Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Мультиплексированный анализ экспрессии генов сетчатки и доступности хроматина с использованием scRNA-Seq и scATAC-Seq

Published: March 12, 2021 doi: 10.3791/62239
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2,3,4,5,6
1Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Psychiatry and Behavioral Science, The Johns Hopkins Hospital, 3Department of Ophthalmology, The Johns Hopkins Hospital, 4Department of Neurology, The Johns Hopkins Hospital, 5Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Kavli Neuroscience Discovery Institute, Johns Hopkins University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Здесь авторы демонстрируют полезность MULTI-seq для фенотипирования и последующих пар scRNA-seq и scATAC-seq в характеристике профилей доступности транскриптома и хроматина в сетчатке.

Abstract

Мощные методы секвенирования следующего поколения предлагают надежный и всесторонний анализ для изучения того, как регуляторные сети генов сетчатки функционируют во время развития и в болезненных состояниях. Секвенирование одноклеточной РНК позволяет всесторонне профилировать изменения экспрессии генов, наблюдаемые при развитии и заболевании сетчатки на клеточном уровне, в то время как одноклеточный ATAC-Seq позволяет профилировать анализ доступности хроматина и связывания фактора транскрипции с аналогичным разрешением. Здесь описывается использование этих методов в развивающейся сетчатке и демонстрируется MULTI-Seq, где отдельные образцы маркируются модифицированным олигонуклеотид-липидным комплексом, что позволяет исследователям как увеличить объем отдельных экспериментов, так и существенно снизить затраты.

Introduction

Понимание того, как гены могут влиять на судьбу клеток, играет ключевую роль в опросе таких процессов, как болезнь и эмбриональное прогрессирование. Сложные взаимосвязи между факторами транскрипции и их генами-мишенями могут быть сгруппированы в генные регуляторные сети. Растущие доказательства помещают эти генные регуляторные сети в центр как болезни, так и развития в эволюционных линиях1. В то время как предыдущие методы, такие как qRT-PCR, были сосредоточены на одном гене или наборе генов, применение технологии высокопроизводительного секвенирования позволяет профилировать полные клеточные транскриптомы.

RNA-seq предлагает взглянуть на крупномасштабную транскриптомику 2,3. Секвенирование одноклеточной РНК (scRNA-seq) дает исследователям возможность не только профилировать транскриптомы, но и связывать конкретные типы клеток с профилями экспрессии генов4. Это достигается биоинформатически путем подачи отдельных профилей клеток в алгоритмы сортировки с использованием известных генных маркеров5. Мультиплексирование с использованием секвенирования индексов с липидными метками (MULTI-seq) предлагает беспрецедентное разнообразие в количестве профилей scRNA-Seq, которые могут быть собраны6. Этот метод на основе липидов отличается от других методов индексации образцов, таких как хеширование клеток, которые полагаются на присутствие поверхностных антигенов и антител с высоким сродством вместо интеграции плазматической мембраны7. Мало того, что теперь можно профилировать профили экспрессии генов по типам клеток, но различные эксперименты могут быть объединены в единую библиотеку секвенирования, что значительно снижает стоимость отдельного эксперимента scRNA-seq6. Стоимость scRNA-seq может показаться непомерно высокой для использования в экспериментах по фенотипированию, где анализируется множество различных генотипов, состояний или образцов пациентов, но мультиплексирование позволяет комбинировать до 96 образцов в одной библиотеке6.

Профилирование экспрессии генов с помощью scRNA-seq было не единственным высокопроизводительным методом секвенирования, который произвел революцию в современном понимании того, как молекулярные механизмы диктуют судьбу клеток. Хотя понимание того, какие транскрипты генов присутствуют в клетке, позволяет идентифицировать тип клетки, не менее важным является понимание того, как геномная организация регулирует развитие и прогрессирование заболевания. Ранние исследования основывались на обнаружении Опосредованного ДНКазой расщепления последовательностей, не связанных с гистонами, с последующим секвенированием полученных фрагментов ДНК для идентификации областей открытого хроматина. Напротив, одноклеточный анализ для транспозонного доступного секвенирования хроматина (scATAC-seq) позволяет исследователям исследовать ДНК с помощью одомашненного транспозона, чтобы легко профилировать открытый хроматин на уровне одного нуклеотида8. Это прошло через масштабирование, аналогичное scRNA-seq, и теперь исследователи могут идентифицировать отдельные типы клеток и фенотипы профиля в тысячах отдельных геномов8.

Сочетание scRNA-seq и scATAC-seq позволило исследователям профилировать тысячи клеток для определения клеточных популяций, геномной организации и регуляторных сетей генов в моделях заболеваний и процессах развития 9,10,11,12. Здесь авторы описывают, как сначала использовать MULTI-seq для конденсации фенотипирования множества животных моделей и использовать парные scRNA-seq и scATAC-seq, чтобы лучше понять ландшафт хроматина и регуляторные сети в этих животных моделях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Использование животных для этих исследований проводилось с использованием протоколов, одобренных Комитетом по уходу и использованию животных Джона Хопкинса, в соответствии с руководящими принципами ARRIVE, и выполнялось в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами.

1. МУЛЬТИ-сек

  1. Подготовка СМИ
    1. Приготовьте и уравновешивайте овомукуоидный ингибитор, 10 мг овомукуоидного ингибитора и 10 мг альбумина на мл сбалансированного солевого раствора Эрла (ЭБСС), в течение 30 мин перед применением13. Уравновешивайте 95% O2:5% CO2 в инкубаторе.
      1. Приготовьте раствор для диссоциации папаина, 20 единиц / мл папаина и 0,005% ДНКазы в ЭБСС, во время этой инкубационной стадии13.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Одного флакона раствора ДНКазы будет достаточно для 5 образцов. Дополнительные флаконы, возможно, потребуется восстановить при выполнении MULTI-seq на более чем 5 образцах.
    2. Готовят липидно-модифицированные олигобаркодирующие растворы.
      1. Сделайте уникальное разбавление штрих-кода для каждого образца, объединив 0,5 мкл раствора штрих-кода 100 мкМ с 4,5 мкл фосфатного буферизованного физиологического раствора (PBS).
      2. Чтобы приготовить раствор якоря: штрих-кода в молярном соотношении 1:1, смешайте 4,4 мкл разбавления штрих-кода 10 мкМ, 0,9 мкл анкерного раствора 50 мкМ и 16,7 мкл PBS и поместите на лед. Конечная концентрация как для нитей штрих-кода, так и для анкерных нитей должна составлять 2 мкМ.
      3. Для приготовления коякорного раствора смешайте 0,88 мкл 50 мкМ коякорного раствора и 21,12 мкл ПБС и поместите на лед. Конечная концентрация коякоря должна составлять 2 мкМ. Умножьте объемы на этом этапе на 1,1 раза больше количества образцов.
    3. Чтобы получить 1% BSA в PBS, растворите 0,1 г бычьего сывороточного альбумина (BSA) в 10 мл PBS и поместите на лед.
    4. Чтобы получить PBS с ингибитором РНКазы, соедините 2,5 мкл ингибитора РНКазы 40 Ед/мкл с 197,5 мкл PBS и храните на льду. Умножьте объемы на этом шаге в 1,1 раза больше количества образцов.
  2. Диссоциация образцов
    1. Эвтаназия животных через вывих шейки матки и/или асфиксиюCO2 в соответствии с институциональными требованиями IACUC. Метод эвтаназии будет зависеть от институциональных требований и используемой модели организма.
    2. Рассечение сетчатки от обоих глаз в холодном PBS под рассеченным микроскопом и перенос в стерильную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл с помощью трансферной пипетки.
    3. Перенесите 500 мкл раствора папаина в пробирку объемом 1,5 мл для каждого образца.
    4. Поместите образцы в раствор папаина и сразу же закройте пробирки.
    5. Инкубируют пробирки, содержащие образцы при 37 °C, 5% CO2 в течение 30 мин. Переворачивайте флаконы 3 раза каждые 10 минут. Выборки должны постепенно диссоциировать с каждым раундом инверсий.
    6. Верните флаконы до комнатной температуры и тритурируйте каждый образец 3-4 раза с помощью пипетки 1 мл, установленной на 300 мкл.
    7. Дайте любым кусочкам нерасслоенной ткани, оставшимся после тритурации, осесть.
    8. Удалите мутную клеточную суспензию, избегая при этом любых кусочков недиссоциированной ткани, и поместите клеточную суспензию каждого образца в новую стерильную трубку с винтовой крышкой 15 мл.
    9. Центрифугируют клеточные суспензии при 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    10. На этапе центрифугирования подготовьте клеточную ресуспенсионную среду.
      1. Смешайте 857 мкл ЭБСС (флакон 1) с 95 мкл восстановленного раствора альбумин-овомукуоидного ингибитора в стерильной трубке с винтовой крышкой 1,5 мл. Добавьте 48 мкл раствора ДНКазы, сэкономленного из 1.1.1. Умножьте объемы на этом шаге в 1,1 раза больше количества образцов.
    11. Выбросьте супернатант, осторожно сохранив клеточные гранулы, и немедленно повторно суспендируйте гранулы клеток в 1 мл клеточного раствора для повторного суспензии, приготовленного на стадии 1.2.10.
    12. Подготовьте прерывистый градиент плотности.
      1. Для каждого образца добавляют 1,6 мл раствора овомукуоидного ингибитора в новую 15 мл стерильную завинчивающуюся трубку и аккуратно накладывают клеточную суспензию сверху. Интерфейс между двумя слоями градиента должен быть видимым, но некоторое смешивание не влияет на результаты.
    13. Центрифугируйте прерывистые градиенты плотности при 70 х г в течение 6 мин при комнатной температуре. Диссоциированные клетки должны гранулироваться в нижней части трубок, в то время как фрагменты мембраны остаются на границе раздела.
    14. Выбросьте супернатант и добавьте 200 мкл PBS для промывки гранулированных клеток. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    15. Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте клетки в 180 мкл PBS с ингибитором РНКазы. Пропустите клетки через клеточный сетчатый фильтр 40 мкм в стерильную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
  3. Штрих-кодирование ячеек
    1. Добавьте 20 мкл раствора якоря: штрих-кода к каждому образцу и аккуратно перемешайте. Убедитесь, что каждый образец получает уникальный раствор якоря: штрих-кода и инкубируйте на льду в течение 5 минут.
      1. Подготовьте материалы, необходимые для генерации гелевой бусины в эмульсии (GEM) и штрих-кодирования во время этой инкубации14.
    2. Добавьте 20 мкл ко-анкерного раствора к каждому образцу и аккуратно перемешайте. Инкубировать на льду в течение 5 мин.
    3. Добавьте 1 мл ледяного 1% BSA в PBS к каждому образцу и центрифугируйте ячейки при 300 х г в течение 5 мин при 4 °C.
    4. Удалите супернатант, не нарушая клеточную гранулу, и добавьте 400 мкл ледяного холода 1% BSA в PBS. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин при 4 °C.
      1. Повторите шаг 1.3.4 в общей сложности 2 промывки. Удалить супернатант и повторно суспендировать в 400 мкл ледяного холода 1% BSA в PBS.
    5. Определите концентрацию клеток для каждого образца с помощью гемоцитометра.
      1. Определите общее количество ячеек для загрузки для каждого образца. Как правило, это общее количество желаемых клеток, деленное на количество образцов. Однако, если биологическая реплика для одного состояния была потеряна, ее доля может быть разделена между другими биологическими репликациями из этого состояния.
      2. Разделите число ячеек, необходимое для каждого образца, на концентрацию клеток этого образца, рассчитанную на этапе 3.5, чтобы определить объем, необходимый для загрузки желаемого количества ячеек.
    6. Объедините объемы, рассчитанные на этапе 3.5.2 из каждого образца, в новую стерильную центрифужную трубку объемом 1,5 мл. Разумно удвоить объем, взятый из каждого образца, в случае сбоя генерации GEM.
      1. Определите «конечную» концентрацию клеток комбинированных образцов с помощью гемоцитометра.
  4. Генерация GEM и штрих-кодирование
    1. Используйте комбинированные образцы для генерации и штрих-кода GEMs14.
  5. Очистка после GEM-RT и усиление кДНК
    1. Подготовить материалы для очистки обратной транскриптазы после GEM и усиления кДНК в соответствии с инструкциями производителя со следующими модификациями14. Выполните очистку после GEM-RT по выбору размера14.
      1. Увеличить объем 80% этанола, приготовленного на 2 мл.
      2. Приготовьте смесь для усиления кДНК на льду14. Добавьте 1 мкл праймера MULTI-seq 2,5 мкМ в смесь усиления кДНК. Вихрь на 5 с и центрифуга на 5 с в настольной мини-центрифуге.
    2. Выполняют усиление кДНК14. КДНК может храниться при 4 °C в течение 72 ч в этот момент.
    3. Выполните очистку кДНК по выбору размера14. Эндогенная транскриптная кДНК может храниться при 4 °C в течение 72 ч или при -20 °C в течение до 4 недель на этом этапе.
      1. Не отбрасывайте супернатант из первого раунда выбора размера. Эта фракция содержит образцы штрих-кодов. Перенесите супернатант в новую стерильную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
      2. Храните супернатант на льду.
    4. Вихрь для повторного суспендирования реагента для выбора размера на основе парамагнитных шариков и добавления 260 мкл парамагнитного реагента для выбора размера на основе шариков (конечный 3,2x) и 180 мкл 100% изопропанола (1,8x) к супернатанту. Пипетку перемешать 10 раз и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин.
    5. Поместите трубку на магнитную стойку и дождитесь очистки раствора. Затем удалите и выбросьте супернатант.
    6. Добавьте в шарики 500 мкл 80% этанола и оставьте настояться 30 с. Удалите и выбросьте супернатант.
      1. Повторите в общей сложности 2 стирки.
    7. Кратковременно центрифугируйте бусины и вернитесь в магнитную стойку. Запустите таймер на 2 мин.
    8. Удалите оставшийся этанол пипеткой P10 и высушите шарики на воздухе на магнитной стойке в течение оставшейся части 2 мин. Не более 2 мин.
    9. Извлеките шарики из магнитной стойки и повторно суспендируйте в буфер элюирования 100 мкл (EB). Пипетку тщательно использовать повторно.
    10. Инкубировать при комнатной температуре в течение 2 мин.
    11. Вернитесь в магнитную стойку и дождитесь очистки раствора.
    12. Перенесите супернатант в свежую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
    13. Повторите шаги с 1.5.4 по 1.5.12. Вдвое уменьшить объем буфера EB, используемого на шаге 1.5.9.
    14. Определение концентрации и распределения ДНК штрих-кода с помощью высокочувствительного набора для анализа dsDNA и флуорометра и анализатора фрагментов15,16. Штрих-код кДНК может храниться при 4 °C в течение 72 ч или при -20 °C в течение 4 недель на этом этапе.
  6. Построение библиотеки штрих-кодов
    1. Готовят 1 мл 80% этанола.
    2. Подготовьте мастер-смесь ПЦР-матрицы библиотеки штрих-кодов в стерильной ленточной трубке ПЦР: объедините 26,25 мкл готовой смеси для ПЦР горячего запуска, 2,5 мкл универсальной грунтовки i5 10 мкМ, 2,5 мкл праймера RPI 10 мкМ, 3,5 нг кДНК штрих-кода (объем, определяемый концентрацией из Шага 5,14) и достаточное количество воды без нуклеазы, чтобы довести конечный объем до 50 мкл.
      1. Используйте уникальный букварь RPI для каждой библиотеки штрих-кодов, если несколько библиотек MULTI-seq секвенированы вместе.
    3. Подвергите мастер-микс библиотеки штрих-кодов библиотеке подготовки ПЦР: 95 °C в течение 5 мин; 10 циклов при 98 °C в течение 15 с, 60 °C в течение 30 с, 72 °C в течение 30 с; 72 °C в течение 1 мин; а затем удерживать при температуре 4 °C.
    4. Вихрь для повторного суспендирования парамагнитного реагента для подбора размера на основе шариков.
    5. Извлеките продукт ПЦР из термоциклера и добавьте 80 мкл (1,6x) реагента для подбора размера на основе парамагнитных шариков. Пипетка основательно.
    6. Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин. Поместите на магнитный сепаратор в высокое положение и дождитесь очистки раствора.
    7. Удалите и выбросьте супернатант.
    8. Добавьте в шарики 200 мкл 80% этанола и дайте постоять 30 с. Удалите и выбросьте супернатант.
      1. Повторите шаг 1.6.8, чтобы выполнить в общей сложности 2 промывки.
    9. Кратковременно центрифугируют трубку и размещают на магнитном сепараторе в низком положении. Запустите таймер на 2 мин.
    10. Удалить оставшийся этанол пипеткой P20 и высушить шарики на воздухе на магнитном сепараторе в течение оставшейся части 2 мин. Не более 2 мин.
    11. Извлеките трубку из магнитного сепаратора и повторно суспендируйте шарики в 25 мкл буфера EB. Пипетку тщательно перемешать, чтобы повторно суспендировать бусины.
    12. Инкубировать в течение 2 мин при комнатной температуре.
    13. Вернитесь к магнитному сепаратору в низком положении и дождитесь очистки раствора. Перенесите супернатант в новую трубку для полосы ПЦР.
    14. Количественная оценка концентрации библиотеки выражений и библиотеки штрихкодов и распределения фрагментов по размерам с помощью высокочувствительного набора для анализа adsDNA и флуорометра и анализатора фрагментов.
  7. 3' Построение библиотеки экспрессии генов
    1. Выполните построение библиотеки экспрессии генов 3' в соответствии с инструкциямипроизводителя 14.
  8. Секвенирование
    1. В дополнение к эндогенной библиотеке кДНК, усиленной на шаге 7, представьте библиотеку штрих-кодов, усиленную на шаге 6. Для простоты представить эти библиотеки по отдельности или в качестве экономически эффективной меры включить аликвоту образца штрихкодирующего материала с эндогенной библиотекой кДНК. Целевой показатель между 20 000-50 000 кДНК и 3000-5000 штрих-кодов на ячейку.
    2. Преобразуйте результирующую последовательность bcl-файлов в файлы fastq с помощью cellranger mkfastq и матрицы подсчета, сгенерированные из них по счетчику cellranger.
    3. Деконволюционные образцы после анализа Cellranger с использованием пакета deMULTIplex r, доступного в репозитории MULTI-seq GitHub (https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/MULTI-seq).

2. Парные scRNA-seq и scATAC-seq

  1. Флэш-замораживание ткани для scATAC-seq и фиксации метанола клеток сетчатки для scRNA-seq
    1. Подготовка СМИ
      1. Чтобы подготовить растворы для диссоциации сетчатки, повторите шаги 1.1.1 и 1.1.4.
      2. Приготовьте ванну с этанолом для сухого льда в небольшом ведре со льдом.
      3. Приготовьте 15 мл 70% этанола, добавив 10,5 мл этанола в 4,5 мл воды без нуклеазы.
      4. Добавьте достаточно сухого льда в ведро со льдом (желательно в форме гранул), чтобы 15 мл жидкости поднялись, чтобы просто покрыть лед. Добавьте 15 мл этанола.
      5. Поместите PBS на лед и 1 мл аликвоты 100% метанола в удобную морозильную камеру -20 °C.
    2. Пробоподготовка
      1. Выполните шаги 1.2.1 и 1.2.2 для изоляции сетчатки; однако на этот раз поместите каждую сетчатку в отдельную микроцентрифужную трубку.
      2. Для образцов, предназначенных для scATAC-seq, удалите любую жидкость из микроцентрифужной трубки с помощью пипетки P200 и немедленно поместите трубку в ванну с этанолом и сухим льдом, чтобы мгновенно заморозить образец.
      3. Для образцов, предназначенных для scRNA-seq, чтобы диссоциировать клетки, повторите шаги с 1.2.3 по 1.2.15 на рассеченной сетчатке.
      4. Центрифугируйте ячейки при 300 х г в течение 3 мин при комнатной температуре.
      5. Удалите супернатант, не нарушая клеточную гранулу.
      6. Добавьте 1 мл охлажденного PBS и аккуратно перемешайте 10 раз или до тех пор, пока клетки полностью не станут суспендированными.
      7. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин при 4 °C.
        1. Повторите шаги 2.1.2.5-2.1.2.7 в общей сложности 2 промывки.
      8. Удалите супернатант, не нарушая клеточную гранулу.
      9. Добавьте 100 мкл охлажденного PBS и осторожно перемешайте 10x или до тех пор, пока клетки не будут полностью суспендированы.
      10. Начните вихрь трубки на самой низкой скорости. Добавьте 900 мкл охлажденного метанола (-20 °C) капля за каплей, продолжая осторожно вихрять трубку, чтобы предотвратить слипание клеток.
      11. Инкубировать клетки на льду в течение 15 мин.
      12. Определить концентрацию фиксированных клеток можно с помощью гемоцитометра.
      13. Оцените эффективность стадии фиксации с помощью трипан синего цвета. Высокая доля жизнеспособных клеток указывает на то, что требуется больше времени фиксации.
      14. Храните замороженную ткань и фиксированные клетки при -80 °C.
  2. Выделение ядер из замороженной ткани для scATAC-seq
    1. Подготовка СМИ
      1. Подготовьте буфер разбавления лизиса, объединив 9,77 мл воды без нуклеазы, 100 мкл 1 M Tris-HCl (рН 7,4), 100 мкл 1 M NaCl, 30 мкл 1 MMgCl2 и 0,1 г BSA.
      2. Подготовьте буфер разбавления лизиса заранее, например, накануне, и храните при температуре 4 °C. В день составления протокола поместите на лед.
      3. Уравновешивание 20x буфера ядер, предусмотренного производителем комплекта scATAC, от -20 °C до комнатной температуры. Вихрь и центрифуга ненадолго.
      4. Подготовьте 1x буфер лизиса, инкубируя 5% раствор дигитонина на водяной бане с температурой 65 °C до растворения осадка. Затем смешайте 2 мл буфера разбавления лизиса, 20 мкл 10% Tween-20, 20 мкл заменителя Nonidet P40 (может быть альтернативно маркирован IGEPAL) и 4 мкл Digitonin.
      5. Храните 1x буфер лизиса на льду.
      6. Чтобы приготовить буфер лизиса 0,1x, соедините 1,8 мл буфера разбавления лизиса с 200 мкл буфера лизиса 1x и храните на льду.
      7. Чтобы подготовить промывочный буфер, соедините 2 мл буфера разбавления лизиса и 20 мкл 10% Tween-20 и храните на льду.
      8. Чтобы подготовить разбавленный буфер ядер, соедините 950 мкл воды без нуклеазы с 50 мкл буфера ядер (20x) и храните на льду.
    2. Выделение ядер
      1. Не размораживайте образец перед лизисом. Добавьте 500 мкл охлажденного 0,1-кратного лизисного буфера в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую замороженный образец. Немедленно гомогенизируйте 15x с помощью гранул пестика.
      2. Инкубировать в течение 5 мин на льду. Подготовьте материалы, необходимые для транспозиции scATAC на этом этапеинкубации 17.
      3. Пипетку смешать 10x с пипеткой 1 мл и инкубировать в течение 10 мин на льду. Полная подготовка материалов, необходимых для транспозиции scATAC на этом этапе инкубации, если она еще не завершена. Нет необходимости готовить больше разбавленного буфера ядер.
      4. Добавьте 500 мкл охлажденного промывочного буфера в лизированные ячейки. Пипетка микс 5x.
      5. Пропустите суспензию через клеточный сетчатый фильтр 70 мкм в новую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Фильтруйте ~ 300 мкл за раз, используя новый 70-мкм клеточный сетчатый фильтр каждый раз.
      6. Пропустите собранный поток через клеточный сетчатый фильтр 40 мкм в новую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл и храните на льду.
      7. Определить концентрацию ядер с помощью гемоцитометра. Исходя из концентрации ядер и общего объема клеточной суспензии, рассчитывают общее количество диссоциированных ядер.
      8. Центрифугу при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C и удаляют супернатант, не разрушая гранулы ядер.
      9. Чтобы создать запас ядер на основе общего количества ядер, определенного на шаге 2.2.2.7., повторно суспендируйте ядра в достаточно разбавленном буфере ядер для достижения желаемой концентрации ядер.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Желаемая концентрация ядер основана на целевом восстановлении ядер для эксперимента scATAC-seq и определяется из Руководства по концентрации ядер, содержащегося в протоколе17 производителя. Например, если в конечном итоге желательно 10 000 ядер, желаемая концентрация ядер для nuclei Stock составляет от 3 080 до 7 700 ядер/мкл. Возможно, лучше всего стремиться к середине диапазона концентрации.
      10. Определить концентрацию ядер с помощью гемоцитометра.
      11. Немедленно приступают к транспозиции scATAC с использованием подготовленного запаса ядер17.
  3. Регидратация фиксированных клеток метанола для использования в scRNA-Seq
    1. Подготовка СМИ
      1. Для приготовления буфера для промывки/разбавления растворите 0,01 г BSA в 1 мл PBS. Затем добавляют 12,5 мкл ингибитора РНКАЗЫ 40 Ед/мкл и осторожно перемешивают. Хранить на льду.
    2. Регидратация клеток
      1. Центрифуга метанола фиксирует ячейки в микроцентрифужной трубке 1,5 мл при 3000 х г в течение 10 мин при 4 °C. Затем удалите супернатант.
      2. Добавьте 200 мкл охлажденного буфера промывки/разбавления в микроцентрифужную трубку. Центрифугу при 300 х г в течение 10 мин при 4 °C и удаляют супернатант. Повторите в общей сложности 2 стирки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте материалы, необходимые для генерации GEM и штрих-кодирования в течение предыдущих двух шагов14.
      3. Чтобы подготовить клеточный запас, основываясь на общем количестве клеток, рассчитанном в 2.1.2.12., повторно суспендируйте ячейки в достаточном буфере промывки/разбавления для достижения желаемой концентрации клеток. Предпочтительные клеточные концентрации составляют от 700 до 1200 клеток/мкл.
      4. Определить клеточную концентрацию клеточного запаса можно с помощью гемоцитометра.
      5. Немедленно приступайте к генерации GEM и штрих-кодированию с использованием клеточного запаса14.
    3. Секвенирование
      1. При выполнении анализа временного курса (например, при развитии или заболевании) последовательность нескольких образцов в мультиплексированном запуске (т. Е. Несколько библиотек на одной проточной ячейке), чтобы сократить технические вариации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Этот рабочий процесс излагает стратегию исследования фенотипов развития и регуляторных процессов с использованием секвенирования одиночных клеток. Мультиплексирование образцов MULTI-seq позволяет проводить первоначальный недорогой анализ фенотипирования, в то время как парный сбор и фиксация образцов для scRNA-seq и scATAC-seq позволяет проводить более углубленное исследование (рисунок 1).

Штрих-кодирование MULTI-seq обеспечивает комбинированное секвенирование нескольких образцов и их последующую вычислительную деконволюцию. Образец происхождения может быть определен для каждой ячейки на основе их экспрессии штрих-кода (рисунок 2A). Эти объединенные образцы могут быть проанализированы как единый набор данных для целей кластеризации клеток и идентификации типов клеток (рисунок 2B). Поскольку каждая ячейка штрих-кодируется до генерации GEM, дублеты клеток будут иметь высокую вероятность демонстрации экспрессии для нескольких штрих-кодов MULTI-seq, и поэтому большинство дублетов могут быть идентифицированы и удалены до кластеризации и идентификации типа ячейки (рисунок 2C). Увеличение количества клеток, используемых на этапе генерации GEM, увеличит долю найденных дублетов. scATAC-seq можно использовать для генерации набора данных с типами клеток, соответствующими тем, которые найдены scRNA-seq (рисунок 2D). Сопряжение экспрессии гена scRNA-seq и информации о доступности ДНК scATAC-seq позволяет реконструировать регуляторные сети генов.

Figure 1
Рисунок 1: Схема, демонстрирующая использование MULTI-Seq в первоначальном анализе, за которым следует отдельный анализ scRNA-Seq и scATAC-Seq в углубленной характеристике фенотипов, методов лечения или болезненных состояний, представляющих интерес. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: UMAP-представления размерного редукции данных MULTI-seq для аллельной серии нокаутирующих мышей P0 Sstr2 , демонстрирующих (а) деконволюцию генотипа для каждой клетки в наборе данных и (б) идентификацию типов клеток в наборе данных. Перегрузка клеток на этапе генерации GEM и штрих-кодирования приведет к увеличению дублетов клеток, подобных тем, которые показаны в (c), который показывает данные из (a) и (b) до удаления дублета и рекластеризации. В (d) данные scATAC-Seq из GFP-положительных клеток, полученных при E16 из эксплантов сетчатки, электропорированных GFP-экспрессирующей контрольной плазмидой в E14. Типы клеток аннотируются на основе доступности генов, специфичных для типа клеток. Эта цифра была модифицирована из Weir, K., Kim, D. W., Blackshaw, S. Регуляция нейрогенеза сетчатки с помощью передачи сигналов соматостатина. bioRxiv 2020.09.26.314104 (2020) doi:10.1101/2020.09.26.31410418 и оригинальные, неопубликованные данные. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Сила MULTI-seq проистекает из бесшовной интеграции данных из нескольких экспериментальных условий или моделей и огромной выгоды с точки зрения стоимости и ограничения пакетных эффектов. Использование MULTI-seq обеспечивает лабораторную беспрецедентную глубину фенотипирования. Негенетические методы мультиплексирования, такие как хеширование клеток или хеширование ядер, открыли дверь к мультиплексированным образцам с использованием штрих-кодированных антител 7,19,20. Однако это зависит от наличия высокоаффинных антител, которые распознают поверхностные белки, экспрессируемые на клетках или их ядрах, что будет невозможно, если эти антитела недоступны или клетки не экспрессируют соответствующую клеточную поверхность или ядерные антигены7. Поскольку MULTI-seq использует липидно-модифицированные олиго штрих-коды для стабильного включения в клетки или их ядра, он позволяет исследователям собирать транскриптомные данные из 96 свежих или фиксированных образцов более дешевым и более широко применимым способом6.

Продолжение первоначального фенотипирования MULTI-Seq с парными scRNA-Seq и scATAC-Seq предложено и продемонстрировано для получения понимания геномной организации, которая совпадает с транскриптомными данными1. Это не только дает представление о гетерохроматиновых и эухроматиновых областях, но и ценное понимание сетей факторов транскрипции, определяющих экспрессию генов. Мультиомный подход может быть использован для выявления динамических изменений хроматина, которые происходят в ключевых точках принятия решений о судьбе клеток, и определения клеточных траекторий развития и заболевания 1,21,22. Это может быть достигнуто путем биоинформатической обработки данных псевдовременным, цис-регуляторным взаимодействиям и анализу 5,23,24,25. Фиксация образцов и секвенирование нескольких в мультиплексированном запуске сокращает источники пакетного эффекта, позволяя сравнивать образцы, например, в эксперименте с временным курсом. Количество необходимых образцов тканей зависит от объема эксперимента. При исследовании фенотипов, связанных с эмбриональными временными точками, одиночных сетчаток часто достаточно и они могут обеспечить сотни тысяч клеток. Одна сетчатка может не обеспечить достаточное количество клеток в более сложных экспериментальных схемах: электропорации ex vivo эксплантов сетчатки, зондирование редких клеточных популяций или генетические модели с недостаточной активацией CRE. В то время как одна сетчатка может обеспечить несколько сотен клеток, они не будут захватывать всю сложность тканей. Для таких экспериментов потребуется оптимизация исходя из потребностей исследователя. Используя эти методы, можно получить представление о том, как гены, проанализированные в MULTI-seq, регулируются во время динамических процессов, таких как развитие и болезнь.

Регуляция генных регуляторных сетей лежит в основе понимания клеточных процессов и того, как они способствуют развитию и заболеваниям 1,26,27. Рабочий процесс, представленный здесь, может быть использован для идентификации этих генных регуляторных сетей в конкретных типах клеток. Тем не менее, этот протокол был оптимизирован для использования с тканью сетчатки мыши. Оптимизация различных этапов, таких как время лизиса или диссоциации, скорость/время центрифугирования и количество стадий фильтрации, может потребоваться для максимизации количества клеток или ядер и минимизации клеточного мусора в клеточных суспензиях из других типов тканей, образцов ex vivo или видов, независимо от того, являются ли образцы свежими, замороженными или зафиксированными в метаноле. Время фиксации метанола, возможно, потребуется увеличить, если образцы показывают высокий уровень жизнеспособных клеток с окрашиванием трипана в синий цвет. Метод MULTI-seq вводит множество дополнительных шагов промывки по сравнению с традиционным scRNA-seq. Чтобы избежать случайного удаления ценных клеток или ДНК, разумно оптимизировать скорость центрифугирования и поддерживать супернатанты, которые обычно отбрасываются при штрих-кодировании клеток, очистке после GEM RT и этапах построения библиотеки штрих-кодов на льду до тех пор, пока этот шаг не будет проверен как успешный. Одним из ограничений MULTI-seq является ограниченное количество клеток и, следовательно, образцов, которые могут быть секвенированы из одной скважины на этапе генерации GEM. Рекомендуется не пытаться чрезмерно перегружать клетки во время этого этапа, чтобы избежать существенного увеличения захвата дублетных клеток. Избегайте загрузки gem-колодца с более чем 20 000 клеток. Скорее, несколько скважин могут быть подготовлены из одной комбинированной суспензии и мультиплексированы во время секвенирования. Это потребует подготовки достаточно большого объема клеточной суспензии для генерации GEM и добавления реплик к шагам 5, 6 и 7 и увеличит стоимость секвенирования, поскольку для большего количества ячеек потребуется больше общих считываний. При правильной оптимизации этот рабочий процесс позволит с точки зрения затрат и времени эффективно идентифицировать фенотипы, специфичные для типа клеток, и генные регуляторные сети.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Раскрывать нечего.

Acknowledgments

Мы благодарим Линду Орзолек из Johns Hopkins Transcriptomics и Deep Sequencing Core за помощь в секвенировании созданных библиотек и Lizhi Jiang за выполнение ex vivo retinal explants.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette filter tips
10% Tween 20 Bio-Rad 1662404
100 µM Barcode Solution Request from Gartner lab https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested
=true
100% Ethanol Millipore Sigma E7023-500ML
100% Methanol Millipore Sigma 322415-100ML
10x Chip Holder 10x Genomics 1000195
10x Chromium controller & Accessory Kit 10x Genomics PN-120263
15mL Centrifuge Tube Quality Biological P886-229411
40 µm FlowMi Cell Strainer Bel-Art H13680-0040
50 µM Anchor Solution Sigma or request from Gartner lab https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested
=true
50 µM Co-Anchor Solution Sigma or request from Gartner lab https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested
=true
5200 Fragment Analyzer system Agilent M5310AA
70 um FlowMi cell strainer Bel-Art H13680-0070
Allegra X-12R Centrifuge VWR BK392302
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9647
Chromium Next GEM Chip G 10x Genomics PN-1000120
Chromium Next GEM Chip H 10x Genomics PN-1000161
Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.1 10x Genomics PN-1000175
Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1 10x Genomics PN-1000121
Digitonin Fisher Scientific BN2006
Dissection microscope Leica
DNA LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 22431021
Dry Ice
EVA Foam Ice Pan Tequipment 04393-54
FA 12-Capillary Array Short, 33 cm Agilent A2300-1250-3355
Fisherbrand Isotemp Water Bath Fisher Scientific 15-460-20Q
Forma CO2 Water Jacketed Incubator ThermoFisher Scientific 3110
Glycerol 50% Aqueous solution Ricca Chemical Company 3290-32
Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber Fisher Scientific 02-671-51B
Illumina NextSeq or NovaSeq Illumina
Kapa Hifi Hotstart ReadyMix HiFi 7958927001
Low TE Buffer Quality Biological 351-324-721
Magnesium Chloride Solution 1 M Sigma-Aldrich M1028
Magnetic Separator Rack for 1.5 mL tubes Millipore Sigma 20-400
Magnetic Separator Rack for 200 µL tubes 10x Genomics NC1469069
MULTI-seq Primer Sigma or IDT See sequence list
MyFuge Mini Centrifuge Benchmark Scientific C1008
Nonidet P40 Substitute Sigma-Aldrich 74385
Nuclease-free water Fisher Scientific AM9937
P2, P10, P20, P200, P1000 micropipettes Eppendorf
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation LK003150
PBS pH 7.4 (1X) Fisher Scientific 10010-023
Qiagen Buffer EB Qiagen 19086
Refridgerated Centrifuge 5424 R Eppendorf 2231000655
RNase-free Disposable Pellet Pestles Fisher Scientific 12-141-368
RNasin Plus RNase Inhibitor Promega N2615
RPI primer Sigma or IDT See sequence list
Single Index Kit N, Set A 10x Genomics PN-1000212
Single Index Kit T Set A 10x Genomics PN-1000213
Sodium Chloride Solution 5 M Sigma-Aldrich 59222C
SPRIselect Reagent Kit Beckman Coulter B23318
Standard Disposable Transfer Pipettes Fisher Scientific 13-711-7M
TempAssure PCR 8-tube strip USA Scientific 1402-4700
Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.4 Sigma-Aldrich T2194
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) Corning 25-900-CI
Universal I5 primer Sigma or IDT See sequence list
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems 4375786
Vortex Mixer VWR 10153-838

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370, (2020).
  2. Nagalakshmi, U., et al. The Transcriptional Landscape of the Yeast Genome Defined by RNA Sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
  3. Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
  4. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50, 96 (2018).
  5. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36, 411-420 (2018).
  6. McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 16, 619-626 (2019).
  7. Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19, 224 (2018).
  8. Chen, X., Miragaia, R. J., Natarajan, K. N., Teichmann, S. A. A rapid and robust method for single cell chromatin accessibility profiling. Nature Communications. 9, 5345 (2018).
  9. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. , 8598 (2020).
  10. Clark, B. S., et al. Single-Cell RNA-Seq Analysis of Retinal Development Identifies NFI Factors as Regulating Mitotic Exit and Late-Born Cell Specification. Neuron. 102, 1111-1126 (2019).
  11. Zheng, Y., et al. A human circulating immune cell landscape in aging and COVID-19. Protein Cell. 11, 740-770 (2020).
  12. Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37, 925-936 (2019).
  13. Worthington Biochemical Corporation. Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , (2020).
  14. 10x Genomics. Chromium Single Cell 3' Reagent Kits v3 User Guide. , (2020).
  15. Agilent. DNF-468 HS Genomic DNA 50 kb Kit Quick Guide for Fragment Analyzer Systems. , (2015).
  16. ThermoFisher Scientific. Qubit dsDNA HS Assay Kits. ThermoFisher Scientific. , (2015).
  17. 10x Genomics. Chromium Single Cell ATAC Reagent Kits User Guide (v1.1 Chemistry). , (2020).
  18. Weir, K., Kim, D. W., Blackshaw, S. Regulation of retinal neurogenesis by somatostatin signaling. bioRxiv. , (2020).
  19. Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14, 865-868 (2017).
  20. Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10, 2907 (2019).
  21. Ma, S., et al. Chromatin Potential Identified by Shared Single-Cell Profiling of RNA and Chromatin. Cell. , (2020).
  22. Buenrostro, J. D., et al. Integrated Single-Cell Analysis Maps the Continuous Regulatory Landscape of Human Hematopoietic Differentiation. Cell. 173, 1535-1548 (2018).
  23. Pliner, H. A., et al. Cicero Predicts cis-Regulatory DNA Interactions from Single-Cell Chromatin Accessibility Data. Molecular Cell. 71, 858-871 (2018).
  24. Granja, J. M., et al. ArchR: An integrative and scalable software package for single-cell chromatin accessibility analysis. BioRxiv. , (2020).
  25. Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177, 1888-1902 (2019).
  26. METABRIC Group. The genomic and transcriptomic architecture of 2,000 breast tumours reveals novel subgroups. Nature. 486, 346-352 (2012).
  27. Izadi, F. Differential Connectivity in Colorectal Cancer Gene Expression Network. Iranian Biomedical Journal. 23, 34-46 (2019).

Tags

Неврология Выпуск 169 Развитие Болезнь scRNA-Seq scATAC-Seq MULTI-Seq мультиплекс Хроматин
Мультиплексированный анализ экспрессии генов сетчатки и доступности хроматина с использованием scRNA-Seq и scATAC-Seq
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weir, K., Leavey, P., Santiago, C.,… More

Weir, K., Leavey, P., Santiago, C., Blackshaw, S. Multiplexed Analysis of Retinal Gene Expression and Chromatin Accessibility Using scRNA-Seq and scATAC-Seq. J. Vis. Exp. (169), e62239, doi:10.3791/62239 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter