Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Um modelo murino de lesão isquêmica da retina induzida pela oclusão da artéria da carótida comum bilateral transitória

Published: November 12, 2020 doi: 10.3791/61865
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,4, 1,2
1Laboratory of Photobiology, Keio University School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, Keio University School of Medicine, 3Animal eye care, Tokyo Animal Eye Clinic, 4Tsubota Laboratory, Inc.
* These authors contributed equally

Summary

Aqui, descrevemos um modelo de camundongo de isquemia de retina por oclusão da artéria carótida comum bilateral transitória usando suturas simples e um grampo. Este modelo pode ser útil para entender os mecanismos patológicos da isquemia da retina causada por anormalidades cardiovasculares.

Abstract

Diversas doenças vasculares, como retinopatia diabética, oclusão de veias da retina ou artérias e síndrome isquêmica ocular podem levar à isquemia da retina. Para investigar mecanismos patológicos da isquemia da retina, são necessários desenvolver modelos experimentais relevantes. Anatomicamente, um dos principais vasos de abastecimento sanguíneo da retina é a artéria oftalmômica (OpA) e a OpA é originária da artéria carótida interna da artéria carótida comum (CCA). Assim, a interrupção da CCA poderia efetivamente causar isquemia retinista. Aqui, estabelecemos um modelo de camundongo de isquemia de retina por oclusão da artéria carótida comum transitória (tBCCAO) para amarrar a CCA direita com suturas de seda 6-0 e ocluir a CCA esquerda transitoriamente por 2 segundos através de um grampo, e mostrou que o tBCCAO poderia induzir isquemia aguda de retina levando à disfunção da retina. O método atual reduz a dependência de instrumentos cirúrgicos usando apenas agulhas cirúrgicas e um grampo, encurta o tempo de oclusão para minimizar a morte inesperada de animais, o que é frequentemente visto em modelos de camundongos de oclusão da artéria cerebral média, e mantém a reprodutibilidade de achados isquêmicos comuns da retina. O modelo pode ser utilizado para investigar a fisiopatologia de retinopatias isquêmicas em camundongos e ainda pode ser usado para triagem in vivo de medicamentos.

Introduction

A retina é um tecido neurossensorial para função visual. Uma vez que uma quantidade substancial de oxigênio é necessária para a função visual, a retina é conhecida como um dos tecidos mais exigentes de oxigênio no corpo1. A retina é suscetível a doenças vasculares, pois o oxigênio é entregue através dos vasos sanguíneos. Vários tipos de doenças vasculares, como a retinopatia diabética e a oclusão dos vasos sanguíneos da retina (veias ou artérias), podem induzir isquemia da retina. Para investigar mecanismos patológicos de isquemia da retina, são considerados necessários modelos experimentais reprodutíveis e clinicamente relevantes de isquemia de retina. A oclusão da artéria cerebral média (MCAO) por inserção de um filamento intraluminal é o método mais utilizado para o desenvolvimento de modelos de roedores in vivo de isquemia cerebral experimental2,3. Devido à proximidade da artéria oftalmológica (OpA) com a MCA, os modelos de MCAO também são utilizados simultaneamente para entender a fisiopatologia da isquemia da retina4,5,6. Para induzir isquemia cerebral junto com isquemia de retina, filamentos longos são tipicamente inseridos através da incisão da artéria carótida comum (CCA) ou da artéria carótida externa (ECA). Esses métodos são difíceis de realizar, requerem muito tempo para completar a cirurgia (mais de 60 minutos para um rato), e levam a altas variabilidades nos desfechos após a cirurgia7. É importante desenvolver um modelo melhor para melhorar essas preocupações.

Neste estudo, bastamos usar a oclusão bilateral de CCA transitória curta (tBCCAO) com agulhas e um grampo para induzir isquemia de retina em camundongos e analisamos resultados típicos de lesões isquêmicas na retina. Neste vídeo, vamos dar uma demonstração do procedimento tBCCAO.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Escola de Medicina da Universidade keio.

1. Preparação de instrumentos cirúrgicos e animais

  1. Autoclave instrumentos cirúrgicos e mantê-los em 70% de álcool etílico. Antes de cada novo procedimento cirúrgico, limpe os instrumentos cirúrgicos cuidadosamente utilizando 70% de álcool etílico.
  2. Prepare camundongos BALB/cAJc1 machos (6 semanas de idade, 26-28 kg) em uma sala específica-livre de patógenos (SPF) para manter condições estéreis antes, durante e depois da cirurgia.

2. Oclusão da artéria carótida comum bilateral transitória (tBCCAO)

  1. Coloque um rato sob anestesia por injeção intraperitoneal com uma combinação de midazolam (40 μg/100 μL), medetomidina (7,5 μg/100 μL) e tartarato butorphanol (50 μg/100 μL), denominado "MMB", como descrito anteriormente8,9. Segure as peles traseiras do mouse para manter o rato longe de bater os olhos até que o rato esteja completamente anestesiado.
    1. Julgue a profundidade da anestesia beliscando o dedo do mouse até que ele não tenha resposta, do qual o método é comumente usado para verificar anestesia completa10.
      NOTA: Geralmente, menos de 5 min são necessários para que os ratos durmam. Receitas adequadas para anestesia geral podem ser diferentes pelas instituições.
  2. Aplique uma gota de 0,1% purificada solução de olírio de hialuronato de sódio aos olhos para evitar o ressecamento nos olhos sob anestesia.
  3. Coloque o mouse de costas e conserte as patas do mouse usando fitas adesivas.
  4. Desinfete a área do pescoço do rato usando 70% de álcool etílico antes da cirurgia.
    NOTA: O recorte adicional da pele não foi realizado, pois isso pode causar inflamação posterior da pele11,12.
  5. Realizar incisão sagital do pescoço com uma lâmina(Figura 1).
    NOTA: A incisão precisa ser feita na linha média entre o pescoço, esterno e traqueia.
  6. Separe as duas glândulas salivares cuidadosamente usando dois fórceps e mobilize-as para visualizar os CCAs subjacentes.
  7. Isole a CCA direita cuidadosamente dos respectivos nervos vagos e veias que acompanham sem prejudicar suas estruturas, e coloque duas suturas de seda 6-0 sob a CCA. Amarre os dois laços firmemente para bloquear o fluxo sanguíneo(Figura 1).
    NOTA: Durante o procedimento, pequenas veias podem ser danificadas. Se o sangramento for visto, é necessário limpar os CCAs claramente.
  8. Encontre a CCA esquerda cuidadosamente a partir dos respectivos nervos vagos e veias que acompanham sem prejudicar suas estruturas, e oclua a CCA esquerda por 2 segundos por um grampo(Figura 1).
    NOTA: É necessário colocar uma agulha de sutura de seda 6-0 sob a CCA esquerda para marcar um local para fixação.
  9. Após a reabertura da CCA esquerda, sutura feridas do pescoço por uma sutura de seda 6-0 e aplicam um pouco de antibiótico (50 μL) no pescoço para inibir infecção bacteriana.
    NOTA: Remova suavemente um grampo para evitar danificar a parede arterial ao reabrir a CCA esquerda.
  10. Injete 0,75 mg/kg de cloridrato de atipamezole intraperitoneally no camundongo para ajudar o rato a se recuperar de anestesia profunda rapidamente. Devolva o mouse para uma gaiola de rato com almofadas pré-aquecidas.
    NOTA: Não deixe o rato sair sozinho até que o rato recupere a consciência suficiente para manter a recumbência severa.
  11. Injete 0,4 mg/kg de tartarato butorphanol no mouse para o manejo da dor quando o rato acordar.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Como primeira dica para o sucesso do tBCCAO, pode-se observar a inclinação das pálpebras do mouse(Figura 2).
  12. Para eutanásia, injete 3x de mistura de MMB nos camundongos e sacrifique-os para experimentos.

3. Observações gerais (taxas de sobrevivência e inclinação das pálpebras)

  1. Após a cirurgia, verifique as taxas de sobrevivência de todas as causas de morte no dia 0 (após a cirurgia), 1, 3 e 7.
  2. Avalie a inclinação das pálpebras por uma escala de classificação de 4 pontos: 1 = sem inclinação, 2 = inclinação leve (~50%), 3 = inclinação severa (acima de 50%) e 4 = inclinação severa com descarga ocular.

4. Perfusão sanguínea retinana

  1. Injete 200 μL de FITC-dextran (25 mg/mL) no ventrículo esquerdo do camundongo, que é comumente usado para a observação da perfusão sanguínea nos vasos de retina do rato13,14.
  2. 2 minutos após a circulação, enuclear os olhos e fixar em 4% paraformaldeído por 1 hora. As retinas foram cuidadosamente obtidas e montadas planas, como descrito anteriormente15, e examinadas através de um microscópio de fluorescência.
  3. Tire fotos das montagens inteiras da retina em 4x de ampliação e mescle em um único usando um analisador de mesclagem, descrito anteriormente16.
  4. Meça as áreas perfundidas através de uma ferramenta de análise de embarcações no software NIH Fiji/ImageJ.

5. Mancha ocidental

  1. 3 e 6 horas após tBCCAO, obtenha os olhos dos ratos e transfira imediatamente para uma placa de Petri contendo PBS frio para isolar as retinas.
  2. Após o isolamento das retinas, realize manchas ocidentais, como descrito anteriormente9.
  3. Incubar com anticorpos para fator indutível de hipóxia-1α (HIF-1α; um marcador geral de hipóxia) e para β-Actin (um controle de carregamento interno) durante a noite seguido da incubação de anticorpos secundários conjugados pelo HRP. Visualize os sinais via chemiluminescência.

6. PCR quantitativo (qPCR)

  1. 6, 12 e 24 horas após tBCCAO, processe as retinas obtidas para qPCR, como descrito anteriormente17.
  2. Execute qPCR via sistema PCR em tempo real. Os primers utilizados estão listados na Tabela 1. Calcule as alterações de dobra entre os níveis de diferentes transcrições pelo método ΔΔCT.

7. Imunohistoquímica (IHC)

  1. 3 dias após tBCCAO, obtenha os olhos de ratos e incorpore em parafina.
  2. Corte os olhos embutidos na parafina por um microtome para obter as seções oculares.
  3. Desparafinar e manchar as seções oculares de 5 μm de espessura como descrito anteriormente13.
  4. Incubar com um anticorpo para proteína ácida fibrilar gliana (GFAP; um marcador confiável para astrócitos e células Müller na retina) durante a noite seguido pela incubação do anticorpo secundário Alexa Fluor 555-conjugado.
  5. Use DAPI (4′,6-diamidino-2-fenildole) para coloração do núcleo na retina. Visualize sinais através de um microscópio de fluorescência.
  6. Avalie a pontuação da morfologia por uma escala de classificação de 4 pontos, como descrito anteriormente13,18: 0 = sem sinal, 1 = poucos pés finais gliais positivos na camada de célula de gânglio (GCL), 2 = poucos processos rotulados que atingem de GCL à camada nuclear externa (ONL) e 3 = a maioria dos processos rotulados que atingem de GCL para ONL.

8. Eletroretinografia (ERG)

  1. 3 e 7 dias após a tBCCAO, realize o ERG utilizando uma cúpula ganzfeld, sistema de aquisição e estimuladores led, como descrito anteriormente9.
  2. Após adaptação escura da noite para o dia, anestesia os ratos com uma combinação de MMB sob luz vermelha fraca.
  3. Use uma solução mista de 0,5% de trópico e 0,5% de fenilefrina para dilatar as pupilas.
  4. Coloque os eletrodos ativos na lente de contato e coloque o eletrodo de referência na boca.
  5. Obtenha respostas de ERG de ambos os olhos de cada animal.
  6. Registos scotopic registro sob adaptação escura com vários estímulos.
  7. Meça as amplitudes de uma onda da linha de base até o ponto mais baixo de uma onda.
  8. Meça as amplitudes da onda B do ponto mais baixo de uma onda até o pico da onda B.
  9. Mantenha todos os ratos aquecidos durante o procedimento usando almofadas de calor.

9. Tomografia de coerência óptica (OCT)

  1. 2 semanas após tBCCAO, realize o OCT usando o sistema SD-OCT, como relatado anteriormente8,9.
  2. Para a medição, sujeitos camundongos à micrária por uma solução mista de 0,5% de tropamida e 0,5% fenilefrina, e à anestesia geral por uma mistura de MMB.
  3. Obtenha imagens de varredura B de fatias equatoriais de varreduras en-face.
  4. Examine as retinas a 0,2, 0,4 e 0,6 mm da cabeça do nervo óptico.
  5. Meça a espessura da retina da camada de fibra nervosa da retina (NFL) até a membrana limitante externa (ELM), e considere a média dos valores medidos como espessura da retina de um camundongo individual.
  6. Plote os resultados como diagramas de aranha.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Após a circulação sistêmica do FITC-dextran por 2 minutos, foram examinadas vasculaturas de retina das retinas esquerda e direita nos camundongos operados por sham e camundongos operados por tBCCAO(Figura Suplementar 1). FITC-dextran era totalmente visível nas duas retinas nos camundongos operados por farsa e na retina esquerda nos camundongos operados por tBCCAO, enquanto era parcialmente detectável na retina direita nos camundongos operados por tBCCAO.

Após tBCCAO, foi examinada a inclinação das pálpebras(Figura 2). Os olhos direito apresentaram leve (pontuação 2; 75%) e pálpebras cortadas (pontuação 3 e 4; 25%) inclinação, enquanto os olhos esquerdos não tinham inclinação (pontuação 1; 93,75%) exceto por um rato (pontuação 2; 6,25%). Embora a inclinação da pálpebra severa com descarga ocular não tenha sido consideravelmente observada nos camundongos operados pela TBCCAO, pudemos ver um rato para este fenótipo (pontuação 4; 6,25%).

A redução do estado de oxigênio nos tecidos leva à estabilização do HIF-1α e à indução de uma série de genes responsivos à hipóxia, tais como EPO, VEGF e BNIP319,20,21. Em primeiro lugar, a hipóxia biológica molecular utilizando um marcador hipóxico geral HIF-1α foi avaliada via mancha ocidental(Figura 3). O aumento da expressão HIF-1α foi significativamente observado na retina direita 3 e 6 horas após tBCCAO. Em seguida, as expressões de genes responsivos à hipóxia foram avaliadas via qPCR(Figura Suplementar 2). Não houve alteração significativa nas expressões genéticas responsivas à hipóxia 6 horas após o tBCCAO. 12 horas após o tBCCAO, encontramos a expressão Binp3 significativamente aumentada e um ligeiro aumento na expressão Epo foi mostrado na retina direita. 24 horas após a TBCCAO, também pudemos encontrar um ligeiro aumento na expressão Epo na retina direita, embora não fosse estatisticamente significante. A expressão vegf não foi alterada de 6 a 24 horas nos camundongos operados pela TBCCAO.

A gliose reativa da retina foi examinada 3 dias após a tBCCAO (Figura 4),já que glia como astrócitos e células de Müller têm sido intimamente associadas à isquemia da retina22. GFAP tem sido amplamente utilizado para detecção de astrócitos e células Müller na retina23. A média dos escores de morfologia para rotulagem GFAP na retina direita foi a mais alta entre as retinas nos camundongos operados por vergonha e a retina esquerda nos camundongos operados por tBCCAO. Com base na localização da expressão GFAP, uma mudança na morfologia na rotulagem GFAP é considerada para refletir a ativação das células Müller.

O ERG foi utilizado para examinar a disfunção da retina após tBCCAO(Figura 5). As amplitudes de onda B no olho direito diminuíram drasticamente 3 e 7 dias após tBCCAO. No entanto, as amplitudes de uma onda no olho direito não foram significativamente alteradas. Quando se trata do olho esquerdo, não foi possível ver nenhuma alteração nas amplitudes das ondas A e B(Figura Suplementar 3).

Realizamos OCT para determinar uma alteração na espessura da retina após tBCCAO(Figura 6). A espessura da retina no olho direito aumentou drasticamente 2 semanas após o tBCCAO, enquanto não houve diferença na espessura da retina no olho esquerdo entre os camundongos operados por tBCCAO e sham.

Figure 1
Figura 1: Esquema do procedimento modelo e circulação sanguínea no círculo de Willis. Uma ilustração esquemática mostrou o procedimento do modelo isquêmico isquêmico de retina induzido por tBCCAO e a circulação sanguínea para a retina. CCA, ECA, ICA, PCA e OpA representam a artéria carótida comum, artéria carótida externa, artéria carótida interna, artéria comunicativa posterior e artéria oftálmica, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Pálpebra inclinando-se após tBCCAO. A gravidade da inclinação das pálpebras foi avaliada pela classificação de 4 pontos com base nas imagens de referência: 1 = sem inclinação, 2 = inclinação leve (~50% inclinação), 3 = inclinação severa (mais de 50% inclinação) e 4 = inclinação severa com descarga ocular. A inclinação das pálpebras foi observada após a tBCCAO e foi mantida durante a observação experimental. Os resultados (sham: n = 10, tBCCAO: n = 16) foram plotados como um gráfico de pontos de dispersão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Estabilização HIF-1α após tBCCAO. Imunoblots representativos e análises quantitativas (grupos para a hora 3; farsa: n = 3, tBCCAO: n = 6 e grupos para a hora 6; sham e tBCCAO: n = 6) para HIF-1α e β-Actin mostraram que hif-1α foi estabilizado na retina direita 3 e 6 horas após tBCCAO. *P < 0,05. Os dados foram analisados utilizando-se o t-teste do Aluno e apresentados como média com ± desvio padrão. L e R defendem a retina esquerda e direita, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: gliose reativo após tBCCAO. As seções sagidoras representativas das retinas (sham: n = 4, tBCCAO: n = 4) e análises quantitativas da rotulagem GFAP (vermelho) por uma pontuação de morfologia (0-3) mostraram que a rotulagem GFAP, principalmente restrita na NFL+GCL, foi expandida para toda a camada interna, de GCL para ONL (setas brancas) na retina direita após tBCCAO. Barras de escala, 50 μm. O DAPI (azul) foi utilizado para coloração do núcleo na retina. NFL, GCL, IPL, INL e ONL representam a camada de fibra nervosa, camada celular de gânglio, camada plexiforme interna, camada nuclear interna e camada nuclear externa, respectivamente. Os dados foram analisados utilizando-se o teste tdo Student e apresentados como mediana com intervalo interquartil, o percentil 25 e 75. *P < 0,05. L e R defendem a retina esquerda e direita, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Disfunção visual no olho direito após tBCCAO. (A) Formas de onda representativas do ERG adaptado à escuridão realizados 3 e 7 dias após o tBCCAO. Intensidade de estimulação (cd.s/m2): 0,005. (B) As análises quantitativas mostraram que houve diminuição das amplitudes da onda b no olho direito (sham: n = 5, tBCCAO: n = 6) enquanto as amplitudes de onda a não foram alteradas. *P < 0,05, **P < 0,01. Os dados foram analisados utilizando-se o t-teste do Aluno e apresentados como média com ± desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Uma mudança na espessura da retina após tBCCAO. Imagens representativas de OCT nas retinas operadas por sham e tBCCAO e análises quantitativas mostraram que houve aumento da espessura da retina na retina direita (sham: n = 4, tBCCAO: n = 8). Não houve alteração na espessura da retina na retina esquerda (sham: n = 4, tBCCAO: n = 8). As barras de escala são de 200 (superior) e 100 (inferior) μm, respectivamente. *P < 0,05. Os valores no eixo horizontal dos diagramas representam 0,2, 0,4 e 0,6 mm distantes da cabeça do nervo óptico (0) detectada pela linha verde. Os dados foram analisados utilizando-se de ANOVA bidirecional seguido de teste pós-hoc bonferroni. Os diagramas de aranha foram apresentados como médias com ± desvio padrão. NFL, INL, ONL e ELM são a camada de fibra nervosa, camada nuclear interna, camada nuclear externa e membrana limitante externa, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Perfusão sanguínea retinana após tBCCAO. Imagens representativas de montagem plana da retina (com maior ampliação de cada imagem) após 2 min de circulação fitc-dextran e análises quantitativas mostraram que a perfusão completa era observável nas duas retinas nos camundongos operados por vergonha e na retina esquerda nos camundongos operados pela TBCCAO. No entanto, a retina direita nos camundongos operados por tBCCAO apresentou perfusão parcial do sangue. Os dados foram analisados utilizando-se o t-teste do Aluno e apresentados como média com ± desvio padrão. L e R defendem a retina esquerda e direita, respectivamente. As barras de escala são de 800 e 400 μm, respectivamente. Clique aqui para baixar este número.

Figura suplementar 2: Expressões de genes responsivos à hipóxia após tBCCAO. As análises quantitativas mostraram um aumento transitório na expressão Bnip3 mRNA na retina direita com significância estatística 12 horas após o tBCCAO. A expressão epo mRNA mostrou uma tendência crescente na retina direita por 24 horas após o tBCCAO, embora seus valores não fossem significativamente diferentes em comparação com a retina direita operada por farsa. **P < 0,01. Os dados foram analisados utilizando-se o t-teste do Aluno e apresentados como média com ± desvio padrão. Clique aqui para baixar este número.

Figura suplementar 3: Função visual no olho esquerdo após tBCCAO. As análises quantitativas mostraram que não houve alteração nas amplitudes das ondas a e b no olho esquerdo (sham: n = 5, tBCCAO: n = 6). P > 0,05. Os dados foram analisados utilizando-se o t-teste do Aluno e apresentados como média com ± desvio padrão. Clique aqui para baixar este número.

Figura suplementar 4: Taxas de sobrevivência após tBCCAO em C57BL6 e BALB. As curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier demonstraram que quase todos os ratos morreram dentro de 3 dias após o tBCCAO em camundongos C57BL6. Quando se trata de camundongos BALB, maior tempo de fixação no tBCCAO induz morte súbita e grave de animais (taxas de sobrevivência no dia 7, 20 seg: 10%, 10 segundos: 20%, 2 segundos: 81% e 0g: 95%). Clique aqui para baixar este número.

Figura suplementar 5: estabilização HIF-1α após CCAO unilateral. Um imunoblot representativo e uma análise quantitativa (sham: n = 3, CCAO unilateral: n = 3) para HIF-1α e β-Actin mostraram que o HIF-1α não estava estabilizado nas retinas 3 horas após o CCAO unilateral. P > 0,05. Os dados foram analisados utilizando-se o teste tdo Aluno e apresentados como média com ± desvio padrão. L e R defendem a retina esquerda e direita, respectivamente. Clique aqui para baixar este número.

Figura suplementar 6: Inclinação de pálpebra severa após tBCCAO com longo tempo de fixação. 10 segundos de inclinação das pálpebras graves induzidas por tBCCAO, que foi avaliada por uma escala de classificação de 4 pontos: 1 = sem inclinação, 2 = inclinação leve (~50%), 3 = inclinação severa (acima de 50%), e 4 = inclinação severa com descarga ocular, conforme descrito na Figura 2. Clique aqui para baixar este número.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

No estudo, mostramos que o tBCCAO, utilizando suturas simples e um grampo, poderia induzir isquemia de retina e disfunção retinista. Além disso, demonstramos que nosso protocolo atual para o desenvolvimento de um modelo de camundongo de isquemia de retina é mais fácil e rápido em comparação com outros protocolos anteriores para o desenvolvimento de modelos de lesão isquêmica de retina2,3,7.

Anatomicamente, as artérias cerebrais esquerda e direita podem ser conectadas através de artérias comunicantes posteriores (PCAs) que fornecem circulação colateral no círculo de Willis para manter o fornecimento adequado de sangue ao sistema nervoso central contra interrupção de fluxo de oclusão ou estenose de vasos individuais24,25 ( Figura1). Lee et al. demonstraram que a perfusão sanguínea da retina pode ser de 10 minutos de atraso (o que não é um bloqueio total da perfusão sanguínea da retina na retina ipsilateral) por CCAO unilateral permanente em camundongos C57BL613. Isso implica que a indução da isquemia da retina por CCAO está intimamente associada com condições de circulação colateral no círculo de Willis. C57BL6 é conhecido por ser a cepa de camundongos mais suscetível à isquemia cerebral pela BCCAO entre sete cepas de camundongos, incluindo a cepa de camundongos balb26do estudo atual . Devido ao círculo incompleto de Willis em C57BL6, a interrupção do fornecimento de sangue cerebral de ambos os CCAs induz danos graves no sistema nervoso central, finalmente levando à morte. Além disso, em nosso estudo preliminar, não conseguimos induzir o tBCCAO em C57BL6 como quase todos os camundongos (cerca de 80%) morreu no prazo de 3 dias após a cirurgia(Figura Suplementar 4). Por isso, aplicamos tBCCAO a outra cepa de rato BALB para o nosso estudo atual.

Para induzir lesões isquêmicas agudas de retina em nosso modelo BALB, a CCA direita foi permanentemente ligada e a CCA esquerda foi aplicada para aumentar o estresse isquêmico da retina aguda através da oclusão transitória. Isso ocorre porque os camundongos não podiam tolerar o estresse isquêmico induzido pelo BCCAO permanente ao contrário dos ratos que têm o círculo completo de Willis27. Em seguida, tentamos otimizar o tempo de oclusão: deixou o CCAO (0-20 segundos), pois o tempo de oclusão tem sido considerado um dos principais fatores que impacta lesões isquêmicas no sistema nervoso central e se conecta diretamente com as taxas de sobrevivência dos modelos experimentais28,29. Verificou-se que as taxas de sobrevivência dos camundongos BALB diminuíram de forma dependente do tempo de oclusão(Figura Suplementar 4). A oclusão da CCA esquerda em mais de 10 segundos mostrou taxas de mortalidade severamente maiores (acima de 50%), enquanto a oclusão da CCA esquerda por 2 segundos ou nenhuma oclusão (ou CCAO unilateral) mostrou taxas de sobrevivência relativamente mais altas (mais de 80%). Portanto, excluímos os grupos (de tempo de oclusão que é de 10 e 20 segundos) para os experimentos adicionais, pois experimentos eficientes e econômicos não podem estar disponíveis. Em seguida, examinamos se a oclusão da CCA esquerda por 2 segundos ou nenhuma oclusão (ou CCAO unilateral) poderia induzir a hipóxia da retina. HIF-1α é um importante regulador que funciona em respostas hipóxiis e está estabilizado sob condições hipóxiis30. Nesse sentido, a estabilização HIF-1α tem sido usada como um marcador biológico molecular geral para a hipóxia. Não foi possível detectar estabilização HIF-1α na retina no grupo de CCAO unilateral (Figura Suplementar 5). Curiosamente, podemos detectar estabilização HIF-1α no grupo de 2 segundos de tBCCAO (Figura 3). Isso implica que o estresse hipóxico da retina pode ser induzido por 2 segundos de tBCCAO em camundongos BALB. Portanto, 2 segundos de tempo de fixação foram finalmente selecionados para o nosso estudo com base nas altas taxas de sobrevivência após a cirurgia e indução da isquemia da retina via estabilização HIF-1α.

Embora a CCA direita tenha sido permanentemente ocluída em camundongos operados por tBCCAO, a perfusão de sangue foi parcialmente detectada na retina direita 2 minutos após a circulação sistêmica do FITC-dextran (Figura Suplementar 1). Além disso, constatamos que não foi detectada alteração na estabilização HIF-1α na retina direita nos camundongos BALB operados pelo CCAO unilateral. Esse fenômeno poderia ser explicado por efeitos da circulação colateral através do círculo de Willis para manter o suprimento sanguíneo para a retina (Figura 1). Embora não pudéssemos entender claramente os efeitos do CCAO transitório esquerdo na perfusão sanguínea para a retina direita, o CCAO esquerdo transitório juntamente com o CCAO direito permanente pode impulsionar insultos hipóxicos agudos na retina direita, como evidenciado por uma mudança significativa na expressão HIF-1α na retina direita após tBCCAO(Figura 3). Além disso, as taxas de sobrevivência dos camundongos dependiam do tempo de oclusão da CCA esquerda. Em conjunto, a intensidade do estresse isquêmico da retina pode ser controlada através do CCAO esquerdo.

O fenótipo de uma pálpebra caída tem sido sugerido como sinal de apresentação ou sintoma fisiopatológico de condições neurológicas graves, especialmente derrame isquêmico31,32. O músculo associado a uma pálpebra caída é levator palpebrae superioris33. Este músculo é fornecido pela artéria palpebral lateral que é um dos ramos derivados da OpA. Assim, quando o OpA, que fornece a retina, é afetado, a inclinação das pálpebras podia ser vista. A inclinação das pálpebras foi observada nos modelos de mouse MCAO34, que também foi reproduzido em nosso modelo tBCCAO. Além disso, descrevemos que a inclinação das pálpebras torna-se severa quando o tempo de oclusão da CCA esquerda demora mais (Figura 2 e Figura Suplementar 6). Isso implica que a gravidade da inclinação das pálpebras (indiretamente referida como a intensidade do estresse isquêmico da retina) pode depender do tempo de oclusão da CCA esquerda.

A disfunção da retina é um dos resultados observados em retinopatias isquêmicas da retina, incluindo estenose de BCCA em camundongos35 e BCCAO em ratos36. Descobrimos que as amplitudes de ondas b diminuíram nos camundongos operados pela TBCCAO. Vários estudos anteriores demonstraram que a MCAO também causou uma redução na amplitude da onda B após a cirurgia37,38. b-wave reflete uma condição fisiológica das células nas camadas internas da retina, incluindo células bipolares e células Müller39. Além disso, a gliose reativa pelas células Müller foi detectada na camada interna da retina após o tBCCAO. Este resultado também é reproduzido nos modelos MCAO40,41 e outros modelos CCAO13,42. Juntos, implica que a disfunção da retina interna pode ser induzida pelo tBCCAO. A espessura da retina tem aumentado transitoriamente na isquemia aguda da retina43,44. Também reproduzimos esse achado nos camundongos operados pela TBCCAO. Esses dados mostram que o comprometimento da circulação sanguínea por tBCCAO pode atingir a retina e finalmente afetar camadas de retina.

Para desfechos consistentes, o tempo anestésico e o tempo de procedimentos cirúrgicos, bem como outros fatores como pesos e idades de modelos experimentais e suas temperaturas corporais durante e após a cirurgia devem ser padronizados45. Particularmente, é preciso atenção para manter a temperatura corporal dos camundongos durante o período de observação experimental. Isso porque a hipotermia pode ter um efeito pré-condicionamento e interferir com efeitos isquêmicos por tBCCAO46. Mesmo que não pudéssemos medir a temperatura corporal exata dos ratos em nossos experimentos, usamos almofadas de aquecimento para aquecer os ratos até que os ratos recuperassem consciência suficiente. Além disso, comparamos os camundongos operados pela TBCCAO com os camundongos operados por farsas para controlar potenciais efeitos de confusão de fatores incontroláveis.

As cepas do rato podem ser um fator variável importante adicional para induzir lesões isquêmicas de retina por tBCCAO. Variação substancial do círculo de Willis em cepas de camundongos pode resultar em uma redução indesejada ou indução de isquemia cerebral, incluindo ishcemia de retina47 e, assim, poderia levar a variabilidades dos resultados. O ajuste do tempo de fixação é recomendado para uma retinopatia isquêmica induzida por tBCCAO quando outras cepas de camundongos são necessárias para serem aplicadas.

Em geral, os incidentes de derrame ou outras lesões cerebrais são invariavelmente acompanhados de perda temporária ou permanente de vison48. Até o momento, o modelo de mouse MCAO é amplamente utilizado para estudos de avc. Como a OpA se origina proximal à origem da MCA, qualquer obstáculo no fluxo sanguíneo na MCA obstrui o fluxo para a retina. Isquemia de retina foi primeiramente demonstrada em ratos por MCAO37. Posteriormente, o mesmo modelo isquêmico de retina foi aplicado em camundongos49. No entanto, para o procedimento, a oclusão leva mais de 60 minutos e encontrar um local de oclusão é extremamente difícil, pois a MCA está enterrada no interior do cérebro. Além disso, o tamanho do filamento e o comprimento de inserção para MCAO decidem muito o sucesso da cirurgia. Esses fatores variáveis adicionais induzem variabilidade dos desfechos isquêmicos após a cirurgia. Embora sejam necessários estudos de comparação direta entre tBCCAO e MCAO, descrevemos as características benéficas de nossos modelos experimentais neste estudo: tempo curto de oclusão, procedimento experimental simples e locais de oclusão altamente acessíveis. Este modelo pode resolver as preocupações vistas nos modelos MCAO.

Embora o uso do modelo de camundongos de isquemia de retina tenha grandes benefícios para estudar lesões isquêmicas da retina, permanecem limitações para essa abordagem. Uma vez que a incisão cirúrgica no pescoço, a separação das glândulas salivares e a oclusão na CCA direita com suturas devem ser aplicadas para o procedimento, as rupturas teciduais que acompanham podem evocar inflamação associada sistemicamente ou pelo menos localmente. Essas preocupações foram parcialmente abordadas usando os camundongos operados por farsa, onde todas as etapas cirúrgicas são conduzidas sem tBCCAO. Outra questão é a exigência de controlar a dor que ocorre durante e após a cirurgia. Em nosso estudo, o tratamento da dor para prevenir o sofrimento dos camundongos foi aplicado através da injeção de solução tartarato butorphanol, um analgésico agonista-antagonista opioide sintético da série fenoanthrene. Pode ser importante estar ciente de que o uso de diferentes tipos de anestésicos e analgésicos pode interromper os efeitos do tBCCAO na isquemia da retina. Outra limitação dessa abordagem (juntamente com as abordagens de outros modelos atualmente utilizados) é que ela não fornece uma simulação perfeita de patologias associadas a distúrbios cardiovasculares da retina humana. Até o momento, os modelos de camundongos utilizados para tais experimentos não sofrem de co-morbidades que estão por trás de retinopatias isquêmicas em humanos, principalmente com síndrome metabólica como diabetes50. Tais complicações que não estão presentes nos modelos atuais do camundongo podem ter efeitos sinérgicos negativos nas vias patológicas para o desenvolvimento de retinopatias isquêmicas. Portanto, isso deve ser levado em conta ao interpretar os resultados dos modelos experimentais atualmente utilizados, incluindo o nosso modelo de mouse tBCCAO. Para entender melhor os mecanismos fisiopatológicos das retinopatias isquêmicas em humanos, nosso modelo pode ser combinado com outros fatores patológicos, como a injeção de estreptozoocina51 ou o suplemento de dieta de alta gordura52 para o desenvolvimento de retinopatia diabética isquêmica. Finalmente, embora tenhamos mostrado redução da perfusão sanguínea da retina nos camundongos operados por tBCCAO, não pudemos entender claramente os efeitos do CCAO transitório esquerdo na perfusão de sangue para a retina direita. Este assunto pode ser abordado usando laser-Doppler, que é tipicamente usado para confirmar que a oclusão ocorreu e a isquemia ocorreu in vivo em tempo real53,54. Esta técnica poderia ser utilizada para melhor compreensão da isquemia da retina em um camundongo operado por tBCCAO individual, em relação à circulação colateral no círculo de Willis.

Apesar dessas limitações, nosso método tBCCAO descrito aqui representa uma abordagem eficaz para produzir isquemia de retina em camundongos. Estudar as mudanças na retina por tBCCAO ajuda a desvendar mecanismos patológicos de retinopatias isquêmicas em humanos. Além disso, esperamos que o modelo de mouse tBCCAO possa ser usado para a triagem de drogas in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por Grants-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (18K09424 para Toshihide Kurihara e 20K18393 para Yukihiro Miwa) do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia (MEXT).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atipamezole hydrochloride Zenoaq Antisedan For anti-anesthesia
Applied Biosystems 7500 Fast Applied Biosystems - For qPCR
Butorphanol tartrate Meiji Seika Pharma Vetorphale For anesthesia
BZ-II Analyzer KEYENCE - For an image merge
BALB/cAJc1 CLEA - Mouse strain
β-Actin (8H10D10) Mouse mAb CST 3700 For western blot
Clamp Forcep World Precision Instruments WPI 500451 For surgery
Dumont forceps #5 Fine Science Tools 11251-10 For surgery
DAPI solution Dojindo 340-07971 For IHC
Envisu SD-OCT system Leica R4310 For OCT
FITC-dextran Merk FD2000S For retinal blood perfusion
Fluorescence microscope KEYENCE BZ-9000 For fluorescence detection
Gatifloxacin hydrate Senju Pharmaceutical Gachifuro For anti-bacterial infection
GFAP Monoclonal Antibody (2.2B10) Thermo 13-0300 For IHC
Heating pad Marukan RH-200 For surgery
HIF-1α (D1S7W) XP Rabbit mAb CST 36169 For western blot
ImageQuant LAS 4000 mini GE Healthcare - For chemiluminescence
Midazolam Sandoz K.K SANDOZ For anesthesia
Microtome Tissue-Tek TEC 6 Sakura - For sectioning
Medetomidine Orion Corporation Domitor For anesthesia
Needle holder Handaya HS-2307 For surgery
PuREC MAYO Corporation - For ERG
Scissor Fine Science Tools 91460-11 For surgery
Sodium hyaluronate Santen Pharmaceutical Hyalein For eye lubrication
Tropicamide/Penylephrine hydrochloride Santen Pharmaceutical Mydrin-P For mydriasis
6-0 silk suture Natsume E12-60N2 For surgery

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, B. Ocular effects of changes in oxygen and carbon dioxide tension. Transactions of the American Ophthalmological Society. 66, 423-474 (1968).
  2. Ingberg, E., Dock, H., Theodorsson, E., Theodorsson, A., Ström, J. O. Method parameters' impact on mortality and variability in mouse stroke experiments: a meta-analysis. Scientific Reports. 6 (1), 21086 (2016).
  3. Atochin, D. N., Clark, J., Demchenko, I. T., Moskowitz, M. A., Huang, P. L. Rapid Cerebral Ischemic Preconditioning in Mice Deficient in Endothelial and Neuronal Nitric Oxide Synthases. Stroke. 34 (5), 1299-1303 (2003).
  4. Allen, R. S., et al. Severity of middle cerebral artery occlusion determines retinal deficits in rats. Experimental Neurology. 254, 206-215 (2014).
  5. Steele, E. C., Guo, Q., Namura, S. Filamentous Middle Cerebral Artery Occlusion Causes Ischemic Damage to the Retina in Mice. Stroke. 39 (7), 2099-2104 (2008).
  6. Minhas, G., Morishita, R., Anand, A. Preclinical models to investigate retinal ischemia: advances and drawbacks. Frontiers in Neurology. 3, 75 (2012).
  7. McColl, B. W., Carswell, H. V., McCulloch, J., Horsburgh, K. Extension of cerebral hypoperfusion and ischaemic pathology beyond MCA territory after intraluminal filament occlusion in C57Bl/6J mice. Brain Res. 997 (1), 15-23 (2004).
  8. Jiang, A. X., et al. Inducement and Evaluation of a Murine Model of Experimental Myopia. Journal of Visualized Experiments. (143), e58822 (2019).
  9. Miwa, Y., et al. Pharmacological HIF inhibition prevents retinal neovascularization with improved visual function in a murine oxygen-induced retinopathy model. Neurochemistry International. 128, 21-31 (2019).
  10. Adams, S., Pacharinsak, C. Mouse Anesthesia and Analgesia. Current Protocols in Mouse Biology. 5 (1), 51-63 (2015).
  11. Speetzen, L. J., Endres, M., Kunz, A. Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia. Journal of Visualized Experiments. (75), e4387 (2013).
  12. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments. (47), e2423 (2011).
  13. Lee, D., Kang, H., Yoon, K. Y., Chang, Y. Y., Song, H. B. A mouse model of retinal hypoperfusion injury induced by unilateral common carotid artery occlusion. Experimental Eye Research. 201, 108275 (2020).
  14. Li, S., et al. Retro-orbital injection of FITC-dextran is an effective and economical method for observing mouse retinal vessels. Molecular Vision. 17, 3566-3573 (2011).
  15. Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo. Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).
  16. Lee, D., et al. A Fairy Chemical Suppresses Retinal Angiogenesis as a HIF Inhibitor. Biomolecules. 10 (10), (2020).
  17. Tomita, Y., et al. Pemafibrate Prevents Retinal Pathological Neovascularization by Increasing FGF21 Level in a Murine Oxygen-Induced Retinopathy Model. International Journal of Molecular Sciences. 20 (23), 5878 (2019).
  18. Yamamoto, H., Schmidt-Kastner, R., Hamasaki, D. I., Yamamoto, H., Parel, J. M. Complex neurodegeneration in retina following moderate ischemia induced by bilateral common carotid artery occlusion in Wistar rats. Experimental Eye Research. 82 (5), 767-779 (2006).
  19. Cheng, L., Yu, H., Yan, N., Lai, K., Xiang, M. Hypoxia-Inducible Factor-1α Target Genes Contribute to Retinal Neuroprotection. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 20 (2017).
  20. Mole, D. R., et al. Genome-wide association of hypoxia-inducible factor (HIF)-1alpha and HIF-2alpha DNA binding with expression profiling of hypoxia-inducible transcripts. The Journal of Biological Chemistry. 284 (25), 16767-16775 (2009).
  21. Majmundar, A. J., Wong, W. J., Simon, M. C. Hypoxia-Inducible Factors and the Response to Hypoxic Stress. Molecular Cell. 40 (2), 294-309 (2010).
  22. Newman, E. A. Glial cell regulation of neuronal activity and blood flow in the retina by release of gliotransmitters. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370 (1672), (2015).
  23. Vecino, E., Rodriguez, F. D., Ruzafa, N., Pereiro, X., Sharma, S. C. Glia-neuron interactions in the mammalian retina. Progress in Retinal and Eye Research. 51, 1-40 (2016).
  24. Symonds, C. The Circle of Willis. British Medical Journal. 1 (4906), 119 (1955).
  25. Lo, W. B., Ellis, H. The circle before willis: a historical account of the intracranial anastomosis. Neurosurgery. 66 (1), 7-18 (2010).
  26. Yang, G., et al. C57BL/6 strain is most susceptible to cerebral ischemia following bilateral common carotid occlusion among seven mouse strains: selective neuronal death in the murine transient forebrain ischemia. Brain Research. 752 (1), 209-218 (1997).
  27. Farkas, E., Luiten, P. G. M., Bari, F. Permanent, bilateral common carotid artery occlusion in the rat: A model for chronic cerebral hypoperfusion-related neurodegenerative diseases. Brain Research Reviews. 54 (1), 162-180 (2007).
  28. Morris, G. P., et al. A Comparative Study of Variables Influencing Ischemic Injury in the Longa and Koizumi Methods of Intraluminal Filament Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice. PLOS ONE. 11 (2), 0148503 (2016).
  29. Tsuchiya, D., Hong, S., Kayama, T., Panter, S. S., Weinstein, P. R. Effect of suture size and carotid clip application upon blood flow and infarct volume after permanent and temporary middle cerebral artery occlusion in mice. Brain Research. 970 (1-2), 131-139 (2003).
  30. Kaelin, W. G., Ratcliffe, P. J. Oxygen Sensing by Metazoans: The Central Role of the HIF Hydroxylase Pathway. Molecular Cell. 30 (4), 393-402 (2008).
  31. Pauly, M., Sruthi, R. Ptosis: evaluation and management. Kerala Journal of Ophthalmolgy. 31 (1), 11-16 (2019).
  32. Averbuch-Heller, L., Leigh, R. J., Mermelstein, V., Zagalsky, L., Streifler, J. Y. Ptosis in patients with hemispheric strokes. Neurology. 58 (4), 620 (2002).
  33. Dutton, J. Atlas of clinical and surgical orbital anatomy, second edition. 113, 1364 (2011).
  34. Ritzel, R. M., et al. Early retinal inflammatory biomarkers in the middle cerebral artery occlusion model of ischemic stroke. Molecular Vision. 22, 575-588 (2016).
  35. Crespo-Garcia, S., et al. Individual and temporal variability of the retina after chronic bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO). PLOS ONE. 13 (3), 0193961 (2018).
  36. Qin, Y., et al. Functional and morphologic study of retinal hypoperfusion injury induced by bilateral common carotid artery occlusion in rats. Scientific Reports. 9 (1), 80 (2019).
  37. Block, F., Grommes, C., Kosinski, C., Schmidt, W., Schwarz, M. Retinal ischemia induced by the intraluminal suture method in rats. Neuroscience Letters. 232 (1), 45-48 (1997).
  38. Allen, R. S., et al. Progesterone Treatment in Two Rat Models of Ocular Ischemia. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (5), 2880-2891 (2015).
  39. Miller, R. F., Dowling, J. E. Intracellular responses of the Müller (glial) cells of mudpuppy retina: their relation to b-wave of the electroretinogram. Journal of Neurophysiology. 33 (3), 323-341 (1970).
  40. Block, F., Grommes, C., Kosinski, C., Schmidt, W., Schwarz, M. Retinal ischemia induced by the intraluminal suture method in rats. Neuroscience Letters. 232 (1), 45-48 (1997).
  41. Lee, J. H., Shin, J. M., Shin, Y. J., Chun, M. H., Oh, S. J. Immunochemical changes of calbindin, calretinin and SMI32 in ischemic retinas induced by increase of intraocular pressure and by middle cerebral artery occlusion. Anatomy & Cell Biology. 44 (1), 25-34 (2011).
  42. Li, S. Y., et al. Lycium barbarum polysaccharides reduce neuronal damage, blood-retinal barrier disruption and oxidative stress in retinal ischemia/reperfusion injury. PLOS ONE. 6 (1), 16380 (2011).
  43. Furashova, O., Matthé, E. Retinal Changes in Different Grades of Retinal Artery Occlusion: An Optical Coherence Tomography Study. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (12), 5209-5216 (2017).
  44. Zadeh, J. K., et al. Short-Time Ocular Ischemia Induces Vascular Endothelial Dysfunction and Ganglion Cell Loss in the Pig Retina. International Journal of Molecular Sciences. 20 (19), (2019).
  45. Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. Rodent stroke model guidelines for preclinical stroke trials (1st edition). Journal of Experimental Stroke & Translational Medicine. 2 (2), 2-27 (2009).
  46. Tang, Y., et al. Hypothermia-induced ischemic tolerance is associated with Drp1 inhibition in cerebral ischemia-reperfusion injury of mice. Brain Research. 1646, 73-83 (2016).
  47. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 13 (4), 683-692 (1993).
  48. Pula, J. H., Yuen, C. A. Eyes and stroke: the visual aspects of cerebrovascular disease. Stroke and Vascular Neurology. 2 (4), 210 (2017).
  49. Steele, E. C., Guo, Q., Namura, S. Filamentous middle cerebral artery occlusion causes ischemic damage to the retina in mice. Stroke. 39 (7), 2099-2104 (2008).
  50. Sim, D. A., et al. The Effects of Macular Ischemia on Visual Acuity in Diabetic Retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 2353-2360 (2013).
  51. Wu, K. K., Huan, Y. Streptozotocin-induced diabetic models in mice and rats. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 5, Unit 5.47 (2008).
  52. Mubarak, A., Hodgson, J. M., Considine, M. J., Croft, K. D., Matthews, V. B. Supplementation of a high-fat diet with chlorogenic acid is associated with insulin resistance and hepatic lipid accumulation in mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61 (18), 4371-4378 (2013).
  53. Ansari, S., Azari, H., McConnell, D. J., Afzal, A., Mocco, J. Intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke with laser doppler flowmetry guidance in mice. Journal of Visualized Experiments. (51), e2879 (2011).
  54. Hedna, V. S., et al. Validity of Laser Doppler Flowmetry in Predicting Outcome in Murine Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion Stroke. Journal of Vascular and Interventional Neurology. 8 (3), 74-82 (2015).

Tags

Medicina Edição 165 Oclusão da artéria Carótida Eletroretinografia Modelos Experimentais Hipóxia Isquemia Tomografia de coerência óptica Retina Reperfusão
Um modelo murino de lesão isquêmica da retina induzida pela oclusão da artéria da carótida comum bilateral transitória
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, D., Miwa, Y., Jeong, H., Ikeda, … More

Lee, D., Miwa, Y., Jeong, H., Ikeda, S. i., Katada, Y., Tsubota, K., Kurihara, T. A Murine Model of Ischemic Retinal Injury Induced by Transient Bilateral Common Carotid Artery Occlusion. J. Vis. Exp. (165), e61865, doi:10.3791/61865 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter