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Medicine

Un modèle murin des dommages rétiniens ischémiques induits par occlusion commune transitoire d’artère carotide

Published: November 12, 2020 doi: 10.3791/61865
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,4, 1,2
1Laboratory of Photobiology, Keio University School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, Keio University School of Medicine, 3Animal eye care, Tokyo Animal Eye Clinic, 4Tsubota Laboratory, Inc.
* These authors contributed equally

Summary

Ici, nous décrivons un modèle de souris de l’ischémie rétinienne par occlusion commune transitoire d’artère carotide utilisant des sutures simples et une pince. Ce modèle peut être utile pour comprendre les mécanismes pathologiques de l’ischémie rétinienne provoquées par des anomalies cardio-vasculaires.

Abstract

Diverses maladies vasculaires telles que la rétinopathie diabétique, l’occlusion des veines rétiniennes ou des artères et le syndrome ischémique oculaire peuvent mener à l’ischémie rétinienne. Pour étudier les mécanismes pathologiques de l’ischémie rétinienne, des modèles expérimentaux pertinents doivent être développés. Anatomiquement, un vaisseau principal d’approvisionnement en sang rétinien est l’artère ophtalmique (OpA) et opa provient de l’artère carotide interne de l’artère carotide commune (CCA). Ainsi, la perturbation de la CCA pourrait effectivement causer l’ischémie rétinienne. Ici, nous avons établi un modèle de souris de l’ischémie rétinienne par occlusion commune transitoire d’artère carotide (tBCCAO) pour attacher le CCA droit avec des sutures de soie 6-0 et pour occluser le CCA gauche transitoirement pendant 2 secondes par l’intermédiaire d’une pince, et avons prouvé que tBCCAO pourrait induire l’ischémie rétinienne aiguë menant au dysfonctionnement rétinien. La méthode actuelle réduit la dépendance aux instruments chirurgicaux en utilisant seulement des aiguilles chirurgicales et une pince, raccourcit le temps d’occlusion pour réduire au minimum la mort animale inattendue, qui est souvent vue dans les modèles de souris de l’occlusion cérébrale moyenne d’artère, et maintient la reproductibilité des résultats ischémiques rétiniens communs. Le modèle peut être utilisé pour étudier la pathophysiologie des rétinopathies ischémiques chez la souris et peut être utilisé pour le dépistage des médicaments in vivo.

Introduction

La rétine est un tissu neurosensoriel pour la fonction visuelle. Puisqu’une quantité substantielle d’oxygène est nécessaire pour la fonction visuelle, la rétine est connue comme l’un des tissus exigeants en oxygène les plus élevés dans lecorps 1. La rétine est sensible aux maladies vasculaires car l’oxygène est livré par les vaisseaux sanguins. Divers types de maladies vasculaires, telles que la rétinopathie diabétique et l’occlusion des vaisseaux sanguins rétiniens (veines ou artères), peuvent induire une ischémie rétinienne. Pour étudier les mécanismes pathologiques de l’ischémie rétinienne, des modèles expérimentaux reproductibles et cliniquement pertinents de l’ischémie rétinienne sont considérés comme nécessaires. Occlusion cérébrale moyenne d’artère (MCAO) par insertion d’un filament intraluminal est la méthode la plus généralement utilisée pour le développement des modèles in vivo de rongeur de l’ischémie cérébraleexpérimentale 2,3. En raison de la proximité de l’artère ophtalmique (OpA) au MCA, les modèles mcao sont également utilisés simultanément pour comprendre la pathophysiologie de l’ischémie rétinienne4,5,6. Pour induire l’ischémie cérébrale avec l’ischémie rétinienne, de longs filaments sont typiquement insérés par incision de l’artère carotide commune (CCA) ou de l’artère carotide externe (ECA). Ces méthodes sont difficiles à exécuter, nécessitent beaucoup de temps pour terminer la chirurgie (plus de 60 minutes pour une souris), et conduisent à des variabilités élevées dans les résultats après la chirurgie7. Il reste important d’élaborer un meilleur modèle pour améliorer ces préoccupations.

Dans cette étude, nous avons simplement employé l’occlusion bilatérale transitoire courte de CCA (tBCCAO) avec des aiguilles et une pince pour induire l’ischémie rétinienne chez les souris et avons analysé des résultats typiques des dommages ischémiques dans la rétine. Dans cette vidéo, nous ferons une démonstration de la procédure tBCCAO.

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Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de la Keio University School of Medicine.

1. Préparation d’instruments chirurgicaux et d’animaux

  1. Autoclavez les instruments chirurgicaux et gardez-les dans 70% d’alcool éthylique. Avant chaque nouvelle intervention chirurgicale, nettoyez soigneusement les instruments chirurgicaux en utilisant 70 % d’alcool éthylique.
  2. Préparer les souris BALB/cAJc1 mâles (6 semaines, 26-28 kg) dans une pièce exempte d’agents pathogènes spécifiques (FPS) afin de maintenir des conditions stériles avant, pendant et après la chirurgie.

2. Occlusion commune transitoire d’artère carotide commune (tBCCAO)

  1. Mettez une souris sous anesthésie par injection intraperitoneal avec une combinaison de midazolam (40 μg/100 μL), de médetomidine (7,5 μg/100 μL) et de tartrate de butorphanol (50 μg/100 μL), appelé « MMB », commedécrit précédemment 8,9. Tenez les peaux arrière de la souris pour empêcher la souris de se cogner les yeux jusqu’à ce que la souris soit complètement anesthésiée.
    1. Jugez la profondeur de l’anesthésie en pinçant l’ateil de la souris jusqu’à ce qu’il n’ait pas de réponse, dont la méthode est couramment utilisée pour vérifier l’anesthésiecomplète 10.
      REMARQUE : En général, moins de 5 minutes sont nécessaires pour que les souris s’endorment. Les recettes appropriées pour l’anesthésie générale peuvent être différentes selon les institutions.
  2. Appliquer une goutte de 0,1% purifié sodium hyaluronate solution goutte oculaire aux yeux pour prévenir la sécheresse sur les yeux sous anesthésie.
  3. Placez la souris sur son dos et fixez les pattes de la souris à l’aide de rubans adhésifs.
  4. Désinfecter la zone du cou de la souris à l’aide de 70% d’alcool éthylique avant la chirurgie.
    REMARQUE : La coupure addition supplémentaire de la fourrure n’a pas été exécutée car ceci peut causer l’inflammation suivantede peau 11,12.
  5. Effectuez une incision sagittale du cou à l’l’insu d’unelame ( figure 1).
    REMARQUE : L’incision doit être faite sur la ligne médiane entre le cou, le sternum et la trachée.
  6. Séparez soigneusement les deux glandes salivaires à l’aide de deux forceps et mobilisez-les pour visualiser les AC sous-jacents.
  7. Isolez soigneusement le CCA droit des nerfs vagal respectifs et des veines qui l’accompagnent sans nuire à leurs structures, et placez deux sutures de soie 6-0 sous le CCA. Attachez les deux liens étroitement pour bloquer le flux sanguin (Figure 1).
    REMARQUE : Pendant l’intervention, de petites veines pourraient être endommagées. Si des saignements sont observés, l’essuyage est nécessaire pour visualiser clairement les AC.
  8. Trouvez soigneusement le CCA gauche des nerfs vagal respectifs et des veines qui l’accompagnent sans nuire à leurs structures, et occlusez le CCA gauche pendant 2 secondes par une pince (figure 1).
    REMARQUE : Une aiguille de suture en soie 6-0 doit être placée sous le CCA gauche pour marquer un emplacement pour le serrage.
  9. Après la réouverture du CCA gauche, suture des plaies du cou par une suture de soie 6-0 et appliquer une touche d’antibiotique (50 μL) sur le cou pour inhiber l’infection bactérienne.
    REMARQUE : Retirez doucement une pince pour éviter d’endommager le mur artélial lors de la réouverture du CCA gauche.
  10. Injectez 0,75 mg/kg d’hydrochlorure d’atipamezole intraperitoneally à la souris pour aider la souris récupérée de l’anesthésie profonde rapidement. Remettre la souris dans une cage à souris avec des coussinets préchauffés.
    REMARQUE : Ne laissez pas la souris laissée sans surveillance jusqu’à ce que la souris reprenne suffisamment conscience pour maintenir la récumbence sternale.
  11. Injecter 0,4 mg/kg de tartrate de butorphanol à la souris pour la gestion de la douleur lorsque la souris se réveille.
    REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici. Comme premier indice pour réussir tBCCAO, la paupière tombant de la souris peut être observée (Figure 2).
  12. Pour l’euthanasie, injecter 3x de mélange MMB aux souris et les sacrifier pour des expériences.

3. Observations générales (taux de survie et tombant des paupières)

  1. Après la chirurgie, vérifiez les taux de survie pour toutes les causes de décès au jour 0 (après la chirurgie), 1, 3 et 7.
  2. Évaluer la limidation par une échelle de notation de 4 points : 1 = pas de tombant, 2 = tombant léger (~50%), 3 = tombant sévère (plus de 50%), et 4 = tombant sévère avec décharge d’oeil.

4. Perfusion de sang rétinien

  1. Injecter 200 μL de FITC-dextran (25 mg/mL) dans le ventricule gauche de la souris, qui est couramment utilisé pour l’observation de la perfusion sanguine dans les vaisseaux rétiniensde la souris 13,14.
  2. 2 minutes après la circulation, enucleate les yeux et fixer dans 4% paraformaldéhyde pendant 1 heure. Les rétines ont été soigneusement obtenues et montées à plat, commeprécédemment décrit 15,et examinées par un microscope de fluorescence.
  3. Prenez des photos des montures entières rétiniennes au grossissement 4x et fusionnez en un seul à l’aide d’un analyseur de fusion,précédemment décrit 16.
  4. Mesurer les zones perfusées à l’aide d’un outil d’analyse des navires dans le logiciel NIH Fiji/ImageJ.

5. Tache occidentale

  1. 3 et 6 heures après tBCCAO, obtenir les yeux des souris et transférer immédiatement dans une boîte de Pétri contenant du PBS froid pour isoler les rétines.
  2. Après l’isolement des rétines, effectuer des ballonnements occidentaux, comme précédemmentdécrit 9.
  3. Incuber avec des anticorps pour le facteur-1α hypoxia-inductible (HIF-1α; un marqueur général d’hypoxie) et pour β-Actin (un contrôle interne de chargement) pendant la nuit suivi de l’incubation des anticorps secondaires HRP-conjugués. Visualisez les signaux par chimioluminescence.

6. PCR quantitatif (QPCR)

  1. 6, 12 et 24 heures après tBCCAO, traiter les rétines obtenues pour qPCR, comme précédemmentdécrit 17.
  2. Effectuez qPCR via le système PCR en temps réel. Les amorces utilisées sont énumérées dans le tableau 1. Calculer les changements de pli entre les niveaux de différentes transcriptions par la méthode ΔΔCT.

7. Immunohistochimie (IHC)

  1. 3 jours après tBCCAO, obtenir les yeux des souris et intégrer dans la paraffine.
  2. Couper les yeux encastrés dans la paraffine par un microtome pour obtenir les sections des yeux.
  3. Dé-paraffiniser et tacher les sections oculaires de 5 μm d’épaisseur comme décrit précédemment13.
  4. Incuber avec un anticorps pour la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP; un marqueur fiable pour les astrocytes et les cellules Müller dans la rétine) pendant la nuit suivie de l’incubation de l’anticorps secondaire conjugué Alexa Fluor 555.
  5. Utilisez DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) pour tacher le noyau dans la rétine. Visualisez les signaux au microscope à fluorescence.
  6. Évaluer la notation morphologique par une échelle d’évaluation de 4 points, commedécrit précédemment 13,18: 0 = aucun signal, 1 = peu de pieds finaux gliale positifs dans la couche de cellules ganglionnaires (GCL), 2 = peu de processus étiquetés atteignant de GCL à la couche nucléaire externe (ONL), et 3 = la plupart des processus étiquetés atteignant de GCL à ONL.

8. Électroréinographie (ERG)

  1. 3 et 7 jours après tBCCAO, effectuez ERG à l’aide d’un dôme Ganzfeld, d’un système d’acquisition et de stimulateurs LED, commedécrit précédemment 9.
  2. Après une adaptation sombre du jour au lendemain, anesthésier les souris avec une combinaison de MMB sous une faible lumière rouge.
  3. Utilisez une solution mixte de 0,5% de tropicamide et 0,5% de phényléphrine pour dilater les pupilles.
  4. Placez les électrodes actives sur la lentille de contact et placez l’électrode de référence dans la bouche.
  5. Obtenez des réponses ERG des deux yeux de chaque animal.
  6. Enregistrez les réponses scotopiques sous adaptation sombre avec divers stimuli.
  7. Mesurer les amplitudes d’une onde de la ligne de base au point le plus bas d’une onde.
  8. Mesurer les amplitudes de l’onde B du point le plus bas d’une onde jusqu’au pic de b-wave.
  9. Gardez toutes les souris au chaud pendant la procédure à l’aide de coussinets thermiques.

9. Tomographie par cohérence optique (OCT)

  1. 2 semaines après tBCCAO, effectuer oct en utilisant le système SD-OCT, comme précédemment signalé8,9.
  2. Pour la mesure, soumettre les souris à la mydriase par une solution mixte de 0,5% de tropicamide et 0,5% de phényléphrine, et à l’anesthésie générale par un mélange de MMB.
  3. Obtenez des images de balayage B à partir de tranches équatoriales de scans en face.
  4. Examiner les rétines à 0,2, 0,4 et 0,6 mm de la tête du nerf optique.
  5. Mesurez l’épaisseur rétinienne de la couche de fibres nerveuses rétiniennes (NFL) à la membrane limite externe (ELM), et considérez la moyenne des valeurs mesurées comme l’épaisseur rétinienne d’une souris individuelle.
  6. Tracez les résultats sous forme de diagrammes d’araignées.

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Representative Results

Après la circulation systémique du FITC-dextran pendant 2 minutes, des vasculatures rétiniennes des rétines gauche et droite dans les souris sham-operated et les souris tBCCAO-actionnées ont été examinées(figure supplémentaire 1). Fitc-dextran était entièrement visible dans les deux rétines chez les souris opérées par imposture et la rétine gauche chez les souris opérées par tBCCAO, alors qu’elle était partiellement détectable dans la rétine droite chez les souris opérées par tBCCAO.

Après tBCCAO, la paupière tombante a été examinée (Figure 2). Les yeux droit ont montré doux (score 2 ; 75%) et paupière sévère (score 3 et 4; 25%) tombant, tandis que les yeux gauches n’avaient pas tombant (score 1; 93.75%) à l’exception d’une souris (score 2; 6,25 %). Bien que la paupière grave tombant avec décharge d’oeil n’ait pas été considérablement observée chez les souris tBCCAO-actionnées, nous avons pu voir une souris pour ce phénotype (score 4 ; 6.25%).

La réduction de l’état de l’oxygène dans les tissus conduit à la stabilisation du HIF-1α et à l’induction d’un certain nombre de gènes hypoxie-sensibles tels que l’EPO, vegf et BNIP319,20,21. Tout d’abord, l’hypoxie biologique moléculaire à l’aide d’un marqueur hypoxique général HIF-1α a été évaluée au moyen de ballonnements occidentaux (figure 3). L’expression accrue de HIF-1α a été sensiblement observée dans la rétine droite 3 et 6 heures après tBCCAO. Ensuite, les expressions des gènes hypoxie-sensibles ont été évaluées par qPCR(figure supplémentaire 2). Il n’y a eu aucun changement significatif dans les expressions génétiques hypoxia-sensibles 6 heures après tBCCAO. 12 heures après tBCCAO, nous avons trouvé l’expression de Binp3 sensiblement augmentée et une légère augmentation de l’expression d’Epo a été montrée dans la rétine droite. 24 heures après tBCCAO, nous avons également pu trouver une légère augmentation de l’expression epo dans la rétine droite bien qu’elle n’ait pas été statistiquement significative. L’expression de Vegf n’a pas été modifiée de 6 à 24 heures chez les souris opérées par tBCCAO.

La gliose réactive rétinienne a été examinée 3 jours après tBCCAO (figure 4), car les gliales telles que les astrocytes et les cellules de Müller ont été étroitement associées à l’ischémie rétinienne22. GfAP a été employé couramment pour la détection des astrocytes et des cellules de Müller dans larétine 23. La moyenne des scores de morphologie pour l’étiquetage GFAP dans la rétine droite était la plus élevée parmi les deux rétines chez les souris opérées par imposture et la rétine gauche chez les souris opérées par le TBCCAO. Basé sur la localisation de l’expression GFAP, un changement de morphologie dans l’étiquetage GFAP est considéré comme le reflet de l’activation des cellules Müller.

ERG a été utilisé pour examiner le dysfonctionnement rétinien après tBCCAO( Figure 5). Les amplitudes de l’onde b dans l’œil droit ont considérablement diminué 3 et 7 jours après tBCCAO. Cependant, les amplitudes d’une onde dans l’oeil droit n’ont pas été sensiblement changées. Quand il s’agit de l’œil gauche, nous ne pouvions pas voir de changements dans les amplitudes des ondes a- et b (Figure supplémentaire 3).

Nous avons effectué oct pour déterminer une altération de l’épaisseur rétinienne après tBCCAO( Figure 6). L’épaisseur rétinienne dans l’oeil droit a augmenté considérablement 2 semaines après tBCCAO, alors qu’il n’y avait aucune différence dans l’épaisseur rétinienne dans l’oeil gauche entre les souris tBCCAO- et sham-operated.

Figure 1
Figure 1 : Schéma de la procédure modèle et de la circulation sanguine dans le cercle de Willis. Une illustration schématique a montré la procédure de modèle ischémique rétinien tBCCAO-induite de souris et la circulation de sang à la rétine. CCA, ECA, ICA, PCA et OpA représentent respectivement l’artère carotide commune, l’artère carotide externe, l’artère carotide interne, l’artère communicante postérieure et l’artère ophtalmique. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Paupière tombante après tBCCAO. La sévérité du tombant des paupières a été évaluée par une cote de 4 points basée sur les images de référence : 1 = pas de tombant, 2 = tombant léger (~50% tombant), 3 = tombant sévère (plus de 50% tombant), et 4 = tombant sévère avec écoulement des yeux. La paupière tombante a été observée après tBCCAO et elle a été maintenue pendant l’observation expérimentale. Les résultats (feinte : n = 10, tBCCAO : n = 16) ont été tracés comme parcelle de point de dispersion. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Stabilisation du HIF-1α après tBCCAO. Immunoblots représentatifs et analyses quantitatives (groupes pendant l’heure 3; feinte : n = 3, tBCCAO : n = 6 et groupes pendant l’heure 6; simulacre et tBCCAO : n = 6) pour HIF-1α et β-Actin ont montré que HIF-1α était stabilisé dans la rétine droite 3 et 6 heures après tBCCAO. *P < 0,05. Les données ont été analysées à l’aide du t-testde l’élève et présentées comme des ± écart standard. L et R sont respectivement pour la rétine gauche et droite. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Gliose réactive après tBCCAO. Les sections sagittales représentatives des rétines (feinte : n = 4, tBCCAO : n = 4) et les analyses quantitatives de l’étiquetage GFAP (rouge) par un score de morphologie (0-3) ont montré que l’étiquetage GFAP, principalement limité dans NFL+GCL, a été étendu à l’ensemble de la couche interne, de GCL à ONL (flèches blanches) dans la rétine droite après tBCCAO. Barres d’échelle, 50 μm. DAPI (bleu) a été utilisé pour tacher le noyau dans la rétine. NFL, GCL, IPL, INL et ONL représentent respectivement la couche de fibres nerveuses, la couche cellulaire ganglionnaire, la couche plexiforme interne, la couche nucléaire interne et la couche nucléaire externe. Les données ont été analysées à l’aide du t-test del’étudiant et présentées comme médianes avec la plage interquartile, le 25e et le 75e percentile. *P < 0,05. L et R sont respectivement pour la rétine gauche et droite. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Dysfonctionnement visuel dans l’œil droit après tBCCAO. (A) Formes d’onde représentatives de l’ERG adapté à l’obscurité réalisées 3 et 7 jours après tBCCAO. Intensité de stimulation (cd.s/m2):0.005. (B) Les analyses quantitatives ont montré qu’il y avait une diminution des amplitudes de l’onde b dans l’œil droit (feinte : n = 5, tBCCAO : n = 6) tandis que les amplitudes d’une onde n’ont pas été modifiées. *P < 0,05, **P < 0,01. Les données ont été analysées à l’aide du t-testde l’élève et présentées comme des ± écart standard. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Changement d’épaisseur rétinienne après tBCCAO. Des images représentatives de l’OCT dans les rétines opérées par sham et tBCCAO et des analyses quantitatives ont montré qu’il y avait une augmentation de l’épaisseur rétinienne dans la rétine droite (feinte : n = 4, tBCCAO : n = 8). Il n’y avait aucun changement dans l’épaisseur rétinienne dans la rétine gauche (feinte : n = 4, tBCCAO : n = 8). Les barres d’échelle sont de 200 (supérieures) et 100 (inférieures) μm, respectivement. *P < 0,05. Les valeurs dans l’axe horizontal des diagrammes représentent 0,2, 0,4 et 0,6 mm de distance par rapport à la tête du nerf optique (0) qui a été détectée par la ligne verte. Les données ont été analysées à l’aide d’ANOVA dans les deux sens suivies d’un test post-hoc Bonferroni. Des diagrammes d’araignée ont été présentés comme moyen avec ± déviation type. NFL, INL, ONL et ELM sont respectivement la couche de fibres nerveuses, la couche nucléaire interne, la couche nucléaire externe et la membrane limite externe. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure supplémentaire 1 : Perfusion du sang rétinien après tBCCAO. Des images représentatives de montage plat rétinien (avec un grossissement plus élevé de chaque image) après 2 min de circulation FITC-dextran et des analyses quantitatives ont montré que la perfusion complète était observable dans les deux rétines chez les souris opérées par imposture et la rétine gauche chez les souris opérées par tBCCAO. Cependant, la rétine droite dans les souris tBCCAO-actionnées a montré la perfusion partielle de sang. Les données ont été analysées à l’aide du t-testde l’élève et présentées comme des ± écart standard. L et R sont respectivement pour la rétine gauche et droite. Les barres d’échelle sont de 800 et 400 μm, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.

Figure supplémentaire 2 : Expressions de gènes hypoxie-sensibles après tBCCAO. Les analyses quantitatives ont montré une augmentation passagère de l’expression d’ARNm Bnip3 dans la rétine droite avec la signification statistique 12 heures après tBCCAO. L’expression d’ARNm d’Epo a montré une tendance croissante dans la rétine droite pendant 24 heures après tBCCAO, bien que ses valeurs n’aient pas été sensiblement différentes par rapport à la rétine droite sham-operated. **P < 0,01. Les données ont été analysées à l’aide du t-testde l’élève et présentées comme des ± écart standard. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.

Figure supplémentaire 3 : Fonction visuelle dans l’œil gauche après tBCCAO. Les analyses quantitatives ont montré qu’il n’y avait aucun changement dans les amplitudes des ondes a- et b dans l’œil gauche (feinte : n = 5, tBCCAO : n = 6). P > 0,05. Les données ont été analysées à l’aide du t-testde l’élève et présentées comme des ± écart standard. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.

Figure supplémentaire 4 : Taux de survie après tBCCAO en C57BL6 et BALB. Les courbes de survie de Kaplan-Meier ont démontré que presque toutes les souris sont mortes dans les 3 jours suivant tBCCAO chez les souris C57BL6. Quand il s’agit de souris BALB, un temps de serrage plus long dans tBCCAO induit la mort animale soudaine et grave (taux de survie le jour 7, 20 sec: 10%, 10 sec: 20%, 2 sec: 81%, et 0 sec: 95%). S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.

Figure supplémentaire 5 : Stabilisation du HIF-1α après la CCAO unilatérale. Une analyse immunoblot et quantitative représentative (feinte : n = 3, CCAO unilatéral : n = 3) pour HIF-1α et β-Actin a prouvé que HIF-1α n’était pas stabilisé dans les rétines 3 heures après CCAO unilatéral. P > 0,05. Les données ont été analysées à l’aide du t-testde l’élève et présentées comme ± écart standard. L et R sont respectivement pour la rétine gauche et droite. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.

Figure supplémentaire 6 : Paupière sévère tombant après tBCCAO avec un long temps de serrage. 10 secondes de l’aléa sévère induit par tBCCAO, qui a été évalué par une échelle de notation de 4 points : 1 = pas de tombant, 2 = tombant léger (~50%), 3 = tombant sévère (plus de 50%), et 4 = tombant sévère avec décharge d’oeil, tel que décrit dans la figure 2. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.

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Discussion

Dans l’étude, nous avons montré que tBCCAO, utilisant des sutures simples et une pince, pourrait induire l’ischémie rétinienne et le dysfonctionnement rétinien qui l’accompagne. En outre, nous avons démontré notre protocole actuel pour le développement d’un modèle de souris de l’ischémie rétinienne est plus facile et plus rapide par rapport à d’autres protocoles précédents pour le développement de modèles de lésions ischémiquesrétiniennes 2,3,7.

Anatomiquement, les artères cérébrales gauche et droite peuvent être reliées par des artères communicantes postérieures (APC) qui assurent une circulation collatérale dans le cercle de Willis afin de maintenir un approvisionnement adéquat en sang au système nerveux central contre l’interruption du débit des occlusions ou de la sténose desvaisseaux individuels 24,25 ( figure1). Lee et coll. ont démontré que la perfusion du sang rétinien pourrait être retardée de 10 min (ce qui n’est pas un blocus entier de la perfusion du sang rétinien dans la rétine ipsilateral) par CCAO unilatéral permanent chez les souris C57BL613. Ceci implique que l’induction de l’ischémie rétinienne par CCAO soit étroitement associée aux conditions de circulation collatérale dans le cercle de Willis. C57BL6 est connu pour être la souche de souris la plus sensible à l’ischémie cérébrale par BCCAO parmi sept souches de souris, y compris la souche de souris balb26 de notre étude actuelle. En raison du cercle incomplet de Willis dans C57BL6, l’interruption de l’approvisionnement en sang de cerveau des deux CCA induit des dommages graves dans le système nerveux central, menant finalement à la mort. En outre, dans notre étude préliminaire, nous n’avons pas induit tBCCAO dans C57BL6 comme presque toutes les souris (environ 80%) est décédé dans les 3 jours suivant la chirurgie( Figure supplémentaire 4). Par conséquent, nous avons appliqué tBCCAO à une autre souche de souris BALB pour notre étude actuelle.

Pour induire des dommages ischémiques rétiniens aigus dans notre modèle de BALB, le CCA droit a été ligaté de façon permanente et le CCA gauche a été appliqué pour amplifier le stress ischémique rétinien aigu par occlusion passagère. C’est parce que les souris ne pouvaient pas tolérer le stress ischémique induit par BCCAO permanente contrairement aux rats qui ont le cercle complet de Willis27. Ensuite, nous avons essayé d’optimiser le temps d’occlusion: quitté CCAO (0-20 secondes), comme le temps d’occlusion a été considéré comme l’un des facteurs clés qui affecte les blessures ischémiques au système nerveux central et se connecte directement avec les taux de survie des modèlesexpérimentaux 28,29. Nous avons constaté que les taux de survie des souris BALB diminuaient d’une manière dépendante du temps d’occlusion(figure supplémentaire 4). L’occlusion de la CCA gauche pendant plus de 10 secondes a montré des taux de mortalité sévèrement plus élevés (plus de 50 %), tandis que l’occlusion du CCA gauche pendant 2 secondes ou aucune occlusion (ou CCAO unilatérale) a montré des taux de survie relativement plus élevés (plus de 80%). Par conséquent, nous avons exclu les groupes (de temps d’occlusion qui est de 10 et 20 secondes) pour les autres expériences car des expériences efficaces et rentables ne peuvent pas être disponibles. Ensuite, nous avons examiné si l’occlusion du CCA gauche pendant 2 secondes ou aucune occlusion (ou CCAO unilatéral) pourrait induire l’hypoxie rétinienne. HIF-1α est un régulateur majeur fonctionnant dans les réponses hypoxiques et est stabilisé dans des conditions hypoxiques30. À cet égard, la stabilisation HIF-1α a été utilisée comme marqueur biologique moléculaire général pour l’hypoxie. Nous n’avons pas pu détecter la stabilisation de HIF-1α dans la rétine dans le groupe de CCAO unilatéral(figure supplémentaire 5). Fait intéressant, nous avons pu détecter la stabilisation HIF-1α dans le groupe de 2 secondes de tBCCAO (Figure 3). Cela implique que le stress hypoxique rétinien pourrait être induit par 2 secondes de tBCCAO chez les souris BALB. Par conséquent, 2 secondes de temps de serrage ont finalement été sélectionnées pour notre étude basée sur des taux de survie élevés après la chirurgie et l’induction de l’ischémie rétinienne par stabilisation HIF-1α.

Bien que le CCA droit ait été obclus de façon permanente chez les souris opérées par tBCCAO, la perfusion sanguine a été partiellement détectée dans la rétine droite 2 minutes après la circulation systémique du FITC-dextran(figure supplémentaire 1). En outre, nous avons constaté qu’une modification de la stabilisation de HIF-1α n’a pas été détectée dans la rétine droite dans les souris unilatérales de BALB CCAO-actionnées. Ce phénomène pourrait s’expliquer par les effets de la circulation collatérale à travers le cercle de Willis pour maintenir l’approvisionnement en sang de la rétine (Figure 1). Même si nous ne pouvions pas comprendre clairement les effets du CCAO transitoire gauche sur la perfusion de sang à la rétine droite, le CCAO gauche transitoire avec le CCAO droit permanent peut amplifier les insultes hypoxiques aiguës dans la rétine droite comme en témoigne un changement significatif dans l’expression de HIF-1α dans la rétine droite après tBCCAO (figure 3). En outre, les taux de survie des souris dépendaient du temps d’occlusion de la CCA gauche. Pris ensemble, l’intensité du stress ischémique rétinien pourrait être contrôlée par CCAO gauche.

Le phénotype d’une paupière tombante a été suggéré comme signe de présentation ou symptôme pathophysiologique des conditions neurologiques graves, particulièrement courseischémique 31,32. Le muscle associé à une paupière tombante est levator palpebrae superioris33. Ce muscle est fourni par l’artère palpebrale latérale qui est l’une des branches dérivées de l’OpA. Par conséquent, lorsque l’OpA, qui fournit la rétine, est affectée, la paupière tombant pourrait être vu. La paupière tombante a été observée dans les modèles de souris MCAO34, qui a également été reproduit dans notre modèle tBCCAO. De plus, nous avons décrit que la lugubre des paupières devient grave lorsque le temps d’occlusion de la CCA gauche prend plus detemps (figure 2 et figure supplémentaire 6). Ceci implique que la sévérité de la paupière tombante (indirectement appelée l’intensité du stress ischémique rétinien) pourrait dépendre du temps d’occlusion du CCA gauche.

Le dysfonctionnement rétinien est l’un des résultats vus dans les rétinopathies ischémiques rétiniennes comprenant la sténose de BCCA chez lessouris 35 et BCCAO chez les rats36. Nous avons constaté que les amplitudes de l’onde B diminuaient chez les souris opérées par le TBCCAO. Plusieurs études précédentes ont démontré que MCAO a également causé une réduction de l’amplitude de la b-ondeaprès la chirurgie 37,38. l’onde b reflète une condition physiologique des cellules dans les couches intérieures rétiniennes, y compris les cellules bipolaires et les cellules Müller39. En outre, le gliosis réactif par les cellules de Müller a été détecté dans la couche rétinienne interne après tBCCAO. Ce résultat est également reproduit dans les modèles MCAO40,41 et autres modèles CCAO13,42. Pris ensemble, il implique que le dysfonctionnement rétinien interne pourrait être induit par tBCCAO. L’épaisseur rétinienne a été rapportée pour augmenter transitoirement dans l’ischémie rétinienneaiguë 43,44. Nous avons également reproduit cette découverte chez les souris opérées par le TBCCAO. Ces données montrent que l’affaiblissement de la circulation sanguine par tBCCAO pourrait atteindre la rétine et enfin affecter les couches rétiniennes.

Pour des résultats cohérents, le temps anesthésique et la durée des interventions chirurgicales ainsi que d’autres facteurs tels que le poids et l’âge des modèles expérimentaux et leurs températures corporelles pendant et après la chirurgie devraient êtrenormalisés 45. En particulier, l’attention est nécessaire pour maintenir la température corporelle des souris tout au long de la période d’observation expérimentale. C’est parce que l’hypothermie pourrait avoir un effet de conditionnement préalable et interférer avec les effets ischémiques par tBCCAO46. Même si nous n’avons pas pu mesurer la température corporelle exacte des souris dans nos expériences, nous avons utilisé des coussinets chauffants pour réchauffer les souris jusqu’à ce que les souris reprennent suffisamment conscience. De plus, nous avons comparé les souris opérées par le TBCCAO avec les souris opérées par simulacre pour contrôler les effets confusionnels potentiels de facteurs incontrôlables.

Les souches de souris pourraient être un facteur variable important supplémentaire pour induire des lésions ischémiques rétiniennes par tBCCAO. La variation substantielle du cercle de Willis dans les souches de souris pourrait avoir comme conséquence une réduction ou une induction non désirée de l’ischémie cérébrale comprenant l’ishcemiarétinien 47 et pourrait ainsi mener aux variabilités des résultats. L’ajustement du temps de serrage est recommandé pour une rétinopathie ischémique induite par tBCCAO réussie quand d’autres souches de souris doivent être appliquées.

En général, les incidents d’AVC ou d’autres lésions cérébrales sont invariablement accompagnés d’une perte de visontemporaire ou permanente 48. À ce jour, le modèle de souris MCAO est largement utilisé pour les études sur l’AVC. Comme opa provient proximale à l’origine du MCA, tout obstacle dans le flux sanguin dans MCA obstrue le flux vers la rétine. L’ischémie rétinienne a d’abord été démontrée chez les rats par MCAO37. Plus tard, le même modèle ischémique rétinien a été appliqué aux souris49. Cependant, pour la procédure, l’occlusion prend plus de 60 minutes et trouver un site d’occlusion est extrêmement difficile car mca est enterré profondément à l’intérieur du cerveau. En outre, la taille du filament et la longueur d’insertion pour MCAO décide grandement du succès de la chirurgie. Ces facteurs variables additionnels induisent des variabilités des résultats ischémiques après la chirurgie. Bien que des études de comparaison directe soient nécessaires entre le TBCCAO et le MCAO, nous avons décrit les caractéristiques bénéfiques de nos modèles expérimentaux dans cette étude : court temps d’occlusion, procédure expérimentale simple et sites d’occlusion hautement accessibles. Ce modèle peut résoudre les préoccupations observées dans les modèles MCAO.

Tandis que l’utilisation du modèle de souris de l’ischémie rétinienne a de grands avantages pour étudier des dommages ischémiques rétiniens, il reste des limitations à cette approche. Puisque l’incision chirurgicale dans le cou, la séparation des glandes salivaires et l’occlusion dans le CCA droit avec des sutures doivent être appliquées pour la procédure, les perturbations de tissu d’accompagnement peuvent évoquer l’inflammation associée systémiquement ou au moins localement. Ces préoccupations ont été partiellement traitées à l’aide des souris opérées par simulacre, où toutes les étapes chirurgicales sont toutes effectuées sans TBCCAO. Un autre problème est l’exigence de gérer la douleur qui se produit pendant et après la chirurgie. Dans notre étude, la gestion de douleur pour empêcher la souffrance des souris a été appliquée par l’injection de la solution de tartrate de butorphanol, un analgésique opioid agoniste-antagoniste synthétiquement dérivé de la série de phénanthrène. Il peut être important d’être conscient que l’utilisation de différents types d’anesthésiques et d’analgésiques peut perturber les effets du TBCCAO sur l’ischémie rétinienne. Une autre limitation de cette approche (avec les approches d’autres modèles actuellement utilisés) est qu’elle ne fournit pas une simulation parfaite des pathologies associées aux troubles rétiniens cardiovasculaires humains. À ce jour, les modèles muraux utilisés pour de telles expériences ne souffrent pas de comorbidités qui sous-tendent les rétinopathies ischémiques chez l’homme, principalement avec le syndrome métabolique commele diabète 50. De telles complications qui ne sont pas présentes dans les modèles actuels de souris pourraient avoir des effets synergiques négatifs sur les voies pathologiques pour le développement des rétinopathies ischémiques. Par conséquent, cela devrait être pris en compte lors de l’interprétation des résultats des modèles expérimentaux actuellement utilisés, y compris notre modèle de souris tBCCAO. Pour mieux comprendre les mécanismes pathophysiologiques des rétinopathies ischémiques chez l’homme, notre modèle peut être combiné avec d’autres facteurs pathologiques tels que l’injection de streptozotocine51 ou supplément de régimeriche en graisses 52 pour le développement de rétinopathie diabétique ischémique. Enfin, même si nous avons montré une réduction de la perfusion du sang rétinien chez les souris opérées par tBCCAO, nous ne pouvions pas comprendre clairement les effets de la CCAO transitoire gauche sur la perfusion sanguine à la rétine droite. Cette question pourrait être abordée à l’aide de laser-Doppler qui est généralement utilisé pour confirmer que l’occlusion a eu lieu et l’ischémie s’est produite in vivoen temps réel 53,54. Cette technique pourrait être utilisée pour une meilleure compréhension de l’ischémie rétinienne chez une souris opérée par le TBCCAO, en ce qui concerne la circulation collatérale dans le cercle de Willis.

Malgré ces limitations, notre méthode tBCCAO décrite ici représente une approche efficace pour produire l’ischémie rétinienne chez la souris. L’étude des changements rétiniens par tBCCAO aide à démêler les mécanismes pathologiques des rétinopathies ischémiques chez l’homme. De plus, nous espérons que le modèle de souris tBCCAO pourrait être utilisé pour le dépistage in vivo des médicaments.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ces travaux ont été soutenus par Grants-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (18K09424 à Toshihide Kurihara et 20K18393 à Yukihiro Miwa) du ministère de l’Éducation, de la Culture, des Sports, de la Science et de la Technologie (MEXT).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atipamezole hydrochloride Zenoaq Antisedan For anti-anesthesia
Applied Biosystems 7500 Fast Applied Biosystems - For qPCR
Butorphanol tartrate Meiji Seika Pharma Vetorphale For anesthesia
BZ-II Analyzer KEYENCE - For an image merge
BALB/cAJc1 CLEA - Mouse strain
β-Actin (8H10D10) Mouse mAb CST 3700 For western blot
Clamp Forcep World Precision Instruments WPI 500451 For surgery
Dumont forceps #5 Fine Science Tools 11251-10 For surgery
DAPI solution Dojindo 340-07971 For IHC
Envisu SD-OCT system Leica R4310 For OCT
FITC-dextran Merk FD2000S For retinal blood perfusion
Fluorescence microscope KEYENCE BZ-9000 For fluorescence detection
Gatifloxacin hydrate Senju Pharmaceutical Gachifuro For anti-bacterial infection
GFAP Monoclonal Antibody (2.2B10) Thermo 13-0300 For IHC
Heating pad Marukan RH-200 For surgery
HIF-1α (D1S7W) XP Rabbit mAb CST 36169 For western blot
ImageQuant LAS 4000 mini GE Healthcare - For chemiluminescence
Midazolam Sandoz K.K SANDOZ For anesthesia
Microtome Tissue-Tek TEC 6 Sakura - For sectioning
Medetomidine Orion Corporation Domitor For anesthesia
Needle holder Handaya HS-2307 For surgery
PuREC MAYO Corporation - For ERG
Scissor Fine Science Tools 91460-11 For surgery
Sodium hyaluronate Santen Pharmaceutical Hyalein For eye lubrication
Tropicamide/Penylephrine hydrochloride Santen Pharmaceutical Mydrin-P For mydriasis
6-0 silk suture Natsume E12-60N2 For surgery

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Médecine Numéro 165 Occlusion de l’artère carotide Électrorétinographie Modèles expérimentaux Hypoxie Ischémie Tomographie par cohérence optique Rétine Reperfusion
Un modèle murin des dommages rétiniens ischémiques induits par occlusion commune transitoire d’artère carotide
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Lee, D., Miwa, Y., Jeong, H., Ikeda, S. i., Katada, Y., Tsubota, K., Kurihara, T. A Murine Model of Ischemic Retinal Injury Induced by Transient Bilateral Common Carotid Artery Occlusion. J. Vis. Exp. (165), e61865, doi:10.3791/61865 (2020).

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