Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

En murin modell av iskemisk retinal skade indusert av forbigående bilaterale felles halspulsåren okklusjon

Published: November 12, 2020 doi: 10.3791/61865
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,4, 1,2
1Laboratory of Photobiology, Keio University School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, Keio University School of Medicine, 3Animal eye care, Tokyo Animal Eye Clinic, 4Tsubota Laboratory, Inc.
* These authors contributed equally

Summary

Her beskriver vi en musemodell av retinal iskemi ved forbigående bilateral felles halspulsåren okklusjon ved hjelp av enkle suturer og en klemme. Denne modellen kan være nyttig for å forstå de patologiske mekanismene i retinal iskemi forårsaket av kardiovaskulære abnormiteter.

Abstract

Ulike vaskulære sykdommer som diabetisk retinopati, okklusjon av retinale årer eller arterier og okulært iskemisk syndrom kan føre til retinal iskemi. For å undersøke patologiske mekanismer av retinal iskemi, må relevante eksperimentelle modeller utvikles. Anatomisk, en hoved retinal blodtilførselsfartøy er oftalmisk arterie (OpA) og OpA stammer fra den indre halspulsåren i den vanlige halspulsåren (CCA). Dermed kan forstyrrelse av CCA effektivt forårsake retinal iskemi. Her etablerte vi en musemodell av retinal iskemi ved forbigående bilateral felles halspulsåren okklusjon (tBCCAO) for å knytte riktig CCA med 6-0 silkesuturer og å okkludere venstre CCA forbigående i 2 sekunder via en klemme, og viste at tBCCAO kunne indusere akutt retinal iskemi som fører til retinal dysfunksjon. Den nåværende metoden reduserer avhengigheten av kirurgiske instrumenter ved bare å bruke kirurgiske nåler og en klemme, forkorter okklusjonstid for å minimere uventet dyredød, som ofte ses i musemodeller av midtre cerebral arterie okklusjon, og opprettholder reproduserbarhet av vanlige retinale iskemiske funn. Modellen kan brukes til å undersøke patofysiologien til iskemiske retinopatier hos mus og videre kan brukes til in vivo narkotikascreening.

Introduction

Netthinnen er et nevrosensorisk vev for visuell funksjon. Siden en betydelig mengde oksygen er nødvendig for visuell funksjon, er netthinnen kjent som en av de høyeste oksygen krevende vev i kroppen1. Netthinnen er utsatt for vaskulære sykdommer som oksygen leveres gjennom blodårene. Ulike typer vaskulære sykdommer, som diabetisk retinopati og retinal blodkar (årer eller arterier) okklusjon, kan indusere retinal iskemi. For å undersøke patologiske mekanismer av retinal iskemi anses reproduserbare og klinisk relevante eksperimentelle modeller av retinal iskemi nødvendig. Midt cerebral arterie okklusjon (MCAO) ved innsetting av en intraluminal filament er den mest generelt benyttede metoden for utvikling av in vivo gnagermodeller av eksperimentell cerebraliskemi 2,3. På grunn av nærheten til oftalmisk arterie (OpA) til MCA, brukes MCAO-modeller også samtidig til å forstå patofysiologien til retinal iskemi4,5,6. For å indusere cerebral iskemi sammen med retinal iskemi, er lange filamenter vanligvis satt inn gjennom snitt av den vanlige halspulsåren (CCA) eller den ytre halspulsåren (ECA). Disse metodene er vanskelige å utføre, krever lang tid for å fullføre operasjonen (over 60 minutter for en mus), og fører til høye variasjoner i resultatene etter operasjonen7. Det er fortsatt viktig å utvikle en bedre modell for å forbedre disse bekymringene.

I denne studien brukte vi ganske enkelt kort forbigående bilateral CCA-okklusjon (tBCCAO) med nåler og en klemme for å indusere retinal iskemi hos mus og analyserte typiske resultater av iskemiske skader i netthinnen. I denne videoen vil vi gi en demonstrasjon av tBCCAO-prosedyren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder som er beskrevet her har blitt godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) av Keio University School of Medicine.

1. Fremstilling av kirurgiske instrumenter og dyr

  1. Autoklav kirurgiske instrumenter og holde dem i 70% etylalkohol. Før hver nye kirurgiske prosedyre, rengjør kirurgiske instrumenter forsiktig ved hjelp av 70% etylalkohol.
  2. Forbered hann BALB/cAJc1-mus (6 uker gammel, 26-28 kg) i et spesifikt patogenfritt (SPF) rom for å opprettholde sterile forhold før, under og etter operasjonen.

2. Forbigående bilateral felles halspulsåren okklusjon (tBCCAO)

  1. Sett en mus under anestesi via intraperitoneal injeksjon med en kombinasjon av midazolam (40 μg/100 μL), medetomidin (7,5 μg/100 μL) og butorphanol tartrat (50 μg/100 μL), kalt "MMB", som tidligere beskrevet8,9. Hold musens ryggskinn for å holde musen borte fra å støte øynene til musen er helt bedøvet.
    1. Døm dybden av anestesi ved å klemme musetåen til den ikke har noe svar, hvorav metoden ofte brukes til å sjekke fullstendig anestesi10.
      MERK: Vanligvis er mindre enn 5 min nødvendig for at mus skal sovne. Riktige oppskrifter for generell anestesi kan være forskjellig av institusjoner.
  2. Påfør en dråpe på 0,1% renset natriumhyaluronat øyedråpeløsning på øynene for å forhindre tørrhet på øynene under anestesi.
  3. Plasser musen på ryggen og fest musens poter ved hjelp av selvklebende bånd.
  4. Desinfiser nakkeområdet av musen ved hjelp av 70% etylalkohol før operasjonen.
    MERK: Ytterligere klipping av pelsen ble ikke utført, da dette kan føre til påfølgende hudbetennelse11,12.
  5. Utfør sagittal snitt i nakken med et blad (Figur 1).
    MERK: Snittet må gjøres på midtlinjen mellom nakke, brystben og luftrør.
  6. Skill begge spyttkjertlene nøye ved hjelp av to tang og mobiliser dem for å visualisere de underliggende CCAene.
  7. Isoler riktig CCA nøye fra de respektive vagalnervene og tilhørende årer uten å skade deres strukturer, og legg to 6-0 silkesuturer under CCA. Bind de to båndene tett for å blokkere blodstrømmen (figur 1).
    MERK: Under prosedyren kan små årer bli skadet. Hvis blødning er sett, tørke er nødvendig for å visualisere CCAs tydelig.
  8. Finn venstre CCA nøye fra de respektive vagal nerver og tilhørende årer uten å skade deres strukturer, og okkluder venstre CCA i 2 sekunder med en klemme (Figur 1).
    MERK: En 6-0 silkesuge nål er nødvendig for å plasseres under venstre CCA for å markere et sted for klemming.
  9. Etter gjenåpning av venstre CCA, sutur sår i nakken av en 6-0 silke sutur og bruke en dab av antibiotika (50 μL) på halsen for å hemme bakteriell infeksjon.
    MERK: Fjern en klemme mykt for å unngå å skade arteriell vegg ved gjenåpning av venstre CCA.
  10. Injiser 0,75 mg/kg atipamezolhydroklorid intraperitonealt til musen for å hjelpe musen gjenopprettet fra dypbedøvelse raskt. Returner musen til et musebur med forvarmede pads.
    MERK: Ikke la musen stå uten tilsyn før musen gjenvinner tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency.
  11. Injiser 0,4 mg/kg butorphanol tartrat til musen for håndtering av smerte når musen våkner.
    MERK: Protokollen kan settes på pause her. Som et første hint for vellykket tBCCAO, kan øyelokk hengende mus observeres (figur 2).
  12. For eutanasi, injiser 3x MMB-blanding til musene og ofre dem for eksperimenter.

3. Generelle observasjoner (overlevelsesrater og øyelokk hengende)

  1. Etter operasjonen, sjekk overlevelse for alle dødsårsaker på dag 0 (etter operasjonen), 1, 3 og 7.
  2. Vurder øyelokket hengende med en 4-punkts rating skala: 1 = ingen hengende, 2 = mild hengende (~ 50%), 3 = alvorlig hengende (over 50%), og 4 = alvorlig hengende med øyeutslipp.

4. Retinal blodperfusjon

  1. Injiser 200 μL FITC-dextran (25 mg/ml) i venstre ventrikkel av musen, som vanligvis brukes til observasjon av blodperfusjon i mus retinal fartøy13,14.
  2. 2 minutter etter sirkulasjon, enucleate øynene og fikse i 4% paraformaldehyd i 1 time. Netthinnen ble nøye oppnådd og flatmontert, som tidligere beskrevet15, og undersøkt via et fluorescensmikroskop.
  3. Ta bilder av retinal hele mounts på 4x forstørrelse og slå sammen i en enkelt ved hjelp av en fusjon analysator, tidligere beskrevet16.
  4. Mål de perfunderte områdene via et fartøyanalyseverktøy i NIH Fiji/ImageJ-programvaren.

5. Vestlig flekk

  1. 3 og 6 timer etter tBCCAO, få øynene til mus og umiddelbart overføre til en petriskål som inneholder kald PBS for å isolere netthinnen.
  2. Etter isolering av netthinnen, utfør vestlig blotting, som tidligere beskrevet9.
  3. Inkuber med antistoffer mot hypoksi-induserbar faktor-1α (HIF-1α; en generell hypoksimarkør) og for β-Actin (en intern lastekontroll) over natten etterfulgt av inkubasjon av HRP-konjugerte sekundære antistoffer. Visualiser signalene via chemiluminescence.

6. Kvantitativ PCR (qPCR)

  1. 6, 12 og 24 timer etter tBCCAO, behandle de oppnådde netthinnen for qPCR, som tidligere beskrevet17.
  2. Utfør qPCR via PCR-system i sanntid. Primere som brukes, er oppført i tabell 1. Beregn foldeendringer mellom nivåer av forskjellige transkripsjoner ved hjelp av ΔΔCT-metoden.

7. Immunohistochemistry (IHC)

  1. 3 dager etter tBCCAO, få øynene til mus og embed i parafin.
  2. Klipp parafin-innebygde øyne med en mikrotom for å oppnå øyeseksjonene.
  3. De-parafinize og flekk øyeseksjoner av 5 μm tykkelse som tidligere beskrevet13.
  4. Inkuber med et antistoff for glialflimmersyreprotein (GFAP; en pålitelig markør for astrocytter og Müller-celler i netthinnen) over natten etterfulgt av inkubasjon av Alexa Fluor 555-konjugert sekundært antistoff.
  5. Bruk DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindol) for flekker kjernen i netthinnen. Visualiser signaler via et fluorescensmikroskop.
  6. Vurdere morfologi scoring med en 4-punkts rating skala, som tidligere beskrevet13,18: 0 = ingen signal, 1 = få positive glial end-føtter i ganglion celle lag (GCL), 2 = få merkede prosesser som strekker seg fra GCL til det ytre kjernefysiske laget (ONL), og 3 = mest merkede prosesser som strekker seg fra GCL til ONL.

8. Elektroretinografi (ERG)

  1. 3 og 7 dager etter tBCCAO, utføre ERG ved hjelp av en Ganzfeld kuppel, oppkjøp system og LED stimulatorer, som tidligere beskrevet9.
  2. Etter mørk tilpasning over natten, bedøve mus med en kombinasjon av MMB under svakt rødt lys.
  3. Bruk en blandet løsning på 0,5% tropicamid og 0,5% fenylefrin for å utvide elevene.
  4. Plasser de aktive elektrodene på kontaktlinsen og plasser referanseelektroden i munnen.
  5. Få ERG svar fra begge øynene til hvert dyr.
  6. Ta opp scotopic svar under mørk tilpasning med ulike stimuli.
  7. Mål amplitudene til en bølge fra grunnlinjen til det laveste punktet i en bølge.
  8. Mål amplitudene av b-bølge fra det laveste punktet av en bølge til toppen av b-bølge.
  9. Hold alle musene varme under prosedyren ved hjelp av varmeputer.

9. Optisk sammenhengtomografi (OKT)

  1. 2 uker etter tBCCAO, utføre OCT ved hjelp av SD-OCT system, som tidligere rapportert8,9.
  2. For målingen, subjekmus til mydriasis ved en blandet løsning på 0,5% tropicamid og 0,5% fenylefrin, og til generell anestesi ved en blanding av MMB.
  3. Få B-skannebilder fra ekvatorialskiver av en-face-skanninger.
  4. Undersøk netthinnen på 0,2, 0,4 og 0,6 mm fra synsnervehodet.
  5. Mål retinal tykkelse fra retinal nerve fiber lag (NFL) til ekstern begrensende membran (ELM), og vurdere gjennomsnittet av målte verdier som retinal tykkelse av en individuell mus.
  6. Plott resultatene som edderkoppdiagrammer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etter systemisk sirkulasjon av FITC-dextran i 2 minutter ble retinale vaskulaturer i venstre og høyre netthinnen i de sham-opererte musene og tBCCAO-opererte mus undersøkt (supplerende figur 1). FITC-dextran var fullt synlig i begge netthinnen i de sham-opererte musene og venstre netthinnen i de tBCCAO-opererte musene, mens den var delvis påviselig i høyre netthinnen i de tBCCAO-opererte musene.

Etter tBCCAO ble øyelokk hengende undersøkt (figur 2). De riktige øynene viste milde (score 2; 75%) og alvorlig øyelokk (score 3 og 4; 25 %) hengende, mens venstre øyne ikke hadde noen hengende (score 1; 93,75%) bortsett fra en mus (score 2; 6,25%). Selv om alvorlig øyelokk hengende med øyeutslipp ikke ble betydelig observert i de tBCCAO-opererte musene, kunne vi se en mus for denne fenotypen (score 4; 6,25%).

Redusert oksygenstatus i vev fører til stabilisering av HIF-1α og induksjon av en rekke hypoksiresponsive gener som EPO, VEGF og BNIP319,20,21. Først av alt ble molekylær biologisk hypoksi ved hjelp av en generell hypoksisk markør HIF-1α evaluert via vestlig blotting (figur 3). Økt HIF-1α-uttrykk ble signifikant observert i høyre netthinnen 3 og 6 timer etter tBCCAO. Deretter ble uttrykk for hypoksiresponsive gener evaluert via qPCR (tilleggsfigur 2). Det var ingen signifikant endring i hypoksiresponsive genuttrykk 6 timer etter tBCCAO. 12 timer etter tBCCAO fant vi Binp3-uttrykket betydelig økt og en liten økning i Epo-uttrykk ble vist i riktig netthinnen. 24 timer etter tBCCAO kunne vi også finne en liten økning i Epo-uttrykk i riktig netthinnen, selv om det ikke var statistisk signifikant. Vegf-uttrykket ble ikke endret fra 6 til 24 timer hos de tBCCAO-opererte musene.

Retinal reaktiv gliose ble undersøkt 3 dager etter tBCCAO (figur 4), som glia som astrocytter og Müller celler har vært nært forbundet med retinal iskemi22. GFAP har blitt mye brukt til påvisning av astrocytter og Müller celler i retina23. Gjennomsnittet av morfologiscore for GFAP-merking i høyre netthinnen var den høyeste blant de begge netthinnen i de sham-opererte musene og venstre netthinnen i de tBCCAO-opererte musene. Basert på lokalisering av GFAP-uttrykk, anses en endring i morfologi i GFAP-merking for å gjenspeile aktivering av Müller-celler.

ERG ble brukt til å undersøke retinal dysfunksjon etter tBCCAO (figur 5). Amplitudene av b-bølge i høyre øye dramatisk redusert 3 og 7 dager etter tBCCAO. Imidlertid ble amplitudene til en bølge i høyre øye ikke signifikant endret. Når det gjelder venstre øye, kunne vi ikke se noen endringer i amplitudene til a- og b-bølger (Supplerende figur 3).

Vi utførte OCT for å bestemme en endring i retinal tykkelse etter tBCCAO (Figur 6). Retinal tykkelse i høyre øye dramatisk økt 2 uker etter tBCCAO, mens det var ingen forskjell i retinal tykkelse i venstre øye mellom tBCCAO- og sham-opererte mus.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk modellprosedyre og blodsirkulasjon i sirkelen av Willis. En skjematisk illustrasjon viste tBCCAO-indusert retinal iskemisk musemodell prosedyre og blodsirkulasjon til netthinnen. CCA, ECA, ICA, PCA og OpA representerer den vanlige halspulsåren, ekstern halspulsåren, indre halspulsåren, bakre kommuniserende arterie og oftalmisk arterie, henholdsvis. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Øyelokk hengende etter tBCCAO. Alvorlighetsgraden av øyelokk hengende ble vurdert ved 4-punkts vurdering basert på referansebildene: 1 = ingen hengende, 2 = mild hengende (~ 50% hengende), 3 = alvorlig hengende (over 50% hengende), og 4 = alvorlig hengende med øyeutslipp. Øyelokk hengende ble observert etter tBCCAO og det ble opprettholdt under eksperimentell observasjon. Resultatene (sham: n = 10, tBCCAO: n = 16) ble plottet som en scatter dot plot. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: HIF-1α stabilisering etter tBCCAO. Representative immunoblots og kvantitative analyser (grupper for time 3; sham: n = 3, tBCCAO: n = 6 og grupper for time 6; sham og tBCCAO: n = 6) for HIF-1α og β-Actin viste at HIF-1α ble stabilisert i høyre netthinnen 3 og 6 timer etter tBCCAO. *P < 0,05. Dataene ble analysert ved hjelp av Studentens t-testog presentert som gjennomsnitt med ±standardavvik. L og R står for henholdsvis venstre og høyre netthinnen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Reaktiv gliose etter tBCCAO. Representative sagittal deler av netthinnen (sham: n = 4, tBCCAO: n = 4) og kvantitative analyser av GFAP merking (rød) av en morfologi scoring (0-3) viste at GFAP merking, for det meste begrenset i NFL + GCL, ble utvidet til hele indre lag, fra GCL til ONL (hvite piler) i høyre netthinnen etter tBCCAO. Skaler stenger, 50 μm. DAPI (blå) ble brukt til å fargekjernen i netthinnen. NFL, GCL, IPL, INL og ONL representerer henholdsvis nervefiberlaget, ganglioncellelaget, det indre pleksiformlaget, det indre kjernefysiske laget og det ytre kjernefysiske laget. Dataene ble analysert ved hjelp av Studentens t-testog presentert som median med interkvartil rekkevidde, 25th og 75th persentil. *P < 0,05. L og R står for henholdsvis venstre og høyre netthinnen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Visuell dysfunksjon i høyre øye etter tBCCAO. (A)Representative bølgeformer av mørktilpasset ERG utført 3 og 7 dager etter tBCCAO. Stimuleringsintensitet (cd.s/m2): 0,005. (B)Kvantitative analyser viste at det var en reduksjon i amplitudene av b-bølge i høyre øye (sham: n = 5, tBCCAO: n = 6) mens amplitudene til en bølge ikke ble endret. *P < 0,05, **P < 0,01. Dataene ble analysert ved hjelp av Studentens t-testog presentert som gjennomsnitt med ±standardavvik. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: En endring i retinal tykkelse etter tBCCAO. Representative OCT-bilder i sham- og tBCCAO-opererte netthinnen og kvantitative analyser viste at det var en økning i retinal tykkelse i høyre netthinnen (sham: n = 4, tBCCAO: n = 8). Det var ingen endring i retinal tykkelse i venstre netthinnen (sham: n = 4, tBCCAO: n = 8). Skaleringsstolper er henholdsvis 200 (øvre) og 100 (nedre) μm. *P < 0,05. Verdiene i den horisontale aksen i diagrammene representerer 0,2, 0,4 og 0,6 mm fjernt fra synsnervehodet (0) som ble oppdaget av den grønne linjen. Dataene ble analysert ved hjelp av toveis ANOVA etterfulgt av en Bonferroni post hoc test. Edderkoppdiagrammer ble presentert som gjennomsnitt med ± standardavvik. NFL, INL, ONL og ELM er henholdsvis nervefiberlaget, det indre kjernefysiske laget, det ytre kjernefysiske laget og den eksterne begrensende membranen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggstall 1: Retinal blodperfusjon etter tBCCAO. Representative retinal flat mount bilder (med høyere forstørrelse av hvert bilde) etter 2 min FITC-dextran sirkulasjon og kvantitative analyser viste at full perfusjon var observerbar i begge netthinnen i sham-opererte mus og venstre netthinnen i tBCCAO-opererte mus. Riktig netthinnen i de tBCCAO-opererte musene viste imidlertid delvis blodperfusjon. Dataene ble analysert ved hjelp av Studentens t-testog presentert som gjennomsnitt med ±standardavvik. L og R står for henholdsvis venstre og høyre netthinnen. Skaleringsstolper er henholdsvis 800 og 400 μm. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.

Supplerende figur 2: Uttrykk for hypoksiresponsive gener etter tBCCAO. Kvantitative analyser viste en forbigående økning i Bnip3 mRNA-uttrykk i høyre netthinnen med statistisk signifikans 12 timer etter tBCCAO. Epo mRNA uttrykk viste en økende tendens i høyre netthinnen i 24 timer etter tBCCAO, selv om verdiene ikke var vesentlig forskjellige i forhold til sham-opererte høyre netthinnen. **P < 0,01. Dataene ble analysert ved hjelp av Studentens t-testog presentert som gjennomsnitt med ±standardavvik. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.

Tilleggsfigur 3: Visuell funksjon i venstre øye etter tBCCAO. Kvantitative analyser viste at det ikke var noen endring i amplitudene til a- og b-bølger i venstre øye (sham: n = 5, tBCCAO: n = 6). P > 0,05. Dataene ble analysert ved hjelp av Studentens t-testog presentert som gjennomsnitt med ±standardavvik. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.

Tilleggstall 4: Overlevelsesrater etter tBCCAO i C57BL6 og BALB. Kaplan-Meier overlevelseskurver viste at nesten alle mus døde innen 3 dager etter tBCCAO hos C57BL6 mus. Når det gjelder BALB-mus, induserer lengre klemtid i tBCCAO plutselig og alvorlig dyredød (overlevelse på dag 7, 20 sek: 10%, 10 sek: 20%, 2 sek: 81%, og 0 sek: 95%). Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.

Tilleggstall 5: HIF-1α stabilisering etter ensidig CCAO. En representativ immunoblot og kvantitativ analyse (sham: n = 3, ensidig CCAO: n = 3) for HIF-1α og β-Actin viste at HIF-1α ikke ble stabilisert i netthinnen 3 timer etter ensidig CCAO. P > 0,05. Dataene ble analysert ved hjelp av Studentens t-testog presentert som gjennomsnitt med ±standardavvik. L og R står for henholdsvis venstre og høyre netthinnen. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.

Tilleggsfigur 6: Alvorlig øyelokk hengende etter tBCCAO med lang klemtid. 10 sekunder med tBCCAO indusert alvorlig øyelokk hengende, som ble vurdert av en 4-punkts rating skala: 1 = ingen hengende, 2 = mild hengende (~ 50%), 3 = alvorlig hengende (over 50%), og 4 = alvorlig hengende med øyeutslipp, som beskrevet i figur 2. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I studien har vi vist at tBCCAO, ved hjelp av enkle suturer og en klemme, kan indusere retinal iskemi og tilhørende retinal dysfunksjon. Videre har vi demonstrert vår nåværende protokoll for utvikling av en musemodell av retinal iskemi er enklere og raskere i forhold til andre tidligere protokoller for utvikling av retinal iskemisk skade modeller2,3,7.

Anatomisk kan venstre og høyre cerebrale arterier kobles via bakre kommuniserende arterier (PCAer) som gir sikkerhet sirkulasjon i sirkelen av Willis for å opprettholde tilstrekkelig blodtilførsel til sentralnervesystemet mot strømningsavbrudd fra okklusjoner eller stenose av individuellefartøy 24,25 ( figur1). Lee et al. demonstrert retinal blodperfusjon kan være 10 min-forsinket (som ikke er en hel blokade av retinal blod perfusjon i ipsilateral netthinnen) ved permanent ensidig CCAO i C57BL6 mus13. Dette innebærer at induksjon av retinal iskemi av CCAO er nært forbundet med forhold for sikkerhet sirkulasjon i sirkelen av Willis. C57BL6 er kjent for å være den mest utsatte musestammen til cerebral iskemi av BCCAO blant syv musestammer, inkludert vår nåværende studies musestamme BALB26. På grunn av den ufullstendige sirkelen av Willis i C57BL6 induserer avbrudd av hjerneblodtilførsel fra begge CCAene alvorlige skader i sentralnervesystemet, noe som til slutt fører til døden. I tillegg, i vår foreløpige studie, klarte vi ikke å indusere tBCCAO i C57BL6 som nesten alle musene (ca. 80%) døde innen 3 dager etter operasjonen (Tilleggstall 4). Derfor brukte vi tBCCAO på en annen musestamme BALB for vår nåværende studie.

For å indusere akutte retinale iskemiske skader i vår BALB-modell, ble høyre CCA permanent ligated og venstre CCA ble brukt for å øke akutt retinal iskemisk stress gjennom forbigående okklusjon. Dette er fordi mus ikke kunne tolerere iskemisk stress indusert av permanent BCCAO i motsetning til rotter som har hele sirkelen av Willis27. Deretter forsøkte vi å optimalisere okklusjonstiden: venstre CCAO (0-20 sekunder), da okklusjonstid har blitt ansett som en av viktige faktorer som påvirker iskemiske skader på sentralnervesystemet og kobles direkte til overlevelsesraten til eksperimentellemodeller 28,29. Vi fant at overlevelsesraten til BALB-mus gikk ned på en okklusjonstidsavhengig måte (tilleggstall 4). Okklusjon av venstre CCA over 10 sekunder viste alvorlig høyere dødelighet (over 50%), mens okklusjon av venstre CCA i 2 sekunder eller ingen okklusjon (eller ensidig CCAO) viste relativt høyere overlevelse (over 80%). Derfor utelukket vi gruppene (av okklusjonstid som er 10 og 20 sekunder) for de videre eksperimentene, da effektive og kostnadseffektive eksperimenter ikke kan være tilgjengelige. Deretter undersøkte vi om okklusjon av venstre CCA i 2 sekunder eller ingen okklusjon (eller ensidig CCAO) kunne indusere retinal hypoksi. HIF-1α er en stor regulator som fungerer i hypoksiske responser og stabiliseres under hypoksiske forhold30. I denne forbindelse har HIF-1α stabilisering blitt brukt som en generell molekylær biologisk markør for hypoksi. Vi kunne ikke oppdage HIF-1α stabilisering i netthinnen i gruppen av ensidig CCAO (Supplerende figur 5). Interessant, kunne vi oppdage HIF-1α stabilisering i gruppen på 2 sekunder av tBCCAO (Figur 3). Dette innebærer at retinal hypoksisk stress kan induseres med 2 sekunder med tBCCAO hos BALB-mus. Derfor ble 2 sekunder med klemtid endelig valgt ut for vår studie basert på høy overlevelse etter operasjonen og induksjon av retinal iskemi via HIF-1α stabilisering.

Selv om riktig CCA ble permanent okkludert i tBCCAO-opererte mus, ble blodperfusjon delvis påvist i riktig netthinnen 2 minutter etter systemisk sirkulasjon av FITC-dextran (tilleggsfigur 1). Videre fant vi at en endring i HIF-1α stabilisering ikke ble oppdaget i riktig netthinnen i de ensidige CCAO-opererte BALB-musene. Dette fenomenet kan forklares med effekter av sikkerhet sirkulasjon gjennom sirkelen av Willis for å opprettholde blodtilførselen til netthinnen (Figur 1). Selv om vi ikke kunne klart forstå effekten av venstre forbigående CCAO på blodperfusjon til høyre netthinnen, forbigående venstre CCAO sammen med permanent høyre CCAO kan øke akutte hypoksiske fornærmelser i høyre netthinnen som det fremgår av en betydelig endring i HIF-1α uttrykk i høyre netthinnen etter tBCCAO (Figur 3). I tillegg var overlevelsesraten til mus avhengig av okklusjonstid for venstre CCA. Samlet sett kan intensiteten av retinal iskemisk stress kontrolleres via venstre CCAO.

Fenotypen av et hengende øyelokk har blitt foreslått som et fremleggstegn eller et patofysiologisk symptom på alvorlige nevrologiske tilstander, spesielt iskemisk slag31,32. Muskelen forbundet med et hengende øyelokk er levator palpebrae superioris33. Denne muskelen leveres av lateral palpebral arterie som er en av grener avledet fra OpA. Derfor, når OpA, som leverer netthinnen, påvirkes, kan øyelokk hengende ses. Øyelokk hengende ble observert i MCAO musemodeller34, som også ble gjengitt i vår tBCCAO modell. Videre beskrev vi at øyelokk hengende blir alvorlig når okklusjonstiden til venstre CCA tar lengre tid (figur 2 og supplerende figur 6). Dette innebærer at alvorlighetsgraden av øyelokk hengende (indirekte referert til som intensiteten av retinal iskemisk stress) kan være avhengig av okklusjon tid venstre CCA.

Retinal dysfunksjon er et av resultatene sett hos retinale iskemiske retinopatier, inkludert stenose av BCCA hos mus35 og BCCAO hos rotter36. Vi fant at amplitudene av b-bølge redusert i de tBCCAO-opererte musene. Flere tidligere studier viste at MCAO også forårsaket en reduksjon i amplituden av b-bølge etter operasjonen37,38. b-bølge reflekterer en fysiologisk tilstand av celler i retinale indre lag, inkludert bipolare celler og Müller celler39. Videre ble reaktiv gliose av Müller-celler oppdaget i det indre retinale laget etter tBCCAO. Dette resultatet er også gjengitt i MCAO modeller40,41 og andre CCAO modeller13,42. Tatt sammen, Det innebærer at indre retinal dysfunksjon kan induseres av tBCCAO. Retinal tykkelse er rapportert å øke forbigående i akutt retinal iskemi43,44. Vi reproduserte også dette funnet hos de tBCCAO-opererte musene. Disse dataene viser at svekkelsen av blodsirkulasjonen ved tBCCAO kan nå netthinnen og til slutt påvirke retinale lag.

For konsistente resultater bør bedøvelsestid og lengde på kirurgiske prosedyrer samt andre faktorer som vekter og aldre av eksperimentelle modeller og kroppstemperaturen under og etter operasjonen standardiseres45. Spesielt er det nødvendig med oppmerksomhet for å opprettholde kroppstemperaturen til mus gjennom den eksperimentelle observasjonsperioden. Dette skyldes at hypotermi kan ha en betinget effekt og forstyrre iskemiske effekter av tBCCAO46. Selv om vi ikke kunne måle nøyaktig kroppstemperatur hos musene i våre eksperimenter, brukte vi varmeputer for å varme musene til musene gjenvant tilstrekkelig bevissthet. Videre sammenlignet vi de tBCCAO-opererte musene med de sham-opererte musene for å kontrollere potensielle forvirrende effekter av ukontrollerbare faktorer.

Musestammer kan være en ekstra viktig variabel faktor for å indusere retinal iskemisk skade ved tBCCAO. Betydelig variasjon av sirkelen av Willis i musestammer kan føre til en uønsket reduksjon eller induksjon av cerebral iskemi inkludert retinal ishcemia47 og dermed kan føre til variasjoner i resultatene. Justering av klemtid anbefales for en vellykket tBCCAO-indusert iskemisk retinopati når andre stammer av mus er nødvendig for å påføres.

Generelt er tilfeller av hjerneslag eller andre hjerneskader alltid ledsaget av midlertidig eller permanent visontap48. Til dags dato er MCAO musemodell mye brukt for hjerneslagstudier. Som OpA stammer proksimal til opprinnelsen til MCA, enhver hindring i blodstrømmen i MCA hindrer strømmen til netthinnen. Retinal iskemi ble først demonstrert hos rotter av MCAO37. Senere ble den samme retinale iskemiske modellen brukt på mus49. Men for prosedyren tar okklusjon mer enn 60 minutter, og å finne et okklusjonssted er ekstremt vanskelig da MCA begraves dypt inne i hjernen. Videre, filament størrelse og innsetting lengde for MCAO sterkt bestemmer suksess for operasjonen. De ekstra variable faktorene induserer variabiler av de iskemiske resultatene etter operasjonen. Selv om direkte sammenligningsstudier er nødvendig mellom tBCCAO og MCAO, beskrev vi de gunstige egenskapene til våre eksperimentelle modeller i denne studien: kort okklusjonstid, enkel eksperimentell prosedyre og svært tilgjengelige okklusjonssteder. Denne modellen kan løse bekymringene sett i MCAO-modeller.

Mens bruken av musemodellen av retinal iskemi har store fordeler for å studere retinal iskemisk skade, er det fortsatt begrensninger for denne tilnærmingen. Siden kirurgisk snitt i nakken, separasjon av spyttkjertlene og okklusjon i riktig CCA med suturer må brukes til prosedyren, kan de medfølgende vevsforstyrrelsene fremkalle assosiert betennelse systemisk eller i det minste lokalt. Disse bekymringene ble delvis adressert ved hjelp av de sham-opererte musene, hvor alle kirurgiske skritt utføres uten tBCCAO. Et annet problem er et krav om å håndtere smerte som oppstår under og etter operasjonen. I vår studie ble smertebehandling for å forhindre lidelse av musene brukt gjennom injeksjon av butorphanol tartratløsning, en syntetisk avledet opioidagonist-antagonistanagetisk fenanthrene-serien. Det kan være viktig å være klar over at bruk av ulike typer anestetika og analgetika kan forstyrre effekten av tBCCAO på retinal iskemi. En annen begrensning til denne tilnærmingen (sammen med tilnærmingene til brukte andre modeller) er at den ikke gir en perfekt simulering av patologier forbundet med menneskelige kardiovaskulære retinale lidelser. Til dags dato lider musemodeller som brukes til slike eksperimenter ikke av komorbiditeter som ligger til grunn for iskemiske retinopatier hos mennesker, hovedsakelig med metabolsk syndrom som diabetes50. Slike komplikasjoner som ikke er tilstede i dagens musemodeller kan ha negative synergistiske effekter på de patologiske banene for utvikling av iskemiske retinopatier. Derfor bør dette tas i betraktning når du tolker resultatene fra de brukte eksperimentelle modellene, inkludert vår tBCCAO-musemodell. For bedre å forstå patofysiologiske mekanismer for iskemiske retinopatier hos mennesker, kan vår modell kombineres med andre patologiske faktorer som streptozotocininjeksjon51 eller høyt fett diett supplement52 for utvikling av iskemisk diabetisk retinopati. Endelig, selv om vi viste redusert retinal blodperfusjon i de tBCCAO-opererte musene, kunne vi ikke klart forstå effekten av venstre forbigående CCAO på blodperfusjon til høyre netthinnen. Denne saken kan løses ved hjelp av laser-Doppler som vanligvis brukes til å bekrefte at okklusjon har funnet sted og iskemi har skjedd in vivo i sanntid53,54. Denne teknikken kan benyttes for bedre forståelse av retinal iskemi i en individuell tBCCAO-operert mus, om sikkerhet sirkulasjon i sirkelen av Willis.

Til tross for disse begrensningene representerer vår tBCCAO-metode beskrevet her en effektiv tilnærming til å produsere retinal iskemi hos mus. Studere retinale endringer av tBCCAO bidrar til å løse patologiske mekanismer av iskemiske retinopatier hos mennesker. Videre håper vi at tBCCAO musemodell kan brukes til in vivo narkotika screening.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Grants-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (18K09424 til Toshihide Kurihara og 20K18393 til Yukihiro Miwa) fra Kunnskapsdepartementet, kultur, sport, vitenskap og teknologi (MEXT).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atipamezole hydrochloride Zenoaq Antisedan For anti-anesthesia
Applied Biosystems 7500 Fast Applied Biosystems - For qPCR
Butorphanol tartrate Meiji Seika Pharma Vetorphale For anesthesia
BZ-II Analyzer KEYENCE - For an image merge
BALB/cAJc1 CLEA - Mouse strain
β-Actin (8H10D10) Mouse mAb CST 3700 For western blot
Clamp Forcep World Precision Instruments WPI 500451 For surgery
Dumont forceps #5 Fine Science Tools 11251-10 For surgery
DAPI solution Dojindo 340-07971 For IHC
Envisu SD-OCT system Leica R4310 For OCT
FITC-dextran Merk FD2000S For retinal blood perfusion
Fluorescence microscope KEYENCE BZ-9000 For fluorescence detection
Gatifloxacin hydrate Senju Pharmaceutical Gachifuro For anti-bacterial infection
GFAP Monoclonal Antibody (2.2B10) Thermo 13-0300 For IHC
Heating pad Marukan RH-200 For surgery
HIF-1α (D1S7W) XP Rabbit mAb CST 36169 For western blot
ImageQuant LAS 4000 mini GE Healthcare - For chemiluminescence
Midazolam Sandoz K.K SANDOZ For anesthesia
Microtome Tissue-Tek TEC 6 Sakura - For sectioning
Medetomidine Orion Corporation Domitor For anesthesia
Needle holder Handaya HS-2307 For surgery
PuREC MAYO Corporation - For ERG
Scissor Fine Science Tools 91460-11 For surgery
Sodium hyaluronate Santen Pharmaceutical Hyalein For eye lubrication
Tropicamide/Penylephrine hydrochloride Santen Pharmaceutical Mydrin-P For mydriasis
6-0 silk suture Natsume E12-60N2 For surgery

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, B. Ocular effects of changes in oxygen and carbon dioxide tension. Transactions of the American Ophthalmological Society. 66, 423-474 (1968).
  2. Ingberg, E., Dock, H., Theodorsson, E., Theodorsson, A., Ström, J. O. Method parameters' impact on mortality and variability in mouse stroke experiments: a meta-analysis. Scientific Reports. 6 (1), 21086 (2016).
  3. Atochin, D. N., Clark, J., Demchenko, I. T., Moskowitz, M. A., Huang, P. L. Rapid Cerebral Ischemic Preconditioning in Mice Deficient in Endothelial and Neuronal Nitric Oxide Synthases. Stroke. 34 (5), 1299-1303 (2003).
  4. Allen, R. S., et al. Severity of middle cerebral artery occlusion determines retinal deficits in rats. Experimental Neurology. 254, 206-215 (2014).
  5. Steele, E. C., Guo, Q., Namura, S. Filamentous Middle Cerebral Artery Occlusion Causes Ischemic Damage to the Retina in Mice. Stroke. 39 (7), 2099-2104 (2008).
  6. Minhas, G., Morishita, R., Anand, A. Preclinical models to investigate retinal ischemia: advances and drawbacks. Frontiers in Neurology. 3, 75 (2012).
  7. McColl, B. W., Carswell, H. V., McCulloch, J., Horsburgh, K. Extension of cerebral hypoperfusion and ischaemic pathology beyond MCA territory after intraluminal filament occlusion in C57Bl/6J mice. Brain Res. 997 (1), 15-23 (2004).
  8. Jiang, A. X., et al. Inducement and Evaluation of a Murine Model of Experimental Myopia. Journal of Visualized Experiments. (143), e58822 (2019).
  9. Miwa, Y., et al. Pharmacological HIF inhibition prevents retinal neovascularization with improved visual function in a murine oxygen-induced retinopathy model. Neurochemistry International. 128, 21-31 (2019).
  10. Adams, S., Pacharinsak, C. Mouse Anesthesia and Analgesia. Current Protocols in Mouse Biology. 5 (1), 51-63 (2015).
  11. Speetzen, L. J., Endres, M., Kunz, A. Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia. Journal of Visualized Experiments. (75), e4387 (2013).
  12. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments. (47), e2423 (2011).
  13. Lee, D., Kang, H., Yoon, K. Y., Chang, Y. Y., Song, H. B. A mouse model of retinal hypoperfusion injury induced by unilateral common carotid artery occlusion. Experimental Eye Research. 201, 108275 (2020).
  14. Li, S., et al. Retro-orbital injection of FITC-dextran is an effective and economical method for observing mouse retinal vessels. Molecular Vision. 17, 3566-3573 (2011).
  15. Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo. Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).
  16. Lee, D., et al. A Fairy Chemical Suppresses Retinal Angiogenesis as a HIF Inhibitor. Biomolecules. 10 (10), (2020).
  17. Tomita, Y., et al. Pemafibrate Prevents Retinal Pathological Neovascularization by Increasing FGF21 Level in a Murine Oxygen-Induced Retinopathy Model. International Journal of Molecular Sciences. 20 (23), 5878 (2019).
  18. Yamamoto, H., Schmidt-Kastner, R., Hamasaki, D. I., Yamamoto, H., Parel, J. M. Complex neurodegeneration in retina following moderate ischemia induced by bilateral common carotid artery occlusion in Wistar rats. Experimental Eye Research. 82 (5), 767-779 (2006).
  19. Cheng, L., Yu, H., Yan, N., Lai, K., Xiang, M. Hypoxia-Inducible Factor-1α Target Genes Contribute to Retinal Neuroprotection. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 20 (2017).
  20. Mole, D. R., et al. Genome-wide association of hypoxia-inducible factor (HIF)-1alpha and HIF-2alpha DNA binding with expression profiling of hypoxia-inducible transcripts. The Journal of Biological Chemistry. 284 (25), 16767-16775 (2009).
  21. Majmundar, A. J., Wong, W. J., Simon, M. C. Hypoxia-Inducible Factors and the Response to Hypoxic Stress. Molecular Cell. 40 (2), 294-309 (2010).
  22. Newman, E. A. Glial cell regulation of neuronal activity and blood flow in the retina by release of gliotransmitters. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370 (1672), (2015).
  23. Vecino, E., Rodriguez, F. D., Ruzafa, N., Pereiro, X., Sharma, S. C. Glia-neuron interactions in the mammalian retina. Progress in Retinal and Eye Research. 51, 1-40 (2016).
  24. Symonds, C. The Circle of Willis. British Medical Journal. 1 (4906), 119 (1955).
  25. Lo, W. B., Ellis, H. The circle before willis: a historical account of the intracranial anastomosis. Neurosurgery. 66 (1), 7-18 (2010).
  26. Yang, G., et al. C57BL/6 strain is most susceptible to cerebral ischemia following bilateral common carotid occlusion among seven mouse strains: selective neuronal death in the murine transient forebrain ischemia. Brain Research. 752 (1), 209-218 (1997).
  27. Farkas, E., Luiten, P. G. M., Bari, F. Permanent, bilateral common carotid artery occlusion in the rat: A model for chronic cerebral hypoperfusion-related neurodegenerative diseases. Brain Research Reviews. 54 (1), 162-180 (2007).
  28. Morris, G. P., et al. A Comparative Study of Variables Influencing Ischemic Injury in the Longa and Koizumi Methods of Intraluminal Filament Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice. PLOS ONE. 11 (2), 0148503 (2016).
  29. Tsuchiya, D., Hong, S., Kayama, T., Panter, S. S., Weinstein, P. R. Effect of suture size and carotid clip application upon blood flow and infarct volume after permanent and temporary middle cerebral artery occlusion in mice. Brain Research. 970 (1-2), 131-139 (2003).
  30. Kaelin, W. G., Ratcliffe, P. J. Oxygen Sensing by Metazoans: The Central Role of the HIF Hydroxylase Pathway. Molecular Cell. 30 (4), 393-402 (2008).
  31. Pauly, M., Sruthi, R. Ptosis: evaluation and management. Kerala Journal of Ophthalmolgy. 31 (1), 11-16 (2019).
  32. Averbuch-Heller, L., Leigh, R. J., Mermelstein, V., Zagalsky, L., Streifler, J. Y. Ptosis in patients with hemispheric strokes. Neurology. 58 (4), 620 (2002).
  33. Dutton, J. Atlas of clinical and surgical orbital anatomy, second edition. 113, 1364 (2011).
  34. Ritzel, R. M., et al. Early retinal inflammatory biomarkers in the middle cerebral artery occlusion model of ischemic stroke. Molecular Vision. 22, 575-588 (2016).
  35. Crespo-Garcia, S., et al. Individual and temporal variability of the retina after chronic bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO). PLOS ONE. 13 (3), 0193961 (2018).
  36. Qin, Y., et al. Functional and morphologic study of retinal hypoperfusion injury induced by bilateral common carotid artery occlusion in rats. Scientific Reports. 9 (1), 80 (2019).
  37. Block, F., Grommes, C., Kosinski, C., Schmidt, W., Schwarz, M. Retinal ischemia induced by the intraluminal suture method in rats. Neuroscience Letters. 232 (1), 45-48 (1997).
  38. Allen, R. S., et al. Progesterone Treatment in Two Rat Models of Ocular Ischemia. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (5), 2880-2891 (2015).
  39. Miller, R. F., Dowling, J. E. Intracellular responses of the Müller (glial) cells of mudpuppy retina: their relation to b-wave of the electroretinogram. Journal of Neurophysiology. 33 (3), 323-341 (1970).
  40. Block, F., Grommes, C., Kosinski, C., Schmidt, W., Schwarz, M. Retinal ischemia induced by the intraluminal suture method in rats. Neuroscience Letters. 232 (1), 45-48 (1997).
  41. Lee, J. H., Shin, J. M., Shin, Y. J., Chun, M. H., Oh, S. J. Immunochemical changes of calbindin, calretinin and SMI32 in ischemic retinas induced by increase of intraocular pressure and by middle cerebral artery occlusion. Anatomy & Cell Biology. 44 (1), 25-34 (2011).
  42. Li, S. Y., et al. Lycium barbarum polysaccharides reduce neuronal damage, blood-retinal barrier disruption and oxidative stress in retinal ischemia/reperfusion injury. PLOS ONE. 6 (1), 16380 (2011).
  43. Furashova, O., Matthé, E. Retinal Changes in Different Grades of Retinal Artery Occlusion: An Optical Coherence Tomography Study. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (12), 5209-5216 (2017).
  44. Zadeh, J. K., et al. Short-Time Ocular Ischemia Induces Vascular Endothelial Dysfunction and Ganglion Cell Loss in the Pig Retina. International Journal of Molecular Sciences. 20 (19), (2019).
  45. Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. Rodent stroke model guidelines for preclinical stroke trials (1st edition). Journal of Experimental Stroke & Translational Medicine. 2 (2), 2-27 (2009).
  46. Tang, Y., et al. Hypothermia-induced ischemic tolerance is associated with Drp1 inhibition in cerebral ischemia-reperfusion injury of mice. Brain Research. 1646, 73-83 (2016).
  47. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 13 (4), 683-692 (1993).
  48. Pula, J. H., Yuen, C. A. Eyes and stroke: the visual aspects of cerebrovascular disease. Stroke and Vascular Neurology. 2 (4), 210 (2017).
  49. Steele, E. C., Guo, Q., Namura, S. Filamentous middle cerebral artery occlusion causes ischemic damage to the retina in mice. Stroke. 39 (7), 2099-2104 (2008).
  50. Sim, D. A., et al. The Effects of Macular Ischemia on Visual Acuity in Diabetic Retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 2353-2360 (2013).
  51. Wu, K. K., Huan, Y. Streptozotocin-induced diabetic models in mice and rats. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 5, Unit 5.47 (2008).
  52. Mubarak, A., Hodgson, J. M., Considine, M. J., Croft, K. D., Matthews, V. B. Supplementation of a high-fat diet with chlorogenic acid is associated with insulin resistance and hepatic lipid accumulation in mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61 (18), 4371-4378 (2013).
  53. Ansari, S., Azari, H., McConnell, D. J., Afzal, A., Mocco, J. Intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke with laser doppler flowmetry guidance in mice. Journal of Visualized Experiments. (51), e2879 (2011).
  54. Hedna, V. S., et al. Validity of Laser Doppler Flowmetry in Predicting Outcome in Murine Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion Stroke. Journal of Vascular and Interventional Neurology. 8 (3), 74-82 (2015).

Tags

Medisin Utgave 165 Halspulsåren okklusjon Elektroretinografi Eksperimentelle modeller Hypoksi Iskemi Optisk sammenhengtomografi Retina Reperfusjon
En murin modell av iskemisk retinal skade indusert av forbigående bilaterale felles halspulsåren okklusjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, D., Miwa, Y., Jeong, H., Ikeda, … More

Lee, D., Miwa, Y., Jeong, H., Ikeda, S. i., Katada, Y., Tsubota, K., Kurihara, T. A Murine Model of Ischemic Retinal Injury Induced by Transient Bilateral Common Carotid Artery Occlusion. J. Vis. Exp. (165), e61865, doi:10.3791/61865 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter