82 (2015).

Tags

Geneeskunde Carotid artery occlusion Electroretinography Experimental models Hypoxia Ischemia Optical coherence tomography Retina Reperfusion
Een Murine-model van ischemisch netvliesletsel veroorzaakt door voorbijgaande bilaterale gemeenschappelijke halsslagader Occlusie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, D., Miwa, Y., Jeong, H., Ikeda, … More

Lee, D., Miwa, Y., Jeong, H., Ikeda, S. i., Katada, Y., Tsubota, K., Kurihara, T. A Murine Model of Ischemic Retinal Injury Induced by Transient Bilateral Common Carotid Artery Occlusion. J. Vis. Exp. (165), e61865, doi:10.3791/61865 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter