Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

En Murine Model af iskæmisk Retinal Skade induceret af forbigående bilaterale fælles halspulsåren Okklusion

Published: November 12, 2020 doi: 10.3791/61865
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,4, 1,2
1Laboratory of Photobiology, Keio University School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, Keio University School of Medicine, 3Animal eye care, Tokyo Animal Eye Clinic, 4Tsubota Laboratory, Inc.
* These authors contributed equally

Summary

Her beskriver vi en musemodel af nethindeiskæmi ved forbigående bilateral fælles halspulsåre okklusion ved hjælp af enkle suturer og en klemme. Denne model kan være nyttig til at forstå de patologiske mekanismer i nethindeiskæmi forårsaget af hjerte-kar-abnormiteter.

Abstract

Forskellige vaskulære sygdomme såsom diabetisk retinopati, okklusion af nethinde vener eller arterier og okulær iskæmisk syndrom kan føre til nethinde iskæmi. For at undersøge patologiske mekanismer for nethindekemi skal der udvikles relevante eksperimentelle modeller. Anatomisk, en vigtigste retinale blod leverer fartøj er den oftalmiske arterie (OpA) og OpA stammer fra den indre halspulsåren af den fælles halspulsåren (CCA). Således kan afbrydelse af CCA effektivt forårsage nethindeisk iskæmi. Her etablerede vi en musemodel af nethindeiskæmi ved forbigående bilateral fælles halspulsåre okklusion (tBCCAO) for at binde den rigtige CCA med 6-0 silke suturer og for at okkludere venstre CCA forbigående i 2 sekunder via en klemme, og viste, at tBCCAO kunne fremkalde akut nethindeiskæmi, der fører til nethinde dysfunktion. Den nuværende metode reducerer afhængigheden af kirurgiske instrumenter ved kun at bruge kirurgiske nåle og en klemme, forkorter okklusion tid til at minimere uventede dyrs død, som ofte ses i mus modeller af midten cerebral arterie okklusion, og fastholder reproducerbarhed af fælles retinal iskæmiske fund. Modellen kan bruges til at undersøge patofysiologien af iskæmiske retinopatier hos mus og yderligere kan bruges til in vivo lægemiddelscreening.

Introduction

Nethinden er et neurosensorisk væv til visuel funktion. Da en betydelig mængde ilt er nødvendig for visuel funktion, nethinden er kendt som en af de højeste ilt krævende væv i kroppen1. Nethinden er modtagelig for vaskulære sygdomme som ilt leveres gennem blodkarrene. Forskellige typer af vaskulære sygdomme, såsom diabetisk retinopati og nethinde blodkar (vener eller arterier) okklusion, kan fremkalde nethinde iskæmi. For at undersøge patologiske mekanismer for nethindeiskæmi anses reproducerbare og klinisk relevante eksperimentelle modeller af nethindeisk iskæmi for nødvendig. Middle cerebral arterie okklusion (MCAO) ved indsættelse af en intraluminal filament er den mest almindeligt anvendte metode til udvikling af in vivo gnaver modeller af eksperimentel cerebral iskæmi2,3. På grund af nærheden af den oftalmiske arterie (OpA) til MCA bruges MCAO-modeller også samtidigt til at forstå patofysiologien af nethindeisk iskæmi4,5,6. For at fremkalde cerebral iskæmi sammen med nethinde iskæmi, lange filamenter er typisk indsættes gennem indsnit i den fælles halspulsåren (CCA) eller den eksterne halspulsåren (ECA). Disse metoder er vanskelige at udføre, kræver lang tid at afslutte operationen (over 60 minutter for en mus) og fører til høje variabiliteter i resultaterne efter operationen7. Det er fortsat vigtigt at udvikle en bedre model til at forbedre disse bekymringer.

I denne undersøgelse brugte vi simpelthen kort forbigående bilateral CCA okklusion (tBCCAO) med nåle og en klemme til at fremkalde nethindeisk iskæmi hos mus og analyserede typiske resultater af iskæmiske skader i nethinden. I denne video vil vi give en demonstration af tBCCAO-proceduren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle de metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) på Keio University School of Medicine.

1. Fremstilling af kirurgiske instrumenter og dyr

  1. Autoklave kirurgiske instrumenter og holde dem i 70% ethylalkohol. Forud for hver ny kirurgisk procedure, rene kirurgiske instrumenter omhyggeligt ved hjælp af 70% ethylalkohol.
  2. Forbered han-BALB/cAJc1-mus (6 uger gamle, 26-28 kg) i et specifikt patogenfrit (SPF) rum for at opretholde sterile forhold før, under og efter operationen.

2. Forbigående bilateral fælles halspulsåre okklusion (tBCCAO)

  1. Sæt en mus under anæstesi via intraperitoneal injektion med en kombination af midazolam (40 μg/100 μL), medetomidin (7,5 μg/100 μL) og butorphanoltartrat (50 μg/100 μL), benævnt "MMB", som tidligere beskrevet8,9. Hold musens rygskind for at holde musen væk fra at støde øjnene, indtil musen er helt bedøvet.
    1. Døm anæstesidybden ved at klemme musetåen, indtil den ikke har noget svar, hvoraf metoden er almindeligt anvendt til kontrol af fuldstændig anæstesi10.
      BEMÆRK: Generelt kræves der mindre end 5 min. for at musene kan falde i søvn. Korrekte opskrifter på generel anæstesi kan være forskellige fra institutioner.
  2. Påfør en dråbe af 0,1% renset natriumhyaluronat øjendråbeopløsning på øjnene for at forhindre tørhed på øjnene under anæstesi.
  3. Placer musen på ryggen og fastgør musens poter ved hjælp af tape.
  4. Desinficere halsen område af musen ved hjælp af 70% ethylalkohol før operationen.
    BEMÆRK: Der blev ikke foretaget yderligere klipning afpelsen,da dette kan forårsage efterfølgende betændelse i huden11,12.
  5. Udfør sagittal indsnit i nakken med et blad (Figur 1).
    BEMÆRK: Der skal laves snit på midterlinjen mellem hals, brystben og luftrør.
  6. Adskil begge spytkirtler omhyggeligt ved hjælp af to pincet og mobilisere dem til at visualisere de underliggende CCAs.
  7. Isoler den rigtige CCA omhyggeligt fra de respektive vagusnerver og ledsagende vener uden at skade deres strukturer, og læg to 6-0 silke suturer under CCA. Bind de to bånd tæt for at blokere blodgennemstrømningen (Figur 1).
    BEMÆRK: Under proceduren kan små vener blive beskadiget. Hvis blødning ses, er aftørring nødvendig for at visualisere CDA'erne tydeligt.
  8. Find den venstre CCA omhyggeligt fra de respektive vagus nerver og ledsagende vener uden at skade deres strukturer, og okkludere venstre CCA i 2 sekunder af en klemme (Figur 1).
    BEMÆRK: En 6-0 silke sutur nål er nødvendig for at blive placeret under venstre CCA for at markere et sted for fastspænding.
  9. Efter genåbning af venstre CCA, sutur sår i nakken med en 6-0 silke sutur og anvende en dab af antibiotika (50 μL) på halsen for at hæmme bakteriel infektion.
    BEMÆRK: Fjern en klemme blødt for at undgå at beskadige arteriel væg ved genåbning af venstre CCA.
  10. Injicere 0,75 mg/kg atipamezolhydrochlorid intraperitoneally til musen for at hjælpe musen inddrives fra dyb anæstesi hurtigt. Vend musen tilbage til et musebur med forvarmede puder.
    BEMÆRK: Lad ikke musen efterlades uden opsyn, før musen genvinder tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde sternal recumbency.
  11. Injicere 0,4 mg/kg butorphanol tartrat til musen for håndtering af smerter, når musen vågner op.
    BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her. Som et første tip til vellykket tBCCAO kan øjenlåg hængende af musen observeres (Figur 2).
  12. For aktiv dødshjælp, injicere 3x af MMB blanding til mus og ofre dem for eksperimenter.

3. Generelle observationer (overlevelsesrater og øjenlåg hængende)

  1. Efter operationen skal du kontrollere overlevelsesraten for alle dødsårsager på dag 0 (efter operationen), 1, 3 og 7.
  2. Vurder øjenlåg hængende med en 4-punkts rating skala: 1 = ingen hængende, 2 = mild hængende (~ 50%), 3 = svær hængende (over 50%), og 4 = svær hængende med øjenafladning.

4. Retinale blod perfusion

  1. Injicere 200 μL FITC-dextran (25 mg/mL) i musens venstre hjertekammer, som er almindeligt anvendt til observation af blodtransfusion i musehindefartøjer13,14.
  2. 2 minutter efter cirkulation,ucleate øjnene og fastsætte i 4% paraformaldehyd i 1 time. Nethinden blev omhyggeligt opnået og fladt monteret, som tidligere beskrevet15, og undersøgt via et fluorescensmikroskop.
  3. Tag fotografier af nethinden hele mounts ved 4x forstørrelse og fusionere ind i en enkelt ved hjælp af en fusionere analysator, tidligere beskrevet16.
  4. Mål de perfunderede områder via et fartøjsanalyseværktøj i NIH Fiji/ImageJ-software.

5. Vestlig skamplet

  1. 3 og 6 timer efter tBCCAO, få musens øjne og straks overføres til en petriskål indeholdende kold PBS for at isolere nethinden.
  2. Efter isolering af nethinden skal du udføre vestlig blotting, som tidligere beskrevet9.
  3. Inkuberes med antistoffer mod hypoxi-indukbel faktor-1α (HIF-1α; en generel hypoximarkør) og for β-Actin (en intern lastekontrol) natten over efterfulgt af inkubation af HRP-konjugerede sekundære antistoffer. Visualiser signalerne via chemiluminescens.

6. Kvantitativ PCR (qPCR)

  1. 6, 12 og 24 timer efter tBCCAO, behandle de opnåede nethinder for qPCR, som tidligere beskrevet17.
  2. Udfør qPCR via PCR-system i realtid. Anvendte primere er anført i tabel 1. Fold ændringer mellem niveauer af forskellige udskrifter ved hjælp af ΔΔC T-metoden.

7. Immunohistochemistry (IHC)

  1. 3 dage efter tBCCAO opnås musens øjne og indlejres i paraffin.
  2. Skær paraffin-indlejrede øjne med en mikrotome for at opnå øjet sektioner.
  3. De-paraffinisere og plette øjensektionerne af 5 μm tykkelse som tidligere beskrevet13.
  4. Inkuberes med et antistof for gliaflimresyreprotein (GFAP; en pålidelig markør for astrocytter og Müller-celler i nethinden) natten over efterfulgt af inkubation af Alexa Fluor 555-konjugeret sekundært antistof.
  5. Brug DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) til farvning af kernen i nethinden. Visualiser signaler via et fluorescensmikroskop.
  6. Vurder morfologi scoring ved en 4-punkts rating skala, som tidligere beskrevet13,18: 0 = intet signal, 1 = få positive glia ende-fødder i ganglion cellelag (GCL), 2 = få mærkede processer nå fra GCL til den ydre nukleare lag (ONL), og 3 = mest mærkede processer nå fra GCL til ONL.

8. Elektroretinografi (ERG)

  1. 3 og 7 dage efter tBCCAO, udføre ERG ved hjælp af en Ganzfeld kuppel, erhvervelse system og LED stimulatorer, som tidligere beskrevet9.
  2. Efter mørk tilpasning natten over bedøver mus med en kombination af MMB under svagt rødt lys.
  3. Brug en blandet opløsning på 0,5% tropicamid og 0,5% phenylephrine til at udvide eleverne.
  4. Placer de aktive elektroder på kontaktlinsen, og placer referenceelektroden i munden.
  5. Få ERG-svar fra begge dyrs øjne.
  6. Optag scotopiske reaktioner under mørk tilpasning med forskellige stimuli.
  7. Mål amplituderne af en bølge fra baseline til det laveste punkt i en bølge.
  8. Mål amplituderne af b-bølge fra det laveste punkt i en bølge til toppen af b-bølge.
  9. Hold alle mus varme under proceduren ved hjælp af varmepuder.

9. Optisk sammenhængstomografi (OLT)

  1. 2 uger efter tBCCAO, udføre OLT ved hjælp af SD-OCT system, som tidligere rapporteret8,9.
  2. Til måling udsættes mus for mydriasis ved en blandet opløsning på 0,5% tropicamid og 0,5% phenylephrine og til generel anæstesi ved en blanding af MMB.
  3. Få B-scanningsbilleder fra ækvatoriale skiver af en-face scanninger.
  4. Undersøg nethinden ved 0,2, 0,4 og 0,6 mm fra synsnervens hoved.
  5. Mål nethindetykkelsen fra nethindenervefiberlaget (NFL) til den eksterne begrænsende membran (ELM), og betragt gennemsnittet af målte værdier som nethindetykkelsen af en individuel mus.
  6. Plot resultaterne som edderkop diagrammer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter systemisk cirkulation af FITC-dextran i 2 minutter blev nethindevakulaturer fra venstre og højre nethinde i de sham-opererede mus og tBCCAO-opererede mus undersøgt (Supplerende figur 1). FITC-dextran var fuldt synlig i begge nethinder i de sham-opererede mus og den venstre nethinde i de tBCCAO-opererede mus, mens den delvist kunne påvises i højre nethinde i de tBCCAO-opererede mus.

Efter tBCCAO blev øjenlåg hængende undersøgt (Figur 2). De rigtige øjne viste mild (score 2; 75%) og alvorligt øjenlåg (score 3 og 4; 25%) hængende, mens venstre øjne ikke havde hængende (score 1; 93,75%) bortset fra en mus (score 2; 6,25%). Selvom der ikke blev observeret alvorlige øjenlåg hængende med øjenudladning i de tBCCAO-opererede mus, kunne vi se en mus for denne fænotype (score 4; 6,25%).

Reduceret iltstatus i væv fører til stabilisering af HIF-1α og induktion af en række hypoxi-responsive gener som EPO, VEGF og BNIP319,20,21. Først og fremmest blev molekylærbiologisk hypoxi ved hjælp af en generel hypoksisk markør HIF-1α evalueret via vestlig blotting (Figur 3). Øget HIF-1α udtryk blev signifikant observeret i højre nethinde 3 og 6 timer efter tBCCAO. Dernæst blev udtryk for hypoxia-responsive gener evalueret via qPCR(Supplerende figur 2). Der var ingen signifikant ændring i hypoxia-responsive genekspressioner 6 timer efter tBCCAO. 12 timer efter tBCCAO fandt vi Binp3-udtryk signifikant øget, og en lille stigning i Epo-udtryk blev vist i højre nethinde. 24 timer efter tBCCAO, kunne vi også finde en lille stigning i Epo udtryk i højre nethinden, selv om det ikke var statistisk signifikant. Vegf-udtrykket blev ikke ændret fra 6 til 24 timer i de tBCCAO-opererede mus.

Retinale reaktive gliose blev undersøgt 3 dage efter tBCCAO (Figur 4), som glia såsom astrocytter og Müller celler har været tæt forbundet med nethinde iskæmi22. GFAP har været meget anvendt til påvisning af astrocytter og Müller celler i nethinden23. Gennemsnittet af morfologiresultater for GFAP-mærkning i højre nethinde var det højeste blandt de begge nethinder i de sham-opererede mus og den venstre nethinde i de tBCCAO-opererede mus. Baseret på lokaliseringen af GFAP-ekspressionen anses en ændring i morfologien i GFAP-mærkningen for at afspejle aktiveringen af Müller-celler.

ERG blev brugt til at undersøge nethinde dysfunktion efter tBCCAO (Figur 5). Amplituderne af b-bølge i højre øje faldt dramatisk 3 og 7 dage efter tBCCAO. Imidlertid blev amplituderne af en bølge i højre øje ikke ændret væsentligt. Når det kommer til venstre øje, kunne vi ikke se nogen ændringer i amplituderne af a- og b-bølger(supplerende figur 3).

Vi udførte OCT for at bestemme en ændring i nethindetykkelse efter tBCCAO(Figur 6). Nethindetykkelsen i højre øje steg dramatisk 2 uger efter tBCCAO, mens der ikke var nogen forskel i nethindetykkelse i venstre øje mellem tBCCAO- og sham-opererede mus.

Figure 1
Figur 1: Skematisk over modelproceduren og blodcirkulationen i Willis' cirkel. En skematisk illustration viste tBCCAO-induceret nethinde iskæmisk mus model procedure og blodcirkulationen til nethinden. CCA, ECA, ICA, PCA og OpA repræsenterer den fælles halspulsåre, ekstern halspulsåre, intern halspulsåre, bageste kommunikere arterie og oftalmisk arterie, henholdsvis. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Øjenlåg hængende efter tBCCAO. Sværhedsgraden af hængende øjenlåg blev vurderet ved 4-punkts rating baseret på referencebillederne: 1 = ingen hængende, 2 = mild hængende (~ 50% hængende), 3 = svær hængende (over 50% hængende) og 4 = alvorlig hængende med øjenafladning. Øjenlåg hængende blev observeret efter tBCCAO, og det blev opretholdt under den eksperimentelle observation. Resultaterne (sham: n = 10, tBCCAO: n = 16) blev afbildet som en scatter dot plot. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: HIF-1α stabilisering efter tBCCAO. Repræsentative immunoblots og kvantitative analyser (grupper for time 3; sham: n = 3, tBCCAO: n = 6 og grupper for time 6; sham og tBCCAO: n = 6) for HIF-1α og β-Actin viste, at HIF-1α blev stabiliseret i højre nethinde 3 og 6 timer efter tBCCAO. *P < 0,05. Dataene blev analyseret ved hjælp af Student's t-testog præsenteret som middelværdi med ±standardafvigelse. L og R står for henholdsvis venstre og højre nethinde. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Reaktiv gliose efter tBCCAO. Repræsentative sagittale dele af nethinden (sham: n = 4, tBCCAO: n = 4) og kvantitative analyser af GFAP-mærkning (rød) ved en morfologiscore (0-3) viste, at GFAP-mærkning, for det meste begrænset i NFL + GCL, blev udvidet til hele det indre lag, fra GCL til ONL (hvide pile) i højre nethinde efter tBCCAO. Skalastænger, 50 μm. DAPI (blå) blev brugt til farvning af kernen i nethinden. NFL, GCL, IPL, INL og ONL repræsenterer nervefiber lag, ganglion cellelag, indre plexiform lag, indre nukleare lag og ydre nukleare lag, hhv. Dataene blev analyseret ved hjælp af Student's t-testog præsenteret som median med interkvartil rækkevidde, den 25. og 75. fraktil. *P < 0,05. L og R står for henholdsvis venstre og højre nethinde. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Visuel dysfunktion i højre øje efter tBCCAO. (A) Repræsentative bølgeformer af mørktilpasset ERG udført 3 og 7 dage efter tBCCAO. Stimuleringsintensitet (cd.s/m2):0,005. (B) Kvantitative analyser viste, at der var et fald i amplituderne af b-bølge i højre øje (sham: n = 5, tBCCAO: n = 6), mens amplituderne af en bølge ikke blev ændret. *P < 0,05, **P < 0,01. Dataene blev analyseret ved hjælp af Student's t-testog præsenteret som middelværdi med ±standardafvigelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: En ændring i nethindetykkelsen efter tBCCAO. Repræsentative OLT-billeder i de sham- og tBCCAO-drevne nethinder og kvantitative analyser viste, at der var en stigning i nethindetykkelsen i højre nethinde (sham: n = 4, tBCCAO: n = 8). Der var ingen ændring i nethindetykkelsen i venstre nethinde (sham: n = 4, tBCCAO: n = 8). Skalastængerne er henholdsvis 200 (øvre) og 100 (lavere) μm. *P < 0,05. Værdierne i diagrammernes vandrette akse repræsenterer 0,2, 0,4 og 0,6 mm fjernt fra synsnervens hoved (0), som blev opdaget af den grønne linje. Dataene blev analyseret ved hjælp af tovejs ANOVA efterfulgt af en Bonferroni post hoc-test. Spider diagrammer blev præsenteret som middelværdi med ± standardafvigelse. NFL, INL, ONL og ELM er henholdsvis nervefiberlaget, det indre atomlag, det ydre atomlag og den eksterne begrænsende membran. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1: Nethindeblod perfusion efter tBCCAO. Repræsentative nethinde flade mount billeder (med højere forstørrelse af hvert billede) efter 2 min FITC-dextran cirkulation og kvantitative analyser viste, at fuld perfusion kunne observeres i begge nethinder i sham-opererede mus og venstre nethinden i tBCCAO-drevne mus. Den højre nethinde i de tBCCAO-opererede mus viste imidlertid delvis blodtransfusion. Dataene blev analyseret ved hjælp af Student's t-testog præsenteret som middelværdi med ±standardafvigelse. L og R står for henholdsvis venstre og højre nethinde. Skalastængerne er henholdsvis 800 og 400 μm. Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 2: Udtryk for hypoxi-responsive gener efter tBCCAO. Kvantitative analyser viste en forbigående stigning i Bnip3 mRNA-ekspression i højre nethinde med statistisk signifikans 12 timer efter tBCCAO. Epo mRNA udtryk viste en stigende tendens i højre nethinden i 24 timer efter tBCCAO, selv om dens værdier ikke var væsentligt forskellige i forhold til den fingerede højre nethinden. **P < 0,01. Dataene blev analyseret ved hjælp af Student's t-testog præsenteret som middelværdi med ±standardafvigelse. Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 3: Visuel funktion i venstre øje efter tBCCAO. Kvantitative analyser viste, at der ikke var nogen ændring i amplituderne af a- og b-bølger i venstre øje (sham: n = 5, tBCCAO: n = 6). P > 0,05. Dataene blev analyseret ved hjælp af Student's t-testog præsenteret som middelværdi med ±standardafvigelse. Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 4: Overlevelsesrater efter tBCCAO i C57BL6 og BALB. Kaplan-Meier overlevelseskurver viste, at næsten alle mus døde inden for 3 dage efter tBCCAO i C57BL6 mus. Når det kommer til BALB-mus, fremkalder længere fastspændingstid i tBCCAO pludselig og alvorlig dyredød (overlevelsesrater på dag 7, 20 sek.: 10%, 10 sek: 20%, 2 sek: 81% og 0 sek:95%). Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 5: HIF-1α stabilisering efter ensidig CCAO. En repræsentativ immunoblot og kvantitativ analyse (sham: n = 3, unilateral CCAO: n = 3) for HIF-1α og β-Actin viste, at HIF-1α ikke var stabiliseret i nethinden 3 timer efter ensidig CCAO. P > 0,05. Dataene blev analyseret ved hjælp af Student's t-testog præsenteret som middelværdi med ±standardafvigelse. L og R står for henholdsvis venstre og højre nethinde. Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 6: Kraftig øjenlåg hængende efter tBCCAO med lang fastspændingstid. 10 sekunders tBCCAO induceret kraftig øjenlåg hængende, som blev vurderet ved en 4-punkts rating skala: 1 = ingen hængende, 2 = mild hængende (~ 50%), 3 = svær hængende (over 50%), og 4 = svær hængende med øjenafladning, som beskrevet i figur 2. Klik her for at downloade dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I undersøgelsen har vi vist, at tBCCAO ved hjælp af enkle suturer og en klemme kan fremkalde nethindeisk iskæmi og ledsagende nethindedysfunktion. Desuden har vi vist, at vores nuværende protokol for udvikling af en musemodel af nethindeisk iskæmi er lettere og hurtigere sammenlignet med andre tidligere protokoller til udvikling af nethindeisk iskæmisk skadesmodel2,3,7.

Anatomisk, venstre og højre cerebral arterier kan tilsluttes via posterior kommunikere arterier (PCAs), som giver sikkerhedsstillelse omsætning i cirklen af Willis at opretholde tilstrækkelig blodforsyning til centralnervesystemet mod flow afbrydelse fra okklusioner eller stenose af de enkelte fartøjer24,25 (Figur 1). Lee et al. påviste nethindeblodperfusion kunne være 10 min forsinket (hvilket ikke er en hel blokade af nethindeblodperfusion i ipsilateral nethinden) ved permanent ensidig CCAO i C57BL6 mus13. Dette indebærer, at CCAO's induktion af nethindeis er tæt forbundet med betingelserne for sikkerhedsstillelse i Willis- kredsen. C57BL6 er kendt for at være den mest modtagelige musestamme for cerebral iskæmi af BCCAO blandt syv musestammer, herunder vores nuværende undersøgelses musestamme BALB26. På grund af den ufuldstændige kreds af Willis i C57BL6, afbrydelse af hjernens blodforsyning fra begge CCAs fremkalder alvorlige skader i centralnervesystemet, endelig fører til døden. Derudover undlod vi i vores foreløbige undersøgelse at fremkalde tBCCAO i C57BL6, da næsten alle mus (ca. 80%) døde inden for 3 dage efter operationen(supplerende figur 4). Derfor har vi anvendt tBCCAO til en anden mus stamme BALB for vores nuværende undersøgelse.

For at fremkalde akutte nethinde iskæmiske skader i vores BALB model, den rigtige CCA var permanent ligated og venstre CCA blev anvendt til at øge akut nethinde iskæmisk stress gennem forbigående okklusion. Dette skyldes, at mus ikke kunne tolerere iskæmisk stress induceret af permanent BCCAO i modsætning til rotter, der har den komplette cirkel af Willis27. Dernæst forsøgte vi at optimere okklusionstid: venstre CCAO (0-20 sekunder), da okklusionstid er blevet betragtet som en af nøglefaktorer, der påvirker iskæmiske skader på centralnervesystemet og direkte forbinder med overlevelsesrater for eksperimentelle modeller28,29. Vi konstaterede, at overlevelsesraten for BALB-mus faldt på en okklusions tidsafhængig måde(supplerende figur 4). Okklusion af venstre CCA over 10 sekunder viste alvorligt højere dødelighed (over 50%), mens okklusion af venstre CCA i 2 sekunder eller ingen okklusion (eller ensidig CCAO) viste relativt højere overlevelsesrater (over 80%). Derfor udelukkede vi grupperne (okklusionstid, som er 10 og 20 sekunder) for de yderligere eksperimenter, da effektive og omkostningseffektive eksperimenter ikke kan være tilgængelige. Dernæst undersøgte vi, om okklusion af venstre CCA i 2 sekunder eller ingen okklusion (eller ensidig CCAO) kunne fremkalde nethinde hypoxi. HIF-1α er en vigtig regulator, der fungerer i hypoksiske reaktioner og stabiliseres under hypoksiske forhold30. I denne henseende er HIF-1α stabilisering blevet brugt som en generel molekylær biologisk markør for hypoxi. Vi kunne ikke påvise HIF-1α stabilisering i nethinden i gruppen af ensidige CCAO(supplerende figur 5). Interessant nok kunne vi opdage HIF-1α stabilisering i gruppen af 2 sekunder af tBCCAO (Figur 3). Dette indebærer nethinde hypoksisk stress kunne induceres med 2 sekunder af tBCCAO i BALB mus. Derfor blev 2 sekunders fastspændingstid endelig valgt til vores undersøgelse baseret på høje overlevelsesrater efter operationen og induktion af nethindeiskæmi via HIF-1α stabilisering.

Selv om den rigtige CCA var permanent okkluderet i tBCCAO-opererede mus, blev blodtransfusion delvist påvist i højre nethinde 2 minutter efter systemisk cirkulation af FITC-dextran (supplerende figur 1). Desuden konstaterede vi, at der ikke blev opdaget en ændring i HIF-1α-stabiliseringen i højre nethinde i de ensidige CCAO-opererede BALB-mus. Dette fænomen kan forklares ved virkninger af sikkerhedsstillelse omsætning gennem cirklen af Willis at opretholde blodforsyningen til nethinden (Figur 1). Selv om vi ikke klart kunne forstå virkningerne af venstre forbigående CCAO på blodperfusion til højre nethinden, forbigående venstre CCAO sammen med permanent højre CCAO kan øge akut hypoksiske fornærmelser i højre nethinden som det fremgår af en betydelig ændring i HIF-1α udtryk i højre nethinden efter tBCCAO (Figur 3). Desuden var overlevelsesraten for mus afhængig af okklusionstid for den venstre CCA. Samlet set kan intensiteten af nethinde iskæmisk stress kontrolleres via venstre CCAO.

Fænotypen af et hængende øjenlåg er blevet foreslået som et præsentationstegn eller et patofysiologisk symptom på alvorlige neurologiske tilstande, især iskæmisk slagtilfælde31,32. Musklen forbundet med en hængende øjenlåg er levator palpebrae superioris33. Denne muskel leveres af den laterale palpebral arterie, som er en af grene afledt af OpA. Derfor, når OpA, der leverer nethinden, er påvirket, øjenlåg hængende kunne ses. Øjenlåg hængende blev observeret i MCAO musemodeller34, som også blev gengivet i vores tBCCAO model. Desuden beskrev vi, at øjenlåg hængende bliver alvorlige, når okklusionstiden for venstre CCA tager længere tid (figur 2 og supplerende figur 6). Dette indebærer, at sværhedsgraden af øjenlåg hængende (indirekte benævnt intensiteten af nethinde iskæmisk stress) kan være afhængig af okklusion tid venstre CCA.

Retinal dysfunktion er et af resultaterne set i nethinde iskæmiske retinopatier, herunder stenose af BCCA hos mus35 og BCCAO hos rotter36. Vi fandt ud af, at amplituderne af b-bølge faldt i de tBCCAO-opererede mus. Flere tidligere undersøgelser viste, at MCAO også forårsaget en reduktion i amplituden af b-bølge efter operationen37,38. b-bølge afspejler en fysiologisk tilstand af celler i nethinde indre lag, herunder bipolære celler og Müller celler39. Desuden blev reaktiv gliose fra Müller-celler påvist i det indre nethindelag efter tBCCAO. Dette resultat er også gengivet i MCAO-modellerne40,41 og andre CCAO-modeller13,42. Samlet set indebærer det, at indre nethinde dysfunktion kunne induceres af tBCCAO. Retinal tykkelse er blevet rapporteret at stige forbigående i akut nethinde iskæmi43,44. Vi har også gengivet dette fund i de tBCCAO-opererede mus. Disse data viser, at tBCCAO's svækkelse af blodcirkulationen kan nå nethinden og endelig påvirke nethindelag.

For konsekvente resultater, bedøvelsestid og længden af kirurgiske procedurer samt andre faktorer såsom vægte og aldre af eksperimentelle modeller og deres kropstemperaturer under og efter operationen bør standardiseres45. Især er der behov for opmærksomhed for at opretholde musens kropstemperatur i hele forsøgsobservationsperioden. Dette skyldes, at hypotermi kan have en forudsætningseffekt og forstyrre iskæmiske virkninger af tBCCAO46. Selvom vi ikke kunne måle musenes nøjagtige kropstemperatur i vores eksperimenter, brugte vi varmepuder til at varme musene, indtil musene genvandt tilstrækkelig bevidsthed. Desuden sammenlignede vi de tBCCAO-opererede mus med de sham-opererede mus for at kontrollere potentielle forvirrende virkninger af ukontrollable faktorer.

Mus stammer kunne være en yderligere vigtig variabel faktor til at fremkalde nethinde iskæmisk skade ved tBCCAO. Betydelig variation af Willis' cirkel i musestammer kan resultere i en uønsket reduktion eller induktion af cerebral iskæmi, herunder nethinde ishcemia47 og derved kan føre til variabiliteter af resultaterne. Justering af fastspændingstid anbefales for en vellykket tBCCAO-induceret iskæmisk retinopati, når andre stammer af mus skal påføres.

Generelt ledsages tilfælde af slagtilfælde eller andre hjerneskader altid med midlertidigt eller permanent visontab48. Til dato er MCAO mus model meget udbredt til slagtilfælde undersøgelser. Da OpA stammer proksimalt til oprindelsen af MCA, enhver hindring i blodgennemstrømningen i MCA hindrer strømmen til nethinden. Nethinde iskæmi blev først demonstreret hos rotter af MCAO37. Senere blev den samme nethindeisk iskæmisk model anvendt på mus49. Men for proceduren, okklusion tager mere end 60 minutter og finde en okklusion site er yderst vanskeligt som MCA er begravet dybt inde i hjernen. Desuden filament størrelse og indsættelse længde for MCAO i høj grad beslutter succes for operationen. Disse yderligere variable faktorer fremkalder variabiliteter af de iskæmiske resultater efter operationen. Selvom der er behov for direkte sammenligningsundersøgelser mellem tBCCAO og MCAO, beskrev vi de gavnlige træk ved vores eksperimentelle modeller i denne undersøgelse: kort okklusionstid, enkel eksperimentel procedure og meget tilgængelige okklusionssteder. Denne model kan løse de bekymringer, der ses i MCAO modeller.

Mens brugen af musen model af nethinde iskæmi har store fordele for at studere nethinde iskæmisk skade, der fortsat begrænsninger for denne fremgangsmåde. Da kirurgisk snit i nakken, adskillelse af spytkirtlerne og okklusion i højre CCA med suturer skal anvendes til proceduren, kan de ledsagende vævsforstyrrelser fremkalde forbundet betændelse systemisk eller i det mindste lokalt. Disse bekymringer blev delvist behandlet ved hjælp af de sham-opererede mus, hvor alle de kirurgiske trin alle udføres uden tBCCAO. Et andet problem er et krav om at håndtere smerter, der opstår under og efter operationen. I vores undersøgelse blev smertebehandling for at forhindre lidelser hos musene anvendt gennem injektion af butorphanol tartratopløsning, en syntetisk afledt opioid agonist-antagonist smertestillende middel i phenanthren-serien. Det kan være vigtigt at være opmærksom på, at brugen af forskellige typer anæstesi og smertestillende midler kan forstyrre tBCCAO's virkninger på nethindeiskæmi. En anden begrænsning af denne tilgang (sammen med tilgangene til aktuelt anvendte andre modeller) er, at den ikke giver en perfekt simulering af patologier forbundet med menneskelige hjerte-kar-nethindeforstyrrelser. Til dato lider musemodeller, der bruges til sådanne eksperimenter, ikke af co-morbiditeter, der ligger til grund for iskæmiske retinopatier hos mennesker, hovedsagelig med metabolisk syndrom som diabetes50. Sådanne komplikationer, som ikke er til stede i de nuværende musemodeller, kan have negative synergistiske virkninger på de patologiske veje til udvikling af iskæmiske retinopatier. Derfor bør dette tages i betragtning ved fortolkningen af resultaterne fra de aktuelt anvendte eksperimentelle modeller, herunder vores tBCCAO-musemodel. For bedre at forstå patofysiologiske mekanismer af iskæmiske retinopatier hos mennesker, kan vores model kombineres med andre patologiske faktorer såsom streptozotocin injektion51 eller højt fedtindhold kost supplement52 til udvikling af iskæmisk diabetisk retinopati. Endelig, selv om vi viste reduceret nethindeblod perfusion i tBCCAO-opererede mus, kunne vi ikke klart forstå virkningerne af venstre forbigående CCAO på blod perfusion til højre nethinden. Dette spørgsmål kunne behandles ved hjælp af laser-Doppler , som typisk bruges til at bekræfte , at okklusion har fundet sted , og iskæmi har fundet sted in vivo i realtid53,54. Denne teknik kunne anvendes til bedre forståelse af nethinde iskæmi i en individuel tBCCAO-drevet mus, om sikkerhedsstillelse omsætning i cirklen af Willis.

På trods af disse begrænsninger repræsenterer vores tBCCAO-metode, der er beskrevet her, en effektiv tilgang til fremstilling af nethindekekymi hos mus. At studere nethindeændringer af tBCCAO hjælper med at optrævle patologiske mekanismer af iskæmiske retinopatier hos mennesker. Desuden håber vi, at tBCCAO-musemodellen kan bruges til in vivo-lægemiddelscreening.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Grants-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (18K09424 til Toshihide Kurihara og 20K18393 til Yukihiro Miwa) fra Ministeriet for Uddannelse, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi (MEXT).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atipamezole hydrochloride Zenoaq Antisedan For anti-anesthesia
Applied Biosystems 7500 Fast Applied Biosystems - For qPCR
Butorphanol tartrate Meiji Seika Pharma Vetorphale For anesthesia
BZ-II Analyzer KEYENCE - For an image merge
BALB/cAJc1 CLEA - Mouse strain
β-Actin (8H10D10) Mouse mAb CST 3700 For western blot
Clamp Forcep World Precision Instruments WPI 500451 For surgery
Dumont forceps #5 Fine Science Tools 11251-10 For surgery
DAPI solution Dojindo 340-07971 For IHC
Envisu SD-OCT system Leica R4310 For OCT
FITC-dextran Merk FD2000S For retinal blood perfusion
Fluorescence microscope KEYENCE BZ-9000 For fluorescence detection
Gatifloxacin hydrate Senju Pharmaceutical Gachifuro For anti-bacterial infection
GFAP Monoclonal Antibody (2.2B10) Thermo 13-0300 For IHC
Heating pad Marukan RH-200 For surgery
HIF-1α (D1S7W) XP Rabbit mAb CST 36169 For western blot
ImageQuant LAS 4000 mini GE Healthcare - For chemiluminescence
Midazolam Sandoz K.K SANDOZ For anesthesia
Microtome Tissue-Tek TEC 6 Sakura - For sectioning
Medetomidine Orion Corporation Domitor For anesthesia
Needle holder Handaya HS-2307 For surgery
PuREC MAYO Corporation - For ERG
Scissor Fine Science Tools 91460-11 For surgery
Sodium hyaluronate Santen Pharmaceutical Hyalein For eye lubrication
Tropicamide/Penylephrine hydrochloride Santen Pharmaceutical Mydrin-P For mydriasis
6-0 silk suture Natsume E12-60N2 For surgery

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, B. Ocular effects of changes in oxygen and carbon dioxide tension. Transactions of the American Ophthalmological Society. 66, 423-474 (1968).
  2. Ingberg, E., Dock, H., Theodorsson, E., Theodorsson, A., Ström, J. O. Method parameters' impact on mortality and variability in mouse stroke experiments: a meta-analysis. Scientific Reports. 6 (1), 21086 (2016).
  3. Atochin, D. N., Clark, J., Demchenko, I. T., Moskowitz, M. A., Huang, P. L. Rapid Cerebral Ischemic Preconditioning in Mice Deficient in Endothelial and Neuronal Nitric Oxide Synthases. Stroke. 34 (5), 1299-1303 (2003).
  4. Allen, R. S., et al. Severity of middle cerebral artery occlusion determines retinal deficits in rats. Experimental Neurology. 254, 206-215 (2014).
  5. Steele, E. C., Guo, Q., Namura, S. Filamentous Middle Cerebral Artery Occlusion Causes Ischemic Damage to the Retina in Mice. Stroke. 39 (7), 2099-2104 (2008).
  6. Minhas, G., Morishita, R., Anand, A. Preclinical models to investigate retinal ischemia: advances and drawbacks. Frontiers in Neurology. 3, 75 (2012).
  7. McColl, B. W., Carswell, H. V., McCulloch, J., Horsburgh, K. Extension of cerebral hypoperfusion and ischaemic pathology beyond MCA territory after intraluminal filament occlusion in C57Bl/6J mice. Brain Res. 997 (1), 15-23 (2004).
  8. Jiang, A. X., et al. Inducement and Evaluation of a Murine Model of Experimental Myopia. Journal of Visualized Experiments. (143), e58822 (2019).
  9. Miwa, Y., et al. Pharmacological HIF inhibition prevents retinal neovascularization with improved visual function in a murine oxygen-induced retinopathy model. Neurochemistry International. 128, 21-31 (2019).
  10. Adams, S., Pacharinsak, C. Mouse Anesthesia and Analgesia. Current Protocols in Mouse Biology. 5 (1), 51-63 (2015).
  11. Speetzen, L. J., Endres, M., Kunz, A. Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia. Journal of Visualized Experiments. (75), e4387 (2013).
  12. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments. (47), e2423 (2011).
  13. Lee, D., Kang, H., Yoon, K. Y., Chang, Y. Y., Song, H. B. A mouse model of retinal hypoperfusion injury induced by unilateral common carotid artery occlusion. Experimental Eye Research. 201, 108275 (2020).
  14. Li, S., et al. Retro-orbital injection of FITC-dextran is an effective and economical method for observing mouse retinal vessels. Molecular Vision. 17, 3566-3573 (2011).
  15. Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo. Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).
  16. Lee, D., et al. A Fairy Chemical Suppresses Retinal Angiogenesis as a HIF Inhibitor. Biomolecules. 10 (10), (2020).
  17. Tomita, Y., et al. Pemafibrate Prevents Retinal Pathological Neovascularization by Increasing FGF21 Level in a Murine Oxygen-Induced Retinopathy Model. International Journal of Molecular Sciences. 20 (23), 5878 (2019).
  18. Yamamoto, H., Schmidt-Kastner, R., Hamasaki, D. I., Yamamoto, H., Parel, J. M. Complex neurodegeneration in retina following moderate ischemia induced by bilateral common carotid artery occlusion in Wistar rats. Experimental Eye Research. 82 (5), 767-779 (2006).
  19. Cheng, L., Yu, H., Yan, N., Lai, K., Xiang, M. Hypoxia-Inducible Factor-1α Target Genes Contribute to Retinal Neuroprotection. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 20 (2017).
  20. Mole, D. R., et al. Genome-wide association of hypoxia-inducible factor (HIF)-1alpha and HIF-2alpha DNA binding with expression profiling of hypoxia-inducible transcripts. The Journal of Biological Chemistry. 284 (25), 16767-16775 (2009).
  21. Majmundar, A. J., Wong, W. J., Simon, M. C. Hypoxia-Inducible Factors and the Response to Hypoxic Stress. Molecular Cell. 40 (2), 294-309 (2010).
  22. Newman, E. A. Glial cell regulation of neuronal activity and blood flow in the retina by release of gliotransmitters. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370 (1672), (2015).
  23. Vecino, E., Rodriguez, F. D., Ruzafa, N., Pereiro, X., Sharma, S. C. Glia-neuron interactions in the mammalian retina. Progress in Retinal and Eye Research. 51, 1-40 (2016).
  24. Symonds, C. The Circle of Willis. British Medical Journal. 1 (4906), 119 (1955).
  25. Lo, W. B., Ellis, H. The circle before willis: a historical account of the intracranial anastomosis. Neurosurgery. 66 (1), 7-18 (2010).
  26. Yang, G., et al. C57BL/6 strain is most susceptible to cerebral ischemia following bilateral common carotid occlusion among seven mouse strains: selective neuronal death in the murine transient forebrain ischemia. Brain Research. 752 (1), 209-218 (1997).
  27. Farkas, E., Luiten, P. G. M., Bari, F. Permanent, bilateral common carotid artery occlusion in the rat: A model for chronic cerebral hypoperfusion-related neurodegenerative diseases. Brain Research Reviews. 54 (1), 162-180 (2007).
  28. Morris, G. P., et al. A Comparative Study of Variables Influencing Ischemic Injury in the Longa and Koizumi Methods of Intraluminal Filament Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice. PLOS ONE. 11 (2), 0148503 (2016).
  29. Tsuchiya, D., Hong, S., Kayama, T., Panter, S. S., Weinstein, P. R. Effect of suture size and carotid clip application upon blood flow and infarct volume after permanent and temporary middle cerebral artery occlusion in mice. Brain Research. 970 (1-2), 131-139 (2003).
  30. Kaelin, W. G., Ratcliffe, P. J. Oxygen Sensing by Metazoans: The Central Role of the HIF Hydroxylase Pathway. Molecular Cell. 30 (4), 393-402 (2008).
  31. Pauly, M., Sruthi, R. Ptosis: evaluation and management. Kerala Journal of Ophthalmolgy. 31 (1), 11-16 (2019).
  32. Averbuch-Heller, L., Leigh, R. J., Mermelstein, V., Zagalsky, L., Streifler, J. Y. Ptosis in patients with hemispheric strokes. Neurology. 58 (4), 620 (2002).
  33. Dutton, J. Atlas of clinical and surgical orbital anatomy, second edition. 113, 1364 (2011).
  34. Ritzel, R. M., et al. Early retinal inflammatory biomarkers in the middle cerebral artery occlusion model of ischemic stroke. Molecular Vision. 22, 575-588 (2016).
  35. Crespo-Garcia, S., et al. Individual and temporal variability of the retina after chronic bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO). PLOS ONE. 13 (3), 0193961 (2018).
  36. Qin, Y., et al. Functional and morphologic study of retinal hypoperfusion injury induced by bilateral common carotid artery occlusion in rats. Scientific Reports. 9 (1), 80 (2019).
  37. Block, F., Grommes, C., Kosinski, C., Schmidt, W., Schwarz, M. Retinal ischemia induced by the intraluminal suture method in rats. Neuroscience Letters. 232 (1), 45-48 (1997).
  38. Allen, R. S., et al. Progesterone Treatment in Two Rat Models of Ocular Ischemia. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (5), 2880-2891 (2015).
  39. Miller, R. F., Dowling, J. E. Intracellular responses of the Müller (glial) cells of mudpuppy retina: their relation to b-wave of the electroretinogram. Journal of Neurophysiology. 33 (3), 323-341 (1970).
  40. Block, F., Grommes, C., Kosinski, C., Schmidt, W., Schwarz, M. Retinal ischemia induced by the intraluminal suture method in rats. Neuroscience Letters. 232 (1), 45-48 (1997).
  41. Lee, J. H., Shin, J. M., Shin, Y. J., Chun, M. H., Oh, S. J. Immunochemical changes of calbindin, calretinin and SMI32 in ischemic retinas induced by increase of intraocular pressure and by middle cerebral artery occlusion. Anatomy & Cell Biology. 44 (1), 25-34 (2011).
  42. Li, S. Y., et al. Lycium barbarum polysaccharides reduce neuronal damage, blood-retinal barrier disruption and oxidative stress in retinal ischemia/reperfusion injury. PLOS ONE. 6 (1), 16380 (2011).
  43. Furashova, O., Matthé, E. Retinal Changes in Different Grades of Retinal Artery Occlusion: An Optical Coherence Tomography Study. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (12), 5209-5216 (2017).
  44. Zadeh, J. K., et al. Short-Time Ocular Ischemia Induces Vascular Endothelial Dysfunction and Ganglion Cell Loss in the Pig Retina. International Journal of Molecular Sciences. 20 (19), (2019).
  45. Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. Rodent stroke model guidelines for preclinical stroke trials (1st edition). Journal of Experimental Stroke & Translational Medicine. 2 (2), 2-27 (2009).
  46. Tang, Y., et al. Hypothermia-induced ischemic tolerance is associated with Drp1 inhibition in cerebral ischemia-reperfusion injury of mice. Brain Research. 1646, 73-83 (2016).
  47. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 13 (4), 683-692 (1993).
  48. Pula, J. H., Yuen, C. A. Eyes and stroke: the visual aspects of cerebrovascular disease. Stroke and Vascular Neurology. 2 (4), 210 (2017).
  49. Steele, E. C., Guo, Q., Namura, S. Filamentous middle cerebral artery occlusion causes ischemic damage to the retina in mice. Stroke. 39 (7), 2099-2104 (2008).
  50. Sim, D. A., et al. The Effects of Macular Ischemia on Visual Acuity in Diabetic Retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 2353-2360 (2013).
  51. Wu, K. K., Huan, Y. Streptozotocin-induced diabetic models in mice and rats. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 5, Unit 5.47 (2008).
  52. Mubarak, A., Hodgson, J. M., Considine, M. J., Croft, K. D., Matthews, V. B. Supplementation of a high-fat diet with chlorogenic acid is associated with insulin resistance and hepatic lipid accumulation in mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61 (18), 4371-4378 (2013).
  53. Ansari, S., Azari, H., McConnell, D. J., Afzal, A., Mocco, J. Intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke with laser doppler flowmetry guidance in mice. Journal of Visualized Experiments. (51), e2879 (2011).
  54. Hedna, V. S., et al. Validity of Laser Doppler Flowmetry in Predicting Outcome in Murine Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion Stroke. Journal of Vascular and Interventional Neurology. 8 (3), 74-82 (2015).

Tags

Medicin Problem 165 Halspulsåren okklusion Elektroretinografi Eksperimentelle modeller Hypoxi Iskæmi Optisk sammenhæng tomografi Retina Reperfusion
En Murine Model af iskæmisk Retinal Skade induceret af forbigående bilaterale fælles halspulsåren Okklusion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, D., Miwa, Y., Jeong, H., Ikeda, … More

Lee, D., Miwa, Y., Jeong, H., Ikeda, S. i., Katada, Y., Tsubota, K., Kurihara, T. A Murine Model of Ischemic Retinal Injury Induced by Transient Bilateral Common Carotid Artery Occlusion. J. Vis. Exp. (165), e61865, doi:10.3791/61865 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter