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Medicine

Un modello murino di lesione retinica ischemica indotta dall'occlusione dell'arteria carotide comune transiente

Published: November 12, 2020 doi: 10.3791/61865
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,4, 1,2
1Laboratory of Photobiology, Keio University School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, Keio University School of Medicine, 3Animal eye care, Tokyo Animal Eye Clinic, 4Tsubota Laboratory, Inc.
* These authors contributed equally

Summary

Qui, descriviamo un modello di topo di ischemia retinica mediante occlusione bilaterale transitoria comune dell'arteria carotide usando suture semplici e un morsetto. Questo modello può essere utile per comprendere i meccanismi patologici dell'ischemia retinica causati da anomalie cardiovascolari.

Abstract

Diverse malattie vascolari come la retinopatia diabetica, l'occlusione delle vene o delle arterie retiniche e la sindrome ischemica oculare possono portare all'ischemia retinica. Per studiare i meccanismi patologici dell'ischemia retinica, è necessario sviluppare modelli sperimentali pertinenti. Anatomicamente, un principale vaso di alimentazione del sangue retinica è l'arteria oftalmica (OpA) e OpA ha origine dall'arteria carotide interna della comune arteria carotide (CCA). Pertanto, l'interruzione del CCA potrebbe effettivamente causare ischemia retinica. Qui, abbiamo stabilito un modello di topo di ischemia retinica mediante occlusione dell'arteria carotide comune bilaterale transitoria (tBCCAO) per legare il CCA destro con suture di seta 6-0 e per occludere il CCA sinistro transitoriamente per 2 secondi tramite un morsetto, e abbiamo dimostrato che tBCCAO potrebbe indurre ischemia retinica acuta che porta alla disfunzione retinica. L'attuale metodo riduce la dipendenza dagli strumenti chirurgici utilizzando solo aghi chirurgici e un morsetto, riduce i tempi di occlusione per ridurre al minimo la morte animale inaspettata, che è spesso vista nei modelli di topo dell'occlusione dell'arteria cerebrale media e mantiene la riproducibilità dei comuni risultati ischemici retinali. Il modello può essere utilizzato per studiare la fisiopatologia delle retinopatie ischemiche nei topi e ulteriormente può essere utilizzato per lo screening in vivo dei farmaci.

Introduction

La retina è un tessuto neurosensoriale per la funzione visiva. Poiché è necessaria una notevole quantità di ossigeno per la funzione visiva, la retina è conosciuta come uno dei tessuti più esigenti di ossigeno nel corpo1. La retina è suscettibile alle malattie vascolari poiché l'ossigeno viene fornito attraverso i vasi sanguigni. Vari tipi di malattie vascolari, come la retinopatia diabetica e il vaso sanguigno retinale (vene o arterie) occlusione, possono indurre ischemia retinica. Per studiare i meccanismi patologici dell'ischemia retinica, sono considerati necessari modelli sperimentali riproducibili e clinicamente rilevanti di ischemia retinica. L'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) mediante inserimento di un filamento intraluminale è il metodo più generalmente utilizzato per lo sviluppo di modelli di roditori in vivo di ischemia cerebrale sperimentale2,3. A causa della vicinanza dell'arteria oftalmica (OpA) a MCA, i modelli MCAO vengono utilizzati anche contemporaneamente per comprendere la fisiopatologia dell'ischemia retinica4,5,6. Per indurre l'ischemia cerebrale insieme all'ischemia retinica, i filamenti lunghi vengono tipicamente inseriti attraverso l'incisione della comune arteria carotide (CCA) o dell'arteria carotide esterna (ECA). Questi metodi sono difficili da eseguire, richiedono molto tempo per completare l'intervento chirurgico (oltre 60 minuti per un topo) e portano ad alte variabilità nei risultati dopo l'interventochirurgico 7. Resta importante sviluppare un modello migliore per migliorare tali preoccupazioni.

In questo studio, abbiamo semplicemente usato breve occlusione bilaterale CCA transitoria (tBCCAO) con aghi e un morsetto per indurre l'ischemia retinica nei topi e analizzato i risultati tipici delle lesioni ischemiche nella retina. In questo video, daremo una dimostrazione della procedura tBCCAO.

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Protocol

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Keio University School of Medicine.

1. Preparazione di strumenti chirurgici e animali

  1. Autoclave strumenti chirurgici e tenerli in 70% alcol etilico. Prima di ogni nuova procedura chirurgica, pulire accuratamente gli strumenti chirurgici utilizzando il 70% di alcol etilico.
  2. Preparare topi BALB/cAJc1 maschi (6 settimane, 26-28 kg) in una stanza priva di agenti patogeni specifici (SPF) per mantenere condizioni sterili prima, durante e dopo l'intervento chirurgico.

2. Occlusione dell'arteria carotide comune bilaterale transitoria (tBCCAO)

  1. Mettere un topo in anestesia mediante iniezione intraperitoneale con una combinazione di midazolam (40 μg/100 μL), medetomidina (7,5 μg/100 μL) e tartrato butorfannolo (50 μg/100 μL), detto "MMB", come descritto in precedenza8,9. Tenere le skin della schiena del mouse per evitare che il mouse sbatta gli occhi fino a quando il mouse non viene completamente anestetizzato.
    1. Giudicare la profondità dell'anestesia pizzicando la dita del mouse fino a quando non ha risposta, di cui il metodo viene comunemente utilizzato per controllare l'anestesia completa10.
      NOTA: Generalmente, sono necessari meno di 5 minuti affinché i topi si addormentino. Le ricette corrette per l'anestesia generale possono essere diverse dalle istituzioni.
  2. Applicare una goccia di soluzione di caduta oculare ialuronato di sodio purificata allo 0,1% sugli occhi per prevenire la secchezza degli occhi in anestesia.
  3. Posizionare il mouse sulla schiena e fissare le zampe del mouse utilizzando nastri adesivi.
  4. Disinfettare l'area del collo del mouse usando il 70% di alcol etilico prima dell'intervento chirurgico.
    NOTA: Il ritaglio aggiuntivo della pelliccia non è stato eseguito in quanto ciò può causare successivainfiammazione della pelle 11,12.
  5. Eseguire l'incisione sagittale del collo con una lama (Figura 1).
    NOTA: L'incisione deve essere effettuata sulla linea mediana tra collo, sterno e trachea.
  6. Separare attentamente entrambe le ghiandole salivari usando due forcep e mobilitarle per visualizzare le CTA sottostanti.
  7. Isolare attentamente il CCA destro dai rispettivi nervi vagali e dalle vene di accompagnamento senza danneggiare le loro strutture e posizionare due suture di seta 6-0 sotto il CCA. Legare saldamente le due cravatte per bloccare il flusso sanguigno (Figura 1).
    NOTA: Durante la procedura, piccole vene potrebbero essere danneggiate. Se si vede sanguinamento, è necessario pulire per visualizzare chiaramente i CCA.
  8. Trovare il CCA sinistro con attenzione dai rispettivi nervi vagali e dalle vene di accompagnamento senza danneggiare le loro strutture e occludere il CCA sinistro per 2 secondi da un morsetto (Figura 1).
    NOTA: È necessario posizionare un ago da sutura di seta 6-0 sotto il CCA sinistro per contrassegnare un sito per il bloccaggio.
  9. Dopo la riapertura del CCA sinistro, le ferite da sutura del collo da una sutura di seta 6-0 e applicare un tampone di antibiotico (50 μL) sul collo per inibire l'infezione batterica.
    NOTA: Rimuovere dolcemente un morsetto per evitare di danneggiare la parete arteriosa durante la riapertura del CCA sinistro.
  10. Iniettare 0,75 mg/kg di atipamezolo cloridrato per via intraperitoneale al topo per aiutare il topo a recuperare rapidamente dall'anestesia profonda. Riportare il mouse in una gabbia per topi con cuscinetti preriscaldati.
    NOTA: Non lasciare il mouse lasciato incustodito fino a quando il mouse non riacquista sufficiente coscienza per mantenere la reclinanza sternale.
  11. Iniettare 0,4 mg/kg di tartrato di butorfanolo al topo per la gestione del dolore quando il topo si sveglia.
    NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Come primo suggerimento per il successo del tBCCAO, si può osservare lo sbavatura delle palpebre del topo (Figura 2).
  12. Per l'eutanasia, iniettare 3 volte di miscela di MMB ai topi e sacrificarli per esperimenti.

3. Osservazioni generali (tassi di sopravvivenza e sbavatura palpebrali)

  1. Dopo l'intervento chirurgico, controllare i tassi di sopravvivenza per tutte le cause di morte al giorno 0 (dopo l'intervento chirurgico), 1, 3 e 7.
  2. Valutare lo sbavatura delle palpebre con una scala di valutazione di 4 punti: 1 = nessun cadente, 2 = lieve sbavatura (~50%), 3 = grave sbavatura (oltre il 50%) e 4 = grave sbavatura con scarica oculare.

4. Perfusione di sangue retinica

  1. Iniettare 200 μL di FITC-dextran (25 mg/mL) nel ventricolo sinistro del topo, che è comunemente usato per l'osservazione della perfusione di sangue nei vasi retinici deltopo 13,14.
  2. 2 minuti dopo la circolazione, enucleare gli occhi e fissare in paraformaldeide al 4% per 1 ora. Le retine sono state accuratamente ottenute e montate in piano, come descrittoin precedenza 15, ed esaminate tramite un microscopio a fluorescenza.
  3. Scattare fotografie dei supporti integrali retini con ingrandimento 4x e unirsi in un unico utilizzando un analizzatore di unione, descritto in precedenza16.
  4. Misurare le aree perfuse tramite uno strumento di analisi delle navi nel software NIH Fiji/ImageJ.

5. Macchia occidentale

  1. 3 e 6 ore dopo il tBCCAO, ottenere gli occhi dei topi e trasferire immediatamente in una piastra di Petri contenente PBS freddo per isolare le retine.
  2. Dopo l'isolamento delle retine, eseguire l'assorbimento occidentale, come descritto in precedenza9.
  3. Incubare con anticorpi per fattore ipossia-inducibile-1α (HIF-1α; un marcatore di ipossia generale) e per β-Actin (un controllo interno del carico) durante la notte seguito dall'incubazione di anticorpi secondari coniugati con HRP. Visualizza i segnali tramite chemiluminescenza.

6. PCR quantitativo (qPCR)

  1. 6, 12 e 24 ore dopo tBCCAO, elaborare le retine ottenute per qPCR, come descritto in precedenza17.
  2. Eseguire qPCR tramite sistema PCR in tempo reale. I primer utilizzati sono elencati nella tabella 1. Calcola le variazioni di piegatura tra i livelli di trascrizioni diverse con il metodo ΔΔCT.

7. Immunoistochimica (IHC)

  1. 3 giorni dopo tBCCAO, ottenere gli occhi dei topi e incorporare in paraffina.
  2. Tagliare gli occhi incorporati nella paraffina con un microtomo per ottenere le sezioni oculari.
  3. De-paraffinare e macchiare le sezioni oculari di 5 μm di spessore come descritto in precedenza13.
  4. Incubare con un anticorpo per la proteina acida fibrillare gliale (GFAP; un marcatore affidabile per astrociti e cellule di Müller nella retina) durante la notte seguito dall'incubazione di anticorpi secondari coniugati con Alexa Fluor 555.
  5. Utilizzare DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindolo) per macchiare il nucleo nella retina. Visualizza i segnali tramite un microscopio a fluorescenza.
  6. Valutare il punteggio morfologico in base a una scala di valutazione di 4 punti, come descritto inprecedenza 13,18: 0 = nessun segnale, 1 = pochi piedi finali gliali positivi nello strato di cellule gangliari (GCL), 2 = pochi processi etichettati che vanno dal GCL allo strato nucleare esterno (ONL) e 3 = processi più etichettati che vanno da GCL a ONL.

8. Elettroretinografia (ERG)

  1. 3 e 7 giorni dopo tBCCAO, eseguire ERG utilizzando una cupola di Ganzfeld, un sistema di acquisizione e stimolatori LED, come descritto in precedenza9.
  2. Dopo l'adattamento scuro durante la notte, anestetizza i topi con una combinazione di MMB sotto la luce rossa fioca.
  3. Utilizzare una soluzione mista dello 0,5% di tropicamide e dello 0,5% di fenilefrina per dilatare le pupille.
  4. Posizionare gli elettrodi attivi sulla lente a contatto e posizionare l'elettrodo di riferimento in bocca.
  5. Ottenere risposte ERG da entrambi gli occhi di ogni animale.
  6. Registra le risposte scotopiche sotto l'adattamento oscuro con vari stimoli.
  7. Misurare le ampiezze di un'onda dalla linea di base al punto più basso di un'onda.
  8. Misurare le ampiezze dell'onda b dal punto più basso di un'onda al picco dell'onda b.
  9. Tenere tutti i topi al caldo durante la procedura utilizzando termoscapacchi.

9. Tomografia a coerenza ottica (PTOM)

  1. 2 settimane dopo tBCCAO, eseguire lo Strumento di personalizzazione di Office utilizzando il sistema SD-OCT, comeprecedentemente riportato 8,9.
  2. Per la misurazione, sottoscrivi i topi alla mioriasi con una soluzione mista dello 0,5% di tropicamide e 0,5% di fenilefrina e all'anestesia generale da una miscela di MMB.
  3. Ottenere immagini di scansione B da fette equatoriali di scansioni en-face.
  4. Esaminare le retine a 0,2, 0,4 e 0,6 mm dalla testa del nervo ottico.
  5. Misurare lo spessore retinico dallo strato di fibra nervosa retinica (NFL) alla membrana limitante esterna (ELM), e considerare la media dei valori misurati come spessore retinico di un singolo topo.
  6. Traccia i risultati come diagrammi a ragno.

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Representative Results

Dopo la circolazione sistemica del FITC-dextran per 2 minuti, sono state esaminate le vasculure retiniche delle retine sinistra e destra nei topi azionati da sham e nei topi azionati da tBCCAO (Figura complementare 1). Fitc-dextran era completamente visibile sia nelle retine nei topi a farsa che nella retina sinistra nei topi azionati da tBCCAO, mentre era parzialmente rilevabile nella retina destra nei topi azionati da tBCCAO.

Dopo il tBCCAO, è stato esaminato lo sbavatura delle palpebre(figura 2). Gli occhi giusti hanno mostrato lievi (punteggio 2; 75%) e palpebra grave (punteggio 3 e 4; 25%) cadenti, mentre gli occhi di sinistra non hanno sbavato (punteggio 1; 93,75%) ad eccezione di un mouse (punteggio 2; 6,25%). Sebbene nei topi azionati da tBCCAO non sia stato osservato considerevolmente un grave sbavatura palpebrale con scarica oculare, abbiamo potuto vedere un topo per questo fenotipo (punteggio 4; 6,25%).

La riduzione dello stato di ossigeno nei tessuti porta alla stabilizzazione dell'HIF-1α e all'induzione di una serie di geni reattivi all'ipossia come EPO, VEGF e BNIP319,20,21. Prima di tutto, l'ipossia biologica molecolare con un marcatore ipossico generale HIF-1α è stata valutata tramite gonfiore occidentale (Figura 3). L'aumento dell'espressione hif-1α è stato significativamente osservato nella retina destra 3 e 6 ore dopo il tBCCAO. Successivamente, le espressioni dei geni ipossia-reattivi sono state valutate tramite qPCR (Figura complementare 2). Non c'è stato alcun cambiamento significativo nelle espressioni geniche reattive all'ipossia 6 ore dopo il tBCCAO. 12 ore dopo tBCCAO, abbiamo trovato l'espressione Binp3 significativamente aumentata e un leggero aumento dell'espressione Epo è stato mostrato nella retina destra. 24 ore dopo tBCCAO, abbiamo anche potuto trovare un leggero aumento dell'espressione Epo nella retina destra anche se non era statisticamente significativa. L'espressione di Vegf non è stata alterata da 6 a 24 ore nei topi azionati da tBCCAO.

La gliosi reattiva retinica è stata esaminata 3 giorni dopo il tBCCAO (Figura 4), poiché glia come gli astrociti e cellule di Müller sono stati strettamente associati all'ischemia retinica22. GFAP è stato ampiamente utilizzato per il rilevamento di astrociti e cellule di Müller nella retina23. La media dei punteggi morfologici per l'etichettatura GFAP nella retina destra era la più alta tra le retine sia nei topi azionati da sham che nella retina sinistra nei topi azionati da tBCCAO. Sulla base della localizzazione dell'espressione GFAP, si ritiene che un cambiamento di morfologia nell'etichettatura GFAP rifletta l'attivazione delle cellule Müller.

L'ERG è stato utilizzato per esaminare la disfunzione retinica dopo tBCCAO(Figura 5). Le ampiezze dell'onda b nell'occhio destro sono drasticamente diminuite 3 e 7 giorni dopo il tBCCAO. Tuttavia, le ampiezze di un'onda nell'occhio destro non sono state significativamente cambiate. Quando si tratta dell'occhio sinistro, non abbiamo potuto vedere alcun cambiamento nelle ampiezze delle onde a e b (Figura complementare 3).

Abbiamo eseguito oct per determinare un'alterazione dello spessore della retina dopo tBCCAO(Figura 6). Lo spessore della retina nell'occhio destro è aumentato drasticamente 2 settimane dopo il tBCCAO, mentre non c'era differenza nello spessore della retina nell'occhio sinistro tra i topi tBCCAO e finti.

Figure 1
Figura 1: Schema della procedura del modello e della circolazione sanguigna nel cerchio di Willis. Un'illustrazione schematica ha mostrato la procedura del modello di topo ischemico retinica indotta da tBCCAO e la circolazione sanguigna alla retina. CCA, ECA, ICA, PCA e OpA rappresentano rispettivamente l'arteria carotide comune, l'arteria carotide esterna, l'arteria carotide interna, l'arteria comunicante posteriore e l'arteria oftalmica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Palpebra cadente dopo tBCCAO. La gravità dello sbavatura delle palpebre è stata valutata con una valutazione di 4 punti in base alle immagini di riferimento: 1 = nessun cadente, 2 = lieve sbavatura (~50% cadente), 3 = cadenza grave (oltre il 50% cadente) e 4 = grave sbavatura con scarica oculare. La palpebra cadente è stata osservata dopo il tBCCAO ed è stata mantenuta durante l'osservazione sperimentale. I risultati (sham: n = 10, tBCCAO: n = 16) sono stati tracciati come un grafico a punti a dispersione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Stabilizzazione hif-1α dopo tBCCAO. Immunobloti rappresentativi e analisi quantitative (gruppi per l'ora 3; sham: n = 3, tBCCAO: n = 6 e gruppi per l'ora 6; sham e tBCCAO: n = 6) per HIF-1α e β-Actin hanno dimostrato che HIF-1α è stato stabilizzato nella retina destra 3 e 6 ore dopo tBCCAO. *P < 0,05. I dati sono stati analizzati utilizzando il test tdi Student e presentati come meschino con ±standard. L e R stanno rispettivamente per la retina sinistra e destra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Gliosi reattiva dopo tBCCAO. Sezioni sagittali rappresentative delle retine (sham: n = 4, tBCCAO: n = 4) e analisi quantitative dell'etichettatura GFAP (rosso) con un punteggio morfologico (0-3) hanno mostrato che l'etichettatura GFAP, per lo più limitata in NFL +GCL, è stata espansa all'intero strato interno, da GCL a ONL (frecce bianche) nella retina destra dopo tBCCAO. Barre di scala, 50 μm. Dapi (blu) è stato utilizzato per macchiare il nucleo nella retina. NFL, GCL, IPL, INL e ONL rappresentano rispettivamente lo strato di fibra nervosa, lo strato di cellule gangliari, lo strato plessiforme interno, lo strato nucleare interno e lo strato nucleare esterno. I dati sono stati analizzati utilizzando il test t diStudent e presentati come mediani con intervallo interquartile, 25° e 75° percentile. *P < 0,05. L e R stanno rispettivamente per la retina sinistra e destra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Disfunzione visiva nell'occhio destro dopo tBCCAO. (A) Forme d'onda rappresentative di ERG adattato al buio eseguite 3 e 7 giorni dopo il tBCCAO. Intensità di stimolazione (cd.s/m2): 0,005. (B) Le analisi quantitative hanno mostrato che vi è stata una diminuzione delle ampiezze dell'onda b nell'occhio destro (sham: n = 5, tBCCAO: n = 6) mentre le ampiezze di un'onda non sono state modificate. *P < 0,05, **P < 0,01. I dati sono stati analizzati utilizzando il test tdi Student e presentati come meschino con ±standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Variazione dello spessore della retina dopo tBCCAO. Le immagini rappresentative degli OCT nelle retine gestite da sham e tBCCAO e le analisi quantitative hanno mostrato che c'è stato un aumento dello spessore della retina nella retina destra (sham: n = 4, tBCCAO: n = 8). Non c'è stato alcun cambiamento nello spessore della retina nella retina sinistra (sham: n = 4, tBCCAO: n = 8). Le barre di scala sono rispettivamente 200 (superiore) e 100 (inferiore) μm. *P < 0,05. I valori nell'asse orizzontale dei diagrammi rappresentano 0,2, 0,4 e 0,6 mm di distanza dalla testa del nervo ottico (0) rilevata dalla linea verde. I dati sono stati analizzati utilizzando ANOVA bi senso seguito da un test post hoc Bonferroni. I diagrammi ragno sono stati presentati come meschino con ± deviazione standard. NFL, INL, ONL ed ELM sono rispettivamente lo strato di fibra nervosa, lo strato nucleare interno, lo strato nucleare esterno e la membrana limitante esterna. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura complementare 1: Perfusione di sangue retinica dopo tBCCAO. Immagini rappresentative a montaggio piatto retinale (con ingrandimento più elevato di ogni immagine) dopo 2 minuti di circolazione FITC-dextran e analisi quantitative hanno mostrato che la perfusione completa era osservabile sia nelle retine nei topi azionati da sham che nella retina sinistra nei topi azionati da tBCCAO. Tuttavia, la retina destra nei topi azionati da tBCCAO ha mostrato una parziale perfusione di sangue. I dati sono stati analizzati utilizzando il test tdi Student e presentati come meschino con ±standard. L e R stanno rispettivamente per la retina sinistra e destra. Le barre di scala sono rispettivamente 800 e 400 μm. Clicca qui per scaricare questa cifra.

Figura complementare 2: Espressioni di geni ipossia-reattivi dopo tBCCAO. Le analisi quantitative hanno mostrato un aumento transitorio dell'espressione di MRNA Bnip3 nella retina destra con significatività statistica 12 ore dopo il tBCCAO. L'espressione di Epo mRNA ha mostrato una crescente tendenza nella retina destra per 24 ore dopo il tBCCAO, sebbene i suoi valori non fossero significativamente diversi rispetto alla retina destra azionata da sham. **P < 0,01. I dati sono stati analizzati utilizzando il test tdi Student e presentati come meschino con ±standard. Clicca qui per scaricare questa cifra.

Figura complementare 3: Funzione visiva nell'occhio sinistro dopo tBCCAO. Le analisi quantitative hanno mostrato che non vi è stato alcun cambiamento nelle ampiezze delle onde a e b nell'occhio sinistro (sham: n = 5, tBCCAO: n = 6). P > 0,05. I dati sono stati analizzati utilizzando il test tdi Student e presentati come meschino con ±standard. Clicca qui per scaricare questa cifra.

Figura complementare 4: Tassi di sopravvivenza dopo tBCCAO in C57BL6 e BALB. Le curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier hanno dimostrato che quasi tutti i topi sono morti entro 3 giorni dopo il tBCCAO nei topi C57BL6. Quando si tratta di topi BALB, il tempo di bloccaggio più lungo in tBCCAO induce morte improvvisa e grave degli animali (tassi di sopravvivenza il giorno 7, 20 secondi: 10%, 10 sec: 20%, 2 sec: 81% e 0 sec: 95%). Clicca qui per scaricare questa cifra.

Figura complementare 5: stabilizzazione hif-1α dopo CCAO unilaterale. Un'immunoblot rappresentativa e un'analisi quantitativa (sham: n = 3, CCAO unilaterale: n = 3) per HIF-1α e β-Actin hanno dimostrato che HIF-1α non è stato stabilizzato nelle retine 3 ore dopo il CCAO unilaterale. P > 0,05. I dati sono stati analizzati utilizzando il test tdi Student e presentati come meschino con ±standard. L e R stanno rispettivamente per la retina sinistra e destra. Clicca qui per scaricare questa cifra.

Figura supplementare 6: Grave palpebra cadente dopo tBCCAO con lungo tempo di bloccaggio. 10 secondi di sbavatura grave della palpebra indotta da tBCCAO, che è stata valutata da una scala di valutazione di 4 punti: 1 = nessun cadente, 2 = lieve sbavatura (~50%), 3 = grave sbavatura (oltre il 50%) e 4 = grave cadente con scarica oculare, come descritto nella figura 2. Clicca qui per scaricare questa cifra.

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Discussion

Nello studio, abbiamo dimostrato che il tBCCAO, utilizzando suture semplici e un morsetto, potrebbe indurre ischemia retinica e conseguente disfunzione retinica. Inoltre, abbiamo dimostrato che il nostro attuale protocollo per lo sviluppo di un modello di topo di ischemia retinica è più facile e veloce rispetto ad altri protocolli precedenti per lo sviluppo di modelli di lesioni ischemiche retiniche2,3,7.

Anatomicamente, le arterie cerebrali sinistra e destra possono essere collegate tramite arterie comunicanti posteriori (PCA) che forniscono circolazione collaterale nel cerchio di Willis per mantenere un adeguato afflusso di sangue al sistema nervoso centrale contro l'interruzione del flusso da occlusione o stenosidei singoli vasi 24,25 (Figura 1). La perfusione di sangue retinica dimostrata potrebbe essere ritardata di 10 minuti (che non è un intero blocco della perfusione di sangue retinica nella retina ipsilaterale) da CCAO unilaterale permanente nei topi C57BL613. Ciò implica che l'induzione dell'ischemia retinica da parte del CCAO è strettamente associata a condizioni di circolazione collaterale nel cerchio di Willis. C57BL6 è noto per essere il ceppo di topo più suscettibile all'ischemia cerebrale da parte del BCCAO tra sette ceppi di topi tra cui il ceppo di topo BALB26del nostro attuale studio. A causa della cerchia incompleta di Willis nel C57BL6, l'interruzione dell'apporto di sangue cerebrale da entrambe le CCA induce gravi danni nel sistema nervoso centrale, portando infine alla morte. Inoltre, nel nostro studio preliminare, non siamo riusciti a indurre tBCCAO in C57BL6 come quasi tutti i topi (circa l'80%) è morto entro 3 giorni dall'intervento chirurgico(Figura complementare 4). Pertanto, abbiamo applicato tBCCAO a un altro BALB di deformazione del mouse per il nostro studio attuale.

Per indurre lesioni ischemiche retiniche acute nel nostro modello BALB, il CCA destro è stato legato in modo permanente e il CCA sinistro è stato applicato per aumentare lo stress ischemico retinale acuto attraverso l'occlusione transitoria. Questo perché i topi non potevano tollerare lo stress ischemico indotto dal BCCAO permanente a differenza dei ratti che hanno il cerchio completo di Willis27. Successivamente, abbiamo cercato di ottimizzare il tempo di occlusione: CCAO sinistro (0-20 secondi), poiché il tempo di occlusione è stato considerato uno dei fattori chiave che influisce sulle lesioni ischemiche al sistema nervoso centrale e si collega direttamente con i tassi disopravvivenza dei modelli sperimentali 28,29. La Corte ha riscontrato che i tassi di sopravvivenza dei topi BALB sono diminuiti in modo dipendente dal tempo di occlusione (Figura complementare 4). L'occlusione del CCA sinistro in 10 secondi ha mostrato tassi di mortalità molto più elevati (oltre il 50%), mentre l'occlusione del CCA sinistro per 2 secondi o nessuna occlusione (o CCAO unilaterale) ha mostrato tassi di sopravvivenza relativamente più elevati (oltre l'80%). Pertanto, abbiamo escluso i gruppi (di tempo di occlusione che è di 10 e 20 secondi) per gli ulteriori esperimenti in quanto non possono essere disponibili esperimenti efficienti ed economici. Successivamente, abbiamo esaminato se l'occlusione del CCA sinistro per 2 secondi o nessuna occlusione (o CCAO unilaterale) potesse indurre ipossia retinica. HIF-1α è un importante regolatore che funziona nelle risposte ipossiche ed è stabilizzato in condizioni ipossiche30. A questo proposito, la stabilizzazione hif-1α è stata usata come marcatore biologico molecolare generale per l'ipossia. Non siamo stati in grado di rilevare la stabilizzazione dell'HIF-1α nella retina nel gruppo del CCAO unilaterale (Figura complementare 5). È interessante notare che potremmo rilevare la stabilizzazione di HIF-1α nel gruppo di 2 secondi di tBCCAO (Figura 3). Ciò implica che lo stress ipossia retinica potrebbe essere indotto da 2 secondi di tBCCAO nei topi BALB. Pertanto, 2 secondi di tempo di bloccaggio sono stati finalmente selezionati per il nostro studio in base agli alti tassi di sopravvivenza dopo l'intervento chirurgico e l'induzione dell'ischemia retinica tramite stabilizzazione HIF-1α.

Sebbene il CCA destro fosse permanentemente occluso nei topi azionati da tBCCAO, la perfusione di sangue è stata parzialmente rilevata nella retina destra 2 minuti dopo la circolazione sistemica di FITC-dextran (Figura complementare 1). Inoltre, la Corte ha riscontrato che un'alterazione della stabilizzazione hif-1α non è stata rilevata nella retina destra nei topi BALB unilaterali azionati da CCAO. Questo fenomeno potrebbe essere spiegato dagli effetti della circolazione collaterale attraverso il cerchio di Willis per mantenere l'apporto di sangue alla retina (Figura 1). Anche se non siamo stati in grado di comprendere chiaramente gli effetti del CCAO trasmissiente sinistro sulla perfusione di sangue alla retina destra, il CCAO sinistro transitorio insieme al CCAO destro permanente può aumentare gli insulti ipossici acuti nella retina destra come evidenziato da un cambiamento significativo nell'espressione HIF-1α nella retina destra dopo tBCCAO (Figura 3). Inoltre, i tassi di sopravvivenza dei topi dipendevano dal tempo di occlusione del CCA sinistro. Nel complesso, l'intensità dello stress ischemico retinale potrebbe essere controllata tramite CCAO sinistro.

Il fenotipo di una palpebra cadente è stato suggerito come segno di presentazione o sintomo fisiopatico di gravi condizioni neurologiche, in particolare ictus ischemico31,32. Il muscolo associato a una palpebra cadente è levator palpebrae superioris33. Questo muscolo è fornito dall'arteria palpebrale laterale che è uno dei rami derivati da OpA. Quindi, quando OpA, che fornisce la retina, è colpita, si potrebbe vedere lo sbavatura delle palpebre. Lo sbavatura delle palpebre è stato osservato nei modelli di mouse MCAO34, che è stato riprodotto anche nel nostro modello tBCCAO. Inoltre, abbiamo descritto che lo sbavatura delle palpebre diventa grave quando il tempo di occlusione del CCA sinistro richiede più tempo (figura 2 e figura complementare 6). Ciò implica che la gravità dello sbavatura delle palpebre (indirettamente indicata come l'intensità dello stress ischemico retinale) potrebbe dipendere dal tempo di occlusione del CCA sinistro.

La disfunzione retinica è uno dei risultati osservati nelle retinopatie ischemiche retiniche, tra cui stenosi del BCCAnei topi 35 e BCCAO neiratti 36. La Corte ha riscontrato che le ampiezze dell'onda B sono diminuite nei topi azionati da tBCCAO. Diversi studi precedenti hanno dimostrato che l'MCAO ha anche causato una riduzione dell'ampiezza dell'onda Bdopo l'intervento chirurgico 37,38. l'onda b riflette una condizione fisiologica delle cellule negli strati interni della retina, comprese le cellule bipolari e le cellule di Müller39. Inoltre, la gliosi reattiva da parte delle cellule di Müller è stata rilevata nello strato retinale interno dopo il tBCCAO. Questo risultato è riprodotto anche nei modelli MCAO40,41 e altri modelli CCAO13,42. Nel complesso, implica che la disfunzione retinica interna potrebbe essere indotta da tBCCAO. È stato riferito che lo spessore della retina aumenta transitoriamente nell'ischemia retinica acuta43,44. Abbiamo anche riprodotto questa scoperta nei topi operati da tBCCAO. Questi dati mostrano che la compromissione della circolazione sanguigna da parte del tBCCAO potrebbe raggiungere la retina e infine influenzare gli strati retinali.

Per risultati coerenti, il tempo anestetico e la durata delle procedure chirurgiche, nonché altri fattori come pesi ed età dei modelli sperimentali e le loro temperature corporee durante e dopo l'intervento chirurgico devono essere standardizzati45. In particolare, è necessaria attenzione per mantenere la temperatura corporea dei topi durante il periodo di osservazione sperimentale. Questo perché l'ipotermia potrebbe avere un effetto precondizione e interferire con gli effetti ischemici di tBCCAO46. Anche se non siamo stati in grado di misurare la temperatura corporea esatta dei topi nei nostri esperimenti, abbiamo usato le pastiglie riscaldanti per riscaldare i topi fino a quando i topi non hanno ripreso sufficiente coscienza. Inoltre, abbiamo confrontato i topi operati con tBCCAO con i topi azionati da sham per controllare potenziali effetti confondenti di fattori incontrollabili.

I ceppi di topo potrebbero essere un ulteriore importante fattore variabile per indurre lesioni ischemiche retiniche da tBCCAO. Una sostanziale variazione del cerchio di Willis nei ceppi di topo potrebbe comportare una riduzione o un'induzione indesiderata dell'ischemia cerebrale, compresa l'ishcemia retinica47, e quindi potrebbe portare a variabilità dei risultati. La regolazione del tempo di bloccaggio è raccomandata per una retinopatia ischemica indotta da tBCCAO di successo quando devono essere applicati altri ceppi di topi.

In generale, gli incidenti di ictus o altre lesioni cerebrali sono invariabilmente accompagnati da una perdita di vison temporanea o permanente48. Ad oggi, il modello di mouse MCAO è ampiamente utilizzato per gli studi sui tratti. Poiché OpA ha origine prossimale all'origine dell'MCA, qualsiasi ostacolo nel flusso sanguigno in MCA ostruisce il flusso verso la retina. L'ischemia retinica è stata dimostrata per la prima volta nei ratti da MCAO37. Successivamente, lo stesso modello ischemico retinale è stato applicato ai topi49. Tuttavia, per la procedura, l'occlusione richiede più di 60 minuti e trovare un sito di occlusione è estremamente difficile in quanto MCA è sepolto nel profondo del cervello. Inoltre, la dimensione del filamento e la lunghezza di inserimento per MCAO decidono notevolmente il successo dell'intervento chirurgico. Questi fattori variabili aggiuntivi inducono variabilità degli esiti ischemici dopo l'intervento chirurgico. Sebbene siano necessari studi di confronto diretto tra tBCCAO e MCAO, abbiamo descritto le caratteristiche benefiche dei nostri modelli sperimentali in questo studio: breve tempo di occlusione, procedura sperimentale semplice e siti di occlusione altamente accessibili. Questo modello può risolvere le preoccupazioni viste nei modelli MCAO.

Mentre l'uso del modello del topo dell'ischemia retinica ha grandi benefici per lo studio della lesione ischemica retinica, rimangono limitazioni a questo approccio. Poiché l'incisione chirurgica nel collo, la separazione delle ghiandole salivari e l'occlusione nel CCA destro con suture devono essere applicate per la procedura, le interruzioni tissutali di accompagnamento possono evocare infiammazioni associate sistemicamente o almeno localmente. Queste preoccupazioni sono state parzialmente affrontate utilizzando i topi finti, dove tutte le fasi chirurgiche sono tutte condotte senza tBCCAO. Un altro problema è un requisito di gestione del dolore che si verifica durante e dopo l'intervento chirurgico. Nel nostro studio, la gestione del dolore per prevenire la sofferenza dei topi è stata applicata attraverso l'iniezione di soluzione di tartrato butorfanolo, un analgesico antagonista dell'agonista oppioide di derivazione sintetica della serie del fenantroene. Potrebbe essere importante essere consapevoli del fatto che l'uso di diversi tipi di anestetici e analgesici può interrompere gli effetti di tBCCAO sull'ischemia retinica. Un'altra limitazione a questo approccio (insieme agli approcci di altri modelli attualmente utilizzati) è che non fornisce una perfetta simulazione di patologie associate a disturbi della retina cardiovascolare umana. Ad oggi, i modelli di topo utilizzati per tali esperimenti non soffrono di comorbilità che sono alla base delle retinopatie ischemiche nell'uomo, principalmente con sindrome metabolica come il diabete50. Tali complicazioni che non sono presenti negli attuali modelli di topo potrebbero avere effetti sinergici negativi sulle vie patologiche per lo sviluppo di retinopatie ischemiche. Pertanto, questo dovrebbe essere preso in considerazione quando si interpretano i risultati dei modelli sperimentali attualmente utilizzati, incluso il nostro modello di mouse tBCCAO. Per comprendere meglio i meccanismi fisiopatologici delle retinopatie ischemiche nell'uomo, il nostro modello può essere combinato con altri fattori patologici come l'iniezione di streptozotocina51 o l'integratorealimentare ad alto contenuto di grassi 52 per lo sviluppo della retinopatia diabetica ischemica. Alla fine, anche se abbiamo mostrato una ridotta perfusione di sangue retinica nei topi azionati da tBCCAO, non siamo stati in grado di comprendere chiaramente gli effetti del CCAO transitorio sinistro sulla perfusione di sangue alla retina destra. Questa questione potrebbe essere affrontata utilizzando laser-Doppler che viene tipicamente utilizzato per confermare che l'occlusione ha avuto luogo e l'ischemia si è verificata in vivo intempo reale 53,54. Questa tecnica potrebbe essere utilizzata per una migliore comprensione dell'ischemia retinica in un singolo topo azionato da tBCCAO, per quanto riguarda la circolazione collaterale nel cerchio di Willis.

Nonostante queste limitazioni, il nostro metodo tBCCAO descritto qui rappresenta un approccio efficace per produrre ischemia retinica nei topi. Studiare i cambiamenti retinali da parte del tBCCAO aiuta a svelare i meccanismi patologici delle retinopatie ischemiche nell'uomo. Inoltre, speriamo che il modello di topo tBCCAO possa essere utilizzato per lo screening in vivo dei farmaci.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato da Grants-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (18K09424 a Toshihide Kurihara e 20K18393 a Yukihiro Miwa) del Ministero dell'Istruzione, della Cultura, dello Sport, della Scienza e della Tecnologia (MEXT).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atipamezole hydrochloride Zenoaq Antisedan For anti-anesthesia
Applied Biosystems 7500 Fast Applied Biosystems - For qPCR
Butorphanol tartrate Meiji Seika Pharma Vetorphale For anesthesia
BZ-II Analyzer KEYENCE - For an image merge
BALB/cAJc1 CLEA - Mouse strain
β-Actin (8H10D10) Mouse mAb CST 3700 For western blot
Clamp Forcep World Precision Instruments WPI 500451 For surgery
Dumont forceps #5 Fine Science Tools 11251-10 For surgery
DAPI solution Dojindo 340-07971 For IHC
Envisu SD-OCT system Leica R4310 For OCT
FITC-dextran Merk FD2000S For retinal blood perfusion
Fluorescence microscope KEYENCE BZ-9000 For fluorescence detection
Gatifloxacin hydrate Senju Pharmaceutical Gachifuro For anti-bacterial infection
GFAP Monoclonal Antibody (2.2B10) Thermo 13-0300 For IHC
Heating pad Marukan RH-200 For surgery
HIF-1α (D1S7W) XP Rabbit mAb CST 36169 For western blot
ImageQuant LAS 4000 mini GE Healthcare - For chemiluminescence
Midazolam Sandoz K.K SANDOZ For anesthesia
Microtome Tissue-Tek TEC 6 Sakura - For sectioning
Medetomidine Orion Corporation Domitor For anesthesia
Needle holder Handaya HS-2307 For surgery
PuREC MAYO Corporation - For ERG
Scissor Fine Science Tools 91460-11 For surgery
Sodium hyaluronate Santen Pharmaceutical Hyalein For eye lubrication
Tropicamide/Penylephrine hydrochloride Santen Pharmaceutical Mydrin-P For mydriasis
6-0 silk suture Natsume E12-60N2 For surgery

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Medicina Numero 165 Occlusione dell'arteria carotide Elettroretinografia Modelli sperimentali Ipossia Ischemia Tomografia a coerenza ottica Retina Riperfusione
Un modello murino di lesione retinica ischemica indotta dall'occlusione dell'arteria carotide comune transiente
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Lee, D., Miwa, Y., Jeong, H., Ikeda, S. i., Katada, Y., Tsubota, K., Kurihara, T. A Murine Model of Ischemic Retinal Injury Induced by Transient Bilateral Common Carotid Artery Occlusion. J. Vis. Exp. (165), e61865, doi:10.3791/61865 (2020).

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