Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Multiplexerad analys av retinal genuttryck och kromatintillgänglighet med hjälp av scRNA-Seq och scATAC-Seq

Published: March 12, 2021 doi: 10.3791/62239
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2,3,4,5,6
1Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Psychiatry and Behavioral Science, The Johns Hopkins Hospital, 3Department of Ophthalmology, The Johns Hopkins Hospital, 4Department of Neurology, The Johns Hopkins Hospital, 5Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Kavli Neuroscience Discovery Institute, Johns Hopkins University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Här visar författarna nyttan av MULTI-seq för fenotypning och efterföljande parade scRNA-seq och scATAC-seq för att karakterisera de transkriptomiska och kromatin tillgänglighetsprofilerna i näthinnan.

Abstract

Kraftfulla nästa generations sekvenseringstekniker erbjuder robust och omfattande analys för att undersöka hur retinala genreglerande nätverk fungerar under utveckling och i sjukdomstillstånd. Encellig RNA-sekvensering gör det möjligt för oss att omfattande profilera genuttrycksförändringar som observerats i retinal utveckling och sjukdom på cellnivå, medan encellig ATAC-Seq gör det möjligt att analysera kromatintillgänglighet och transkriptionsfaktorbindning för att profileras med liknande upplösning. Här beskrivs användningen av dessa tekniker i den utvecklande näthinnan, och MULTI-Seq demonstreras, där enskilda prover är märkta med ett modifierat oligonukleotid-lipidkomplex, vilket gör det möjligt för forskare att både öka omfattningen av enskilda experiment och avsevärt minska kostnaderna.

Introduction

Att förstå hur gener kan påverka cellöden spelar en nyckelroll i förhörsprocesser som sjukdom och embryonal progression. De komplexa sambanden mellan transkriptionsfaktorer och deras målgener kan grupperas i genreglerande nätverk. Ökande bevis placerar dessa genreglerande nätverk i centrum för både sjukdom och utveckling över evolutionära linjer1. Medan tidigare tekniker som qRT-PCR fokuserade på en enda gen eller uppsättning gener, möjliggör tillämpningen av sekvenseringsteknik med hög genomströmning profilering av kompletta cellulära transkriptom.

RNA-seq ger en inblick i storskalig transkriptomik 2,3. Encellig RNA-sekvensering (scRNA-seq) ger utredare möjlighet att inte bara profilera transkriptom utan länka specifika celltyper med genuttrycksprofiler4. Detta uppnås bioinformatiskt genom att mata in enskilda cellprofiler i sorteringsalgoritmer med hjälp av kända genmarkörer5. Multiplexering med lipidtaggad indexsekvensering (MULTI-seq) erbjuder oöverträffad mångfald i antalet scRNA-Seq-profiler som kan samlas in6. Denna lipidbaserade teknik skiljer sig från andra provindexeringstekniker såsom cellhashing som förlitar sig på närvaron av ytantigener och antikroppar med hög affinitet istället för plasmamembranintegration7. Det är nu inte bara möjligt att profilera genuttrycksprofiler i celltyper utan olika experiment kan kombineras till ett enda sekvenseringsbibliotek, vilket dramatiskt sänker kostnaden för ett individuellt scRNA-seq-experiment6. Kostnaden för scRNA-seq kan verka oöverkomlig för användning i fenotypningsexperiment där många olika genotyper, tillstånd eller patientprover analyseras, men multiplexering möjliggör kombination av upp till 96 prover i ett enda bibliotek6.

Profilering av genuttryck via scRNA-seq har inte varit den enda sekvenseringsbaserade tekniken med hög genomströmning som revolutionerar den nuvarande förståelsen av hur molekylära mekanismer dikterar cellens öde. Medan förståelse av vilka genutskrifter som finns i en cell möjliggör identifiering av celltyp, är det lika viktigt att förstå hur genomisk organisation reglerar utveckling och sjukdomsprogression. Tidiga studier förlitade sig på att detektera DNase-medierad klyvning av sekvenser som inte är bundna till histoner, följt av sekvensering av de resulterande DNA-fragmenten för att identifiera regioner av öppet kromatin. Däremot tillåter encellsanalys för transposontillgänglig kromatinsekvensering (scATAC-seq) forskare att undersöka DNA med en domesticerad transposon för att enkelt profilera öppet kromatin vid den enda nukleotidnivån8. Detta har gått igenom en liknande skalning som scRNA-seq och nu kan utredare identifiera enskilda celltyper och profilfenotyper över tusentals enskilda genom8.

Parningen av scRNA-seq och scATAC-seq har gjort det möjligt för forskare att profilera tusentals celler för att bestämma cellpopulationer, genomisk organisation och genreglerande nätverk i sjukdomsmodeller och utvecklingsprocesser 9,10,11,12. Här beskriver författarna hur man först kan använda MULTI-seq för att kondensera fenotypning av en myriad av djurmodeller och använda parade scRNA-seq och scATAC-seq för att få en bättre förståelse för kromatinlandskapet och reglerande nätverk i dessa djurmodeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Användningen av djur för dessa studier genomfördes med hjälp av protokoll som godkänts av Johns Hopkins Animal Care and Use Committee, i enlighet med ARRIVE-riktlinjerna, och utfördes i enlighet med relevanta riktlinjer och föreskrifter.

1. FLERA seq

  1. Förberedelse av media
    1. Förbered och balansera ovomucoidhämmare, 10 mg ovomucoidhämmare och 10 mg albumin per ml Earles balanserade saltlösning (EBSS), i 30 minuter före användning13. Balansera med 95% O2:5%CO2 i en inkubator.
      1. Förbered papaindissociationslösning, 20 enheter/ml papain och 0,005% DNas i EBSS, under detta inkubationssteg13.
        OBS: En injektionsflaska med DNase-lösning räcker för 5 prover. Ytterligare injektionsflaskor kan behöva beredas om multi-seq utförs på fler än 5 prover.
    2. Förbered lipidmodifierade oligo-streckkodningslösningar.
      1. Gör en unik streckkodsutspädning för varje prov genom att kombinera 0,5 μl 100 μM streckkodsfondlösning med 4,5 μl fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
      2. För att förbereda ankare: streckkodslösning vid molförhållandet 1: 1, kombinera 4,4 μL 10 μM streckkodsutspädning, 0,9 μL 50 μM ankarlösning och 16,7 μL PBS och placera på is. Den slutliga koncentrationen för både streckkodssträngar och förankringssträngar bör vara 2 μM.
      3. För att förbereda medankarelösning, kombinera 0,88 μl 50 μM medankareslösning och 21,12 μl PBS och placera på is. Den slutliga koncentrationen av medankaren bör vara 2 μM. Multiplicera volymerna i detta steg med 1,1x antalet prover.
    3. För att göra 1% BSA i PBS, lös upp 0,1 g bovint serumalbumin (BSA) i 10 ml PBS och lägg på is.
    4. För att göra PBS med RNas-hämmare, kombinera 2,5 μl 40 U / μL RNas-hämmare med 197,5 μL PBS och lagra på is. Multiplicera volymerna i detta steg med 1,1x antalet prover.
  2. Exempel dissociation
    1. Avliva djur genom cervikal dislokation och/eller CO 2-kvävning i enlighet med institutionella IACUC-krav. Metod för eutanasi beror på institutionella krav och modellorganism som används.
    2. Dissekera näthinnan från båda ögonen i kall PBS under ett dissektionsmikroskop och överför till ett sterilt 1,5 ml mikrocentrifugrör med hjälp av en överföringspipett.
    3. Överför 500 μl av papainlösningen till ett 1,5 ml rör för varje prov.
    4. Placera proverna i papainlösningen och täck omedelbart rören.
    5. Inkubera rören som innehåller proverna vid 37 °C, 5 %CO2 i 30 minuter. Vänd injektionsflaskorna 3 gånger var 10: e minut. Proverna bör gradvis dissocieras med varje omgång inversioner.
    6. Sätt tillbaka injektionsflaskorna till rumstemperatur och triturera varje prov 3-4 gånger med en 1 ml pipett inställd på 300 μl.
    7. Låt alla bitar av odissocierad vävnad som finns kvar efter trituration sätta sig.
    8. Ta bort den grumliga cellsuspensionen samtidigt som du undviker bitar av odissocierad vävnad och placera varje provs cellsuspension i ett nytt sterilt 15 ml skruvkapslat rör.
    9. Centrifugera cellsuspensionerna vid 300 x g i 5 min vid rumstemperatur.
    10. Under centrifugeringssteget förbereder du cellåterkopplingsmediet.
      1. Blanda 857 μL EBSS (injektionsflaska 1) med 95 μL färdigberedd albumin-ovomucoidhämmare i ett sterilt 1,5 ml skruvkapslat rör. Tillsätt 48 μL DNase-lösning sparad från 1.1.1. Multiplicera volymerna i detta steg med 1,1x antalet prover.
    11. Kassera supernatanten, var noga med att behålla cellpelletsen och återsuspendera omedelbart cellpelletsen i 1 ml cellåterlösning framställd i steg 1.2.10.
    12. Förbered diskontinuerlig densitetsgradient.
      1. Tillsätt 1,6 ml ovomucoidhämmarelösning till ett nytt 15 ml sterilt skruvkapslat rör för varje prov och lägg försiktigt cellsuspensionen ovanpå. Gränssnittet mellan de två lagren i övertoningen ska vara synligt men viss blandning påverkar inte resultaten.
    13. Centrifugera de diskontinuerliga densitetsgradienterna vid 70 x g i 6 minuter vid rumstemperatur. De dissocierade cellerna ska pelleteras i botten av rören medan membranfragment förblir vid gränssnittet.
    14. Kassera supernatanten och tillsätt 200 μL PBS för att tvätta de pelleterade cellerna. Centrifugera vid 300 x g i 5 min vid rumstemperatur.
    15. Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i 180 μL PBS med RNas-hämmare. För cellerna genom en 40 μm cellsil till ett sterilt 1,5 ml mikrocentrifugrör.
  3. Cell streckkodning
    1. Tillsätt 20 μL ankare:streckkodslösning till varje prov och pipettera försiktigt för att blanda. Se till att varje prov får en unik ankare:streckkodslösning och inkubera på is i 5 min.
      1. Förbered de material som krävs för generering av gelpärlor (GEM) och streckkodning under denna inkubation14.
    2. Tillsätt 20 μL medankarelösning till varje prov och pipettera försiktigt för att blanda. Inkubera på is i 5 min.
    3. Tillsätt 1 ml iskall 1 % BSA i PBS till varje prov och centrifugera cellerna vid 300 x g i 5 minuter vid 4 °C.
    4. Ta bort supernatanten utan att störa cellpelleten och tillsätt 400 μl iskallt 1% BSA i PBS. Centrifugera vid 300 x g i 5 min vid 4 °C.
      1. Upprepa steg 1.3.4 för totalt 2 tvättar. Ta bort supernatanten och återsuspendera i 400 μL iskall 1% BSA i PBS.
    5. Bestäm koncentrationen av celler för varje prov med hjälp av en hemocytometer.
      1. Bestäm det totala antalet celler som ska läsas in för varje prov. Vanligtvis är detta det totala antalet celler som önskas dividerat med antalet prover. Om en biologisk replikat för ett tillstånd gick förlorad kan dess andel dock delas upp mellan de andra biologiska replikaten från det tillståndet.
      2. Dela antalet celler som önskas för varje prov med cellkoncentrationen för det provet beräknat i steg 3.5 för att bestämma den volym som krävs för att ladda önskat antal celler.
    6. Kombinera volymerna beräknade i steg 3.5.2 från varje prov i ett nytt sterilt 1,5 ml centrifugrör. Det är klokt att fördubbla volymen som tas från varje prov i händelse av fel på GEM-generering.
      1. Bestäm "slutlig" cellkoncentration av de kombinerade proverna med hjälp av en hemocytometer.
  4. GEM-generering och streckkodning
    1. Använd kombinerade prover för att generera och streckkoda GEM14.
  5. Post GEM-RT Cleanup och cDNA Amplification
    1. Förbered material för post GEM omvänd transkriptasrensning och cDNA-förstärkning enligt tillverkarens instruktioner med följande ändringar14. Utför efter GEM-RT-rensning efter storleksval14.
      1. Öka volymen 80% etanol framställd med 2 ml.
      2. Förbered cDNA Amplification Mix på is14. Tillsätt 1 μl 2,5 μM MULTI-seq primer till cDNA Amplification mix. Vortex för 5 s och centrifug i 5 s i en minicentrifug på bänkskivan.
    2. Utför cDNA-förstärkning14. cDNA kan förvaras vid 4 °C i upp till 72 timmar vid denna tidpunkt.
    3. Utför cDNA-rensning efter storleksval14. Det endogena transkriptet cDNA kan förvaras vid 4 °C i upp till 72 timmar eller vid -20 °C i upp till 4 veckor vid denna tidpunkt.
      1. Kasta inte supernatanten från den första omgången av storleksval . Denna fraktion innehåller exempelstreckkoderna. Överför supernatanten till ett nytt sterilt 1,5 ml mikrocentrifugrör.
      2. Förvara supernatanten på is.
    4. Virvel för att återsuspendera paramagnetiskt pärlbaserat storleksvalsreagens och tillsätt 260 μL paramagnetiskt pärlbaserat storleksvalsreagens (slutligt 3,2x) och 180 μL 100% isopropanol (1,8x) till supernatanten. Pipettera blandningen 10 gånger och inkubera vid rumstemperatur i 5 min.
    5. Placera röret på ett magnetställ och vänta tills lösningen rensas. Ta sedan bort och kassera supernatanten.
    6. Tillsätt 500 μL 80% etanol till pärlorna och låt stå i 30 s. Ta bort och kassera supernatanten.
      1. Upprepa i totalt 2 tvättar.
    7. Centrifugera pärlorna kort och återgå till magnetstället. Starta en timer i 2 min.
    8. Ta bort den återstående etanolen med en P10-pipett och lufttorka pärlorna på magnetstället under resten av 2 minuter. Överstiga inte 2 min.
    9. Ta bort pärlorna från magnetstället och återsuspendera i 100 μL elueringsbuffert (EB). Pipettera noggrant för att återsuspendera.
    10. Inkubera vid rumstemperatur i 2 min.
    11. Återgå till magnetstället och vänta tills lösningen rensas.
    12. Överför supernatanten till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör.
    13. Upprepa steg 1.5.4 till 1.5.12. Halvera volymen buffert-EB som används i steg 1.5.9.
    14. Bestäm streckkodens DNA-koncentration och storleksfördelning med hjälp av ett dsDNA-analyskit med hög känslighet och fluorometer- och fragmentanalysator15,16. Streckkoden cDNA kan förvaras vid 4 °C i upp till 72 timmar eller vid -20 °C i upp till 4 veckor vid denna tidpunkt.
  6. Konstruktion av streckkodsbibliotek
    1. Förbered 1 ml 80% etanol.
    2. Förbered streckkodsbibliotekets PCR-masterblandning i ett sterilt PCR-bandrör: kombinera 26,25 μl 2x PCR-färdigblandning med varm start, 2,5 μl 10 μM Universal i5-primer, 2,5 μl 10 μM RPI-primer, 3,5 ng streckkod cDNA (volym bestämd av koncentration från steg 5.14) och tillräckligt med nukleasfritt vatten för att få den slutliga volymen till 50 μL.
      1. Använd en unik RPI-primer för varje streckkodsbibliotek om flera MULTI-seq-bibliotek sekvenseras tillsammans.
    3. Utsätt streckkodsbibliotekets huvudmix för en PCR för biblioteksförberedelse: 95 °C i 5 minuter; 10 cykler på 98 °C i 15 s, 60 °C i 30 s, 72 °C i 30 s, 72 °C i 1 min; och håll sedan vid 4 °C.
    4. Vortex för att återsuspendera det paramagnetiska pärlbaserade storleksvalsreagenset.
    5. Ta bort PCR-produkten från termocyklern och tillsätt 80 μL (1,6x) paramagnetiskt pärlbaserat storleksvalsreagens. Pipettera noggrant.
    6. Inkubera vid rumstemperatur i 5 min. Placera på magnetavskiljaren i högt läge och vänta tills lösningen rensas.
    7. Ta bort och kassera supernatanten.
    8. Tillsätt 200 μL 80% etanol till pärlorna och låt stå i 30 s. Ta bort och kassera supernatanten.
      1. Upprepa steg 1.6.8 för totalt 2 tvättar.
    9. Centrifugera röret kort och placera på magnetavskiljaren i lågt läge. Starta en timer i 2 min.
    10. Ta bort den återstående etanolen med en P20-pipett och lufttorka pärlorna på magnetavskiljaren under resten av 2 minuter. Överstiga inte 2 min.
    11. Ta bort röret från magnetavskiljaren och återsuspendera pärlorna i 25 μL buffert EB. Pipett blanda noggrant för att återsuspendera pärlorna.
    12. Inkubera i 2 min vid rumstemperatur.
    13. Återgå till magnetavskiljaren i lågt läge och vänta tills lösningen rensas. Överför supernatanten till ett nytt PCR-bandrör.
    14. Kvantifiera uttrycksbiblioteks- och streckkodsbibliotekskoncentration och fragmentstorleksfördelning med adsDNA-analyskit med hög känslighet och fluorometer- och fragmentanalysator.
  7. 3 'Genuttrycksbibliotekets konstruktion
    1. Utför 3' genuttrycksbibliotekskonstruktion enligt tillverkarens instruktioner14.
  8. Sekvensering
    1. Förutom det endogena cDNA-biblioteket som förstärktes i steg 7 skickar du streckkodsbiblioteket som förstärktes i steg 6. För enkelhetens skull kan du skicka in dessa bibliotek separat, eller som en kostnadseffektiv åtgärd inkludera en alikvot av exempelfältets streckkodningsmaterial med det endogena cDNA-biblioteket. Mål mellan 20 000–50 000 cDNA och 3 000–5 000 streckkodsläsningar per cell.
    2. Konvertera de resulterande sekvenserings-bcl-filerna till fastq-filer med cellranger mkfastq och räkna matriser som genereras från dessa av cellrangerantal.
    3. Dekonvolute-prover efter Cellranger-analys med hjälp av deMULTIplex r-paketet som finns tillgängligt på MULTI-seq GitHub-förvaret (https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/MULTI-seq).

2. Parade scRNA-seq och scATAC-seq

  1. Blixtfrysningsvävnad för scATAC-seq och metanolfixering av retinala celler för scRNA-seq
    1. Förberedelse av media
      1. För att förbereda lösningarna för retinal dissociation, upprepa steg 1.1.1 och 1.1.4.
      2. Förbered ett etanol torrisbad i en liten ishink.
      3. Förbered 15 ml 70% etanol genom att tillsätta 10,5 ml etanol till 4,5 ml nukleasfritt vatten.
      4. Tillsätt tillräckligt med torris i ishinken (helst i pelletsform) så att 15 ml vätska kommer att stiga för att bara täcka isen. Tillsätt 15 ml etanol.
      5. Placera PBS på is och 1 ml alikvoter 100% metanol i en bekväm frys på -20 °C.
    2. Beredning av prov
      1. Följ steg 1.2.1 och 1.2.2 för att isolera näthinnor; men den här gången placera varje näthinna i ett separat mikrocentrifugrör.
      2. För de prover som är avsedda för scATAC-seq, avlägsna eventuell vätska från mikrocentrifugröret med en P200-pipett och täck omedelbart och placera röret i etanol-torrisbad för att blixtfrysa provet.
      3. För de prover som är avsedda för scRNA-seq, för att dissociera cellerna, upprepa steg 1.2.3 till 1.2.15 på den dissekerade näthinnan.
      4. Centrifugera cellerna vid 300 x g i 3 min vid rumstemperatur.
      5. Ta bort supernatanten utan att störa cellpelleten.
      6. Tillsätt 1 ml kyld PBS och pipettera försiktigt 10 gånger eller tills cellerna är helt suspenderade.
      7. Centrifugera vid 300 x g i 5 min vid 4 °C.
        1. Upprepa steg 2.1.2.5 till 2.1.2.7 för totalt 2 tvättar.
      8. Ta bort supernatanten utan att störa cellpelleten.
      9. Tillsätt 100 μL kyld PBS och blanda försiktigt 10x eller tills cellerna är helt suspenderade.
      10. Börja virvla röret med den lägsta hastighetsinställningen. Tillsätt 900 μL kyld metanol (-20 °C) droppe för droppe medan du fortsätter att försiktigt virvla röret för att förhindra att cellerna klumpar ihop sig.
      11. Inkubera cellerna på is i 15 min.
      12. Bestäm koncentrationen av de fasta cellerna med hjälp av en hemocytometer.
      13. Bedöm effekten av fixeringssteget med hjälp av trypanblått. En hög andel livskraftiga celler indikerar att mer fixeringstid krävs.
      14. Förvara fryst vävnad och fasta celler vid -80 °C.
  2. Kärnisolering från blixtfryst vävnad för scATAC-seq
    1. Förberedelse av media
      1. Förbered lysutspädningsbufferten genom att kombinera 9,77 ml nukleasfritt vatten, 100 μl 1 M Tris-HCl (pH 7,4), 100 μl 1 M NaCl, 30 μl 1 MMgCl2 och 0,1 g BSA.
      2. Förbered lysutspädningsbufferten framåt, till exempel dagen innan, och förvara vid 4 °C. På protokollets dag, placera på is.
      3. Balansera 20x kärnbuffert som tillhandahålls av tillverkaren av scATAC-satsen från -20 °C till rumstemperatur. Vortex och centrifug kort.
      4. Förbered 1x lysbufferten genom att inkubera 5 % Digitoninlösning i ett 65 °C vattenbad tills fällningen är upplöst. Kombinera sedan 2 ml lysutspädningsbuffert, 20 μl 10% Tween-20, 20 μl Nonidet P40 Substitute (kan alternativt märkas IGEPAL) och 4 μL Digitonin.
      5. Förvara 1x lysbufferten på is.
      6. För att förbereda 0,1x lysbufferten, kombinera 1,8 ml lysutspädningsbuffert med 200 μL av 1x lysbufferten och förvara på is.
      7. För att förbereda tvättbufferten, kombinera 2 ml lysutspädningsbuffert och 20 μl 10% Tween-20 och förvara på is.
      8. För att förbereda den utspädda kärnbufferten, kombinera 950 μL nukleasfritt vatten med 50 μL kärnbuffert (20x) och förvara på is.
    2. Kärnor isolering
      1. Tina inte provet före lys. Tillsätt 500 μl kyld 0,1x lysbuffert till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör som innehåller det frysta provet. Homogenisera omedelbart 15x med en pelletsstöt.
      2. Inkubera i 5 min på is. Förbered de material som krävs för scATAC-införlivande under detta inkubationssteg17.
      3. Pipettera 10x med en 1 ml pipett och inkubera i 10 min på is. Fullständig beredning av de material som krävs för scATAC-införlivande under detta inkubationssteg om det inte redan är slutfört. Det är onödigt att förbereda mer utspädd kärnbuffert.
      4. Tillsätt 500 μL kyld tvättbuffert till de lyserade cellerna. Pipettblandning 5x.
      5. För suspensionen genom en 70 μm cellsil till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör. Filtrera ~300 μl åt gången med en ny 70 μm cellsil varje gång.
      6. Överför det uppsamlade flödet genom en 40 μm cellsil till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör och förvara på is.
      7. Bestäm kärnkoncentrationen med hjälp av en hemocytometer. Baserat på kärnkoncentrationen och den totala volymen av cellsuspensionen, beräkna det totala antalet dissocierade kärnor.
      8. Centrifugera vid 500 x g i 5 min vid 4 °C och avlägsna supernatanten utan att störa kärnpelleten.
      9. För att skapa kärnorna baserat på det totala antalet kärnor som bestäms i steg 2.2.2.7, återsuspendera kärnorna i tillräckligt med utspädd kärnbuffert för att nå en önskad kärnkoncentration.
        OBS: Önskad kärnkoncentration baseras på den riktade kärnåtervinningen för scATAC-seq-experimentet och bestäms utifrån riktlinjerna för kärnkoncentration som finns i tillverkarens protokoll17. Till exempel, om 10 000 kärnor i slutändan önskas, är den önskade kärnkoncentrationen för kärnorna mellan 3 080 och 7 700 kärnor / μL. Det kan vara bäst att sikta på mitten av intervallet i koncentration.
      10. Bestäm kärnkoncentrationen med hjälp av en hemocytometer.
      11. Fortsätt omedelbart till scATAC-införlivande med hjälp av det beredda kärnorna17.
  3. Rehydrering av metanol fasta celler för användning i scRNA-Seq
    1. Förberedelse av media
      1. För att bereda tvätt-/utspädningsbufferten, lös upp 0,01 g BSA i 1 ml PBS. Tillsätt sedan 12,5 μl 40 U/μl RNas-hämmare och blanda försiktigt. Förvara på is.
    2. Cell rehydrering
      1. Centrifugera metanolfasta celler i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör vid 3000 x g i 10 minuter vid 4 °C. Ta sedan bort supernatanten.
      2. Tillsätt 200 μL kyld tvätt-/utspädningsbuffert till mikrocentrifugröret. Centrifugera vid 300 x g i 10 min vid 4 °C och avlägsna supernatanten. Upprepa i totalt 2 tvättar.
        OBS: Förbered det material som krävs för GEM-generering och streckkodning under de två föregående stegen14.
      3. För att bereda celllagret, baserat på det totala cellantalet beräknat i 2.1.2.12, återförsuspendera cellerna i tillräckligt tvätt/utspädningsbuffert för att uppnå önskad cellkoncentration. Föredragna cellkoncentrationer är mellan 700 och 1200 celler / μl.
      4. Bestäm cellkoncentrationen i cellbeståndet med hjälp av en hemocytometer.
      5. Fortsätt omedelbart till GEM-generering och streckkodning med celllagret14.
    3. Sekvensering
      1. När du utför tidskursanalys (som vid utveckling eller sjukdom), sekvensera flera prover i en multiplexerad körning (dvs. flera bibliotek på en enda flödescell) för att minska den tekniska variationen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detta arbetsflöde innehåller en strategi för undersökning av utvecklingsfenotyper och regleringsprocesser med hjälp av encellssekvensering. MULTI-seq-provmultiplexering möjliggör en initial lågkostnads fenotypningsanalys medan parad insamling och fixering av prover för scRNA-seq och scATAC-seq möjliggör mer djupgående undersökning (figur 1).

MULTI-seq-streckkodning möjliggör kombinerad sekvensering av flera prover och deras efterföljande beräkningsdekonvolution. Ursprungsprovet kan bestämmas för varje cell baserat på deras streckkodsuttryck (figur 2A). Dessa kombinerade prover kan analyseras som en enda datauppsättning för cellkluster och celltypidentifiering (figur 2B). Eftersom varje cell är streckkodad före GEM-generering kommer celldubblar att ha stor sannolikhet att visa uttryck för flera MULTI-seq streckkoder och en majoritet av dubbletter kan därför identifieras och tas bort före klustring och celltypidentifiering (figur 2C). Att öka antalet celler som används i GEM-generationssteget kommer att öka andelen dubbletter som hittas. scATAC-seq kan användas för att generera en datauppsättning med celltyper för att matcha de som hittas av scRNA-seq (figur 2D). Parningen av scRNA-seq-genuttryck och scATAC-seq DNA-tillgänglighetsinformation möjliggör rekonstruktion av genreglerande nätverk.

Figure 1
Figur 1: Schematisk som visar användningen av MULTI-Seq i initial analys, följt av separat scRNA-Seq och scATAC-Seq-analys i djupgående karakterisering av fenotyper, behandlingar eller sjukdomstillstånd av intresse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: UMAP-dimensionella reduktionsrepresentationer av MULTI-seq-data för en allelisk serie P0 Sstr2 knockout-möss som visar (a) dekonvolutionen av genotyp för varje cell i datasetet och (b) identifieringen av celltyper i datasetet. Överbelastning av celler under GEM-genererings- och streckkodssteget kommer att resultera i en ökning av celldubblar som de som ses i (c), som visar data från (a) och (b) innan dubblering tas bort och återstörs. I (d) elektroporerar scATAC-Seq-data från GFP-positiva celler erhållna vid E16 från retinala explanter elektroporerade med en GFP-uttryckande kontrollplasmid vid E14. Celltyper kommenteras baserat på tillgänglighet av celltypspecifika gener. Denna siffra har modifierats från Weir, K., Kim, D. W., Blackshaw, S. Reglering av retinal neurogenes genom somatostatin signalering. bioRxiv 2020.09.26.314104 (2020) doi:10.1101/2020.09.26.31410418 och ursprungliga, opublicerade data. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kraften i MULTI-seq härrör från sömlös integration av data från flera experimentella förhållanden eller modeller och den enorma fördelen när det gäller kostnad och begränsande batcheffekter. Att använda MULTI-seq erbjuder ett laboratorium utan motstycke fenotypningsdjup. Icke-genetiska multiplexeringsmetoder som cellhashing eller kärnhashing öppnade dörren för multiplexerade prover genom användning av streckkodade antikroppar 7,19,20. Detta beror emellertid på tillgängligheten av antikroppar med hög affinitet som känner igen ytproteiner uttryckta på celler eller deras kärnor, vilket inte kommer att vara möjligt om dessa antikroppar inte är tillgängliga eller cellerna inte uttrycker lämplig cellyta eller nukleära antigener7. Eftersom MULTI-seq använder lipidmodifierade oligo-streckkoder för att stabilt införliva i cellerna eller deras kärnor, gör det det möjligt för forskare att samla transkriptomiska data från upp till 96 färska eller fasta prover på ett billigare och mer allmänt tillämpligt sätt6.

Uppföljning av den initiala MULTI-Seq-fenotypningen med parade scRNA-Seq och scATAC-Seq föreslås och visas upp för att få en förståelse för den genomiska organisationen som sammanfaller med transkriptomiska data1. Detta ger inte bara en uppfattning om heterokromatin- och eukromatinregionerna utan också värdefull förståelse för transkriptionsfaktornätverken som driver genuttryck. Ett multi-omiskt tillvägagångssätt kan användas för att avslöja de dynamiska kromatinförändringarna som äger rum vid viktiga punkter i cell ödesbeslut och bestämma cellulära banor i utveckling och sjukdom 1,21,22. Detta kan åstadkommas genom att bioinformatiskt utsätta data för pseudotid, cis-regulatoriska interaktioner och fotavtrycksanalys 5,23,24,25. Om du åtgärdar exemplen och sekvenserar flera i en multiplexerad körning minskar källorna till batcheffekt, vilket möjliggör jämförelse mellan prover, till exempel genom ett tidskursexperiment. Antalet vävnadsprover som krävs beror på experimentets omfattning. När man undersöker fenotyperna associerade med embryonala tidpunkter är enstaka näthinnor ofta tillräckliga och kan ge hundratusentals celler. En enda näthinna kanske inte ger tillräckligt med celler i mer komplexa experimentella system: ex vivo-elektroporationer av retinala explantat, sondering för sällsynta cellpopulationer eller genetiska modeller med otillräcklig CRE-aktivering. Medan en enda näthinna kan ge några hundra celler, kommer dessa inte att fånga hela vävnadskomplexiteten. För sådana experiment krävs optimering baserat på en forskares behov. Genom att använda dessa tekniker kan man få insikt i hur generna som analyseras i MULTI-seq regleras under dynamiska processer som utveckling och sjukdom.

Reglering av genreglerande nätverk ligger i hjärtat av att förstå cellulära processer och hur de bidrar till utveckling och sjukdom 1,26,27. Arbetsflödet som presenteras här kan användas för att identifiera dessa genreglerande nätverk i specifika celltyper. Detta protokoll har dock optimerats för användning med näthinnevävnad från musen. Optimering av olika steg, såsom lys- eller dissociationstid, centrifugeringshastigheter / tider och antal filtreringssteg kan krävas för att maximera antalet celler eller kärnor och minimera cellskräpet i cellsuspensioner från andra vävnadstyper, ex vivo-prover eller arter, oavsett om proverna är färska, frysta eller fixerade i metanol. Metanolfixeringstiden kan behöva ökas om prover visar höga halter av livskraftiga celler med trypanblå färgning. MULTI-seq-tekniken introducerar många ytterligare tvättsteg jämfört med traditionell scRNA-seq. För att undvika oavsiktligt bortskaffande av värdefulla celler eller DNA är det klokt att optimera centrifugeringshastigheter och behålla supernatanter som normalt skulle kasseras i cellfältkodningen, post-GEM RT-rengöring och konstruktionssteg för streckkodsbibliotek på is tills det steget har verifierats för att lyckas. En begränsning för MULTI-seq är det begränsade antalet celler, och därmed prover, som kan sekvenseras från en enda brunn i GEM-generationssteget. Det rekommenderas att inte försöka överbelasta celler för mycket under detta steg för att undvika en betydande ökning av dublettcellfångst. Undvik att ladda en GEM-brunn med mer än 20 000 celler. Snarare kan flera brunnar framställas från en enda kombinerad suspension och multiplexeras under sekvensering. Detta kommer att kräva att man förbereder en tillräckligt stor volym cellsuspension för GEM-generering och tillägg av replikat till steg 5, 6 och 7 och kommer att öka kostnaden för sekvensering eftersom fler totala läsningar behövs för fler celler. Med korrekt optimering kommer detta arbetsflöde att möjliggöra kostnads- och tidseffektiv identifiering av celltypspecifika fenotyper och genreglerande nätverk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Linda Orzolek från Johns Hopkins Transcriptomics och Deep Sequencing Core för hjälp med att sekvensera de producerade biblioteken och Lizhi Jiang för att utföra ex vivo retinal explantat.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette filter tips
10% Tween 20 Bio-Rad 1662404
100 µM Barcode Solution Request from Gartner lab https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested
=true
100% Ethanol Millipore Sigma E7023-500ML
100% Methanol Millipore Sigma 322415-100ML
10x Chip Holder 10x Genomics 1000195
10x Chromium controller & Accessory Kit 10x Genomics PN-120263
15mL Centrifuge Tube Quality Biological P886-229411
40 µm FlowMi Cell Strainer Bel-Art H13680-0040
50 µM Anchor Solution Sigma or request from Gartner lab https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested
=true
50 µM Co-Anchor Solution Sigma or request from Gartner lab https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested
=true
5200 Fragment Analyzer system Agilent M5310AA
70 um FlowMi cell strainer Bel-Art H13680-0070
Allegra X-12R Centrifuge VWR BK392302
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9647
Chromium Next GEM Chip G 10x Genomics PN-1000120
Chromium Next GEM Chip H 10x Genomics PN-1000161
Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.1 10x Genomics PN-1000175
Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1 10x Genomics PN-1000121
Digitonin Fisher Scientific BN2006
Dissection microscope Leica
DNA LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 22431021
Dry Ice
EVA Foam Ice Pan Tequipment 04393-54
FA 12-Capillary Array Short, 33 cm Agilent A2300-1250-3355
Fisherbrand Isotemp Water Bath Fisher Scientific 15-460-20Q
Forma CO2 Water Jacketed Incubator ThermoFisher Scientific 3110
Glycerol 50% Aqueous solution Ricca Chemical Company 3290-32
Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber Fisher Scientific 02-671-51B
Illumina NextSeq or NovaSeq Illumina
Kapa Hifi Hotstart ReadyMix HiFi 7958927001
Low TE Buffer Quality Biological 351-324-721
Magnesium Chloride Solution 1 M Sigma-Aldrich M1028
Magnetic Separator Rack for 1.5 mL tubes Millipore Sigma 20-400
Magnetic Separator Rack for 200 µL tubes 10x Genomics NC1469069
MULTI-seq Primer Sigma or IDT See sequence list
MyFuge Mini Centrifuge Benchmark Scientific C1008
Nonidet P40 Substitute Sigma-Aldrich 74385
Nuclease-free water Fisher Scientific AM9937
P2, P10, P20, P200, P1000 micropipettes Eppendorf
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation LK003150
PBS pH 7.4 (1X) Fisher Scientific 10010-023
Qiagen Buffer EB Qiagen 19086
Refridgerated Centrifuge 5424 R Eppendorf 2231000655
RNase-free Disposable Pellet Pestles Fisher Scientific 12-141-368
RNasin Plus RNase Inhibitor Promega N2615
RPI primer Sigma or IDT See sequence list
Single Index Kit N, Set A 10x Genomics PN-1000212
Single Index Kit T Set A 10x Genomics PN-1000213
Sodium Chloride Solution 5 M Sigma-Aldrich 59222C
SPRIselect Reagent Kit Beckman Coulter B23318
Standard Disposable Transfer Pipettes Fisher Scientific 13-711-7M
TempAssure PCR 8-tube strip USA Scientific 1402-4700
Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.4 Sigma-Aldrich T2194
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) Corning 25-900-CI
Universal I5 primer Sigma or IDT See sequence list
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems 4375786
Vortex Mixer VWR 10153-838

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370, (2020).
  2. Nagalakshmi, U., et al. The Transcriptional Landscape of the Yeast Genome Defined by RNA Sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
  3. Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
  4. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50, 96 (2018).
  5. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36, 411-420 (2018).
  6. McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 16, 619-626 (2019).
  7. Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19, 224 (2018).
  8. Chen, X., Miragaia, R. J., Natarajan, K. N., Teichmann, S. A. A rapid and robust method for single cell chromatin accessibility profiling. Nature Communications. 9, 5345 (2018).
  9. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. , 8598 (2020).
  10. Clark, B. S., et al. Single-Cell RNA-Seq Analysis of Retinal Development Identifies NFI Factors as Regulating Mitotic Exit and Late-Born Cell Specification. Neuron. 102, 1111-1126 (2019).
  11. Zheng, Y., et al. A human circulating immune cell landscape in aging and COVID-19. Protein Cell. 11, 740-770 (2020).
  12. Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37, 925-936 (2019).
  13. Worthington Biochemical Corporation. Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , (2020).
  14. 10x Genomics. Chromium Single Cell 3' Reagent Kits v3 User Guide. , (2020).
  15. Agilent. DNF-468 HS Genomic DNA 50 kb Kit Quick Guide for Fragment Analyzer Systems. , (2015).
  16. ThermoFisher Scientific. Qubit dsDNA HS Assay Kits. ThermoFisher Scientific. , (2015).
  17. 10x Genomics. Chromium Single Cell ATAC Reagent Kits User Guide (v1.1 Chemistry). , (2020).
  18. Weir, K., Kim, D. W., Blackshaw, S. Regulation of retinal neurogenesis by somatostatin signaling. bioRxiv. , (2020).
  19. Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14, 865-868 (2017).
  20. Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10, 2907 (2019).
  21. Ma, S., et al. Chromatin Potential Identified by Shared Single-Cell Profiling of RNA and Chromatin. Cell. , (2020).
  22. Buenrostro, J. D., et al. Integrated Single-Cell Analysis Maps the Continuous Regulatory Landscape of Human Hematopoietic Differentiation. Cell. 173, 1535-1548 (2018).
  23. Pliner, H. A., et al. Cicero Predicts cis-Regulatory DNA Interactions from Single-Cell Chromatin Accessibility Data. Molecular Cell. 71, 858-871 (2018).
  24. Granja, J. M., et al. ArchR: An integrative and scalable software package for single-cell chromatin accessibility analysis. BioRxiv. , (2020).
  25. Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177, 1888-1902 (2019).
  26. METABRIC Group. The genomic and transcriptomic architecture of 2,000 breast tumours reveals novel subgroups. Nature. 486, 346-352 (2012).
  27. Izadi, F. Differential Connectivity in Colorectal Cancer Gene Expression Network. Iranian Biomedical Journal. 23, 34-46 (2019).

Tags

Neurovetenskap Utgåva 169 Utveckling Sjukdom scRNA-Seq scATAC-Seq MULTI-Seq multiplex Kromatin
Multiplexerad analys av retinal genuttryck och kromatintillgänglighet med hjälp av scRNA-Seq och scATAC-Seq
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weir, K., Leavey, P., Santiago, C.,… More

Weir, K., Leavey, P., Santiago, C., Blackshaw, S. Multiplexed Analysis of Retinal Gene Expression and Chromatin Accessibility Using scRNA-Seq and scATAC-Seq. J. Vis. Exp. (169), e62239, doi:10.3791/62239 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter