Summary
Hier beschreiben wir ein Mausmodell der retinalen Ischämie durch vorübergehende bilaterale gemeinsame Karotisarterienverschluss mit einfachen Nähten und einer Klemme. Dieses Modell kann nützlich sein, um die pathologischen Mechanismen der retinalen Ischämie zu verstehen, die durch kardiovaskuläre Anomalien verursacht wird.
Abstract
Verschiedene Gefäßerkrankungen wie diabetische Retinopathie, Okklusion der Netzhautvenen oder Arterien und das okuläre ischämische Syndrom können zu retinaler Ischämie führen. Um pathologische Mechanismen der retinalen Ischämie zu untersuchen, müssen relevante experimentelle Modelle entwickelt werden. Anatomisch ist ein Haupt-Retinal-Blutversorgungsgefäß die ophthalmologische Arterie (OpA) und OpA stammt aus der inneren Halsschlagader der gemeinsamen Halsschlagader (CCA). So könnte eine Störung der CCA effektiv retinale Ischämie verursachen. Hier haben wir ein Mausmodell der retinalen Ischämie durch vorübergehende bilaterale gemeinsame Karotisarterienverschluss (tBCCAO) etabliert, um die rechte CCA mit 6-0 Seidennähten zu binden und die linke CCA vorübergehend für 2 Sekunden über eine Klemme zu verschließen, und zeigten, dass tBCCAO akute retinale Ischämie induzieren kann, die zu einer retinalen Dysfunktion führt. Die aktuelle Methode reduziert die Abhängigkeit von chirurgischen Instrumenten, indem sie nur chirurgische Nadeln und eine Klemme verwendet, verkürzt die Okklusionszeit, um unerwartete Tiersterben zu minimieren, was häufig in Mausmodellen der mittleren Zerebrierungsokklusion zu beobachten ist, und behält die Reproduzierbarkeit der häufigen retinalen ischämischen Befunde bei. Das Modell kann verwendet werden, um die Pathophysiologie der ischämischen Retinopathien bei Mäusen zu untersuchen und kann weiter für in vivo Drogenscreening verwendet werden.
Introduction
Die Netzhaut ist ein neurosensorisches Gewebe für die visuelle Funktion. Da eine erhebliche Menge an Sauerstoff für die visuelle Funktion benötigt wird, ist die Netzhaut als eines der höchsten sauerstofffordernden Gewebe im Körperbekannt 1. Die Netzhaut ist anfällig für Gefäßerkrankungen, da Sauerstoff über die Blutgefäße abgegeben wird. Verschiedene Arten von Gefäßerkrankungen, wie diabetische Retinopathie und Netzhautblutgefäß (Venen oder Arterien) Okklusion, können netzhautische Ischämie induzieren. Zur Untersuchung pathologischer Mechanismen der retinalen Ischämie werden reproduzierbare und klinisch relevante experimentelle Modelle der retinalen Ischämie als notwendig erachtet. Die mittlere zerebrale Arterienverschluss (MCAO) durch Einsetzen eines intraluminalen Filaments ist die am häufigsten verwendete Methode zur Entwicklung von in vivo Nagetiermodellen der experimentellen zerebralen Ischämie2,3. Aufgrund der Nähe der ophthalmologischen Arterie (OpA) zu MCA werden MCAO-Modelle auch gleichzeitig verwendet, um die Pathophysiologie der Netzhautischämie4,5,6zu verstehen. Um zerebrale Ischämie zusammen mit retinaler Ischämie zu induzieren, werden lange Filamente in der Regel durch Inzision der gemeinsamen Halsschlagader (CCA) oder der äußeren Halsschlagader (ECA) eingesetzt. Diese Methoden sind schwierig durchzuführen, benötigen eine lange Zeit, um die Operation abzuschließen (über 60 Minuten für eine Maus), und führen zu hohen Variabilitäten in den Ergebnissen nach der Operation7. Es ist nach wie vor wichtig, ein besseres Modell zu entwickeln, um diese Bedenken zu verbessern.
In dieser Studie verwendeten wir einfach kurze transiente bilaterale CCA-Okklusion (tBCCAO) mit Nadeln und einer Klemme, um retinale Ischämie bei Mäusen zu induzieren und analysierten typische Ergebnisse ischämischer Verletzungen in der Netzhaut. In diesem Video werden wir eine Demonstration des tBCCAO-Verfahrens geben.
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Protocol
Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Keio University School of Medicine genehmigt.
1. Vorbereitung von chirurgischen Instrumenten und Tieren
- Autoklav chirurgische Instrumente und halten Sie sie in 70% Ethylalkohol. Reinigen Sie vor jedem neuen chirurgischen Eingriff chirurgische Instrumente sorgfältig mit 70% Ethylalkohol.
- Bereiten Sie männliche BALB/cAJc1-Mäuse (6 Wochen alt, 26-28 kg) in einem spezifisch pathogenfreien (SPF) Raum vor, um sterile Bedingungen vor, während und nach der Operation aufrechtzuerhalten.
2. Transiente bilaterale gemeinsame Karotisarterienverschluss (tBCCAO)
- Setzen Sie eine Maus unter Anästhesie durch intraperitoneale Injektion mit einer Kombination aus Midazolam (40 g/100 l), Medetomidin (7,5 g/100 l) und Butorphanoltartrat (50 g/100 l), wie zuvor beschrieben8,9. Halten Sie die Hinterhaut der Maus, um die Maus davon abzuhalten, ihre Augen zu stoßen, bis die Maus vollständig beästhebt ist.
- Beurteilen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Maus Zehen kneifen, bis sie keine Antwort hat, von welcher Methode wird häufig für die Überprüfung der vollständigen Anästhesie10verwendet.
HINWEIS: Im Allgemeinen sind weniger als 5 min erforderlich, damit Mäuse einschlafen können. Richtige Rezepte für die Vollnarkose können von Institutionen unterschiedlich sein.
- Beurteilen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Maus Zehen kneifen, bis sie keine Antwort hat, von welcher Methode wird häufig für die Überprüfung der vollständigen Anästhesie10verwendet.
- Tragen Sie einen Tropfen von 0,1% gereinigte Natriumhyaluronat Augentropfenlösung auf die Augen auf, um Trockenheit auf den Augen unter Anästhesie zu verhindern.
- Legen Sie die Maus auf den Rücken und fixieren Sie die Pfoten der Maus mit Klebebändern.
- Desinfizieren Sie den Halsbereich der Maus mit 70% Ethylalkohol vor der Operation.
HINWEIS: ZusätzlicheS Abschneiden des Fells wurde nicht durchgeführt, da dies zu einer nachfolgenden Hautentzündung führen kann11,12. - Führen Sie einen sagittalen Schnitt des Halses mit einer Klinge (Abbildung 1).
HINWEIS: Der Schnitt muss an der Mittellinie zwischen Hals, Brustbein und Luftröhre erfolgen. - Trennen Sie beide Speicheldrüsen sorgfältig mit zwei Zangen und mobilisieren Sie sie, um die zugrunde liegenden CCAs zu visualisieren.
- Isolieren Sie die richtige CCA sorgfältig von den jeweiligen vagalen Nerven und begleitenden Venen, ohne ihre Strukturen zu schädigen, und legen Sie zwei 6-0 Seidennähte unter die CCA. Binden Sie die beiden Krawatten fest, um den Blutfluss zu blockieren (Abbildung 1).
HINWEIS: Während des Verfahrens können kleine Venen beschädigt werden. Wenn Blutungen auftreten, ist ein Wischen erforderlich, um die CCAs klar zu visualisieren. - Finden Sie die linke CCA sorgfältig von den jeweiligen vagalen Nerven und begleitenden Venen, ohne ihre Strukturen zu beschädigen, und verschließen Sie die linke CCA für 2 Sekunden durch eine Klemme (Abbildung 1).
HINWEIS: Eine 6-0 Seidennahtnadel muss unter dem linken CCA platziert werden, um eine Stelle zum Spannen zu markieren. - Nach wiedererbrechen der linken CCA, Nähte des Halses durch eine 6-0 Seidennaht und wenden Sie einen Tupfer von Antibiotikum (50 l) auf den Hals, um bakterielle Infektion zu hemmen.
HINWEIS: Entfernen Sie beim Wiederöffnen des linken CCA eine Klemme, um eine Beschädigung der Arterienwand zu vermeiden. - Injizieren Sie 0,75 mg/kg Atipamezolhydrochlorid intraperitoneal in die Maus, um der Maus zu helfen, sich schnell von der tiefen Anästhesie erholt zu haben. Bringen Sie die Maus in einen Mauskäfig mit vorgeheizten Pads zurück.
HINWEIS: Lassen Sie die Maus nicht unbeaufsichtigt, bis die Maus wieder genügend Bewusstsein, um die Brustbeschisse zu erhalten. - Injizieren Sie 0,4 mg/kg Butorphanoltartrat in die Maus, um Schmerzen zu lindern, wenn die Maus aufwacht.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Als erster Hinweis für erfolgreiches tBCCAO ist ein Augenlid-Tropfen der Maus zu beobachten (Abbildung 2). - Zur Euthanasie spritzen Sie den Mäusen 3x MMB-Mischung und opfern sie für Experimente.
3. Allgemeine Beobachtungen (Überlebensraten und Augenlidtropfen)
- Überprüfen Sie nach der Operation die Überlebensraten auf alle Todesursachen am Tag 0 (nach der Operation), 1, 3 und 7.
- Beurteilen Sie das Augenlid-Tropfen mit einer 4-Punkt-Bewertungsskala: 1 = kein Absinken, 2 = leichtes Absinken (50 %), 3 = schweres Abtropfen (über 50 %) und 4 = starkes Abtropfen mit Augenentladung.
4. Retinale Blutperfusion
- Injizieren Sie 200 l FITC-Dextran (25 mg/ml) in den linken Herzkammerschlitz der Maus, die häufig für die Beobachtung der Blutperfusion in mausretinalen Gefäßen13,14verwendet wird.
- 2 Minuten nach der Zirkulation die Augen enukleieren und 1 Stunde lang in 4% Paraformaldehyd fixieren. Die Netzhaut wurde, wie zuvor beschrieben15,sorgfältig erhalten und flach montiert und mit einem Fluoreszenzmikroskop untersucht.
- Fotografieren Sie die retinalen ganzen Halterungen bei 4-facher Vergrößerung und verschmelzen Sie mit einem Zusammenführungsanalysator zu einem einzigen, zuvor beschriebenen16.
- Messen Sie die durchgedreten Bereiche mit einem Gefäßanalysetool in der NIH Fiji/ImageJ-Software.
5. Westlicher Fleck
- 3 und 6 Stunden nach tBCCAO, erhalten Sie die Augen von Mäusen und sofort auf eine Petrischale mit kaltem PBS übertragen, um die Netzhaut zu isolieren.
- Führen Sie nach der Isolierung der Netzhaut eine westliche Blotting, wie zuvor beschrieben9.
- Inkubieren Sie über Nacht mit Antikörpern für den hypoxieinduzierbaren Faktor-1 (HIF-1- und ein allgemeiner Hypoxie-Marker) und für β-Actin (eine interne Belastungskontrolle), gefolgt von der Inkubation von HRP-konjugierten Sekundärantikörpern. Visualisieren Sie die Signale über Chemilumineszenz.
6. Quantitative PCR (qPCR)
- 6, 12 und 24 Stunden nach tBCCAO, verarbeiten Sie die erhaltenen Netzhaut für qPCR, wie zuvor beschrieben17.
- Führen Sie qPCR über ein Echtzeit-PCR-System aus. Verwendete Primer sind in Tabelle 1aufgeführt. Berechnen Sie Faltenänderungen zwischen Ebenen verschiedener Transkripte nach der Methode "CT".
7. Immunhistochemie (IHC)
- 3 Tage nach tBCCAO die Augen von Mäusen erhalten und in Paraffin einbetten.
- Schneiden Sie die paraffin-eingebetteten Augen durch ein Mikrotome, um die Augenpartien zu erhalten.
- Deparaffinisieren und färben Sie die Augenabschnitte von 5 m Dicke, wie zuvor beschrieben13.
- Inkubieren Sie mit einem Antikörper für glialfibrilläres saures Protein (GFAP; ein zuverlässiger Marker für Astrozyten und Müller-Zellen in der Netzhaut) über Nacht, gefolgt von der Inkubation von Alexa Fluor 555-konjugierten Sekundärantikörpern.
- Verwenden Sie DAPI (4,6-Diamidino-2-Phenylindole) zur Färbung des Kerns in der Netzhaut. Visualisierung von Signalen über ein Fluoreszenzmikroskop.
- Bewerten Sie die Morphologiebewertung anhand einer 4-Punkte-Bewertungsskala, wie zuvor beschrieben13,18: 0 = kein Signal, 1 = wenige positive Glia-Endfüße in der Ganglienzellschicht (GCL), 2 = wenige markierte Prozesse, die von GCL bis zur äußeren Kernschicht (ONL) reichen, und 3 = am meisten markierte Prozesse, die von GCL bis ONL reichen.
8. Elektroretinographie (ERG)
- 3 und 7 Tage nach tBCCAO, führen Sie ERG mit einer Ganzfeld-Kuppel, einem Erfassungssystem und LED-Stimulatoren durch, wie zuvor beschrieben9.
- Nach dunkler Anpassung über Nacht, beanmaßen Sie Mäuse mit einer Kombination von MMB unter dunklem roten Licht.
- Verwenden Sie eine gemischte Lösung von 0,5% Tropicamid und 0,5% Phenylephrin, um die Pupillen zu verdorn.
- Legen Sie die aktiven Elektroden auf die Kontaktlinse und legen Sie die Referenzelektrode in den Mund.
- Erhalten Sie ERG-Antworten von beiden Augen jedes Tieres.
- Zeichnen Sie skotopische Reaktionen unter dunkler Anpassung mit verschiedenen Reizen auf.
- Messen Sie die Amplituden der A-Welle von der Grundlinie bis zum tiefsten Punkt der A-Welle.
- Messen Sie die Amplituden der B-Welle vom tiefsten Punkt der A-Welle bis zum Gipfel der B-Welle.
- Halten Sie alle Mäuse während des Eingriffs mit Wärmepads warm.
9. Optische Kohärenztomographie (OCT)
- 2 Wochen nach tBCCAO, führen Sie OCT mit SD-OCT-System, wie zuvor berichtet8,9.
- Für die Messung Mäuse einer Mydriasis durch eine gemischte Lösung von 0,5% Tropicamid und 0,5% Phenylephrin und der Vollnarkose durch eine Mischung aus MMB unterziehen.
- Erhalten Sie B-Scan-Bilder aus äquatorialen Slices von En-Face-Scans.
- Untersuchen Sie die Netzhaut bei 0,2, 0,4 und 0,6 mm vom Sehnervenkopf entfernt.
- Messen Sie die Netzhautdicke von der retinalen Nervenfaserschicht (NFL) bis zur externen Grenzmembran (ELM), und betrachten Sie den Durchschnitt der Gemessenen Werte als Netzhautdicke einer einzelnen Maus.
- Zeichnen Sie die Ergebnisse als Spinnendiagramme.
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Representative Results
Nach systemischer Zirkulation von FITC-Dextran für 2 Minuten wurden netzhautvaskulaturen der linken und rechten Netzhaut bei den scheinbetriebenen Mäusen und tBCCAO-betriebenen Mäusen untersucht (Zusatzabbildung 1). FITC-Dextran war sowohl in den Netzhaut bei den scheinbetriebenen Mäusen als auch in der linken Netzhaut bei den tBCCAO-betriebenen Mäusen vollständig sichtbar, während es in der rechten Netzhaut bei den tBCCAO-betriebenen Mäusen teilweise nachweisbar war.
Nach tBCCAO wurde das Herabfallen der Augenlider untersucht (Abbildung 2). Die rechten Augen zeigten milde (Score 2; 75%) und schweres Augenlid (Score 3 und 4; 25%) Tropfen, während die linken Augen hatten kein Tropfen (Score 1; 93.75%) bis auf eine Maus (Score 2; 6,25%). Obwohl bei den tBCCAO-betriebenen Mäusen ein starkes Augenlid-Abtropfen mit Augenentladung nicht wesentlich beobachtet wurde, konnten wir eine Maus für diesen Phänotyp sehen (Score 4; 6,25%).
Reduzierter Sauerstoffstatus im Gewebe führt zur Stabilisierung von HIF-1 und zur Induktion einer Reihe von Hypoxie-responsiven Genen wie EPO, VEGF und BNIP319,20,21. Zunächst wurde die molekularbiologische Hypoxie mit einem allgemeinen hypoxischen Marker HIF-1 über Western Blotting(Abbildung 3) ausgewertet. Erhöhte HIF-1-Expression wurde signifikant in der rechten Netzhaut 3 und 6 Stunden nach tBCCAO beobachtet. Als nächstes wurden Ausdrücke von Hypoxie-responsiven Genen über qPCR (Ergänzende Abbildung 2) ausgewertet. Es gab keine signifikante Veränderung der Hypoxie-responsiven Genexpressionen 6 Stunden nach tBCCAO. 12 Stunden nach tBCCAO stellten wir fest, dass die Binp3-Expression signifikant zunahm und eine leichte Zunahme der Epo-Expression in der rechten Netzhaut gezeigt wurde. 24 Stunden nach tBCCAO konnten wir auch einen leichten Anstieg der Epo-Expression in der rechten Netzhaut feststellen, obwohl er statistisch nicht signifikant war. Die Vegf-Expression wurde bei den tBCCAO-betriebenen Mäusen nicht von 6 bis 24 Stunden verändert.
Die retinale reaktive Gliose wurde 3 Tage nach tBCCAO untersucht (Abbildung 4), da Glia wie Astrozyten und Müller-Zellen eng mit retinaler Ischämie22in Verbindung gebracht wurden. GFAP wurde häufig zum Nachweis von Astrozyten und Müller-Zellen in der Netzhaut23eingesetzt. Der Durchschnitt der Morphologiewerte für die GFAP-Kennzeichnung in der rechten Netzhaut war der höchste unter den beiden Netzhaut-Retinas bei den scheinbetriebenen Mäusen und der linken Netzhaut bei den tBCCAO-betriebenen Mäusen. Basierend auf der Lokalisierung der GFAP-Expression wird eine Veränderung der Morphologie in der GFAP-Kennzeichnung als Reaktivierung von Müller-Zellen betrachtet.
ERG wurde verwendet, um Netzhautfunktionsstörungen nach tBCCAO zu untersuchen (Abbildung 5). Die Amplituden der B-Welle im rechten Auge verringerten sich 3 und 7 Tage nach tBCCAO dramatisch. Die Amplituden einer Welle im rechten Auge wurden jedoch nicht signifikant verändert. Wenn es um das linke Auge geht, konnten wir keine Veränderungen in den Amplituden von A- und B-Wellen sehen (Ergänzende Abbildung 3).
Wir führten OCT durch, um eine Veränderung der Netzhautdicke nach tBCCAO zu bestimmen (Abbildung 6). Die Netzhautdicke im rechten Auge nahm 2 Wochen nach tBCCAO dramatisch zu, während es keinen Unterschied in der Netzhautdicke im linken Auge zwischen den tBCCAO- und scheinbetriebenen Mäusen gab.
Abbildung 1: Schemat des Modellverfahrens und der Blutzirkulation im Kreis von Willis. Eine schematische Abbildung zeigte die tBCCAO-induzierte retinale ischämische Mausmodell-Prozedur und die Durchblutung der Netzhaut. CCA, ECA, ICA, PCA und OpA stellen die gemeinsame Halsschlagader, die äußere Halsschlagader, die innere Halsschlagader, die hintere Kommunikationsarterie bzw. die ophthalmologische Arterie dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Augenlid-Drooping nach tBCCAO. Die Schwere des Augenlidtropfens wurde anhand der Referenzbilder mit 4-Punkte-Bewertung bewertet: 1 = kein Abtropfen, 2 = leichtes Absinken (50 % Tropfen), 3 = schweres Absinken (über 50 % Tropfen) und 4 = starkes Abtropfen mit Augenentladung. Augenlidtropfen wurde nach tBCCAO beobachtet und während der experimentellen Beobachtung aufrechterhalten. Die Ergebnisse (Schein: n = 10, tBCCAO: n = 16) wurden als Streupunktdiagramm dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: HIF-1-Stabilisierung nach tBCCAO. Repräsentative Immunoblots und quantitative Analysen (Gruppen für Stunde 3; Schein: n = 3, tBCCAO: n = 6 und Gruppen für Stunde 6; Schein und tBCCAO: n = 6) für HIF-1 und β-Actin zeigten, dass HIF-1' in der rechten Netzhaut 3 und 6 Stunden nach tBCCAO stabilisiert wurde. *P < 0,05. Die Daten wurden mit dem Student es t-test analysiert und als Mittelwert mit ±Standardabweichung dargestellt. L und R stehen für die linke bzw. rechte Netzhaut. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Reaktive Gliose nach tBCCAO. Repräsentative sagittale Abschnitte der Netzhaut (Schein: n = 4, tBCCAO: n = 4) und quantitative Analysen der GFAP-Kennzeichnung (rot) durch eine Morphologie-Scoring (0–3) zeigten, dass die GFAP-Kennzeichnung, die meist in NFL+GCL eingeschränkt ist, nach tBCCAO auf die gesamte innere Schicht, von GCL bis ONL (weiße Pfeile) in der rechten Netzhaut, erweitert wurde. Schuppenstäbe, 50 m. DAPI (blau) wurde zur Färbung des Kerns in der Netzhaut verwendet. NFL, GCL, IPL, INL und ONL stellen die Nervenfaserschicht, Ganglienzellschicht, innere Plexiformschicht, innere Kernschicht bzw. äußere Kernschicht dar. Die Daten wurden mit dem Student es t-testanalysiert und als Median mit interquartiler Reichweite, dem 25. und 75. Perzentil, dargestellt. *P < 0,05. L und R stehen für die linke bzw. rechte Netzhaut. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Visuelle Dysfunktion im rechten Auge nach tBCCAO. (A) Repräsentative Wellenformen von dunkel angepasstem ERG, die 3 und 7 Tage nach tBCCAO durchgeführt wurden. Stimulationsintensität (cd.s/m2): 0.005. (B) Quantitative Analysen zeigten, dass die Amplituden der B-Welle im rechten Auge abnehmen (Schein: n = 5, tBCCAO: n = 6), während die Amplituden der a-Welle nicht verändert wurden. *P < 0,05, **P < 0,01. Die Daten wurden mit dem Student es t-test analysiert und als Mittelwert mit ±Standardabweichung dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Eine Veränderung der Netzhautdicke nach tBCCAO. Repräsentative OCT-Bilder in den schein- und tBCCAO-betriebenen Netzhaut und quantitative Naschenanalysen zeigten, dass die Netzhautdicke in der rechten Netzhaut zunahm (Schein: n = 4, tBCCAO: n = 8). Es gab keine Veränderung der Netzhautdicke in der linken Netzhaut (Schein: n = 4, tBCCAO: n = 8). Die Skalenbalken sind 200 (oben) bzw. 100 (unter) m. *P < 0,05. Die Werte in der horizontalen Achse der Diagramme stellen 0,2, 0,4 und 0,6 mm entfernung vom Sehnervenkopf (0) dar, der durch die grüne Linie erkannt wurde. Die Daten wurden mit einer zweiseitig angelegten ANOVA analysiert, gefolgt von einem Bonferroni-Post-hoc-Test. Spinnendiagramme wurden als Mittelwert mit ± Standardabweichung dargestellt. NFL, INL, ONL und ELM sind die Nervenfaserschicht, die innere Kernschicht, die äußere Kernschicht bzw. die äußere Grenzmembran. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Retinale Blutperfusion nach tBCCAO. Repräsentative retinale Flachmontagebilder (mit höherer Vergrößerung jedes Bildes) nach 2 min FITC-Dextran-Zirkulation und quantitative Analysen zeigten, dass eine vollständige Perfusion sowohl in den beiden Netzhaut bei den scheinbetriebenen Mäusen als auch in der linken Netzhaut bei den tBCCAO-betriebenen Mäusen zu beobachten war. Die rechte Netzhaut bei den tBCCAO-operierten Mäusen zeigte jedoch eine partielle Blutperfusion. Die Daten wurden mit dem Student es t-test analysiert und als Mittelwert mit ±Standardabweichung dargestellt. L und R stehen für die linke bzw. rechte Netzhaut. Die Skalenbalken sind 800 bzw. 400 m. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Ausdrücke von Hypoxie-responsiven Genen nach tBCCAO. Quantitative Analysen zeigten eine vorübergehende Zunahme der Bnip3 mRNA-Expression in der rechten Netzhaut mit statistischer Signifikanz 12 Stunden nach tBCCAO. Die Epo mRNA-Expression zeigte 24 Stunden nach tBCCAO eine zunehmende Tendenz in der rechten Netzhaut, obwohl sich ihre Werte im Vergleich zur scheinoperierten rechten Netzhaut nicht signifikant unterschieden. P < 0,01. Die Daten wurden mit dem Student es t-test analysiert und als Mittelwert mit ±Standardabweichung dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 3: Visuelle Funktion im linken Auge nach tBCCAO. Quantitative Analysen zeigten, dass sich die Amplituden von A- und B-Wellen im linken Auge nicht veränderten (Schein: n = 5, tBCCAO: n = 6). P > 0,05. Die Daten wurden mit dem Student es t-test analysiert und als Mittelwert mit ±Standardabweichung dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 4: Überlebensraten nach tBCCAO in C57BL6 und BALB. Kaplan-Meier-Überlebenskurven zeigten, dass fast alle Mäuse innerhalb von 3 Tagen nach tBCCAO bei C57BL6-Mäusen starben. Wenn es um BALB-Mäuse geht, führt eine längere Spannzeit in tBCCAO zu einem plötzlichen und schweren Tiertod (Überlebensraten an Tag 7, 20 Sek.: 10 %, 10 Sek.: 20 %, 2 Sek.: 81 % und 0 Sek. 95 %). Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 5: HIF-1-Stabilisierung nach einseitiger CCAO. Eine repräsentative Immunoblot- und quantitative Analyse (Schein: n = 3, einseitige CCAO: n = 3) für HIF-1 und β-Actin zeigte, dass HIF-1" 3 Stunden nach einseitigem CCAO nicht in der Netzhaut stabilisiert wurde. P > 0,05. Die Daten wurden mit dem Student es t-test analysiert und als Mittelwert mit ±Standardabweichung dargestellt. L und R stehen für die linke bzw. rechte Netzhaut. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 6: Schweres Augenlid-Abtropfen nach tBCCAO mit langer Spannzeit. 10 Sekunden tBCCAO induzierten schweres Augenlid-Absinken, das anhand einer 4-Punkt-Bewertungsskala beurteilt wurde: 1 = kein Absinken, 2 = leichtes Absinken (50 %), 3 = schweres Abtropfen (über 50 %), und 4 = schweres Abtropfen mit Augenentladung, wie in Abbildung 2beschrieben. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
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Discussion
In der Studie haben wir gezeigt, dass tBCCAO, mit einfachen Nähten und einer Klemme, netzhautische Ischämie und begleitende Netzhautfunktionsstörung induzieren könnte. Darüber hinaus haben wir unser aktuelles Protokoll für die Entwicklung eines Mausmodells der retinalen Ischämie demonstriert ist einfacher und schneller im Vergleich zu anderen früheren Protokollen für die Entwicklung von retinalen ischämischen Verletzungsmodellen2,3,7.
Anatomisch können die linken und rechten Hirnarterien über hintere kommunizierende Arterien (PCAs) angeschlossen werden, die eine Kollateralzirkulation im Kreis von Willis ermöglichen, um eine ausreichende Blutversorgung des zentralnervösen Systems gegen Strömungsunterbrechungen oder Stenose einzelner Gefäße zu gewährleisten24,25 (Abbildung 1). Lee et al. nachgewiesene retinale Blutperfusion könnte 10 min-verzögert sein (was keine ganze Blockade der retinalen Blutperfusion in der ipsilateralen Netzhaut ist) durch permanente einseitige CCAO bei C57BL6 Mäusen13. Dies impliziert, dass die Induktion der retinalen Ischämie durch CCAO eng mit den Bedingungen der Collateral-Zirkulation im Kreis von Willis verbunden ist. C57BL6 ist bekannt als der anfälligste Mausstamm für zerebrale Ischämie durch BCCAO unter sieben Mausstämmen, einschließlich der Mausstämme unserer aktuellen Studie BALB26. Aufgrund des unvollständigen Kreises von Willis in C57BL6 führt die Unterbrechung der Hirnblutversorgung beider CCAs zu schweren Schäden im zentralen Nervensystem, die schließlich zum Tod führen. Darüber hinaus haben wir in unserer Vorstudie nicht tBCCAO in C57BL6 induzieren, da fast alle Mäuse (ca. 80%) innerhalb von 3 Tagen nach der Operation gestorben (Ergänzende Abbildung 4). Daher haben wir tBCCAO für unsere aktuelle Studie auf eine andere Mausdehnung BALB angewendet.
Um akute retinale ischämische Verletzungen in unserem BALB-Modell zu induzieren, wurde die rechte CCA dauerhaft ligiert und die linke CCA wurde angewendet, um akuten retinalen ischämischen Stress durch vorübergehende Verschluss zu verstärken. Dies liegt daran, dass Mäuse ischämischen Stress, der durch permanente BCCAO induziert wird, im Gegensatz zu Ratten, die den kompletten Kreis von Willis27haben, nicht tolerieren konnten. Als nächstes versuchten wir, die Okklusionszeit zu optimieren: verließ CCAO (0-20 Sekunden), da die Okklusionszeit als einer der Schlüsselfaktoren angesehen wurde, die ischämische Verletzungen des zentralen Nervensystems beeinflussen und sich direkt mit den Überlebensraten der experimentellen Modelle28,29verbinden. Wir fanden heraus, dass die Überlebensraten von BALB-Mäusen in einer okklusionszeitabhängigen Weise zurückgingen (Ergänzende Abbildung 4). Die Okklusion des linken CCA über 10 Sekunden zeigte eine stark höhere Sterblichkeitsrate (über 50%), während die Okklusion des linken CCA für 2 Sekunden oder keine Okklusion (oder einseitige CCAO) relativ höhere Überlebensraten (über 80%) aufwies. Daher haben wir die Gruppen (der Okklusionszeit, die 10 und 20 Sekunden beträgt) für die weiteren Experimente ausgeschlossen, da effiziente und kostengünstige Experimente nicht verfügbar sind. Als nächstes untersuchten wir, ob die Okklusion der linken CCA für 2 Sekunden oder keine Okklusion (oder einseitige CCAO) netzretinale Hypoxie induzieren könnte. HIF-1 ist ein wichtiger Regulator, der in hypoxischen Reaktionen funktioniert und unter hypoxischen Bedingungen stabilisiert wird30. In dieser Hinsicht wurde die HIF-1-Stabilisierung als allgemeiner molekularbiologischer Marker für Hypoxie verwendet. Wir konnten keine HIF-1-Stabilisierung in der Netzhaut in der Gruppe der einseitigen CCAO(Ergänzende Abbildung 5) erkennen. Interessanterweise konnten wir hIF-1-Stabilisierung in der Gruppe von 2 Sekunden von tBCCAO (Abbildung 3) erkennen. Dies impliziert, dass retinale hypoxische Belastung durch 2 Sekunden tBCCAO bei BALB-Mäusen induziert werden könnte. Daher wurden schließlich 2 Sekunden Spannzeit für unsere Studie ausgewählt, basierend auf hohen Überlebensraten nach der Operation und Induktion der retinalen Ischämie über HIF-1-Stabilisierung.
Obwohl die richtige CCA bei tBCCAO-betriebenen Mäusen dauerhaft verschlossen war, wurde die Blutperfusion 2 Minuten nach systemischer Zirkulation von FITC-Dextran teilweise in der rechten Netzhaut nachgewiesen (Ergänzende Abbildung 1). Darüber hinaus stellten wir fest, dass bei den einseitigen CCAO-betriebenen BALB-Mäusen keine Veränderung der HIF-1-Stabilisierung in der rechten Netzhaut festgestellt wurde. Dieses Phänomen könnte durch Dieauswirkungen der Kollateralzirkulation durch den Kreis von Willis erklärt werden, um die Blutversorgung der Netzhaut aufrechtzuerhalten (Abbildung 1). Obwohl wir die Auswirkungen der linken transienten CCAO auf die Blutdurchblutung auf die rechte Netzhaut nicht klar verstehen konnten, kann transiente linke CCAO zusammen mit permanenten rechten CCAO akute hypoxische Beleidigungen in der rechten Netzhaut verstärken, wie eine signifikante Veränderung der HIF-1-Expression in der rechten Netzhaut nach tBCCAO (Abbildung 3) belegt. Darüber hinaus waren die Überlebensraten von Mäusen von der Okklusionszeit des linken CCA abhängig. Zusammengenommen könnte die Intensität des retinalen ischämischen Stresses über linkes CCAO gesteuert werden.
Der Phänotyp eines tropfenden Augenlids wurde als vorbringendes Zeichen oder als pathophysiologisches Symptom schwerer neurologischer Erkrankungen, insbesondere ischämischer Schlaganfall31,32, vorgeschlagen. Der Muskel, der mit einem tropfenden Augenlid assoziiert ist, ist Levator palpebrae superioris33. Dieser Muskel wird von der seitlichen palpebralen Arterie versorgt, die einer der von OpA abgeleiteten Zweige ist. Wenn also OpA, das die Netzhaut liefert, betroffen ist, konnte man augenlidtropfendes Verhalten erkennen. Augenlidtropfen wurde bei MCAO Mausmodellen34beobachtet, die auch in unserem tBCCAO-Modell reproduziert wurden. Darüber hinaus beschrieben wir, dass das Herabfallen des Augenlids schwerwiegend wird, wenn die Okklusionszeit des linken CCA länger dauert (Abbildung 2 und Ergänzende Abbildung 6). Dies impliziert, dass die Schwere des Augenlidabfalls (indirekt als die Intensität des retinalen ischämischen Stresses bezeichnet) von der Okklusionszeit des linken CCA abhängen könnte.
Netzhautfunktionsstörungen sind eines der Ergebnisse, die bei retinalen ischämischen Retinopathien einschließlich Dernose von BCCA bei Mäusen35 und BCCAO bei Ratten36beobachtet wurden. Wir fanden heraus, dass die Amplituden der B-Welle bei den tBCCAO-betriebenen Mäusen abnahmen. Mehrere frühere Studien zeigten, dass MCAO auch eine Verringerung der Amplitude der B-Welle nach der Operationverursachte 37,38. b-Welle reflektiert einen physiologischen Zustand von Zellen in retinalen inneren Schichten, einschließlich bipolarer Zellen und Müller-Zellen39. Darüber hinaus wurde eine reaktive Gliose durch Müller-Zellen in der inneren Netzhautschicht nach tBCCAO nachgewiesen. Dieses Ergebnis wird auch in den MCAO-Modellen40,41 und anderen CCAO-Modellen13,42wiedergegeben. Zusammengenommen impliziert es, dass innere Netzhautfunktionsstörungen durch tBCCAO induziert werden könnten. Die Netzhautdicke erhöht sich nachweislich vorübergehend bei akuter retinaler Ischämie43,44. Diesen Befund haben wir auch in den tBCCAO-betriebenen Mäusen reproduziert. Diese Daten zeigen, dass die Beeinträchtigung der Durchblutung durch tBCCAO die Netzhaut erreichen und schließlich Netzhautschichten beeinflussen könnte.
Für konsistente Ergebnisse sollten anästhetische Zeit und Dauer der chirurgischen Eingriffe sowie andere Faktoren wie Gewichte und Alter von experimentellen Modellen und deren Körpertemperaturen während und nach der Operation standardisiert werden45. Insbesondere ist Aufmerksamkeit erforderlich, um die Körpertemperatur von Mäusen während des gesamten experimentellen Beobachtungszeitraums aufrechtzuerhalten. Dies liegt daran, dass Hypothermie eine vorkonditionierende Wirkung haben und ischämische Effekte durch tBCCAO46stören könnte. Obwohl wir die genaue Körpertemperatur der Mäuse in unseren Experimenten nicht messen konnten, verwendeten wir Heizkissen, um die Mäuse zu erwärmen, bis die Mäuse wieder genügend Bewusstsein erlangten. Darüber hinaus verglichen wir die tBCCAO-betriebenen Mäuse mit den scheinbetriebenen Mäusen, um mögliche verwirrende Effekte unkontrollierbarer Faktoren zu kontrollieren.
Mausstämme könnten ein zusätzlicher wichtiger variabler Faktor sein, um retinale ischämische Verletzungen durch tBCCAO zu induzieren. Erhebliche Variation des Kreises von Willis in Mausstämmen könnte zu einer unerwünschten Reduktion oder Induktion der zerebralen Ischämie einschließlich netzretinaler Ishcämie47 führen und dadurch zu Variabilitäten der Ergebnisse führen. Die Einstellung der Spannzeit wird für eine erfolgreiche tBCCAO-induzierte ischämische Retinopathie empfohlen, wenn andere Mäusestämme angewendet werden müssen.
Im Allgemeinen werden Schlaganfallfälle oder andere Hirnverletzungen ausnahmslos mit vorübergehendem oder dauerhaftem Visonverlust einhergehen48. Bis heute ist das MCAO-Mausmodell weit verbreitet für Schlaganfallstudien. Da OpA proximal zum Ursprung von MCA stammt, behindert jede Behinderung des Blutflusses in MCA den Fluss zur Netzhaut. Die Retinale Ischämie wurde zuerst bei Ratten von MCAO37nachgewiesen. Später wurde das gleiche retinale ischämische Modell auf Mäuse angewendet49. Jedoch, für den Eingriff, Okklusion dauert mehr als 60 Minuten und die Suche nach einer Okklusion Stelle ist extrem schwierig, da MCA tief im Gehirn vergraben ist. Darüber hinaus entscheidet die Filamentgröße und Einfügelänge für MCAO stark über den Erfolg der Operation. Diese zusätzlichen variablen Faktoren induzieren Variabilitäten der ischämischen Ergebnisse nach der Operation. Obwohl direkte Vergleichsstudien zwischen tBCCAO und MCAO erforderlich sind, haben wir in dieser Studie die positiven Merkmale unserer experimentellen Modelle beschrieben: kurze Okklusionszeit, einfaches experimentelles Verfahren und hochzugängliche Okklusionsstellen. Dieses Modell kann die Bedenken in MCAO-Modellen lösen.
Während die Verwendung des Mausmodells der retinalen Ischämie große Vorteile für das Studium der retinalen ischämischen Verletzungen hat, gibt es weiterhin Einschränkungen in diesem Ansatz. Da für das Verfahren ein chirurgischer Schnitt in den Hals, die Trennung der Speicheldrüsen und die Okklusion in der rechten CCA mit Nähten angewendet werden müssen, können die begleitenden Gewebestörungen systemische oder zumindest lokal damit verbundene Entzündungen hervorrufen. Diese Bedenken wurden teilweise mit den scheinoperierten Mäusen behoben, bei denen alle chirurgischen Schritte ohne tBCCAO durchgeführt werden. Ein weiteres Problem ist die Anforderung, Schmerzen zu bewältigen, die während und nach der Operation auftreten. In unserer Studie wurde das Schmerzmanagement zur Vorbeugung von Leiden der Mäuse durch die Injektion von Butorphanol-Tartratlösung, einem synthetisch abgeleiteten Opioid-Agonist-Antagonisten-Analgetikum der Phenanthren-Serie, angewendet. Es könnte wichtig sein, sich bewusst zu sein, dass die Verwendung von verschiedenen Arten von Anästhetika und Analgetika Die Auswirkungen von tBCCAO auf retinale Ischämie stören kann. Eine weitere Einschränkung dieses Ansatzes (zusammen mit den Ansätzen der derzeit verwendeten anderen Modelle) ist, dass es keine perfekte Simulation von Pathologien im Zusammenhang mit menschlichen kardiovaskulären Netzhauterkrankungen bietet. Bis heute leiden Mausmodelle, die für solche Experimente verwendet werden, nicht an Komorbiditäten, die ischämischen Retinopathien beim Menschen zugrunde liegen, hauptsächlich mit metabolischem Syndrom wie Diabetes50. Solche Komplikationen, die in aktuellen Mausmodellen nicht vorhanden sind, könnten negative synergistische Auswirkungen auf die pathologischen Pfade für die Entwicklung ischämischer Retinopathien haben. Daher sollte dies bei der Interpretation der Ergebnisse der derzeit verwendeten experimentellen Modelle einschließlich unseres tBCCAO-Mausmodells berücksichtigt werden. Um pathophysiologische Mechanismen ischämischer Retinopathien beim Menschen besser zu verstehen, kann unser Modell mit anderen pathologischen Faktoren wie Streptozotocin-Injektion51 oder fettreiche Diätergänzung52 für die Entwicklung der ischämischen diabetischen Retinopathie kombiniert werden. Schließlich konnten wir, obwohl wir eine reduzierte Retinalblutperfusion bei den tBCCAO-operierten Mäusen zeigten, die Auswirkungen der linken transienten CCAO auf die Blutdurchblutung auf die rechte Netzhaut nicht klar verstehen. Diese Angelegenheit könnte mit Laser-Doppler angegangen werden, die in der Regel verwendet wird, um zu bestätigen, dass Okklusion stattgefunden hat und Ischämie in vivo in Echtzeit aufgetretenist 53,54. Diese Technik könnte für ein besseres Verständnis der retinalen Ischämie in einer einzelnen tBCCAO-betriebenen Maus in Bezug auf die Kollateralzirkulation im Kreis von Willis verwendet werden.
Trotz dieser Einschränkungen stellt unsere hier beschriebene tBCCAO-Methode einen effektiven Ansatz zur Herstellung von retinaler Ischämie bei Mäusen dar. Die Untersuchung von Netzhautveränderungen durch tBCCAO hilft, pathologische Mechanismen ischämischer Retinopathien beim Menschen zu entwirren. Darüber hinaus hoffen wir, dass das tBCCAO-Mausmodell für das In-vivo-Drogenscreening verwendet werden könnte.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Grants-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (18K09424 an Toshihide Kurihara und 20K18393 an Yukihiro Miwa) vom Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atipamezole hydrochloride | Zenoaq | Antisedan | For anti-anesthesia |
| Applied Biosystems 7500 Fast | Applied Biosystems | - | For qPCR |
| Butorphanol tartrate | Meiji Seika Pharma | Vetorphale | For anesthesia |
| BZ-II Analyzer | KEYENCE | - | For an image merge |
| BALB/cAJc1 | CLEA | - | Mouse strain |
| β-Actin (8H10D10) Mouse mAb | CST | 3700 | For western blot |
| Clamp Forcep | World Precision Instruments | WPI 500451 | For surgery |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11251-10 | For surgery |
| DAPI solution | Dojindo | 340-07971 | For IHC |
| Envisu SD-OCT system | Leica | R4310 | For OCT |
| FITC-dextran | Merk | FD2000S | For retinal blood perfusion |
| Fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-9000 | For fluorescence detection |
| Gatifloxacin hydrate | Senju Pharmaceutical | Gachifuro | For anti-bacterial infection |
| GFAP Monoclonal Antibody (2.2B10) | Thermo | 13-0300 | For IHC |
| Heating pad | Marukan | RH-200 | For surgery |
| HIF-1α (D1S7W) XP Rabbit mAb | CST | 36169 | For western blot |
| ImageQuant LAS 4000 mini | GE Healthcare | - | For chemiluminescence |
| Midazolam | Sandoz K.K | SANDOZ | For anesthesia |
| Microtome Tissue-Tek TEC 6 | Sakura | - | For sectioning |
| Medetomidine | Orion Corporation | Domitor | For anesthesia |
| Needle holder | Handaya | HS-2307 | For surgery |
| PuREC | MAYO Corporation | - | For ERG |
| Scissor | Fine Science Tools | 91460-11 | For surgery |
| Sodium hyaluronate | Santen Pharmaceutical | Hyalein | For eye lubrication |
| Tropicamide/Penylephrine hydrochloride | Santen Pharmaceutical | Mydrin-P | For mydriasis |
| 6-0 silk suture | Natsume | E12-60N2 | For surgery |
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