Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

En murin modell av skandinaviska retinal skada framkallas av transient bilaterala gemensamma halsartären ocklusion

Published: November 12, 2020 doi: 10.3791/61865
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,4, 1,2
1Laboratory of Photobiology, Keio University School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, Keio University School of Medicine, 3Animal eye care, Tokyo Animal Eye Clinic, 4Tsubota Laboratory, Inc.
* These authors contributed equally

Summary

Här beskriver vi en mus modell av retinal ischemi av transient bilaterala gemensamma halsartären ocklusion med enkla suturer och en klämma. Denna modell kan vara användbar för att förstå de patologiska mekanismerna för retinal ischemi orsakas av kardiovaskulära avvikelser.

Abstract

Olika vaskulär sjukdomar såsom diabetiker retinopati, ocklusion av retinal vener eller artärer och okulär skandinaviska syndrom kan leda till retinal ischemi. För att undersöka patologiska mekanismer för retinal ischemi måste relevanta experimentella modeller utvecklas. Anatomiskt är ett huvudsakligt retinalt blodkärl den oftalmiska artären (OpA) och OpA härstammar från den inre halsartären i den gemensamma halsartären (CCA). Således kan störningar av CCA effektivt orsaka retinal ischemi. Här etablerade vi en musmodell av retinal ischemi av transient bilaterala gemensamma halsartären ocklusion (tBCCAO) att binda rätt CCA med 6-0 silke suturer och att ockludera den vänstra CCA övergående i 2 sekunder via en klämma, och visade att tBCCAO kunde inducera akut retinal ischemi leder till retinal dysfunktion. Den nuvarande metoden minskar beroendet av kirurgiska instrument genom att endast använda kirurgiska nålar och en klämma, förkortar ocklusionstiden för att minimera oväntad djurdöd, vilket ofta ses i musmodeller av mellersta cerebrala gatan ocklusion, och upprätthåller reproducerbarhet av gemensamma retinal skandinaviska fynd. Modellen kan användas för att undersöka patofysiologin hos ischemiska retinopatier hos möss och kan vidare användas för in vivo-läkemedelsscreening.

Introduction

Näthinnan är en neurosensorisk vävnad för visuell funktion. Eftersom en betydande mängd syre behövs för visuell funktion, är näthinnan känd som en av de högsta syrekrävande vävnaderna i kroppen1. Näthinnan är mottaglig för kärlsjukdomar eftersom syre levereras genom blodkärl. Olika typer av kärlsjukdomar, såsom diabetiker retinopati och retinal blodkärl (vener eller artärer) ocklusion, kan inducera retinal ischemi. För att undersöka patologiska mekanismer för retinal ischemi anses reproducerbara och kliniskt relevanta experimentella modeller av retinal ischemi vara nödvändiga. Mellersta cerebrala gatan ocklusion (MCAO) genom införandet av en intraluminal glödtråd är den mest allmänt använda metoden för utveckling av in vivo gnagare modeller av experimentell cerebral ischemi2,3. På grund av närheten av den oftalmiska gatan (OpA) till MCA används MCAO-modeller också samtidigt för att förstå patofysiologin hos retinal ischemi4,5,6. För att inducera cerebral ischemi tillsammans med retinal ischemi, sätts långa filament vanligtvis genom snitt av den gemensamma halsartären (CCA) eller den yttre halsartären (ECA). Dessa metoder är svåra att utföra, kräver lång tid att slutföra operationen (över 60 minuter för en mus) och leder till höga variationer i resultaten efter operationen7. Det är fortfarande viktigt att utveckla en bättre modell för att förbättra dessa problem.

I denna studie använde vi helt enkelt kort övergående bilaterala CCA ocklusion (tBCCAO) med nålar och en klämma för att inducera retinal ischemi hos möss och analyserade typiska resultat av skandinaviska skador i näthinnan. I den här videon kommer vi att ge en demonstration av tBCCAO-förfarandet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla metoder som beskrivs här har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Keio University School of Medicine.

1. Beredning av kirurgiska instrument och djur

  1. Autoklav kirurgiska instrument och hålla dem i 70% etylalkohol. Före varje nytt kirurgiskt ingrepp, rengör kirurgiska instrument noggrant med 70% etylalkohol.
  2. Förbered manliga BALB/cAJc1 möss (6 veckor gamla, 26-28 kg) i ett specifikt patogenfritt (SPF) rum för att upprätthålla sterila tillstånd före, under och efter operationen.

2. Övergående bilaterala gemensamma halsartären ocklusion (tBCCAO)

  1. Sätt en mus under anestesi via intraperitoneal injektion med en kombination av midazolam (40 μg/100 μL), medetomidin (7,5 μg/100 μL) och butorphanol tartrat (50 μg/100 μL), kallas "MMB", som tidigarebeskrivits 8,9. Håll musens ryggutslag för att hålla musen borta från att stöta ögonen tills musen är helt sövd.
    1. Bedöm anestesidjupet genom att nypa must tå tills den inte har något svar, varav metod används ofta för att kontrollera fullständig anestesi10.
      OBS: I allmänhet krävs mindre än 5 min för att möss ska somna. Lämpliga recept för allmän anestesi kan vara olika av institutioner.
  2. Applicera en droppe 0,1% renad natriumhyaluronat ögondroppelösning på ögonen för att förhindra torrhet på ögonen under anestesi.
  3. Placera musen på ryggen och fixa musens tassar med tejp.
  4. Desinficera musens halsområde med 70% etylalkohol före operationen.
    OBS: Ytterligare urklipp av pälsen utfördes inte eftersom detta kan orsaka efterföljande hudinflammation11,12.
  5. Utför sagittalt snitt i nacken med ett blad (bild 1).
    OBS: Snitt måste göras på mittlinjen mellan nacke, bröstben och luftstrupe.
  6. Separera båda salivkörtlarna noggrant med hjälp av två tångar och mobilisera dem för att visualisera de underliggande ccas.
  7. Isolera rätt CCA noggrant från respektive vagal nerver och medföljande vener utan att skada deras strukturer, och placera två 6-0 silke suturer under CCA. Knyt de två banden tätt för att blockera blodflödet (Bild 1).
    OBS: Under proceduren kan små vener skadas. Om blödning ses krävs torkning för att visualisera CCAs tydligt.
  8. Hitta den vänstra CCA noggrant från respektive vagal nerver och medföljande vener utan att skada deras strukturer, och occlude den vänstra CCA i 2 sekunder med en klämma (Figur 1).
    OBS: En 6-0 silkes sutur nål behövs för att placeras under vänster CCA för att markera en plats för fastspänning.
  9. Efter återöppnande av den vänstra CCA, sutur sår i nacken av en 6-0 silk sutur och tillämpa en dab av antibiotikum (50 μL) på halsen för att hämma bakteriell infektion.
    OBS: Ta försiktigt bort en klämma för att undvika att skada artärväggen när den vänstra CCA öppnas igen.
  10. Injicera 0,75 mg/kg atipamezolehydroklorid intraperitoneally till musen för att hjälpa musen återhämta sig från djupbedövning snabbt. Sätt tillbaka musen i en musbur med förvärmda kuddar.
    OBS: Låt inte musen lämnas obevakad förrän musen återfår tillräckligt medvetande för att bibehålla sternal återhållsamhet.
  11. Injicera 0,4 mg/kg butorphanol tartrat till musen för hantering av smärta när musen vaknar.
    Protokollet kan pausas här. Som ett första tips för framgångsrik tBCCAO kan ögonlocksdroppar av musen observeras (figur 2).
  12. För dödshjälp, injicera 3x MMB-blandning till mössen och offra dem för experiment.

3. Allmänna observationer (överlevnadsgrad och ögonlocksdroppar)

  1. Efter operationen, kontrollera överlevnadsgraden för alla dödsorsaker vid dag 0 (efter operationen), 1, 3 och 7.
  2. Utvärdera ögonlocksdroppar med en 4-punktsskala: 1 = ingen hängande, 2 = mild hängande (~ 50%), 3 = svår hängande (över 50%), och 4 = svår hängande med ögonurladdning.

4. Näthinneblodperfusion

  1. Injicera 200 μL FITC-dextran (25 mg/ml) i musens vänstra ventrikel, som ofta används för observation av blodperfusion i mushinnekärl13,14.
  2. 2 minuter efter cirkulationen, enucleate ögonen och fixera i 4% paraformaldehyd i 1 timme. Näthinnan erhölls noggrant och plattmonterade, som tidigarebeskrivits 15, och undersöktes via ett fluorescensmikroskop.
  3. Ta fotografier av näthinnans hela fästen vid 4x förstoring och sammanfoga till en enda med hjälp av en sammanslagningsanalysator, tidigare beskriven16.
  4. Mät de perfunderade områdena via ett fartygsanalysverktyg i NIH Fiji/ImageJ-programvara.

5. Västra fläck

  1. 3 och 6 timmar efter tBCCAO, få mössens ögon och överför omedelbart till en petriskål som innehåller kall PBS för att isolera näthinnan.
  2. Efter isolering av näthinnan, utför västra blotting, som tidigare beskrivits9.
  3. Inkubera med antikroppar för hypoxiinducerbar faktor-1α (HIF-1α; en allmän hypoximarkör) och för β-Actin (en intern belastningskontroll) över natten följt av inkubation av HRP-konjugerade sekundära antikroppar. Visualisera signalerna via chemiluminescens.

6. Kvantitativ PCR (qPCR)

  1. 6, 12 och 24 timmar efter tBCCAO, bearbeta de erhållna näthinnan för qPCR, som tidigarebeskrivits 17.
  2. Utför qPCR via PCR-system i realtid. Primers som används listas i tabell 1. Beräkna vikändringar mellan nivåer av olika transkriptioner med ΔΔCT-metoden.

7. Immunohistokemi (IHC)

  1. 3 dagar efter tBCCAO, få ögonen på möss och bädda in i paraffin.
  2. Skär de paraffin inbäddade ögonen med en mikrotom för att få ögonsektionerna.
  3. Avparaffinisera och färga ögondelarna med 5 μm tjocklek som tidigare beskrivits13.
  4. Inkubera med en antikropp för gliaflimmersyraprotein (GFAP; en tillförlitlig markör för astrocyter och Müllerceller i näthinnan) över natten följt av inkubation av Alexa Fluor 555-konjugerad sekundär antikropp.
  5. Använd DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindol) för färgning av kärnan i näthinnan. Visualisera signaler via ett fluorescensmikroskop.
  6. Utvärdera morfologi poängsättning med en 4-punkts klassificering skala, som tidigarebeskrivits 13,18: 0 = ingen signal, 1 = några positiva glia ändfötter i ganglion cell lager (GCL), 2 = få märkta processer når från GCL till det yttre kärnskiktet (ONL) och 3 = mest märkta processer når från GCL till ONL.

8. Elektroretinografi (ERG)

  1. 3 och 7 dagar efter tBCCAO, utför ERG med hjälp av en Ganzfeld kupol, förvärvssystem och LED-stimulatorer, som tidigare beskrivits9.
  2. Efter mörk anpassning över natten, bedöva möss med en kombination av MMB under svagt rött ljus.
  3. Använd en blandad lösning på 0,5% tropicamide och 0,5% fenylefrin för att vidga eleverna.
  4. Placera de aktiva elektroderna på kontaktlinsen och placera referenselektroden i munnen.
  5. Få ERG-svar från båda ögonen på varje djur.
  6. Spela in scotopic svar under mörk anpassning med olika stimuli.
  7. Mät amplituderna för en våg från baslinjen till den lägsta punkten i en våg.
  8. Mät b-vågens amplituder från den lägsta punkten i en våg till toppen av b-vågen.
  9. Håll alla möss varma under proceduren med hjälp av värmekuddar.

9. Optisk koherenstomografi (OCT)

  1. 2 veckor efter tBCCAO, utför OCT med SD-OCT-systemet, som tidigarerapporterats 8,9.
  2. För mätningen, försök möss till mydriasis genom en blandad lösning av 0,5% tropicamide och 0,5% fenylefrin, och till allmän anestesi genom en blandning av MMB.
  3. Hämta B-skanningsbilder från ekvatorialsegment av en-face-skanningar.
  4. Undersök näthinnan vid 0,2, 0,4 och 0,6 mm från det optiska nervhuvudet.
  5. Mät näthinnetjockleken från näthinnans nervfiberskikt (NFL) till det yttre begränsningsmembranet (ELM) och betrakta medelvärdet av uppmätta värden som näthinnetjocklek hos en enskild mus.
  6. Plotta resultaten som spindeldiagram.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter systemisk cirkulation av FITC-dextran i 2 minuter undersöktes retinala vaskulaturer av vänster och höger näthinnorna hos de skenstyrda mössen och tBCCAO-drivna mössen (kompletterande figur 1). FITC-dextran var fullt synlig i de båda näthinnan i de sham-operated mössen och den vänstra näthinnan i tBCCAO-drivna möss, medan det delvis var detekterbart i rätt näthinnan i tBCCAO-drivna möss.

Efter tBCCAO undersöktes ögonlocksdroppar(figur 2). De högra ögonen visade mild (poäng 2; 75%) och svår ögonlock (poäng 3 och 4; 25%) hängande, medan de vänstra ögonen inte hade någon hängande (poäng 1; 93,75%) med undantag för en mus (poäng 2; 6,25 %). Även om allvarliga ögonlock hängande med öga ansvarsfrihet observerades inte avsevärt i tBCCAO-drivna möss, kunde vi se en mus för denna fenotyp (poäng 4; 6,25%).

Minskad syrestatus i vävnader leder till stabilisering av HIF-1α och induktion av ett antal hypoxikänsliga gener som EPO, VEGF och BNIP319,20,21. Först och främst utvärderades molekylär biologisk hypoxi med hjälp av en allmän hypoxisk markör HIF-1α via western blotting (Figur 3). Ökad HIF-1α uttryck observerades betydligt i rätt näthinnan 3 och 6 timmar efter tBCCAO. Därefter utvärderades uttryck av hypoxiresponsiva gener via qPCR (Kompletterande figur 2). det fanns ingen betydande förändring i hypoxi-lyhörda gen uttryck 6 timmar efter tBCCAO. 12 timmar efter tBCCAO fann vi Binp3 uttryck avsevärt ökat och en liten ökning av Epo uttryck visades i rätt näthinnan. 24 timmar efter tBCCAO kunde vi också hitta en liten ökning av Epo-uttrycket i rätt näthinnan även om det inte var statistiskt signifikant. Vegf uttryck ändrades inte från 6 till 24 timmar i tBCCAO-drivna möss.

Retinal reaktiv gliosis undersöktes 3 dagar efter tBCCAO (Figur 4), som glia såsom astrocyter och Müller celler har varit nära associerade med retinal ischemi22. GFAP har använts i stor utsträckning för påvisande av astrocyter och Müller celler i näthinnan23. Genomsnittet av morfologi poäng för GFAP märkning i rätt näthinnan var den högsta bland de båda näthinnan i de sham-operated möss och den vänstra näthinnan i tBCCAO-drivna möss. Baserat på lokalisering av GFAP uttryck, en förändring i morfologi i GFAP märkning anses återspegla aktivering av Müller celler.

ERG användes för att undersöka näthinnedysfunktion efter tBCCAO(figur 5). Amplituderna av b-wave i det högra ögat minskade dramatiskt 3 och 7 dagar efter tBCCAO. Amplituderna av en våg i det högra ögat ändrades dock inte signifikant. När det gäller vänster öga kunde vi inte se några förändringar i amplituderna i a- och b-vågor(kompletterande figur 3).

Vi utförde OCT för att bestämma en förändring i näthinnetjocklek efter tBCCAO (Figur 6). Retinal tjocklek i det högra ögat ökade dramatiskt 2 veckor efter tBCCAO, medan det inte fanns någon skillnad i näthinnetjocklek i vänster öga mellan tBCCAO- och sham-operated möss.

Figure 1
Figur 1: Schematiskt för modellförfarandet och blodcirkulationen i Willis cirkel. En schematisk illustration visade tBCCAO-inducerad retinal skandinaviska mus modell förfarande och blodcirkulation till näthinnan. CCA, ECA, ICA, PCA och OpA representerar den gemensamma halsartären, yttre halsartären, inre halsartären, bakre kommunicerande artären respektive oftalmiska gatan. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Ögonlock hängande efter tBCCAO. Svårighetsgraden av ögonlocksdroppar bedömdes med 4-punktsbetyg baserat på referensbilderna: 1 = ingen hängande, 2 = mild hängande (~ 50% hängande), 3 = svår hängande (över 50% hängande) och 4 = svår hängande med ögonurladdning. Ögonlock hängande observerades efter tBCCAO och det bibehölls under den experimentella observationen. Resultaten (sham: n = 10, tBCCAO: n = 16) ritades som en punktdiagram. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Bild 3: HIF-1α stabilisering efter tBCCAO. Representativa immunoblots och kvantitativa analyser (grupper för timme 3; sham: n = 3, tBCCAO: n = 6 och grupper för timme 6; sham och tBCCAO: n = 6) för HIF-1α och β-Actin visade att HIF-1α stabiliserades i rätt näthinnan 3 och 6 timmar efter tBCCAO. *P & 0,05. Data analyserades med hjälp av Students t-testoch presenterades som medelvärde med ± standardavvikelse. L och R står för vänster respektive höger näthinna. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Reaktiv gliosis efter tBCCAO. Representativa sagittal delar av näthinnan (sham: n = 4, tBCCAO: n = 4) och kvantitativa analyser av GFAP märkning (röd) av en morfologi poäng (0-3) visade att GFAP märkning, mestadels begränsad i NFL + GCL, utvidgades till hela inre skiktet, från GCL till ONL (vita pilar) i rätt näthinnan efter tBCCAO. Skalstänger, 50 μm. DAPI (blå) användes för färgning av kärnan i näthinnan. NFL, GCL, IPL, INL och ONL representerar nervfiberskiktet, ganglioncellskiktet, det inre plexiformskiktet, det inre kärnskiktet respektive det yttre kärnvapenskiktet. Data analyserades med hjälp av Students t-testoch presenterades som median med interkvartilt intervall, den 25: e och 75: e percentilen. *P & 0,05. L och R står för vänster respektive höger näthinna. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5: Visuell dysfunktion i höger öga efter tBCCAO. a)Representativa vågformer av mörkanpassat ERG som utförts 3 och 7 dagar efter tBCCAO. Stimuleringsintensitet (cd.s/m2): 0,005. (B) Kvantitativa analyser visade att det fanns en minskning av amplituderna av b-våg i det högra ögat (sham: n = 5, tBCCAO: n = 6) medan amplituderna i en våg inte ändrades. *P < 0,05, **P < 0,01. Data analyserades med hjälp av Students t-testoch presenterades som medelvärde med ± standardavvikelse. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 6
Figur 6: En förändring av näthinnetjockleken efter tBCCAO. Representativa OCT bilder i sham- och tBCCAO-drivna näthinnorna och kvantitativa analyser visade att det fanns en ökning av näthinnan tjocklek i rätt näthinnan (sham: n = 4, tBCCAO: n = 8). Det fanns ingen förändring i näthinnans tjocklek i den vänstra näthinnan (sham: n = 4, tBCCAO: n = 8). Skalstängerna är 200 (övre) respektive 100 (nedre) μm. *P & 0,05. Värdena i diagrammens horisontella axel representerar 0, 2, 0, 4 och 0, 6 mm från det optiska nervhuvudet (0) som upptäcktes av den gröna linjen. Data analyserades med tvåvägs ANOVA följt av ett Bonferroni post hoc-test. Spindeldiagram presenterades som medelvärde med ± standardavvikelse. NFL, INL, ONL och ELM är nervfiberskiktet, det inre kärnskiktet, det yttre kärnskiktet respektive det yttre begränsningsmembranet. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Kompletterande figur 1: Blodperfusion i näthinne blodet efter tBCCAO. Representativa retinal platt mount bilder (med högre förstoring av varje bild) efter 2 min fitc-dextran cirkulation och kvantitativa analyser visade att fullständig perfusion kunde observeras i båda näthinnan i de sham-operated möss och den vänstra näthinnan i tBCCAO-drivna möss. Rätt näthinna i tBCCAO-drivna möss visade dock partiell blodperfusion. Data analyserades med hjälp av Students t-testoch presenterades som medelvärde med ± standardavvikelse. L och R står för vänster respektive höger näthinna. Skalstängerna är 800 respektive 400 μm. Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Kompletterande figur 2: Uttryck för hypoxikänsliga gener efter tBCCAO. Kvantitativa analyser visade en övergående ökning av Bnip3 mRNA uttryck i rätt näthinnan med statistisk signifikans 12 timmar efter tBCCAO. Epo mRNA uttryck visade en ökande tendens i rätt näthinnan i 24 timmar efter tBCCAO, även om dess värden inte var betydligt annorlunda i jämförelse med den sham-operated rätt näthinnan. **P < 0,01. Data analyserades med hjälp av Students t-testoch presenterades som medelvärde med ± standardavvikelse. Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Kompletterande figur 3: Visuell funktion i vänster öga efter tBCCAO. Kvantitativa analyser visade att det inte fanns någon förändring i amplituderna av a- och b-vågor i det vänstra ögat (sham: n = 5, tBCCAO: n = 6). P > 0,05. Data analyserades med hjälp av Students t-testoch presenterades som medelvärde med ± standardavvikelse. Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Kompletterande figur 4: Överlevnad efter tBCCAO i C57BL6 och BALB. Kaplan-Meier överlevnadskurvor visade att nästan alla möss dog inom 3 dagar efter tBCCAO i C57BL6 möss. När det gäller BALB-möss inducerar längre klämtid i tBCCAO plötslig och allvarlig djurdöd (överlevnadsgraden dag 7, 20 sek: 10%, 10 sek: 20%, 2 sek: 81% och 0 sek: 95%). Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Kompletterande figur 5: HIF-1α stabilisering efter ensidiga CCAO. En representativ immunoblot och kvantitativ analys (sham: n = 3, ensidiga CCAO: n = 3) för HIF-1α och β-Actin visade att HIF-1α inte stabiliserades i näthinnan 3 timmar efter ensidiga CCAO. P > 0,05. Data analyserades med hjälp av Students t-testoch presenterades som medelvärde med ± standardavvikelse. L och R står för vänster respektive höger näthinna. Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Kompletterande figur 6: Svår ögonlocksdroppning efter tBCCAO med lång klämtid. 10 sekunders tBCCAO inducerad svår ögonlocksdroppar, som bedömdes med en 4-punktsklassskala: 1 = ingen hängande, 2 = mild hängande (~ 50%), 3 = svår hängande (över 50%), och 4 = svår hängande med ögonurladdning, enligt beskrivningen i figur 2. Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I studien har vi visat att tBCCAO, med enkla suturer och en klämma, kan inducera retinal ischemi och medföljande näthinnedysfunktion. Dessutom har vi visat att vårt nuvarande protokoll för utveckling av en musmodell av näthinne ischemi är enklare och snabbare i jämförelse med andra tidigare protokoll för utveckling av retinal skandinaviska skador modeller2,3,7.

Anatomiskt kan de vänstra och högra cerebrala artärerna anslutas via bakre kommunicerande artärer (PCA) som ger säkerhetercirkulation i Willis cirkel för att upprätthålla tillräcklig blodtillförsel till centrala nervsystemet mot flödesavbrott från ocklusioner eller stenos hos enskildafartyg 24,25 ( Figur1). Lee et al. visat retinal blod perfusion kan vara 10 min-fördröjd (som inte är en hel blockad av näthinnan blod perfusion i den ensidiga näthinnan) av permanent ensidiga CCAO i C57BL6 möss13. Detta innebär att CCAO:s induktion av retinal ischemi är nära förknippat med villkor för cirkulation av säkerheter i Willis krets. C57BL6 är känd för att vara den mest mottagliga musstammen för cerebral ischemi av BCCAO bland sju musstammar inklusive vår nuvarande studies musstam BALB26. På grund av den ofullständiga cirkeln av Willis i C57BL6 inducerar avbrott i hjärnans blodtillförsel från båda CCA allvarliga skador i centrala nervsystemet, vilket slutligen leder till döden. Dessutom misslyckades vi i vår förstudie att inducera tBCCAO i C57BL6 som nästan alla möss (ca 80%) avled inom 3 dagar efter operationen (kompletterande figur 4). Därför applicerade vi tBCCAO på en annan musstam BALB för vår nuvarande studie.

För att inducera akut retinal skandinaviska skador i vår BALB modell, rätt CCA var permanent ligated och den vänstra CCA tillämpades för att öka akut retinal skandinaviska stress genom övergående ocklusion. Detta beror på att möss inte kunde tolerera ischemisk stress inducerad av permanent BCCAO till skillnad från råttor som har hela cirkeln av Willis27. Därefter försökte vi optimera ocklusionstiden: vänster CCAO (0-20 sekunder), eftersom ocklusionstid har ansetts vara en av nyckelfaktorerna som påverkar skandinaviska skador på centrala nervsystemet och direkt ansluter till överlevnadsgraden för experimentellamodeller 28,29. Vi fann att överlevnadsgraden för BALB-möss minskade på ett ocklusion tidsberoende sätt(kompletterande figur 4). Ocklusion av den vänstra CCA över 10 sekunder visade allvarligt högre dödstal (över 50%), medan ocklusion av den vänstra CCA i 2 sekunder eller ingen ocklusion (eller ensidiga CCAO) visade relativt högre överlevnadsgrad (över 80%). Därför uteslöt vi grupperna (av ocklusionstid som är 10 och 20 sekunder) för de ytterligare experimenten eftersom effektiva och kostnadseffektiva experiment inte kan vara tillgängliga. Därefter undersökte vi om ocklusion av den vänstra CCA i 2 sekunder eller ingen ocklusion (eller ensidiga CCAO) kan inducera näthinnan hypoxi. HIF-1α är en stor regulator som fungerar i hypoxiska svar och stabiliseras under hypoxiska förhållanden30. I detta avseende har HIF-1α stabilisering använts som en allmän molekylär biologisk markör för hypoxi. Vi kunde inte upptäcka HIF-1α stabilisering i näthinnan i gruppen av ensidiga CCAO(kompletterande figur 5). Intressant nog kunde vi upptäcka HIF-1α stabilisering i gruppen av 2 sekunder av tBCCAO (Figur 3). Detta innebär retinal hypoxic stress kan induceras av 2 sekunder av tBCCAO hos BALB möss. Därför valdes 2 sekunders klämtid slutligen för vår studie baserat på hög överlevnad efter kirurgi och induktion av retinal ischemi via HIF-1α stabilisering.

Även om den högra CCA var permanent ockluderad i tBCCAO-drivna möss, upptäcktes blodperfusion delvis i rätt näthinnan 2 minuter efter systemisk cirkulation av FITC-dextran(kompletterande figur 1). Dessutom fann vi att en förändring i HIF-1α stabilisering inte upptäcktes i rätt näthinnan i ensidiga CCAO-drivna BALB möss. Detta fenomen kan förklaras av effekterna av cirkulationen av säkerheter genom Willis cirkel för att upprätthålla blodtillförseln till näthinnan (figur 1). Även om vi inte tydligt kunde förstå effekterna av vänster transienta CCAO på blodperfusion till höger näthinna, kan transient vänster CCAO tillsammans med permanent höger CCAO öka akuta hypoxiska förolämpningar i höger näthinnan som framgår av en betydande förändring i HIF-1α uttryck i höger näthinnan efter tBCCAO (Figur 3). Dessutom var överlevnadsgraden hos möss beroende av ocklusionstiden för den vänstra CCA. Sammantaget kan intensiteten av retinal skandinaviska stress kontrolleras via vänster CCAO.

Fenotyp av ett droopy ögonlock har föreslagits som ett presenterar tecken eller ett patofysiologiskt symptom på allvarliga neurologiska tillstånd, särskilt skandinaviska stroke31,32. Muskeln som är associerad med ett dreglande ögonlock är levator palpebrae superioris33. Denna muskel levereras av laterala palpebral gatan som är en av grenar som härrör från OpA. Därför, när OpA, som levererar näthinnan, påverkas, kan ögonlock hängande ses. Ögonlock hängande observerades i MCAO mus modeller34, som också reproducerades i vår tBCCAO modell. Dessutom beskrev vi att ögonlocksdroppar blir allvarliga när ocklusionstiden för det vänstra CCA tar längre tid (figur 2 och kompletterande figur 6). Detta innebär att svårighetsgraden av ögonlock hängande (indirekt kallas intensiteten av retinal skandinaviska stress) kan vara beroende av ocklusion tid av vänstra CCA.

Retinal dysfunktion är ett av resultaten sett i retinal skandinaviska retinopatier inklusive stenos av BCCA hos möss35 och BCCAO hos råttor36. Vi fann att amplituderna av b-våg minskade i tBCCAO-drivna möss. Flera tidigare studier visade att MCAO också orsakade en minskning av amplituden av b-wave efter operationen37,38. b-vågen återspeglar ett fysiologiskt tillstånd hos celler i retinala inre skikt, inklusive bipolära celler och Müllerceller39. Reaktiv gliosis av Müller celler upptäcktes dessutom i inre näthinnan skiktet efter tBCCAO. Detta resultat återges också i MCAO-modellerna40,41 och andra CCAO-modeller13,42. Sammantaget innebär det att inre näthinnedysfunktion kan induceras av tBCCAO. Retinal tjocklek har rapporterats öka tillfälligt i akut retinal ischemi43,44. Vi reproducerade också detta fynd i tBCCAO-drivna möss. Dessa data visar att försämringen av blodcirkulationen av tBCCAO kan nå näthinnan och slutligen påverka näthinnans lager.

För konsekventa resultat bör bedövningstid och längden på kirurgiska ingrepp samt andra faktorer som vikter och åldrar av experimentella modeller och deras kroppstemperaturer under och efter operationen standardiseras45. Särskilt behövs uppmärksamhet för att upprätthålla mössens kroppstemperatur under hela den experimentella observationsperioden. Detta beror på att hypotermi kan ha en förkonditionerande effekt och störa ischemiska effekter av tBCCAO46. Även om vi inte kunde mäta mössens exakta kroppstemperatur i våra experiment, använde vi värmekuddar för att värma mössen tills mössen återfick tillräckligt medvetande. Dessutom jämförde vi de tBCCAO-drivna mössen med de sham-operated mössen för att kontrollera potentiella förvirrande effekter av okontrollerbara faktorer.

Mus stammar kan vara en ytterligare viktig variabel faktor att inducera retinal skandinaviska skada av tBCCAO. Betydande variation av cirkeln av Willis i mus stammar kan resultera i en oönskad minskning eller induktion av cerebral ischemi inklusive retinal ishcemia47 och därmed kan leda till variationer i resultaten. Justering av klämningstiden rekommenderas för en framgångsrik tBCCAO-inducerad ischemisk retinopati när andra stammar av möss måste appliceras.

I allmänhet åtföljs incidenter av stroke eller andra hjärnskador alltid med tillfällig eller permanent visonförlust48. Hittills används MCAO-musmodell ofta för strokestudier. Eftersom OpA har sitt ursprung i MCA: s ursprung hindrar eventuella hinder i blodflödet i MCA flödet till näthinnan. Retinal ischemi visades först hos råttor av MCAO37. Senare applicerades samma retinal skandinaviska modell på möss49. Men för proceduren tar ocklusion mer än 60 minuter och att hitta en ocklusionsplats är extremt svårt eftersom MCA är begravd djupt inne i hjärnan. Dessutom bestämmer glödtrådens storlek och insättningslängd för MCAO i hög grad operationens framgång. Dessa ytterligare varierande faktorer inducerar variationer i de skandinaviska resultaten efter operationen. Även om direkta jämförelsestudier behövs mellan tBCCAO och MCAO, beskrev vi de fördelaktiga egenskaperna hos våra experimentella modeller i denna studie: kort ocklusionstid, enkelt experimentellt förfarande och mycket tillgängliga ocklusionsplatser. Denna modell kan lösa de problem som ses i MCAO-modeller.

Medan användningen av musmodellen av retinal ischemi har stora fördelar för att studera retinal ischemisk skada, finns det fortfarande begränsningar för detta tillvägagångssätt. Eftersom kirurgiskt snitt i nacken, separation av salivkörtlarna och ocklusion i rätt CCA med suturer måste tillämpas för förfarandet, kan de medföljande vävnad störningarna framkalla tillhörande inflammation systemiskt eller åtminstone lokalt. Dessa farhågor togs delvis upp med hjälp av de skenstyrda mössen, där alla kirurgiska steg utförs utan tBCCAO. En annan fråga är ett krav på att hantera smärta som uppstår under och efter operationen. I vår studie tillämpades smärtlindring för att förhindra lidande hos mössen genom injektion av butorphanol tartrat lösning, en syntetiskt härledda opioid agonist-antagonist smärtstillande medel i fenanthrene serien. Det kan vara viktigt att vara medveten om att användning av olika typer av bedövningsmedel och smärtstillande medel kan störa effekterna av tBCCAO på retinal ischemi. En annan begränsning av detta tillvägagångssätt (tillsammans med metoderna hos för närvarande använda andra modeller) är att det inte ger en perfekt simulering av patologier i samband med mänskliga kardiovaskulära näthinnesjukdomar. Hittills lider musmodeller som används för sådana experiment inte av samsjuklighet som ligger till grund för ischemiska retinopatier hos människor, främst med metaboliskt syndrom som diabetes50. Sådana komplikationer som inte finns i nuvarande musmodeller kan ha negativa synergistiska effekter på de patologiska vägarna för utveckling av skandinaviska retinopatier. Därför bör detta beaktas vid tolkningen av resultaten från de för närvarande använda experimentella modellerna, inklusive vår tBCCAO-musmodell. För att bättre förstå patofysiologiska mekanismer för skandinaviska retinopatier hos människor, vår modell kan kombineras med andra patologiska faktorer såsom streptozotocin injektion51 eller hög fett kosttillskott52 för utveckling av skandinaviska diabetiker retinopati. Äntligen, även om vi visade minskad retinal blodperfusion i tBCCAO-drivna möss, kunde vi inte tydligt förstå effekterna av vänster transient CCAO på blodperfusion till rätt näthinnan. Denna fråga kan behandlas med laser-Doppler som vanligtvis används för att bekräfta att ocklusion har ägt rum och ischemi har inträffat in vivo i realtid53,54. Denna teknik kan användas för bättre förståelse av näthinne ischemi i en enskild tBCCAO-drivna mus, när det gäller säkerheter cirkulation i cirkeln av Willis.

Trots dessa begränsningar representerar vår tBCCAO-metod som beskrivs här ett effektivt tillvägagångssätt för att producera retinal ischemi hos möss. Att studera retinal förändringar av tBCCAO hjälper till att riva upp patologiska mekanismer av skandinaviska retinopatier hos människor. Dessutom hoppas vi att tBCCAO-musmodellen kan användas för in vivo-läkemedelsscreening.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Grants-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (18K09424 till Toshihide Kurihara och 20K18393 till Yukihiro Miwa) från ministeriet för utbildning, kultur, idrott, vetenskap och teknik (MEXT).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atipamezole hydrochloride Zenoaq Antisedan For anti-anesthesia
Applied Biosystems 7500 Fast Applied Biosystems - For qPCR
Butorphanol tartrate Meiji Seika Pharma Vetorphale For anesthesia
BZ-II Analyzer KEYENCE - For an image merge
BALB/cAJc1 CLEA - Mouse strain
β-Actin (8H10D10) Mouse mAb CST 3700 For western blot
Clamp Forcep World Precision Instruments WPI 500451 For surgery
Dumont forceps #5 Fine Science Tools 11251-10 For surgery
DAPI solution Dojindo 340-07971 For IHC
Envisu SD-OCT system Leica R4310 For OCT
FITC-dextran Merk FD2000S For retinal blood perfusion
Fluorescence microscope KEYENCE BZ-9000 For fluorescence detection
Gatifloxacin hydrate Senju Pharmaceutical Gachifuro For anti-bacterial infection
GFAP Monoclonal Antibody (2.2B10) Thermo 13-0300 For IHC
Heating pad Marukan RH-200 For surgery
HIF-1α (D1S7W) XP Rabbit mAb CST 36169 For western blot
ImageQuant LAS 4000 mini GE Healthcare - For chemiluminescence
Midazolam Sandoz K.K SANDOZ For anesthesia
Microtome Tissue-Tek TEC 6 Sakura - For sectioning
Medetomidine Orion Corporation Domitor For anesthesia
Needle holder Handaya HS-2307 For surgery
PuREC MAYO Corporation - For ERG
Scissor Fine Science Tools 91460-11 For surgery
Sodium hyaluronate Santen Pharmaceutical Hyalein For eye lubrication
Tropicamide/Penylephrine hydrochloride Santen Pharmaceutical Mydrin-P For mydriasis
6-0 silk suture Natsume E12-60N2 For surgery

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, B. Ocular effects of changes in oxygen and carbon dioxide tension. Transactions of the American Ophthalmological Society. 66, 423-474 (1968).
  2. Ingberg, E., Dock, H., Theodorsson, E., Theodorsson, A., Ström, J. O. Method parameters' impact on mortality and variability in mouse stroke experiments: a meta-analysis. Scientific Reports. 6 (1), 21086 (2016).
  3. Atochin, D. N., Clark, J., Demchenko, I. T., Moskowitz, M. A., Huang, P. L. Rapid Cerebral Ischemic Preconditioning in Mice Deficient in Endothelial and Neuronal Nitric Oxide Synthases. Stroke. 34 (5), 1299-1303 (2003).
  4. Allen, R. S., et al. Severity of middle cerebral artery occlusion determines retinal deficits in rats. Experimental Neurology. 254, 206-215 (2014).
  5. Steele, E. C., Guo, Q., Namura, S. Filamentous Middle Cerebral Artery Occlusion Causes Ischemic Damage to the Retina in Mice. Stroke. 39 (7), 2099-2104 (2008).
  6. Minhas, G., Morishita, R., Anand, A. Preclinical models to investigate retinal ischemia: advances and drawbacks. Frontiers in Neurology. 3, 75 (2012).
  7. McColl, B. W., Carswell, H. V., McCulloch, J., Horsburgh, K. Extension of cerebral hypoperfusion and ischaemic pathology beyond MCA territory after intraluminal filament occlusion in C57Bl/6J mice. Brain Res. 997 (1), 15-23 (2004).
  8. Jiang, A. X., et al. Inducement and Evaluation of a Murine Model of Experimental Myopia. Journal of Visualized Experiments. (143), e58822 (2019).
  9. Miwa, Y., et al. Pharmacological HIF inhibition prevents retinal neovascularization with improved visual function in a murine oxygen-induced retinopathy model. Neurochemistry International. 128, 21-31 (2019).
  10. Adams, S., Pacharinsak, C. Mouse Anesthesia and Analgesia. Current Protocols in Mouse Biology. 5 (1), 51-63 (2015).
  11. Speetzen, L. J., Endres, M., Kunz, A. Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia. Journal of Visualized Experiments. (75), e4387 (2013).
  12. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments. (47), e2423 (2011).
  13. Lee, D., Kang, H., Yoon, K. Y., Chang, Y. Y., Song, H. B. A mouse model of retinal hypoperfusion injury induced by unilateral common carotid artery occlusion. Experimental Eye Research. 201, 108275 (2020).
  14. Li, S., et al. Retro-orbital injection of FITC-dextran is an effective and economical method for observing mouse retinal vessels. Molecular Vision. 17, 3566-3573 (2011).
  15. Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo. Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).
  16. Lee, D., et al. A Fairy Chemical Suppresses Retinal Angiogenesis as a HIF Inhibitor. Biomolecules. 10 (10), (2020).
  17. Tomita, Y., et al. Pemafibrate Prevents Retinal Pathological Neovascularization by Increasing FGF21 Level in a Murine Oxygen-Induced Retinopathy Model. International Journal of Molecular Sciences. 20 (23), 5878 (2019).
  18. Yamamoto, H., Schmidt-Kastner, R., Hamasaki, D. I., Yamamoto, H., Parel, J. M. Complex neurodegeneration in retina following moderate ischemia induced by bilateral common carotid artery occlusion in Wistar rats. Experimental Eye Research. 82 (5), 767-779 (2006).
  19. Cheng, L., Yu, H., Yan, N., Lai, K., Xiang, M. Hypoxia-Inducible Factor-1α Target Genes Contribute to Retinal Neuroprotection. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 20 (2017).
  20. Mole, D. R., et al. Genome-wide association of hypoxia-inducible factor (HIF)-1alpha and HIF-2alpha DNA binding with expression profiling of hypoxia-inducible transcripts. The Journal of Biological Chemistry. 284 (25), 16767-16775 (2009).
  21. Majmundar, A. J., Wong, W. J., Simon, M. C. Hypoxia-Inducible Factors and the Response to Hypoxic Stress. Molecular Cell. 40 (2), 294-309 (2010).
  22. Newman, E. A. Glial cell regulation of neuronal activity and blood flow in the retina by release of gliotransmitters. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370 (1672), (2015).
  23. Vecino, E., Rodriguez, F. D., Ruzafa, N., Pereiro, X., Sharma, S. C. Glia-neuron interactions in the mammalian retina. Progress in Retinal and Eye Research. 51, 1-40 (2016).
  24. Symonds, C. The Circle of Willis. British Medical Journal. 1 (4906), 119 (1955).
  25. Lo, W. B., Ellis, H. The circle before willis: a historical account of the intracranial anastomosis. Neurosurgery. 66 (1), 7-18 (2010).
  26. Yang, G., et al. C57BL/6 strain is most susceptible to cerebral ischemia following bilateral common carotid occlusion among seven mouse strains: selective neuronal death in the murine transient forebrain ischemia. Brain Research. 752 (1), 209-218 (1997).
  27. Farkas, E., Luiten, P. G. M., Bari, F. Permanent, bilateral common carotid artery occlusion in the rat: A model for chronic cerebral hypoperfusion-related neurodegenerative diseases. Brain Research Reviews. 54 (1), 162-180 (2007).
  28. Morris, G. P., et al. A Comparative Study of Variables Influencing Ischemic Injury in the Longa and Koizumi Methods of Intraluminal Filament Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice. PLOS ONE. 11 (2), 0148503 (2016).
  29. Tsuchiya, D., Hong, S., Kayama, T., Panter, S. S., Weinstein, P. R. Effect of suture size and carotid clip application upon blood flow and infarct volume after permanent and temporary middle cerebral artery occlusion in mice. Brain Research. 970 (1-2), 131-139 (2003).
  30. Kaelin, W. G., Ratcliffe, P. J. Oxygen Sensing by Metazoans: The Central Role of the HIF Hydroxylase Pathway. Molecular Cell. 30 (4), 393-402 (2008).
  31. Pauly, M., Sruthi, R. Ptosis: evaluation and management. Kerala Journal of Ophthalmolgy. 31 (1), 11-16 (2019).
  32. Averbuch-Heller, L., Leigh, R. J., Mermelstein, V., Zagalsky, L., Streifler, J. Y. Ptosis in patients with hemispheric strokes. Neurology. 58 (4), 620 (2002).
  33. Dutton, J. Atlas of clinical and surgical orbital anatomy, second edition. 113, 1364 (2011).
  34. Ritzel, R. M., et al. Early retinal inflammatory biomarkers in the middle cerebral artery occlusion model of ischemic stroke. Molecular Vision. 22, 575-588 (2016).
  35. Crespo-Garcia, S., et al. Individual and temporal variability of the retina after chronic bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO). PLOS ONE. 13 (3), 0193961 (2018).
  36. Qin, Y., et al. Functional and morphologic study of retinal hypoperfusion injury induced by bilateral common carotid artery occlusion in rats. Scientific Reports. 9 (1), 80 (2019).
  37. Block, F., Grommes, C., Kosinski, C., Schmidt, W., Schwarz, M. Retinal ischemia induced by the intraluminal suture method in rats. Neuroscience Letters. 232 (1), 45-48 (1997).
  38. Allen, R. S., et al. Progesterone Treatment in Two Rat Models of Ocular Ischemia. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (5), 2880-2891 (2015).
  39. Miller, R. F., Dowling, J. E. Intracellular responses of the Müller (glial) cells of mudpuppy retina: their relation to b-wave of the electroretinogram. Journal of Neurophysiology. 33 (3), 323-341 (1970).
  40. Block, F., Grommes, C., Kosinski, C., Schmidt, W., Schwarz, M. Retinal ischemia induced by the intraluminal suture method in rats. Neuroscience Letters. 232 (1), 45-48 (1997).
  41. Lee, J. H., Shin, J. M., Shin, Y. J., Chun, M. H., Oh, S. J. Immunochemical changes of calbindin, calretinin and SMI32 in ischemic retinas induced by increase of intraocular pressure and by middle cerebral artery occlusion. Anatomy & Cell Biology. 44 (1), 25-34 (2011).
  42. Li, S. Y., et al. Lycium barbarum polysaccharides reduce neuronal damage, blood-retinal barrier disruption and oxidative stress in retinal ischemia/reperfusion injury. PLOS ONE. 6 (1), 16380 (2011).
  43. Furashova, O., Matthé, E. Retinal Changes in Different Grades of Retinal Artery Occlusion: An Optical Coherence Tomography Study. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (12), 5209-5216 (2017).
  44. Zadeh, J. K., et al. Short-Time Ocular Ischemia Induces Vascular Endothelial Dysfunction and Ganglion Cell Loss in the Pig Retina. International Journal of Molecular Sciences. 20 (19), (2019).
  45. Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. Rodent stroke model guidelines for preclinical stroke trials (1st edition). Journal of Experimental Stroke & Translational Medicine. 2 (2), 2-27 (2009).
  46. Tang, Y., et al. Hypothermia-induced ischemic tolerance is associated with Drp1 inhibition in cerebral ischemia-reperfusion injury of mice. Brain Research. 1646, 73-83 (2016).
  47. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 13 (4), 683-692 (1993).
  48. Pula, J. H., Yuen, C. A. Eyes and stroke: the visual aspects of cerebrovascular disease. Stroke and Vascular Neurology. 2 (4), 210 (2017).
  49. Steele, E. C., Guo, Q., Namura, S. Filamentous middle cerebral artery occlusion causes ischemic damage to the retina in mice. Stroke. 39 (7), 2099-2104 (2008).
  50. Sim, D. A., et al. The Effects of Macular Ischemia on Visual Acuity in Diabetic Retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 2353-2360 (2013).
  51. Wu, K. K., Huan, Y. Streptozotocin-induced diabetic models in mice and rats. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 5, Unit 5.47 (2008).
  52. Mubarak, A., Hodgson, J. M., Considine, M. J., Croft, K. D., Matthews, V. B. Supplementation of a high-fat diet with chlorogenic acid is associated with insulin resistance and hepatic lipid accumulation in mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61 (18), 4371-4378 (2013).
  53. Ansari, S., Azari, H., McConnell, D. J., Afzal, A., Mocco, J. Intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke with laser doppler flowmetry guidance in mice. Journal of Visualized Experiments. (51), e2879 (2011).
  54. Hedna, V. S., et al. Validity of Laser Doppler Flowmetry in Predicting Outcome in Murine Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion Stroke. Journal of Vascular and Interventional Neurology. 8 (3), 74-82 (2015).

Tags

Medicin Utgåva 165 Halsartärens ocklusion Elektroretinografi Experimentella modeller Hypoxia Ischemi Optisk koherenstomografi Näthinna Reperfusion
En murin modell av skandinaviska retinal skada framkallas av transient bilaterala gemensamma halsartären ocklusion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, D., Miwa, Y., Jeong, H., Ikeda, … More

Lee, D., Miwa, Y., Jeong, H., Ikeda, S. i., Katada, Y., Tsubota, K., Kurihara, T. A Murine Model of Ischemic Retinal Injury Induced by Transient Bilateral Common Carotid Artery Occlusion. J. Vis. Exp. (165), e61865, doi:10.3791/61865 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter