Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

تحليل متعدد الإرسال للتعبير الجيني للشبكية وإمكانية الوصول إلى الكروماتين باستخدام scRNA-Seq و scATAC-Seq

Published: March 12, 2021 doi: 10.3791/62239
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2,3,4,5,6
1Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Psychiatry and Behavioral Science, The Johns Hopkins Hospital, 3Department of Ophthalmology, The Johns Hopkins Hospital, 4Department of Neurology, The Johns Hopkins Hospital, 5Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Kavli Neuroscience Discovery Institute, Johns Hopkins University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

هنا ، يعرض المؤلفون فائدة MULTI-seq للتنميط الظاهري وما تلاه من scRNA-seq و scATAC-seq في توصيف ملفات تعريف إمكانية الوصول إلى النسخ والكروماتين في شبكية العين.

Abstract

توفر تقنيات تسلسل الجيل التالي القوية تحليلا قويا وشاملا للتحقيق في كيفية عمل الشبكات التنظيمية لجينات الشبكية أثناء التطور وفي الحالات المرضية. يسمح لنا تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية بتحديد ملامح شاملة لتغيرات التعبير الجيني التي لوحظت في تطور الشبكية والمرض على المستوى الخلوي ، في حين يسمح ATAC-Seq أحادي الخلية بتحليل إمكانية الوصول إلى الكروماتين وربط عامل النسخ ليتم توصيفه بدقة مماثلة. هنا يتم وصف استخدام هذه التقنيات في شبكية العين النامية ، ويتم توضيح MULTI-Seq ، حيث يتم تصنيف العينات الفردية بمركب أوليغونوكليوتيد دهني معدل ، مما يمكن الباحثين من زيادة نطاق التجارب الفردية وتقليل التكاليف بشكل كبير.

Introduction

يلعب فهم كيف يمكن للجينات التأثير على مصير الخلية دورا رئيسيا في استجواب العمليات مثل المرض والتطور الجنيني. يمكن تجميع العلاقات المعقدة بين عوامل النسخ والجينات المستهدفة في شبكات تنظيم الجينات. تضع الأدلة المتزايدة هذه الشبكات التنظيمية الجينية في مركز كل من المرض والتطور عبر السلالات التطورية1. في حين أن التقنيات السابقة مثل qRT-PCR ركزت على جين واحد أو مجموعة من الجينات ، فإن تطبيق تقنية التسلسل عالية الإنتاجية يسمح بتنميط النسخ الخلوي الكامل.

يقدم RNA-seq لمحة عن النسخ على نطاق واسع 2,3. يمنح تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) الباحثين القدرة ليس فقط على تحديد خصائص النسخ ولكن أيضا ربط أنواع معينة من الخلايا بملفات تعريف التعبير الجيني4. يتم تحقيق ذلك من الناحية المعلوماتية الحيوية عن طريق تغذية ملفات تعريف الخلايا الفردية في خوارزميات الفرز باستخدام علامات الجينات المعروفة5. يوفر الإرسال المتعدد باستخدام تسلسل المؤشرات الموسومة بالدهون (MULTI-seq) تنوعا غير مسبوق في عدد ملفات تعريف scRNA-Seq التي يمكن جمعها6. تختلف هذه التقنية القائمة على الدهون عن تقنيات فهرسة العينات الأخرى مثل تجزئة الخلايا التي تعتمد على وجود مستضدات سطحية وأجسام مضادة عالية التقارب بدلا من تكامل غشاء البلازما7. ليس فقط من الممكن الآن تحديد ملامح التعبير الجيني في أنواع الخلايا ولكن يمكن دمج تجارب مختلفة في مكتبة تسلسل واحدة ، مما يقلل بشكل كبير من تكلفة تجربة scRNA-seq الفردية6. قد تبدو تكلفة scRNA-seq باهظة للاستخدام في تجارب التنميط الظاهري حيث يتم تحليل العديد من الأنماط الجينية أو الظروف أو عينات المرضى المختلفة ، ولكن تعدد الإرسال يسمح بالجمع بين ما يصل إلى 96 عينة في مكتبة واحدة6.

لم يكن تنميط التعبير الجيني عبر scRNA-seq هو التقنية الوحيدة القائمة على التسلسل عالي الإنتاجية لإحداث ثورة في الفهم الحالي لكيفية إملاء الآليات الجزيئية مصير الخلية. في حين أن فهم النصوص الجينية الموجودة في الخلية يمكن من تحديد نوع الخلية ، إلا أنه من المهم بنفس القدر فهم كيفية تنظيم الجينوم الذي ينظم التطور وتطور المرض. اعتمدت الدراسات المبكرة على الكشف عن الانقسام بوساطة الحمض النووي للتسلسلات غير المرتبطة بالهيستونات، تليها تسلسل شظايا الحمض النووي الناتجة لتحديد مناطق الكروماتين المفتوح. وعلى النقيض من ذلك، فإن فحص الخلية الواحدة لتسلسل الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه من قبل الترانسبوزون (scATAC-seq) يسمح للباحثين بفحص الحمض النووي باستخدام ترانسبوزون مستأنس لتحديد ملامح الكروماتين المفتوح بسهولة على مستوى النيوكليوتيد الواحد8. وقد مر هذا من خلال تحجيم مماثل ل scRNA-seq والآن يمكن للباحثين تحديد أنواع الخلايا الفردية والأنماط الظاهرية الشخصية عبر الآلاف من الجينومات الفردية8.

وقد سمح الاقتران بين scRNA-seq و scATAC-seq للباحثين بالقدرة على تحديد ملامح الآلاف من الخلايا لتحديد مجموعات الخلايا والتنظيم الجيني والشبكات التنظيمية الجينية في نماذج الأمراض والعمليات التنموية9،10،11،12. هنا يحدد المؤلفون كيفية استخدام MULTI-seq لأول مرة لتكثيف التنميط الظاهري لعدد لا يحصى من النماذج الحيوانية واستخدام scRNA-seq و scATAC-seq المقترنين للحصول على فهم أفضل لمشهد الكروماتين والشبكات التنظيمية في هذه النماذج الحيوانية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم استخدام الحيوانات في هذه الدراسات باستخدام بروتوكولات معتمدة من قبل لجنة جونز هوبكنز لرعاية واستخدام الحيوانات ، وفقا لإرشادات REACH ، وتم تنفيذها وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة.

1. متعدد المقاييس

  1. الإعداد الإعلامي
    1. تحضير وموازنة مثبط البويضات ، 10 ملغ من مثبط البويضات و 10 ملغ من الألبومين لكل مل من محلول الملح المتوازن من إيرل (EBSS) ، لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام13. التوازن مع 95٪ O 2: 5٪ CO2 في حاضنة.
      1. تحضير محلول التفكك غراء ، 20 وحدة / مل غراء و 0.005 ٪ DNase في EBSS ، خلال خطوة الحضانة هذه13.
        ملاحظة: قارورة واحدة من محلول DNase ستكون كافية ل 5 عينات. قد تحتاج قوارير إضافية إلى إعادة تشكيلها في حالة إجراء MULTI-seq على أكثر من 5 عينات.
    2. إعداد حلول الترميز الباركود أوليغو المعدلة الدهون.
      1. قم بإجراء تخفيف فريد للباركود لكل عينة من خلال الجمع بين 0.5 ميكرولتر من محلول مخزون الباركود 100 ميكرومتر مع 4.5 ميكرولتر من محلول ملحي مخزنة مؤقتا بالفوسفات (PBS).
      2. لإعداد محلول المرساة: الباركود بنسبة مولية 1: 1 ، اجمع 4.4 ميكرولتر من تخفيف الباركود 10 ميكرومتر ، و 0.9 ميكرولتر من محلول مرساة 50 ميكرومتر ، و 16.7 ميكرولتر من PBS وضعه على الجليد. يجب أن يكون التركيز النهائي لكل من خيوط الباركود وخيوط المرساة 2 ميكرومتر.
      3. لإعداد محلول الإرساء المشترك ، اجمع بين 0.88 ميكرولتر من محلول الإرساء المشترك 50 ميكرومتر و 21.12 ميكرولتر من PBS وضعه على الجليد. يجب أن يكون التركيز النهائي للمرساة المشتركة 2 ميكرومتر.
    3. لجعل 1٪ BSA في PBS ، قم بإذابة 0.1 غرام من ألبومين مصل البقر (BSA) في 10 مل من PBS وضعه على الجليد.
    4. لصنع PBS مع مثبط RNase ، اجمع 2.5 ميكرولتر من مثبط 40 U / μL RNase مع 197.5 ميكرولتر من PBS وخزنه على الجليد. اضرب وحدات التخزين في هذه الخطوة في 1.1x عدد العينات.
  2. تفكك العينة
    1. القتل الرحيم للحيوانات من خلال خلع عنق الرحم و / أو اختناق CO2 وفقا لمتطلبات IACUC المؤسسية. تعتمد طريقة القتل الرحيم على المتطلبات المؤسسية ونموذج الكائن الحي المستخدم.
    2. تشريح شبكية العين من كلتا العينين في PBS الباردة تحت مجهر تشريح ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم 1.5 مل باستخدام ماصة نقل.
    3. انقل 500 ميكرولتر من محلول غراء إلى أنبوب 1.5 مل لكل عينة.
    4. ضع عينات في محلول غراء وقم بتغطية الأنابيب على الفور.
    5. احتضان الأنابيب التي تحتوي على العينات عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 30 دقيقة. عكس القوارير 3 مرات كل 10 دقائق. يجب أن تنفصل العينات تدريجيا مع كل جولة من الانقلابات.
    6. أعد القوارير إلى درجة حرارة الغرفة وقم بتقطيع كل عينة 3-4 مرات باستخدام ماصة 1 مل مضبوطة على 300 ميكرولتر.
    7. اسمح لأي قطع من الأنسجة غير المنفصلة المتبقية بعد التثليث أن تستقر.
    8. قم بإزالة تعليق الخلايا الغائم مع تجنب أي قطع من الأنسجة غير المنفصلة ووضع تعليق خلية كل عينة في أنبوب جديد معقم بمحلول لولبي بسعة 15 مل.
    9. جهاز الطرد المركزي يعلق الخلية عند 300 × g لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    10. أثناء خطوة الطرد المركزي ، قم بإعداد وسائط إعادة تعليق الخلية.
      1. امزج 857 ميكرولتر من EBSS (قارورة 1) مع 95 ميكرولتر من محلول مثبط الألبومين والبويضات المعاد تشكيله في أنبوب معقم مغطى بالمسمار 1.5 مل. أضف 48 ميكرولتر من حل DNase المحفوظ من 1.1.1. اضرب وحدات التخزين في هذه الخطوة في 1.1x عدد العينات.
    11. تخلص من السوبرناتانت ، واحرص على الاحتفاظ بكريات الخلايا ، وأعد تعليق كريات الخلايا على الفور في محلول إعادة تعليق خلية 1 مل تم إعداده في الخطوة 1.2.10.
    12. إعداد تدرج الكثافة المتقطعة.
      1. لكل عينة، أضف 1.6 مل من محلول مثبط البويضات إلى أنبوب جديد معقم بغطاء لولبي بسعة 15 مل وقم بطبقة تعليق الخلية بعناية في الأعلى. يجب أن تكون الواجهة بين طبقتي التدرج مرئية ولكن بعض الخلط لا يؤثر على النتائج.
    13. جهاز طرد مركزي لتدرجات الكثافة المتقطعة عند 70 × g لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يجب أن تضرب الخلايا المنفصلة في الجزء السفلي من الأنابيب بينما تبقى شظايا الغشاء في الواجهة.
    14. تخلص من السوبرناتانت وأضف 200 ميكرولتر من PBS لغسل الخلايا الحبيبية. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    15. تخلص من السوبرناتانت وأعد تعليق الخلايا في 180 ميكرولتر من PBS باستخدام مثبط RNase. مرر الخلايا عبر مصفاة خلايا 40 ميكرومتر إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 مل.
  3. الترميز الشريطي للخلية
    1. أضف 20 ميكرولتر من محلول المرساة: الباركود إلى كل عينة وماصة بلطف للخلط. تأكد من أن كل عينة تتلقى مرساة فريدة من نوعها : حل الباركود واحتضان على الجليد لمدة 5 دقائق.
      1. قم بإعداد المواد اللازمة لتوليد حبة الجل في المستحلب (GEM) والترميز الشريطي خلال هذه الحضانة14.
    2. أضف 20 ميكرولتر من محلول الإرساء المشترك إلى كل عينة وماصة بلطف للخلط. احتضان على الجليد لمدة 5 دقائق.
    3. أضف 1 مل من BSA المثلج بنسبة 1٪ في PBS إلى كل عينة وقم بالطرد المركزي للخلايا عند 300 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    4. إزالة supernatant دون إزعاج بيليه الخلية وإضافة 400 ميكرولتر الجليد البارد 1٪ BSA في PBS. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      1. كرر الخطوة 1.3.4 لما مجموعه 2 غسلة. قم بإزالة supernatant وإعادة التعليق في 400 ميكرولتر من الثلج البارد 1٪ BSA في PBS.
    5. تحديد تركيز الخلايا لكل عينة باستخدام مقياس مفاصل.
      1. حدد العدد الإجمالي للخلايا المراد تحميلها لكل عينة. عادة ما يكون هذا هو العدد الإجمالي للخلايا المطلوبة مقسوما على عدد العينات. ومع ذلك ، إذا فقدت نسخة بيولوجية لحالة واحدة ، يمكن تقسيم حصتها بين النسخ المتماثلة البيولوجية الأخرى من تلك الحالة.
      2. اقسم عدد الخلايا المطلوبة لكل عينة على تركيز خلية تلك العينة المحسوبة في الخطوة 3.5 لتحديد الحجم المطلوب لتحميل العدد المطلوب من الخلايا.
    6. اجمع الأحجام المحسوبة في الخطوة 3.5.2 من كل عينة في أنبوب طرد مركزي جديد معقم بسعة 1.5 مل. من الحكمة مضاعفة الحجم المأخوذ من كل عينة في حالة فشل توليد GEM.
      1. تحديد تركيز الخلايا "النهائي" للعينات المدمجة باستخدام مقياس الدم.
  4. توليد GEM والترميز الشريطي
    1. استخدم العينات المدمجة لإنشاء والباركود GEMs14.
  5. تنظيف ما بعد GEM-RT وتضخيم cDNA
    1. قم بإعداد مواد لتنظيف النسخ العكسي بعد GEM وتضخيم cDNA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة مع التعديلات التالية14. قم بإجراء تنظيف GEM-RT بعد ذلك حسب تحديد الحجم14.
      1. زيادة حجم 80 ٪ من الإيثانول المحضر بمقدار 2 مل.
      2. تحضير مزيج تضخيم cDNA على الجليد14. أضف 1 ميكرولتر من التمهيدي MULTI-seq 2.5 ميكرومتر إلى مزيج تضخيم cDNA. دوامة لمدة 5 ثانية وأجهزة طرد مركزي لمدة 5 ثوان في جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة.
    2. أداء تضخيم cDNA14. يمكن تخزين cDNA في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 72 ساعة في هذه المرحلة.
    3. قم بإجراء تنظيف cDNA حسب اختيار الحجم14. يمكن تخزين cDNA النسخ الداخلي عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 72 ساعة أو عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 4 أسابيع في هذه المرحلة.
      1. لا تتخلص من supernatant من الجولة الأولى من اختيار الحجم . يحتوي هذا الكسر على نماذج الباركود. انقل السوبرنات إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد 1.5 مل.
      2. تخزين supernatant على الجليد.
    4. دوامة لإعادة تعليق كاشف اختيار الحجم القائم على الخرز شبه المغناطيسي وإضافة كاشف اختيار الحجم القائم على الخرزة البارامغناطيسية 260 ميكرولتر (النهائي 3.2x) و 180 ميكرولتر من 100٪ isopropanol (1.8x) إلى supernatant. ماصة المزيج 10 مرات وحضانت في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    5. ضع الأنبوب على رف مغناطيسي وانتظر حتى يمسح الحل. ثم قم بإزالة وتجاهل supernatant.
    6. أضف 500 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 80٪ إلى الخرز واتركه لمدة 30 ثانية. قم بإزالة وتجاهل supernatant.
      1. كرر ما مجموعه 2 غسل.
    7. لفترة وجيزة الطرد المركزي الخرز والعودة إلى الرف المغناطيسي. بدء تشغيل مؤقت لمدة 2 دقيقة.
    8. قم بإزالة الإيثانول المتبقي باستخدام ماصة P10 وجفف الخرز في الهواء على الرف المغناطيسي لبقية دقيقتين. لا تتجاوز 2 دقيقة.
    9. قم بإزالة الخرز من الحامل المغناطيسي وأعد تعليقه في مخزن مؤقت للإزالة 100 ميكرولتر (EB). ماصة تماما لإنعاش.
    10. حضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
    11. ارجع إلى الرف المغناطيسي وانتظر حتى يتم مسح الحل.
    12. انقل السوبرنات إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل.
    13. كرر الخطوات من 1.5.4 إلى 1.5.12. خفض حجم EB المخزن المؤقت المستخدم في الخطوة 1.5.9 إلى النصف.
    14. تحديد تركيز الحمض النووي الباركود وتوزيع الحجم باستخدام مجموعة فحص dsDNA عالية الحساسية ومقياس الفلورومتر ومحلل الشظايا15,16. يمكن تخزين الباركود cDNA في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 72 ساعة أو عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 4 أسابيع في هذه المرحلة.
  6. بناء مكتبة الباركود
    1. تحضير 1 مل من 80 ٪ من الإيثانول.
    2. قم بإعداد المزيج الرئيسي لمكتبة الباركود PCR في أنبوب شريط PCR معقم: اجمع بين 26.25 ميكرولتر من 2x مزيج جاهز لبدء تشغيل PCR الساخن ، و 2.5 ميكرولتر من 10 ميكرومتر Universal i5 التمهيدي ، و 2.5 ميكرولتر من 10 ميكرومتر RPI التمهيدي ، و 3.5 نانوغرام من الباركود cDNA (الحجم الذي يحدده التركيز من الخطوة 5.14) ، وما يكفي من الماء الخالي من النوكليز للوصول بالحجم النهائي إلى 50 ميكرولتر.
      1. استخدم تمهيدي RPI فريدا لكل مكتبة باركود إذا تم تسلسل مكتبات MULTI-seq متعددة معا.
    3. إخضاع المزيج الرئيسي لمكتبة الباركود لإعداد مكتبة PCR: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ؛ 10 دورات من 98 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ؛ 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ؛ ثم عقد عند 4 درجات مئوية.
    4. دوامة لإعادة تعليق كاشف اختيار الحجم القائم على الخرز البارامغناطيسي.
    5. قم بإزالة منتج PCR من جهاز التدوير الحراري وأضف 80 ميكرولتر (1.6x) من كاشف اختيار الحجم القائم على الخرز البارامغناطيسي. ماصة بدقة.
    6. حضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ضع على فاصل المغناطيس في الموضع العالي وانتظر حتى يمسح الحل.
    7. قم بإزالة وتجاهل supernatant.
    8. أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 80٪ إلى الخرز واتركه لمدة 30 ثانية. قم بإزالة وتجاهل supernatant.
      1. كرر الخطوة 1.6.8 لما مجموعه 2 غسلة.
    9. الطرد المركزي لفترة وجيزة الأنبوب ووضعها على الفاصل المغناطيسي في الموضع المنخفض. بدء تشغيل مؤقت لمدة 2 دقيقة.
    10. قم بإزالة الإيثانول المتبقي باستخدام ماصة P20 وجفف الخرز في الهواء على الفاصل المغناطيسي لبقية الدقيقتين. لا تتجاوز 2 دقيقة.
    11. قم بإزالة الأنبوب من الفاصل المغناطيسي وأعد تعليق الخرز في 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت EB. تخلط الماصة جيدا لإعادة تعليق الخرز.
    12. حضانة لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    13. ارجع إلى الفاصل المغناطيسي في الموضع المنخفض وانتظر حتى يتم مسح الحل. انقل السوبرناتانت إلى أنبوب شريط PCR جديد.
    14. تحديد تركيز مكتبة التعبير ومكتبة الباركود وتوزيع حجم الشظايا باستخدام مجموعة مقايسة adsDNA عالية الحساسية ومقياس الفلورومتر ومحلل الشظايا.
  7. 3' بناء مكتبة التعبير الجيني
    1. قم بإجراء بناء مكتبة التعبير الجيني 3 'وفقا لتعليمات الشركة المصنعة14.
  8. التسلسل
    1. بالإضافة إلى مكتبة cDNA الذاتية المنشأ التي تم تضخيمها في الخطوة 7، أرسل مكتبة الباركود المضخمة في الخطوة 6. من أجل البساطة ، أرسل هذه المكتبات بشكل منفصل ، أو كإجراء فعال من حيث التكلفة ، قم بتضمين اقتباس من عينة من مواد الترميز الشريطي مع مكتبة cDNA الذاتية. استهدف ما بين 20,000-50,000 cDNA و 3,000-5,000 قراءة الباركود لكل خلية.
    2. قم بتحويل ملفات bcl الناتجة عن التسلسل إلى ملفات fastq بواسطة cellranger mkfastq وعدد المصفوفات التي تم إنشاؤها من هذه بواسطة عدد cellranger.
    3. تقوم عينات Deconvolute بعد تحليل Cellranger باستخدام حزمة deMULTIplex r المتوفرة في مستودع GitHub MULTI-seq (https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/MULTI-seq).

2. المقترنة scRNA-seq و scATAC-seq

  1. تجميد فلاش الأنسجة ل scATAC-seq وتثبيت الميثانول من خلايا الشبكية ل scRNA-seq
    1. الإعداد الإعلامي
      1. لإعداد حلول لانفصال الشبكية، كرر الخطوتين 1.1.1 و 1.1.4.
      2. تحضير حمام الثلج الجاف الإيثانول في دلو ثلج صغير.
      3. تحضير 15 مل من الإيثانول 70٪ عن طريق إضافة 10.5 مل من الإيثانول إلى 4.5 مل من الماء الخالي من النوكلياز.
      4. أضف ما يكفي من الثلج الجاف إلى دلو الثلج (يفضل أن يكون في شكل حبيبات) بحيث يرتفع 15 مل من السائل لتغطية الجليد فقط. أضف 15 مل من الإيثانول.
      5. ضع PBS على الجليد و 1 مل من الميثانول 100٪ في فريزر مناسب -20 درجة مئوية.
    2. إعداد العينات
      1. اتبع الخطوتين 1.2.1 و 1.2.2 لعزل الشبكية. ومع ذلك ، هذه المرة وضع كل شبكية العين في أنبوب طرد مركزي دقيق منفصل.
      2. بالنسبة للعينات الموجهة إلى scATAC-seq ، قم بإزالة أي سائل من أنبوب الطرد المركزي الدقيق باستخدام ماصة P200 وقم على الفور بتغطية الأنبوب ووضعه في حمام ثلج جاف بالإيثانول لتجميد العينة.
      3. بالنسبة للعينات الموجهة إلى scRNA-seq ، لفصل الخلايا ، كرر الخطوات من 1.2.3 إلى 1.2.15 على شبكية العين المشوهة.
      4. جهاز طرد مركزي للخلايا عند 300 × g لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      5. قم بإزالة supernatant دون تعطيل بيليه الخلية.
      6. أضف 1 مل من PBS المبرد وامزج الماصة بلطف 10 مرات أو حتى يتم تعليق الخلايا تماما.
      7. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
        1. كرر الخطوات من 2.1.2.5 إلى 2.1.2.7 لما مجموعه غسلتان.
      8. قم بإزالة supernatant دون تعطيل بيليه الخلية.
      9. أضف 100 ميكرولتر من PBS المبرد واخلط بلطف 10x أو حتى يتم تعليق الخلايا تماما.
      10. ابدأ في دوامة الأنبوب بأقل إعداد للسرعة. أضف 900 ميكرولتر من الميثانول المبرد (-20 درجة مئوية) قطرة قطرة مع الاستمرار في دوامة الأنبوب بلطف لمنع الخلايا من التكتل.
      11. احتضان الخلايا على الجليد لمدة 15 دقيقة.
      12. أوجد تركيز الخلايا الثابتة باستخدام مقياس الدم.
      13. تقييم فعالية خطوة التثبيت باستخدام التربان الأزرق. يشير جزء كبير من الخلايا القابلة للحياة إلى أن هناك حاجة إلى مزيد من وقت التثبيت.
      14. تخزين الأنسجة المجمدة والخلايا الثابتة في -80 درجة مئوية.
  2. عزل النوى عن الأنسجة المجمدة الفلاش ل scATAC-seq
    1. الإعداد الإعلامي
      1. قم بإعداد المخزن المؤقت لتخفيف التحلل عن طريق الجمع بين 9.77 مل من الماء الخالي من النوكليز ، و 100 ميكرولتر من 1 M Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.4) ، و 100 ميكرولتر من 1 M NaCl ، و 30 ميكرولتر من 1 M MgCl2 ، و 0.1 g من BSA.
      2. قم بإعداد المخزن المؤقت لتخفيف التحلل أمامك ، كما هو الحال في اليوم السابق ، وقم بتخزينه عند 4 درجات مئوية. في يوم البروتوكول ، ضع على الجليد.
      3. توازن 20x نواة المخزن المؤقت التي تقدمها الشركة المصنعة لمجموعة scATAC من -20 درجة مئوية إلى درجة حرارة الغرفة. دوامة وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة.
      4. قم بإعداد المخزن المؤقت للتحلل 1x عن طريق احتضان محلول Digitonin بنسبة 5٪ في حمام مائي 65 درجة مئوية حتى يتم إذابة الراسب. ثم الجمع بين 2 مل من المخزن المؤقت لتخفيف التحلل ، 20 ميكرولتر من 10 ٪ Tween-20 ، 20 ميكرولتر من Nonidet P40 Replacement (قد يطلق عليه بدلا من ذلك IGEPAL) ، و 4 ميكرولتر من Digitonin.
      5. قم بتخزين مخزن التحلل المؤقت 1x على الجليد.
      6. لإعداد المخزن المؤقت للتحلل 0.1x ، اجمع 1.8 مل من المخزن المؤقت لتخفيف التحلل مع 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل 1x وخزنه على الجليد.
      7. لتحضير المخزن المؤقت للغسيل، امزج بين 2 مل من المخزن المؤقت لتخفيف التحلل و20 ميكرولتر من 10٪ Tween-20 وخزنه على الجليد.
      8. لتحضير المخزن المؤقت للنوى المخففة، امزج 950 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز مع 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنوى (20x) وخزنه على الجليد.
    2. عزل النوى
      1. لا تذوب العينة قبل التحلل. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت المبرد 0.1x للتحلل إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على العينة المجمدة. تجانس على الفور 15x باستخدام مدقة بيليه.
      2. احتضان لمدة 5 دقائق على الجليد. قم بإعداد المواد اللازمة لنقل scATAC خلال خطوة الحضانة17 هذه.
      3. تخلط الماصة 10x مع ماصة 1 مل وتحضن لمدة 10 دقائق على الجليد. الإعداد الكامل للمواد اللازمة لنقل scATAC خلال خطوة الحضانة هذه إذا لم تكن قد اكتملت بالفعل. من غير الضروري إعداد المزيد من النوى المخففة العازلة.
      4. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل المبرد إلى الخلايا المحللة. مزيج ماصة 5x.
      5. مرر التعليق من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر إلى أنبوب جديد لأجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل. تصفية ~ 300 ميكرولتر في المرة الواحدة باستخدام مصفاة خلية جديدة 70 ميكرومتر في كل مرة.
      6. مرر التدفق الذي تم جمعه من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل وخزنه على الجليد.
      7. أوجد تركيز النوى باستخدام مقياس الدم. استنادا إلى تركيز النوى والحجم الكلي لتعليق الخلية ، احسب العدد الإجمالي للنوى المنفصلة.
      8. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وإزالة supernatant دون تعطيل حبيبات النوى.
      9. لإنشاء مخزون النوى استنادا إلى إجمالي عدد النوى المحدد في الخطوة 2.2.2.7.، أعد تعليق النوى في مخزن مؤقت للنوى المخففة بما يكفي للوصول إلى تركيز النوى المطلوب.
        ملاحظة: يعتمد تركيز النوى المطلوب على استرداد النوى المستهدفة لتجربة scATAC-seq ويتم تحديده من إرشادات تركيز النوى الموجودة في بروتوكول الشركة المصنعةرقم 17. على سبيل المثال، إذا كانت هناك حاجة في نهاية المطاف إلى 10,000 نواة، فإن تركيز النوى المطلوب لمخزون النوى يتراوح بين 3,080 و7,700 نواة/ميكرولتر. قد يكون من الأفضل استهداف منتصف النطاق في التركيز.
      10. أوجد تركيز النوى باستخدام مقياس الدم.
      11. انتقل فورا إلى نقل scATAC باستخدام مخزون النوى المحضر17.
  3. إماهة الخلايا الثابتة للميثانول لاستخدامها في scRNA-Seq
    1. الإعداد الإعلامي
      1. لتحضير المخزن المؤقت للغسيل / التخفيف ، قم بإذابة 0.01 جم من BSA في 1 مل من PBS. ثم أضف 12.5 ميكرولتر من مثبط 40 U / μL RNase واخلطه بلطف. يخزن على الجليد.
    2. إماهة الخلايا
      1. خلايا مثبتة من الميثانول في جهاز طرد مركزي 1.5 مل عند 3000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. ثم قم بإزالة السوبرناتانت.
      2. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت المبرد للغسيل / التخفيف إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وإزالة supernatant. كرر ما مجموعه 2 غسل.
        ملاحظة: قم بإعداد المواد المطلوبة لتوليد GEM والترميز الشريطي خلال الخطوتين السابقتين14.
      3. لإعداد مخزون الخلايا، استنادا إلى إجمالي عدد الخلايا المحسوب في 2.1.2.12.، أعد تعليق الخلايا في مخزن مؤقت كاف للغسل/التخفيف لتحقيق تركيز الخلية المطلوب. تركيزات الخلايا المفضلة هي بين 700 و 1200 خلية / ميكرولتر.
      4. تحديد تركيز الخلية من مخزون الخلية باستخدام مقياس الدم.
      5. انتقل على الفور إلى توليد GEM والترميز الشريطي باستخدام مخزون الخلايا14.
    3. التسلسل
      1. عند إجراء تحليل دورة زمنية (كما هو الحال في التطوير أو المرض) ، قم بتسلسل عينات متعددة في تشغيل متعدد الإرسال (أي مكتبات متعددة على خلية تدفق واحدة) لتقليل التباين التقني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يضع سير العمل هذا استراتيجية للتحقيق في الأنماط الظاهرية التنموية والعمليات التنظيمية باستخدام تسلسل الخلية الواحدة. يتيح تعدد الإرسال المتعدد للعينات MULTI-seq إجراء فحص أولي منخفض التكلفة للتنميط الظاهري بينما يسمح الجمع المقترن وتثبيت العينات ل scRNA-seq و scATAC-seq بإجراء تحقيق أكثر تعمقا (الشكل 1).

يتيح الترميز الشريطي متعدد التسلسلات للعينات المتعددة وفك الالتفاف الحسابي اللاحق. يمكن تحديد عينة المنشأ لكل خلية بناء على تعبير الباركود الخاص بها (الشكل 2A). ويمكن تحليل هذه العينات المدمجة كمجموعة بيانات واحدة لأغراض تجميع الخلايا وتحديد نوع الخلية (الشكل 2 ب). نظرا لأن كل خلية يتم ترميزها بالباركود قبل توليد GEM ، سيكون لثنائيات الخلايا احتمال كبير لإظهار التعبير عن الرموز الشريطية المتعددة MULTI-seq وبالتالي يمكن تحديد غالبية الثنائيات وإزالتها قبل التجميع وتحديد نوع الخلية (الشكل 2C). زيادة عدد الخلايا المستخدمة في خطوة توليد GEM سيزيد من نسبة المضاعفة الموجودة. يمكن استخدام scATAC-seq لإنشاء مجموعة بيانات مع أنواع الخلايا لمطابقة تلك التي تم العثور عليها بواسطة scRNA-seq (الشكل 2D). يتيح الاقتران بين التعبير الجيني scRNA-seq ومعلومات إمكانية الوصول إلى الحمض النووي scATAC-seq إعادة بناء الشبكات التنظيمية الجينية.

Figure 1
الشكل 1: مخطط يوضح استخدام MULTI-Seq في التحليل الأولي ، يليه تحليل scRNA-Seq و scATAC-Seq منفصل في توصيف متعمق للأنماط الظاهرية أو العلاجات أو الحالات المرضية المثيرة للاهتمام. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تمثيلات اختزال أبعاد UMAP لبيانات MULTI-seq لسلسلة أليلية من الفئران الضربة القاضية P0 Sstr2 توضح (أ) تفكيك النمط الوراثي لكل خلية في مجموعة البيانات و (ب) تحديد أنواع الخلايا في مجموعة البيانات. سيؤدي التحميل الزائد للخلايا أثناء خطوة توليد GEM والترميز الشريطي إلى زيادة في مضاعفة الخلايا مثل تلك الموضحة في (c) ، والتي تظهر البيانات من (أ) و (ب) قبل إزالة المضاعفة وإعادة تجميعها. في (د) ، بيانات scATAC-Seq من الخلايا الإيجابية GFP التي تم الحصول عليها في E16 من explants شبكية العين بالكهرباء مع بلازميد تحكم يعبر عن GFP في E14. يتم شرح أنواع الخلايا بناء على إمكانية الوصول إلى الجينات الخاصة بنوع الخلية. تم تعديل هذا الرقم من Weir, K., Kim, D. W., Blackshaw, S. تنظيم تكوين الخلايا العصبية في الشبكية عن طريق إشارات السوماتوستاتين. bioRxiv 2020.09.26.314104 (2020) doi:10.1101/2020.09.26.31410418 والبيانات الأصلية غير المنشورة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تنبع قوة MULTI-seq من التكامل السلس للبيانات من ظروف أو نماذج تجريبية متعددة والفائدة الهائلة من حيث التكلفة والحد من تأثيرات الدفعات. يوفر استخدام MULTI-seq عمقا غير مسبوق للتنميط الظاهري في المختبر. طرق الإرسال المتعدد غير الجينية مثل تجزئة الخلايا أو تجزئة النوى فتحت الباب أمام عينات متعددة الإرسال من خلال استخدام الأجسام المضادة المشفرة7،19،20. ومع ذلك ، يعتمد هذا على توافر الأجسام المضادة عالية التقارب التي تتعرف على البروتينات السطحية المعبر عنها على الخلايا أو نواتها ، والتي لن تكون ممكنة إذا كانت هذه الأجسام المضادة غير متوفرة أو لم تعبر الخلايا عن سطح الخلية المناسب أو المستضدات النووية7. نظرا لأن MULTI-seq يستخدم الباركود oligo المعدل بالدهون لدمجه بشكل مستقر في الخلايا أو نواتها ، فإنه يسمح للباحثين بجمع بيانات النسخ من ما يصل إلى 96 عينة جديدة أو ثابتة بطريقة أرخص وأكثر قابلية للتطبيق على نطاق أوسع6.

يتم اقتراح وعرض متابعة النمط الظاهري الأولي ل MULTI-Seq مع scRNA-Seq و scATAC-Seq المقترن للحصول على فهم للتنظيم الجينومي الذي يتزامن مع البيانات النسخية1. هذا لا يعطي فقط فكرة عن مناطق heterochromatin و euchromatin ولكن أيضا فهم قيم لشبكات عامل النسخ التي تقود التعبير الجيني. يمكن استخدام نهج متعدد الأوميك للكشف عن تغيرات الكروماتين الديناميكية التي تحدث في النقاط الرئيسية لقرارات مصير الخلية وتحديد المسارات الخلوية في التطور والمرض1،21،22. يمكن تحقيق ذلك من خلال إخضاع البيانات بالمعلوماتية الحيوية للوقت الزائف ، والتفاعلات التنظيمية لرابطة الدول المستقلة وتحليل البصمة5،23،24،25. يؤدي تثبيت العينات وتسلسل مضاعف في تشغيل متعدد الإرسال إلى تقليل مصادر تأثير الدفعة، مما يتيح المقارنة بين العينات مثل تجربة الدورة الزمنية. يعتمد عدد عينات الأنسجة المطلوبة على نطاق التجربة. عند فحص الأنماط الظاهرية المرتبطة بالنقاط الزمنية الجنينية، غالبا ما تكون الشبكية المفردة كافية ويمكن أن توفر مئات الآلاف من الخلايا. قد لا توفر شبكية العين الواحدة خلايا كافية في مخططات تجريبية أكثر تعقيدا: عمليات كهربية خارج الجسم الحي لخلايا شبكية العين ، أو التحقيق في مجموعات الخلايا النادرة ، أو النماذج الجينية مع عدم كفاية تنشيط CRE. في حين أن شبكية العين الواحدة قد توفر بضع مئات من الخلايا ، إلا أنها لن تلتقط تعقيد الأنسجة الكامل. بالنسبة لمثل هذه التجارب ، ستكون هناك حاجة إلى التحسين بناء على احتياجات الباحث. باستخدام هذه التقنيات ، يمكن للمرء أن يكتسب نظرة ثاقبة حول كيفية تنظيم الجينات التي تم تحليلها في MULTI-seq خلال العمليات الديناميكية مثل التطور والمرض.

يكمن تنظيم الشبكات التنظيمية الجينية في قلب فهم العمليات الخلوية وكيف تساهم في التطور والمرض1،26،27. يمكن استخدام سير العمل المعروض هنا لتحديد هذه الشبكات التنظيمية الجينية في أنواع معينة من الخلايا. ومع ذلك ، فقد تم تحسين هذا البروتوكول للاستخدام مع أنسجة شبكية العين للفأر. قد تكون هناك حاجة إلى تحسين الخطوات المختلفة ، مثل وقت التحلل أو التفكك ، وسرعات / أوقات الطرد المركزي ، وعدد خطوات الترشيح لزيادة عدد الخلايا أو النوى إلى أقصى حد وتقليل حطام الخلايا في معلقات الخلايا من أنواع الأنسجة الأخرى ، أو عينات خارج الجسم الحي ، أو الأنواع ، سواء كانت العينات طازجة أو مجمدة أو مثبتة في الميثانول. قد تحتاج إلى زيادة وقت تثبيت الميثانول إذا أظهرت العينات مستويات عالية من الخلايا القابلة للحياة مع تلطيخ أزرق تريبان. تقدم تقنية MULTI-seq العديد من خطوات الغسيل الإضافية على scRNA-seq التقليدي. لتجنب التخلص العرضي من الخلايا القيمة أو الحمض النووي ، من الحكمة تحسين سرعات الطرد المركزي والحفاظ على المواد الفائقة التي عادة ما يتم التخلص منها في الترميز الشريطي للخلايا ، وتنظيف ما بعد GEM RT ، وخطوات بناء مكتبة الباركود على الجليد حتى يتم التحقق من نجاح هذه الخطوة. أحد القيود على MULTI-seq هو العدد المحدود من الخلايا ، وبالتالي العينات ، التي يمكن تسلسلها من بئر واحد في خطوة توليد GEM. يوصى بعدم محاولة الحمل الزائد للخلايا بشكل مفرط خلال هذه الخطوة لتجنب زيادة كبيرة في التقاط الخلايا المزدوجة. تجنب تحميل بئر GEM بأكثر من 20000 خلية. بدلا من ذلك ، يمكن تحضير آبار متعددة من تعليق واحد مشترك ومتعددة الإرسال أثناء التسلسل. سيتطلب ذلك إعداد حجم كبير بما فيه الكفاية من تعليق الخلايا لتوليد GEM وإضافة النسخ المتماثلة إلى الخطوات 5 و 6 و 7 وسيزيد من تكلفة التسلسل حيث هناك حاجة إلى المزيد من القراءات الإجمالية لمزيد من الخلايا. ومن خلال التحسين المناسب، سيمكن سير العمل هذا من تحديد الأنماط الظاهرية الخاصة بنوع الخلية والشبكات التنظيمية الجينية بكفاءة من حيث التكلفة والوقت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لا شيء للإفصاح.

Acknowledgments

نشكر ليندا أورزوليك من مركز جونز هوبكنز للنسخ و Deep Sequencing Core للمساعدة في تسلسل المكتبات المنتجة و Lizhi Jiang على أداء عمليات استئصال الشبكية خارج الجسم الحي .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette filter tips
10% Tween 20 Bio-Rad 1662404
100 µM Barcode Solution Request from Gartner lab https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested
=true
100% Ethanol Millipore Sigma E7023-500ML
100% Methanol Millipore Sigma 322415-100ML
10x Chip Holder 10x Genomics 1000195
10x Chromium controller & Accessory Kit 10x Genomics PN-120263
15mL Centrifuge Tube Quality Biological P886-229411
40 µm FlowMi Cell Strainer Bel-Art H13680-0040
50 µM Anchor Solution Sigma or request from Gartner lab https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested
=true
50 µM Co-Anchor Solution Sigma or request from Gartner lab https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested
=true
5200 Fragment Analyzer system Agilent M5310AA
70 um FlowMi cell strainer Bel-Art H13680-0070
Allegra X-12R Centrifuge VWR BK392302
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9647
Chromium Next GEM Chip G 10x Genomics PN-1000120
Chromium Next GEM Chip H 10x Genomics PN-1000161
Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.1 10x Genomics PN-1000175
Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1 10x Genomics PN-1000121
Digitonin Fisher Scientific BN2006
Dissection microscope Leica
DNA LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 22431021
Dry Ice
EVA Foam Ice Pan Tequipment 04393-54
FA 12-Capillary Array Short, 33 cm Agilent A2300-1250-3355
Fisherbrand Isotemp Water Bath Fisher Scientific 15-460-20Q
Forma CO2 Water Jacketed Incubator ThermoFisher Scientific 3110
Glycerol 50% Aqueous solution Ricca Chemical Company 3290-32
Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber Fisher Scientific 02-671-51B
Illumina NextSeq or NovaSeq Illumina
Kapa Hifi Hotstart ReadyMix HiFi 7958927001
Low TE Buffer Quality Biological 351-324-721
Magnesium Chloride Solution 1 M Sigma-Aldrich M1028
Magnetic Separator Rack for 1.5 mL tubes Millipore Sigma 20-400
Magnetic Separator Rack for 200 µL tubes 10x Genomics NC1469069
MULTI-seq Primer Sigma or IDT See sequence list
MyFuge Mini Centrifuge Benchmark Scientific C1008
Nonidet P40 Substitute Sigma-Aldrich 74385
Nuclease-free water Fisher Scientific AM9937
P2, P10, P20, P200, P1000 micropipettes Eppendorf
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation LK003150
PBS pH 7.4 (1X) Fisher Scientific 10010-023
Qiagen Buffer EB Qiagen 19086
Refridgerated Centrifuge 5424 R Eppendorf 2231000655
RNase-free Disposable Pellet Pestles Fisher Scientific 12-141-368
RNasin Plus RNase Inhibitor Promega N2615
RPI primer Sigma or IDT See sequence list
Single Index Kit N, Set A 10x Genomics PN-1000212
Single Index Kit T Set A 10x Genomics PN-1000213
Sodium Chloride Solution 5 M Sigma-Aldrich 59222C
SPRIselect Reagent Kit Beckman Coulter B23318
Standard Disposable Transfer Pipettes Fisher Scientific 13-711-7M
TempAssure PCR 8-tube strip USA Scientific 1402-4700
Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.4 Sigma-Aldrich T2194
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) Corning 25-900-CI
Universal I5 primer Sigma or IDT See sequence list
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems 4375786
Vortex Mixer VWR 10153-838

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370, (2020).
  2. Nagalakshmi, U., et al. The Transcriptional Landscape of the Yeast Genome Defined by RNA Sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
  3. Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
  4. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50, 96 (2018).
  5. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36, 411-420 (2018).
  6. McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 16, 619-626 (2019).
  7. Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19, 224 (2018).
  8. Chen, X., Miragaia, R. J., Natarajan, K. N., Teichmann, S. A. A rapid and robust method for single cell chromatin accessibility profiling. Nature Communications. 9, 5345 (2018).
  9. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. , 8598 (2020).
  10. Clark, B. S., et al. Single-Cell RNA-Seq Analysis of Retinal Development Identifies NFI Factors as Regulating Mitotic Exit and Late-Born Cell Specification. Neuron. 102, 1111-1126 (2019).
  11. Zheng, Y., et al. A human circulating immune cell landscape in aging and COVID-19. Protein Cell. 11, 740-770 (2020).
  12. Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37, 925-936 (2019).
  13. Worthington Biochemical Corporation. Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , (2020).
  14. 10x Genomics. Chromium Single Cell 3' Reagent Kits v3 User Guide. , (2020).
  15. Agilent. DNF-468 HS Genomic DNA 50 kb Kit Quick Guide for Fragment Analyzer Systems. , (2015).
  16. ThermoFisher Scientific. Qubit dsDNA HS Assay Kits. ThermoFisher Scientific. , (2015).
  17. 10x Genomics. Chromium Single Cell ATAC Reagent Kits User Guide (v1.1 Chemistry). , (2020).
  18. Weir, K., Kim, D. W., Blackshaw, S. Regulation of retinal neurogenesis by somatostatin signaling. bioRxiv. , (2020).
  19. Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14, 865-868 (2017).
  20. Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10, 2907 (2019).
  21. Ma, S., et al. Chromatin Potential Identified by Shared Single-Cell Profiling of RNA and Chromatin. Cell. , (2020).
  22. Buenrostro, J. D., et al. Integrated Single-Cell Analysis Maps the Continuous Regulatory Landscape of Human Hematopoietic Differentiation. Cell. 173, 1535-1548 (2018).
  23. Pliner, H. A., et al. Cicero Predicts cis-Regulatory DNA Interactions from Single-Cell Chromatin Accessibility Data. Molecular Cell. 71, 858-871 (2018).
  24. Granja, J. M., et al. ArchR: An integrative and scalable software package for single-cell chromatin accessibility analysis. BioRxiv. , (2020).
  25. Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177, 1888-1902 (2019).
  26. METABRIC Group. The genomic and transcriptomic architecture of 2,000 breast tumours reveals novel subgroups. Nature. 486, 346-352 (2012).
  27. Izadi, F. Differential Connectivity in Colorectal Cancer Gene Expression Network. Iranian Biomedical Journal. 23, 34-46 (2019).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 169 ، التنمية ، المرض ، scRNA-Seq ، scATAC-Seq ، MULTI-Seq ، multiplex ، الكروماتين
تحليل متعدد الإرسال للتعبير الجيني للشبكية وإمكانية الوصول إلى الكروماتين باستخدام scRNA-Seq و scATAC-Seq
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weir, K., Leavey, P., Santiago, C.,… More

Weir, K., Leavey, P., Santiago, C., Blackshaw, S. Multiplexed Analysis of Retinal Gene Expression and Chromatin Accessibility Using scRNA-Seq and scATAC-Seq. J. Vis. Exp. (169), e62239, doi:10.3791/62239 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter