Labelvrije kwantitatieve proteomics workflow voor discovery-driven host-pathogen interacties
Summary
Hier presenteren we een protocol om het samenspel tussen gastheer en ziekteverwekker te profileren tijdens infectie door op massaspectrometrie gebaseerde proteomics. Dit protocol maakt gebruik van labelvrije kwantificering om veranderingen in eiwitrijkdom van zowel gastheer (bijv. macrofagen) als ziekteverwekker (bijv. Cryptococcus neoformans)in één experiment te meten.
Abstract
De technologische prestaties van op massaspectrometrie (MS) gebaseerde kwantitatieve proteomics openen veel onontdekte wegen voor het analyseren van het wereldwijde proteoom van een organisme onder wisselende omstandigheden. Deze krachtige strategie die wordt toegepast op de interacties van microbiële pathogenen met de gewenste gastheer karakteriseert beide perspectieven ten opzichte van infectie volledig. Hierin beschrijft de workflow labelvrije kwantificering (LFQ) van het infectoom van Cryptococcus neoformans, een schimmelfaccultatieve intracellulaire ziekteverwekker die de veroorzaker is van de dodelijke ziekte cryptococcosis, in aanwezigheid van vereeuwigde macrofaagcellen. Het protocol beschrijft de juiste eiwitpreparaattechnieken voor zowel pathogene als zoogdiercellen binnen één experiment, wat resulteert in de juiste peptide-indiening voor vloeistofchromatografie (LC)-MS/MS-analyse. Het generieke karakter van LFQ met hoge doorvoer maakt een breed dynamisch scala aan eiwitidentificatie en kwantificering mogelijk, evenals overdraagbaarheid naar elke host-pathogene infectie-instelling, met behoud van extreme gevoeligheid. De methode is geoptimaliseerd om uitgebreide, onbevooroordeelde eiwitrijkdomsprofielen van een ziekteverwekker te catalogiseren binnen infectie-nabootsende omstandigheden. In het bijzonder biedt de hier aangetoonde methode essentiële informatie over C. neoformans pathogenese, zoals eiwitproductie die nodig is voor virulentie en identificeert kritische gastheereiwitten die reageren op microbiële invasie.
Introduction
De prevalentie van invasieve schimmelinfecties neemt enorm toe en is gecorreleerd met onaanvaardbaar hoge sterftecijfers, meestal gerapporteerd bij personen met immunodeficiënte aanleg1. Cryptococcus neoformans is een beruchte opportunistische schimmelpathogene die in staat is tot intracellulaire overleving in gastheermacrofaagcellen. Ontoereikende antischimmelinterventie resulteert in schimmelverspreiding en levensbedreigende manifestaties van cryptokokken meningitis en meningoencephalitis2,3. De wereldwijde toename van de immunogecompromitteerde status heeft een parallelle toename van het gebruik van schimmelwerende middelen geëist, waarbij veel schimmelsoorten, waaronder C. neoformans, in toenemende mate resistentie hebben ontwikkeld naar4,5,6. Daarom is het absoluut noodzakelijk om robuuste en efficiënte technologieën te implementeren om essentiële biologische vragen met betrekking tot de reactie van de gastheerverdediging en microbiële pathogenese te beantwoorden.
Het nieuwe tijdperk van technologische vooruitgang in massaspectrometrie (MS), met inbegrip van de generatie van krachtige computationele en bioinformatische pijpleidingen, vormt de basis voor een integratieve visie voor grootschalige analyse van onderzoek naar gastheerpathogenen7,8. Conventionele pathogenese-gedreven proteomische analyse profileert gewoonlijk de visie op infectie vanuit het perspectief van de gastheer of de ziekteverwekker, met inbegrip van uitgebreide methodologieën zoals eiwitcorrelatieprofilering, affiniteitschromatografie in combinatie met proteomics en interactomics9. Onderzoeken naar de virulentie van gevaarlijke ziekteverwekkers in een gastheersysteem zijn van enorm klinisch belang; de toepassing van een analyse met twee perspectieven in één enkel experiment werd echter voorheen als onbereikbaar beschouwd. Het perspectief van de ziekteverwekker op infectie wordt bijvoorbeeld vaak overweldigd door zeer overvloedige gastheereiwitten, wat resulteert in een verminderde gevoeligheid voor de detectie van laag-overvloedige schimmeleiwitten7. Bovendien nodigt de hoge steekproefcomplexiteit veel doelen uit om in één experimenteel systeem te onderzoeken en blijkt het een uitdaging om werkingsmechanismen voor een specifiek ziekteverwekkereiwit op te helderen.
Bottom-up proteomics is een populaire MS-techniek die beheersbare monstervoorbereiding mogelijk maakt, waarbij peptiden worden gegenereerd door sequentiespecifieke enzymatische vertering gevolgd door scheiding, identificatie en kwantificering van vloeibare chromatografie door MS10,11. Hier presenteren we een methode die een data-afhankelijke acquisitiestrategie demonstreert die is bedoeld om een onbevooroordeelde dekking van een op infecties gebaseerd proteoom of ‘infectoom’ te bereiken. In het bijzonder werpt labelvrije kwantificering (LFQ) de afhankelijkheid van chemische of metabole etiketten af voor een robuuste en nauwkeurige identificatie van veranderingen in het eiwitgehalte in meerdere proteomen, waardoor de behandeling en verwerking van monsters worden verminderd12,13. Deze universele toepassing ondervraagt geproduceerde eiwitten op een bepaald moment in een cel onafhankelijk van elke verwachte eiwitproductie; zo kunnen nieuwe inzichten worden ontdekt die van cruciaal belang zijn voor infectie.
De workflow die hierin wordt beschreven, is geoptimaliseerd om veranderingen in het eiwitniveau van C. neoformans te onderzoeken tijdens infectie-nabootsende aandoeningen met gastheer-immuuncellen (figuur 1). In plaats van te vertrouwen op de isolatie en scheiding van celtypen, haalt deze aanpak het gastheer- en ziekteverwekkerproteoom samen en maakt gebruik van bioinformatische scheiding met behulp van twee organismespecifieke databases om soortspecifieke eiwitproductie te onderscheiden. Deze methode biedt voordelen voor een onbeperkt aantal monsters dat moet worden verwerkt zonder de extra dure voorbereidingsstappen die nodig zijn in op isotopen gebaseerde etiketteringsstudies of fractionering. Bovendien ondersteunt deze workflow geoptimaliseerde eiwitextractieprotocollen die kunnen worden overgedragen op een breed scala aan schimmel- en bacteriële pathogenen die gastheer immuuncellen kunnen richten en infecteren. Over het algemeen schetst dit protocol de stappen om een onbevooroordeelde eiwitextractie en monsterverwerking voor ms met hoge resolutie te voltooien, gevolgd door gegevens en statistische analyse, in staat om een schat aan kennis te bieden van schimmeleiwitten die belangrijk zijn voor infectie in combinatie met uitgebreide profilering van de reactie van de gastheerverdediging.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritieke stappen in het protocol zijn onder meer de voorbereiding van macrofaagcellen en het verzamelen van co-cultuurmonsters voor eiwitverwerking met minimale verstoring van de cellen. Het is belangrijk om stappen uit te voeren om hechtende macrofaagcellen voorzichtig en zorgvuldig te wassen, te inenten en te verwijderen om onnodige lyse van cellen voorafgaand aan de verzameling te voorkomen. Het vaststellen van de juiste MOI voor het experiment is ook van cruciaal belang, omdat het inenten met een te hoge MOI snelle m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken Dr. Jonathan Krieger van Bioinformatics Solutions Inc. voor het bedienen van de massaspectrometer voor representatieve experimenten, evenals leden van de Geddes-McAlister-groep voor hun hulp bij experimentele opstelling en manuscriptfeedback. De auteurs erkennen financiële steun, gedeeltelijk, van de Banting Research Foundation – The Jarislowsky Fellowship Discovery Award, New Frontiers Research Fund – Exploration (NFRFE-2019-00425), en de Canadian Foundation for Innovation (JELF 38798) voor J.G.M., evenals NSERC Canada Graduate Scholarship – Masters and Ontario Graduate Scholarship for B.B., en Queen Elizabeth II Graduate Scholarship in Science and Technology for A.S..
Materials
| 100 mM Tris-HCl, pH 8.5 | Fisher Scientific | BP152-1 | Maintain at 4°C |
| 60 x 15 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 174888 | |
| 6-well cell culture plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Acetonitrile, MS grade | Pierce | TS-51101 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 1099510001 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 34850-1L | |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | ThermoFisher Scientific | A643-500 | Prepare a stock 50 mM ABC solution, stable at room temperature for up to one month. |
| Bel-Art™ HiFlow Vacuum Aspirator Collection System | Fisher Scientific | 13-717-300 | Not essential, serological pipettes can be used to remove media. |
| C18 resin | 3M Empore | 3M2215 | |
| Cell Scrapers | VWR | 10062-906 | Not essential, other methods to release macrophage cells can be used. |
| Centrifugal vaccuum concentrator | Eppendorf | 07-748-15 | |
| Complete Filtration Unit | VWR | 10040-436 | |
| Conical falcon tubes (15 mL) | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Not essential, haemocytometer can be used as an alternative. |
| CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega | G1780 | |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | R0861 | Prepare bulk stock solution of 1 M DTT, flash frozen and stored at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 10566016 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 12483020 | Heat inactivate by incubating at 60°C for 30 minutes. Prepare 50 ml aliquots and flash freeze. Thaw prior to media preparation |
| Haemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| High-performance liquid chromatography system | ThermoFisher Scientific | LC140 | Gradient length is based on sample complexity, recommended 120 min gradient for infectome samples. |
| High-resolution mass spectrometer | ThermoFisher Scientific | 726042 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich | I6125 | Prepare 0.55 M bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| LoBind Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 13-698-794 | |
| MaxQuant | https://maxquant.org/ | MaxQuant is a public platform that offers tutorials, such as the MaxQuant Summer School, outlining the computational analysis steps of large MS data sets | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 13864457 | |
| Penicillin : Streptomycin 10k/10k | VWR | CA12001-692 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| Peptide separation columns | ThermoFisher Scientific | ES803 | |
| Perseus Software | http://maxquant.net/perseus/ | ||
| Phosphate Buffered Saline | VWR | CA12001-676 | Puchase not required. PBS can also be prepared but sterile filteration must be performed before use. |
| Pierce BCA Protein Assay | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Pipette, Disposable Serological (10 mL) | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pipette, Disposable Serological (25 mL) Basix | Fisher Scientific | 14955235 | |
| Probe sonciator | ThermoFisher Scientific | 100-132-894 | |
| Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693159001 | |
| Sodium dodecyl sulfate | ThermoFisher Scientific | 28364 | 20% (w/v) |
| Spectrophotometer (Nanodrop) | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| STAGE tipping centrifuge | Sonation | STC-V2 | |
| Thermal Shaker | VWR | NO89232-908 | |
| Trifluoroacetic acid | ThermoFisher Scientific | 85183 | |
| Trypsin/Lys-C protease mix, MS grade | Pierce | A40007 | Maintain at -20 °C. |
| Ultrasonic bath | Bransonic | A89375-450 | Stored in cold room (4C) |
| Urea | Sigma Aldrich | U1250-1KG | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| Yeast-extract peptone dextrose broth | BD Difco | BM20 |
References
- Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and Multi-National Prevalence of Fungal Diseases-Estimate Precision. Journal of Fungi. , (2017).
- Tugume, L., et al. HIV-Associated cryptococcal meningitis occurring at relatively higher CD4 counts. Journal of Infectious Diseases. 219 (6), 877-883 (2019).
- Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2017).
- Perfect, J. R. The antifungal pipeline: A reality check. Nature Reviews Drug Discovery. , (2017).
- Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of anti-fungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. , 1-14 (2020).
- Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2018).
- Ball, B., Bermas, A., Carruthers-Lay, D., Geddes-McAlister, J. Mass Spectrometry-Based Proteomics of Fungal Pathogenesis, Host-Fungal Interactions, and Antifungal Development. Journal of Fungi. , (2019).
- Sukumaran, A., et al. Decoding communication patterns of the innate immune system by quantitative proteomics. J Leukocyte Biol. , (2019).
- Salas, D., Stacey, R. G., Akinlaja, M., Foster, L. J. Next-generation interactomics: Considerations for the use of co-elution to measure protein interaction networks. Molecular and Cellular Proteomics. , (2020).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
- Mann, M., Kulak, N. A., Nagaraj, N., Cox, J. The Coming Age of Complete, Accurate, and Ubiquitous Proteomes. Molecular Cell. 49 (4), 583-590 (2013).
- Cox, J., et al. Accurate Proteome-wide Label-free Quantification by Delayed Normalization and Maximal Peptide Ratio Extraction, Termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Ankney, J. A., Muneer, A., Chen, X. Relative and Absolute Quantitation in Mass Spectrometry-Based Proteomics. Annual Review of Analytical Chemistry. , (2018).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
- Cox, J., et al. Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. , (2011).
- Zhong, Z., Pirofski, L. A. Opsonization of Cryptococcus neoformans by human anticryptococcal glucuronoxylomannan antibodies. Infection and Immunity. , (1996).
- Nicola, A. M., et al. Macrophage autophagy in immunity to Cryptococcus neoformans and Candida albicans. Infection and Immunity. , (2012).
- Ball, B., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling of Cryptococcus neoformans. Current Protocols in Microbiology. , (2019).
- Geddes-McAlister, J., Gadjeva, M. Mass spectromerty-based quantitative proteomics of murine-derived polymorphonuclear neutrophils. Current Protocols in Immunology. , (2019).
- Geddes, J. M. H., et al. Secretome profiling of Cryptococcus neoformans reveals regulation of a subset of virulence-associated proteins and potential biomarkers by protein kinase A. BMC Microbiology. , (2015).
- Geddes, J. M. H., et al. Analysis of the protein kinase a-regulated proteome of Cryptococcus neoformans identifies a role for the ubiquitin-proteasome pathway in capsule formation. mBio. 7 (1), 1-15 (2016).
- Al Shweiki, M. H. D. R., et al. Assessment of Label-Free Quantification in Discovery Proteomics and Impact of Technological Factors and Natural Variability of Protein Abundance. Journal of Proteome Research. , (2017).
- Ong, S. E. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Borner, G. H. H. Organellar Maps Through Proteomic Profiling – A Conceptual Guide. Molecular & Cellular Proteomics. , (2020).
- Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. , (2019).
- Kugadas, A., et al. Frontline Science: Employing enzymatic treatment options for management of ocular biofilm-based infections. Journal of Leukocyte Biology. , (2019).
- Yeung, J., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Label-Free Quantitative Proteomics Distinguishes General and Site-Specific Host Responses to Pseudomonas aeruginosa Infection at the Ocular Surface. Proteomics. , (2020).
- Yeung, J., Lamb, J., Krieger, J. R., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling ofMurine Ocular Tissue and theExtracellular Environment. Current Protocols in Mouse Biology. 10 (83), (2020).
