Summary
Aqui, os autores apresentam a utilidade de MULTI-seq para fenotipagem e posterior emparelhamento scRNA-seq e scATAC-seq na caracterização dos perfis de acessibilidade transcriptômica e cromatina na retina.
Abstract
Poderosas técnicas de sequenciamento de próxima geração oferecem análises robustas e abrangentes para investigar como as redes reguladoras de genes da retina funcionam durante o desenvolvimento e nos estados de doenças. O sequenciamento de RNA unicelular nos permite traçar alterações abrangentes de expressão genética observadas no desenvolvimento da retina e na doença a nível celular, enquanto o ATAC-Seq unicelular permite que a análise da acessibilidade e do fator de transcrição de cromatina sejam perfilada em resolução semelhante. Aqui, descreve-se o uso dessas técnicas na retina em desenvolvimento, e multi-Seq é demonstrado, onde amostras individuais são rotuladas com um complexo oligonucleotídeo-lipídio modificado, permitindo aos pesquisadores aumentar o escopo de experimentos individuais e reduzir substancialmente os custos.
Introduction
Entender como os genes podem influenciar o destino celular desempenha um papel fundamental na interrogação de processos como doenças e progressão embrionária. As complexas relações entre fatores de transcrição e seus genes-alvo podem ser agrupadas em redes reguladoras genéticas. A montagem de evidências coloca essas redes reguladoras genéticas no centro de doenças e desenvolvimento através das linhagens evolutivas1. Embora técnicas anteriores como qRT-PCR se concentrem em um único gene ou conjunto de genes, a aplicação da tecnologia de sequenciamento de alto rendimento permite o perfil de transcriptomes celulares completos.
O RNA-seq oferece um vislumbre da transcriptômica em larga escala 2,3. O sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-seq) dá aos pesquisadores a capacidade de não apenas traçar transcrições de perfil, mas vincular tipos de células específicas com perfisde expressão genética 4. Isso é conseguido bioinformática alimentando perfis de células individuais em algoritmos de classificação usando marcadores genéticos conhecidos5. O multiplexing usando sequenciamento de índices marcados por lipídios (MULTI-seq) oferece uma diversidade sem precedentes no número de perfis scRNA-Seq que podem ser coletados6. Esta técnica baseada em lipídio difere de outras técnicas de indexação de amostras, como o hashing celular que dependem da presença de antígenos superficiais e anticorpos de alta afinidade em vez da integração da membrana plasmática7. Não só agora é possível traçar perfis de expressão genética em tipos de células, mas diferentes experimentos podem ser combinados em uma única biblioteca de sequenciamento, reduzindo drasticamente o custo de um experimento individual de scRNA-seq6. O custo do scRNA-seq pode parecer proibitivo para uso em experimentos de fenotipos onde são analisados muitos genótipos, condições ou amostras de pacientes diferentes, mas o multiplexing permite a combinação de até 96 amostras em uma única biblioteca6.
O perfil da expressão genética via scRNA-seq não tem sido a única técnica baseada em sequenciamento de alto rendimento para revolucionar a compreensão atual de como os mecanismos moleculares ditam o destino celular. Embora entender quais transcrições genéticas estão presentes em uma célula permite a identificação do tipo celular, igualmente importante é entender como a organização genômica regula o desenvolvimento e a progressão da doença. Estudos iniciais se basearam na detecção de decote mediado por DNase de sequências não ligadas a histones, seguidos pelo sequenciamento dos fragmentos de DNA resultantes para identificar regiões de cromatina aberta. Em contraste, o ensaio celular único para sequenciamento de cromatina acessível transposon (scATAC-seq) permite que os pesquisadores testem DNA com um transposon domesticado para perfilar facilmente cromatina aberta no nível único de nucleotídeo8. Isso passou por um dimensionamento semelhante ao scRNA-seq e agora os pesquisadores podem identificar tipos de células individuais e perfis de fenótipos em milhares de genomas individuais8.
O emparelhamento de scRNA-seq e scATAC-seq permitiu aos pesquisadores a capacidade de perfilar milhares de células para determinar populações celulares, organização genômica e redes de regulação genética em modelos de doenças e processos de desenvolvimento 9,10,11,12. Aqui, os autores descrevem como primeiro utilizar multi-seq para condensar fenotipagem de uma miríade de modelos animais e empregar scRNA-seq e scATAC-seq emparelhados para obter uma melhor compreensão da paisagem e redes regulatórias de cromatina nesses modelos animais.
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Protocol
O uso de animais para esses estudos foi realizado por meio de protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais johns Hopkins, em conformidade com as diretrizes do ARRIVE, e foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos relevantes.
1. MULTI-seq
- Preparação da mídia
- Prepare e equilibre o inibidor de ovomucoid, 10 mg de inibidor de ovomucoid e 10 mg de albumina por mL da Solução de Sal Balanceado (EBSS) de Earle, por 30 minutos antes do uso13. Equilibre com 95% O2:5% CO2 em uma incubadora.
- Prepare a solução de dissociação papain, 20 unidades/mL papain e 0,005% DNase na EBSS, durante esta etapa de incubação13.
NOTA: Um frasco de solução DNase será suficiente para 5 amostras. Frascos adicionais podem precisar ser reconstituídos se realizarem MULTI-seq em mais de 5 amostras.
- Prepare a solução de dissociação papain, 20 unidades/mL papain e 0,005% DNase na EBSS, durante esta etapa de incubação13.
- Prepare soluções de codificação de oligo modificadas lipídicas.
- Faça uma diluição de código de barras única para cada amostra, combinando 0,5 μL de 100 μM de solução de estoque de código de barras com 4,5 μL de Salina Tamponada fosfato (PBS).
- Para preparar a solução de código de barras de 1:1 na relação molar, combine 4,4 μL de diluição de código de barras de 10 μM, 0,9 μL de solução de âncora de 50 μM e 16,7 μL de PBS e coloque no gelo. A concentração final tanto para os fios de código de barras quanto para os fios de âncora deve ser de 2 μM.
- Para preparar a solução co-âncora, combine 0,88 μL de solução co-âncora de 50 μM e 21,12 μL de PBS e coloque no gelo. A concentração final da co-âncora deve ser de 2 μM. Multiplique os volumes nesta etapa por 1,1x o número de amostras.
- Para fazer 1% de BSA na PBS, dissolva 0,1 g de albumina de soro bovino (BSA) em 10 mL de PBS e coloque no gelo.
- Para fazer PBS com inibidor de RNase, combine 2,5 μL de 40 inibidores de RNase U/μL com 197,5 μL de PBS e armazene no gelo. Multiplique os volumes nesta etapa por 1,1x o número de amostras.
- Prepare e equilibre o inibidor de ovomucoid, 10 mg de inibidor de ovomucoid e 10 mg de albumina por mL da Solução de Sal Balanceado (EBSS) de Earle, por 30 minutos antes do uso13. Equilibre com 95% O2:5% CO2 em uma incubadora.
- Dissociação da amostra
- Eutanize os animais por luxação cervical e/ou asfixia por CO2 de acordo com os requisitos institucionais da IACUC. O método para a eutanásia dependerá de requisitos institucionais e organismo modelo utilizado.
- Disseque a retina de ambos os olhos em PBS frio sob um microscópio de dissecção e transfira para um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL estéril usando uma pipeta de transferência.
- Transfira 500 μL da solução papain para um tubo de 1,5 mL para cada amostra.
- Coloque amostras na solução papain e cubra imediatamente os tubos.
- Incubar os tubos contendo as amostras a 37 °C, 5% de CO2 por 30 min. Inverta os frascos 3 vezes a cada 10 minutos. As amostras devem se dissociar progressivamente a cada rodada de inversões.
- Volte os frascos à temperatura ambiente e triturar cada amostra 3-4 vezes com uma pipeta de 1 mL definida para 300 μL.
- Deixe que quaisquer pedaços de tecido não dissociado permaneçam após a trituração para resolver.
- Remova a suspensão celular nublada, evitando qualquer pedaço de tecido não dissociado e coloque a suspensão celular de cada amostra em um novo tubo estéril de 15 mL tampado por parafuso.
- Centrifugar as suspensões celulares a 300 x g por 5 min a temperatura ambiente.
- Durante a etapa de centrifugação, prepare a mídia de resuspensão celular.
- Misture 857 μL de EBSS (Frasco 1) com 95 μL de solução inibidora de albumina-ovomucoid reconstituída em um tubo estéril de 1,5 mL tampado. Adicione 48 μL de solução DNase salvo de 1.1.1. Multiplique os volumes nesta etapa por 1,1x o número de amostras.
- Descarte o supernasce, tenha o cuidado de reter as pelotas celulares e resuspense imediatamente as pelotas de célula em solução de ressuspensão de células de 1 mL preparada na etapa 1.2.10.
- Prepare o gradiente de densidade descontínua.
- Para cada amostra, adicione 1,6 mL de solução inibidora de ovomucoid a um novo tubo estéril de 15 mL e coloque cuidadosamente a suspensão celular em cima. A interface entre as duas camadas do gradiente deve ser visível, mas alguma mistura não afeta os resultados.
- Centrifugar os gradientes de densidade descontínua a 70 x g por 6 min a temperatura ambiente. As células dissociadas devem ser pelotas na parte inferior dos tubos enquanto os fragmentos de membrana permanecem na interface.
- Descarte o supernasce e adicione 200 μL de PBS para lavar as células pelladas. Centrifugar a 300 x g por 5 min a temperatura ambiente.
- Descarte o supernasce e resuspenque as células em 180 μL de PBS com inibidor de RNase. Passe as células através de um coador de células de 40 μm em um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL estéril.
- Codificação de barras de células
- Adicione 20 μL de solução de âncora:código de barras a cada amostra e pipeta suavemente para misturar. Certifique-se de que cada amostra receba uma solução de âncora única:código de barras e incubar no gelo por 5 minutos.
- Prepare os materiais necessários para a geração de contas de gel (GEM) e a codificação de barras durante esta incubação14.
- Adicione 20 μL de solução co-âncora a cada amostra e pipeta suavemente para misturar. Incubar no gelo por 5 minutos.
- Adicione 1 mL de 1% de BSA gelado em PBS a cada amostra e centrifugar as células a 300 x g por 5 min a 4 °C.
- Remova o supernatante sem perturbar a pelota celular e adicione 400 μL de gelo frio 1% BSA no PBS. Centrifugar a 300 x g por 5 min a 4 °C.
- Repita o passo 1.3.4 para um total de 2 lavagens. Remova o supernatante e resuspend em 400 μL gelado frio 1% BSA em PBS.
- Determine a concentração de células para cada amostra usando um hemótmetro.
- Determine o número total de células para carregar para cada amostra. Normalmente, este é o número total de células desejadas divididas pelo número de amostras. No entanto, se uma réplica biológica para uma condição foi perdida, sua parte pode ser dividida entre as outras réplicas biológicas dessa condição.
- Divida o número de células desejadas para cada amostra pela concentração celular dessa amostra calculada na etapa 3.5 para determinar o volume necessário para carregar o número desejado de células.
- Combine os volumes calculados na etapa 3.5.2 de cada amostra em um novo tubo de centrífuga estéril de 1,5 mL. É prudente dobrar o volume retirado de cada amostra em caso de falha na geração GEM.
- Determine a concentração celular "final" das amostras combinadas usando um hemócito.
- Adicione 20 μL de solução de âncora:código de barras a cada amostra e pipeta suavemente para misturar. Certifique-se de que cada amostra receba uma solução de âncora única:código de barras e incubar no gelo por 5 minutos.
- Geração GEM e barcoding
- Use amostras combinadas para gerar e código de barras GEMs14.
- Pós limpeza GEM-RT e amplificação cDNA
- Prepare materiais para a limpeza pós-transcriptase reversa gem e amplificação cDNA de acordo com as instruções do fabricante com as seguintes modificações14. Realize a limpeza pós GEM-RT por seleção de tamanho14.
- Aumento do volume de 80% de etanol preparado por 2 mL.
- Prepare a amplificação cDNA Mix no gelo14. Adicione 1 μL de 2,5 μM MULTI-seq primer ao mix de amplificação cDNA. Vórtice para 5 s e centrífuga para 5 s em uma mini centrífuga de bancada.
- Realize a amplificação cDNA14. O cDNA pode ser armazenado a 4 °C por até 72 h neste ponto.
- Realizar a limpeza cDNA por seleção de tamanho14. A transcrição endógena cDNA pode ser armazenada a 4 °C por até 72 h ou a -20 °C por até 4 semanas neste ponto.
- Não descarte o supernatante da primeira rodada de seleção de tamanho. Esta fração contém os códigos de barras da amostra. Transfira o supernatante para um novo tubo de microcentrífugo estéril de 1,5 mL.
- Guarde o supernatante no gelo.
- Vortex para resuspend reagente de tamanho baseado em contas paramagnéticas e adicionar 260 μL reagente de tamanho à base de contas paramagnética (final 3.2x) e 180 μL de 100% isopropanol (1,8x) ao supernante. Pipeta a mistura 10 vezes e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos.
- Coloque o tubo em um rack magnético e espere a solução clarear. Em seguida, remova e descarte o supernatante.
- Adicione 500 μL de 80% de etanol às contas e deixe ficar para os 30 s. Remova e descarte o supernatante.
- Repita para um total de 2 lavagens.
- Centrifufique brevemente as contas e retorne ao rack magnético. Inicie um temporizador por 2 minutos.
- Remova o etanol restante com uma pipeta P10 e seque as contas no rack magnético durante o restante dos 2 minutos. Não exceda 2 min.
- Remova as contas do rack magnético e resuspense em 100 μL tampão de eluição (EB). Pipeta bem para resuspend.
- Incubar em temperatura ambiente por 2 minutos.
- Volte para o rack magnético e espere a solução clarear.
- Transfira o supernatante para um tubo de microcentrífugo fresco de 1,5 mL.
- Repetição de passos 1.5.4 a 1.5.12. Reduza pela metade o volume de EB tampão utilizado na etapa 1.5.9.
- Determine a concentração de DNA de código de barras e a distribuição de tamanho usando um kit de ensaio de alta sensibilidade dsDNA e fluorômetro e analisador defragmentos 15,16. O código de barras cDNA pode ser armazenado a 4 °C por até 72 h ou a -20 °C por até 4 semanas neste momento.
- Prepare materiais para a limpeza pós-transcriptase reversa gem e amplificação cDNA de acordo com as instruções do fabricante com as seguintes modificações14. Realize a limpeza pós GEM-RT por seleção de tamanho14.
- Construção de biblioteca de código de barras
- Prepare 1 mL de 80% de etanol.
- Prepare a biblioteca de código de barras PCR master mix em um tubo de tira PCR estéril: combine 26,25 μL de 2x hot start PCR ready mix, 2,5 μL de 10 μM Primer Universal i5, 2,5 μL de primer RPI de 10 μM, 3,5 ng de código de barras cDNA (volume determinado pela concentração do Passo 5.14), e água sem nuclease suficiente para levar o volume final a 50 μL.
- Use um primer RPI exclusivo para cada biblioteca de código de barras se várias bibliotecas MULTI-seq forem sequenciadas juntas.
- Sujeito a mistura mestre da biblioteca de código de barras a uma preparação de biblioteca PCR: 95 °C por 5 min; 10 ciclos de 98 °C para 15 s, 60 °C para 30 s, 72 °C para 30 s; 72 °C por 1 min; e, em seguida, mantenha a 4 °C.
- Vórtice para resuspensar o reagente de seleção de tamanho paramagnético baseado em contas.
- Remova o produto PCR do termociclador e adicione 80 μL (1,6x) de reagente de seleção de tamanho paramagnético à base de contas. Pipeta completamente.
- Incubar em temperatura ambiente por 5 minutos. Coloque no separador de ímãs na posição alta e aguarde a solução para limpar.
- Remova e descarte o supernatante.
- Adicione 200 μL de 80% de etanol às contas e deixe ficar por 30 s. Remova e descarte o supernatante.
- Repita o passo 1.6.8 para um total de 2 lavagens.
- Centrifufique brevemente o tubo e coloque no separador magnético na posição baixa. Inicie um temporizador por 2 minutos.
- Remova o etanol restante com uma pipeta P20 e seque as contas no separador magnético durante o restante dos 2 minutos. Não exceda 2 min.
- Remova o tubo do separador magnético e resuspense as contas em 25 μL de EB tampão. A pipeta misture bem para resuspensar as contas.
- Incubar por 2 minutos em temperatura ambiente.
- Retorne ao separador magnético na posição baixa e aguarde a solução para limpar. Transfira o supernatante para um novo tubo de tira PCR.
- Quantifique a concentração da biblioteca de expressões e a distribuição do tamanho do fragmento usando o kit de ensaio de alta sensibilidade adsDNA e o fluorômetro e o analisador de fragmentos.
- Construção da Biblioteca de Expressão Genética de 3'
- Realize a construção da biblioteca de expressão genética de 3'de acordo com as instruções do fabricante14.
- Seqüenciamento
- Além da biblioteca endógena cDNA amplificada na etapa 7, submeta a biblioteca de código de barras amplificada na etapa 6. Para simplificar, envie essas bibliotecas separadamente, ou como medida econômica, inclua uma alíquota do material de codificação de barras de amostra com a biblioteca cDNA endógena. Meta entre 20.000-50.000 cDNA e 3.000-5.000 leituras de código de barras por célula.
- Converta os arquivos bcl de sequenciamento resultantes em arquivos fastq por cellranger mkfastq e conte matrizes geradas a partir destes pela contagem de violoncelranger.
- Amostras desconvolutes pós análise cellranger usando o pacote r deMULTIplex disponível no repositório MULTI-seq GitHub (https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/MULTI-seq).
2. ScRNA-seq emparelhado e scATAC-seq
- Tecido de congelamento flash para scATAC-seq e fixação de metanol de células da retina para scRNA-seq
- Preparação da mídia
- Para preparar as soluções para dissociação da retina, repita as etapas 1.1.1 e 1.1.4.
- Prepare um banho de gelo seco de etanol em um pequeno balde de gelo.
- Prepare 15 mL de 70% de etanol adicionando 10,5 mL de etanol a 4,5 mL de água sem nuclease.
- Adicione gelo seco suficiente ao balde de gelo (de preferência em forma de pelota) que 15 mL de líquido subirão para cobrir apenas o gelo. Adicione os 15 mL de etanol.
- Coloque PBS no gelo e 1 mL de alíquotas de 100% metanol em um conveniente congelador de -20 °C.
- Preparação da amostra
- Siga as etapas 1.2.1 e 1.2.2 para isolar as retinas; no entanto, desta vez coloque cada retina em um tubo de microcentrifuuge separado.
- Para as amostras destinadas ao scATAC-seq, remova qualquer líquido do tubo de microcentrifuuge usando uma pipeta P200 e tampar imediatamente e colocar o tubo em banho de gelo seco a etanol para congelar a amostra.
- Para as amostras destinadas ao scRNA-seq, para dissociar as células, repita as etapas 1.2.3 a 1.2.15 na retina dissecada.
- Centrifugar as células a 300 x g por 3 min a temperatura ambiente.
- Remova o supernatante sem interromper a pelota celular.
- Adicione 1 mL de PBS refrigerado e misture delicadamente a pipeta 10 vezes ou até que as células estejam completamente suspensas.
- Centrifugar a 300 x g por 5 min a 4 °C.
- Repetição de passos 2.1.2.5 a 2.1.2.7 para um total de 2 lavagens.
- Remova o supernatante sem interromper a pelota celular.
- Adicione 100 μL de PBS refrigerado e misture suavemente 10x ou até que as células estejam completamente suspensas.
- Comece a fazer o vórtice do tubo na configuração de velocidade mais baixa. Adicione 900 μL de metanol resfriado (-20 °C) gota a gota enquanto continua a vórtice suavemente o tubo para evitar que as células se aglomeram.
- Incubar as células no gelo por 15 minutos.
- Determine a concentração das células fixas usando um hemótmetro.
- Avalie a eficácia da etapa de fixação usando o azul trypan. Uma alta fração de células viáveis indica que mais tempo de fixação é necessário.
- Armazene o tecido congelado e as células fixas a -80 °C.
- Preparação da mídia
- Isolamento de núcleos de tecido congelado flash para scATAC-seq
- Preparação da mídia
- Prepare o tampão de diluição de lise combinando 9,77 mL de água sem nuclease, 100 μL de 1 M Tris-HCl (pH 7.4), 100 μL de 1 M NaCl, 30 μL de 1 M MgCl2 e 0,1 g de BSA.
- Prepare o tampão de diluição de lise à frente, como no dia anterior, e armazene a 4 °C. No dia do protocolo, coloque no gelo.
- Equilibre o tampão de núcleos de 20x fornecido pelo fabricante do kit scATAC de -20 °C até a temperatura ambiente. Vórtice e centrífuga brevemente.
- Prepare o tampão de 1x lysis incubando a solução de 5% de Digitonin em um banho de água de 65 °C até que o precipitado seja dissolvido. Em seguida, combine 2 mL de tampão de diluição de lise, 20 μL de 10% Tween-20, 20 μL de Substituto P40 Nãoide (pode ser rotulado alternativamente IGEPAL) e 4 μL de Digitonin.
- Armazene o tampão de 1x de lise no gelo.
- Para preparar o tampão de 0,1x de lise, combine 1,8 mL de tampão de diluição de lise com 200 μL do tampão de 1x lysis e armazene no gelo.
- Para preparar o tampão de lavagem, combine 2 mL de tampão de diluição de lise e 20 μL de 10% Tween-20 e armazene no gelo.
- Para preparar o tampão de núcleos diluídos, combine 950 μL de água sem nuclease com 50 μL de tampão de núcleos (20x) e armazene no gelo.
- Isolamento dos Núcleos
- Não descongele a amostra antes da lise. Adicione 500 μL de tampão de 0,1x de lise refrigerado a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo a amostra congelada. Homogeneize imediatamente 15x usando um pilão de pelota.
- Incubar por 5 minutos no gelo. Prepare os materiais necessários para a transposição scATAC durante esta etapa de incubação17.
- Misture 10x com uma pipeta de 1 mL e incubar por 10 minutos no gelo. Preparação completa dos materiais necessários para a transposição scATAC durante esta etapa de incubação, se ainda não concluída. É desnecessário preparar mais Buffer de Núcleos Diluídos.
- Adicione 500 μL de tampão de lavagem refrigerado às células líssedas. Mistura de pipeta 5x.
- Passe a suspensão através de um coador de células de 70 μm em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Filtrar ~300 μL de cada vez usando um novo coador de células de 70 μm cada vez.
- Passe o fluxo coletado através de um coador de células de 40 μm em um novo tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL e armazene no gelo.
- Determine a concentração dos núcleos usando um hemócito. Com base na concentração dos núcleos e no volume total da suspensão celular, calcule o número total de núcleos dissociados.
- Centrifugar a 500 x g por 5 min a 4 °C e remover o sobrenatante sem interromper a pelota dos núcleos.
- Para criar o estoque de núcleos com base na contagem total de núcleos determinados na etapa 2.2.2.7., resuspensar os núcleos em buffer de núcleos diluídos suficientes para alcançar uma concentração de núcleos desejado.
NOTA: A concentração de núcleos desejados baseia-se na recuperação dos núcleos-alvo para o experimento scATAC-seq e é determinada a partir das Diretrizes de Concentração dos Núcleos encontradas no protocolo17 do fabricante. Por exemplo, se 10.000 núcleos forem finalmente desejados, a concentração de núcleos desejada para o Estoque de Núcleos está entre 3.080 e 7.700 núcleos/μL. Talvez seja melhor mirar no meio do intervalo em concentração. - Determine a concentração dos núcleos usando um hemócito.
- Proceda imediatamente à transposição scATAC usando o estoque de núcleos preparados17.
- Preparação da mídia
- Reidratação de Células Fixas de Metanol para uso em scRNA-Seq
- Preparação de mídia
- Para preparar o tampão de lavagem/diluição, dissolva 0,01 g de BSA em 1 mL de PBS. Em seguida, adicione 12,5 μL de 40 U/μL RNase Inibidor e misture suavemente. Guarde no gelo.
- Reidratação celular
- Centrífugas de células fixas de metanol em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL a 3000 x g por 10 min a 4 °C. Em seguida, remova o supernatante.
- Adicione 200 μL de tampão de lavagem/diluição refrigerado ao tubo de microcentrifusagem. Centrifugar a 300 x g por 10 min a 4 °C e remover o sobrenante. Repita para um total de 2 lavagens.
NOTA: Prepare os materiais necessários para a geração GEM e a codificação de barras durante as duas etapas anteriores14. - Para preparar o estoque celular, com base no número total de células calculado em 2.1.2.12., resuspencou as células em suficiente tampão de lavagem/diluição para alcançar a concentração celular desejada. As concentrações celulares preferidas estão entre 700 e 1200 células/μL.
- Determine a concentração celular do estoque celular usando um hemócito.
- Proceda imediatamente para a geração GEM e a codificação de barras usando o estoque decélulas 14.
- Seqüenciamento
- Ao realizar a análise do curso de tempo (como no desenvolvimento ou doença), sequencie várias amostras em uma execução multiplexada (ou seja, várias bibliotecas em uma única célula de fluxo) para reduzir a variação técnica.
- Preparação de mídia
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Representative Results
Este fluxo de trabalho estabelece uma estratégia de investigação de fenótipos de desenvolvimento e processos regulatórios usando sequenciamento de célula única. O multiplexing de amostra multi-seq permite um ensaio inicial de fenotipagem de baixo custo, enquanto a coleta e fixação emparelhadas de amostras para scRNA-seq e scATAC-seq permite uma investigação mais aprofundada (Figura 1).
A codificação multi-seq permite o sequenciamento combinado de múltiplas amostras e sua subsequente desconvolução computacional. A amostra de origem pode ser determinada para cada célula com base em sua expressão de código de barras (Figura 2A). Essas amostras combinadas podem ser analisadas como um único conjunto de dados para fins de agrupamento celular e identificação do tipo celular (Figura 2B). Como cada célula é barrada antes da geração GEM, os doublets de célula terão uma alta probabilidade de mostrar expressão para vários códigos de barras MULTI-seq e, portanto, a maioria dos doublets pode ser identificada e removida antes do agrupamento e identificação do tipo celular (Figura 2C). O aumento do número de células utilizadas na etapa de geração GEM aumentará a proporção de doublets encontrados. scATAC-seq pode ser usado para gerar um conjunto de dados com tipos de células para coincidir com os encontrados por scRNA-seq (Figura 2D). O emparelhamento de expressão genética scRNA-seq e informações de acessibilidade de DNA scATAC-seq permite a reconstrução de redes reguladoras genéticas.
Figura 1: Demonstração de esquema do uso de MULTI-Seq na análise inicial, seguido de análise separada de SCRNA-Seq e scATAC-Seq em caracterização aprofundada de fenótipos, tratamentos ou estados de interesse da doença. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Representações de redução dimensional umap de dados MULTI-seq para uma série arélica de camundongos eliminatórios P0 Sstr2 demonstrando (a) a desconvolução do genótipo para cada célula no conjunto de dados e (b) a identificação de tipos de células no conjunto de dados. A sobrecarga de células durante a geração GEM e a etapa de codificação de barras resultarão em um aumento de dobras celulares como as vistas em (c), que mostra os dados de (a) e (b) antes da remoção e reclusão do doublet. Em (d), dados scATAC-Seq de células GFP positivos obtidos no E16 a partir de explants de retina eletroporados com um plasmídeo de controle de expressão de GFP no E14. Os tipos de células são anotados com base na acessibilidade de genes específicos do tipo celular. Este número foi modificado de Weir, K., Kim, D.W., Blackshaw, S. Regulação da neurogênese da retina por sinalização de somatostatina. bioRxiv 2020.09.26.314104 (2020) doi:10.1101/2020.09.26.31410418 e dados originais e inéditos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O poder do MULTI-seq decorre da integração perfeita de dados de múltiplas condições experimentais ou modelos e do enorme benefício em termos de custo e limitação dos efeitos em lote. Utilizar multi-seq oferece um laboratório sem precedentes fenotipagem de profundidade. Métodos não genéticos de multiplexagem, como hashing celular ou hashing de núcleos, abriram a porta para amostras multiplexadas através do uso de anticorposcom código de barras 7,19,20. No entanto, isso se baseia na disponibilidade de anticorpos de alta afinidade que reconhecem proteínas superficiais expressas nas células ou seus núcleos, o que não será possível se esses anticorpos estiverem indisponíveis ou as células não expressarem superfície celular apropriada ou antígenos nucleares7. Como multi-seq utiliza códigos de barras de oligo modificados lipídico para incorporar de forma estável nas células ou seus núcleos, permite aos pesquisadores coletar dados transcriômicos de até 96 amostras frescas ou fixas de forma mais barata e maisamplamente aplicável 6.
Acompanhando o fenotipagem multi-Seq inicial com scRNA-Seq emparelhado e scATAC-Seq é sugerido e apresentado para obter uma compreensão da organização genômica que coincide com os dados transcriptômicos1. Isso não só dá uma ideia das regiões heterocromatina e eucromatina, mas também uma valiosa compreensão das redes de fator de transcrição que conduzem a expressão genética. Uma abordagem multi-omic pode ser usada para revelar as mudanças dinâmicas de cromatina que ocorrem em pontos-chave das decisões de destino celular e determinar trajetórias celulares no desenvolvimento e na doença 1,21,22. Isso pode ser feito através de bioinformática submetendo os dados a pseudotime, interações cis-regulatórias e análise de pegada 5,23,24,25. Corrigir as amostras e sequenciamento múltiplo em uma corrida multiplexada reduz as fontes de efeito em lote, permitindo a comparação entre amostras, como através de um experimento de curso de tempo. O número de amostras de tecido necessárias depende do escopo do experimento. Ao examinar os fenótipos associados aos pontos de tempo embrionários, as retinas únicas são muitas vezes suficientes e podem fornecer centenas de milhares de células. Uma única retina pode não fornecer células suficientes em esquemas experimentais mais complexos: eletroporações ex vivo de explanações de retina, sondagem para populações de células raras ou modelos genéticos com ativação insuficiente de CRE. Embora uma única retina possa fornecer algumas centenas de células, estas não capturarão toda a complexidade tecidual. Para esses experimentos, a otimização será necessária com base nas necessidades de um pesquisador. Utilizando essas técnicas, pode-se obter uma visão de como os genes analisados em MULTI-seq são regulados durante processos dinâmicos como desenvolvimento e doenças.
A regulação das redes reguladoras genéticas está no centro da compreensão dos processos celulares e de como eles contribuem para o desenvolvimento e doença 1,26,27. O fluxo de trabalho aqui apresentado pode ser usado para identificar essas redes reguladoras genéticas em tipos de células específicas. No entanto, este protocolo foi otimizado para uso com tecido de retina do rato. A otimização de várias etapas, como lise ou tempo de dissociação, velocidades/vezes de centrifugação e número de etapas de filtragem podem ser necessárias para maximizar o número de células ou núcleos e minimizar os detritos celulares em suspensões celulares de outros tipos de tecidos, amostras ex vivo ou espécies, sejam elas as amostras frescas, congeladas ou fixadas em metanol. O tempo de fixação do metanol pode precisar ser aumentado se as amostras mostrarem altos níveis de células viáveis com coloração azul trypan. A técnica MULTI-seq introduz muitas etapas adicionais de lavagem sobre o scRNA-seq tradicional. Para evitar o descarte acidental de células valiosas ou DNA, é prudente otimizar as velocidades de centrifugação e manter supernacantes que normalmente seriam descartados na codificação de barras de células, limpeza pós-GEM RT e etapas de construção de biblioteca de código de barras no gelo até que esse passo tenha sido verificado como bem sucedido. Uma limitação ao MULTI-seq é o número limitado de células e, portanto, amostras, que podem ser sequenciadas a partir de um único poço na etapa de geração GEM. Recomenda-se não tentar sobrecarregar excessivamente as células durante esta etapa para evitar um aumento substancial na captura de células de doublet. Evite carregar bem um POÇO GEM com mais de 20.000 células. Em vez disso, vários poços podem ser preparados a partir de uma única suspensão combinada e multiplexed durante o sequenciamento. Isso exigirá a preparação de um grande volume suficiente de suspensão celular para geração GEM e a adição de réplicas às etapas 5, 6 e 7 e aumentará o custo de sequenciamento à medida que mais leituras totais forem necessárias para mais células. Com a otimização adequada, esse fluxo de trabalho permitirá a identificação eficiente de custos e tempo de fenótipos específicos do tipo celular e redes reguladoras genéticas.
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Disclosures
Nada para revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Linda Orzolek da Johns Hopkins Transcriptomics and Deep Sequencing Core por ajudar a sequenciar as bibliotecas produzidas e Lizhi Jiang por realizar as explantas ex vivo retinal.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette filter tips | |||
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| 100 µM Barcode Solution | Request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
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| 100% Ethanol | Millipore Sigma | E7023-500ML | |
| 100% Methanol | Millipore Sigma | 322415-100ML | |
| 10x Chip Holder | 10x Genomics | 1000195 | |
| 10x Chromium controller & Accessory Kit | 10x Genomics | PN-120263 | |
| 15mL Centrifuge Tube | Quality Biological | P886-229411 | |
| 40 µm FlowMi Cell Strainer | Bel-Art | H13680-0040 | |
| 50 µM Anchor Solution | Sigma or request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
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| 50 µM Co-Anchor Solution | Sigma or request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
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| 5200 Fragment Analyzer system | Agilent | M5310AA | |
| 70 um FlowMi cell strainer | Bel-Art | H13680-0070 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | VWR | BK392302 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Chromium Next GEM Chip G | 10x Genomics | PN-1000120 | |
| Chromium Next GEM Chip H | 10x Genomics | PN-1000161 | |
| Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.1 | 10x Genomics | PN-1000175 | |
| Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1 | 10x Genomics | PN-1000121 | |
| Digitonin | Fisher Scientific | BN2006 | |
| Dissection microscope | Leica | ||
| DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
| Dry Ice | |||
| EVA Foam Ice Pan | Tequipment | 04393-54 | |
| FA 12-Capillary Array Short, 33 cm | Agilent | A2300-1250-3355 | |
| Fisherbrand Isotemp Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-20Q | |
| Forma CO2 Water Jacketed Incubator | ThermoFisher Scientific | 3110 | |
| Glycerol 50% Aqueous solution | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| Illumina NextSeq or NovaSeq | Illumina | ||
| Kapa Hifi Hotstart ReadyMix | HiFi | 7958927001 | |
| Low TE Buffer | Quality Biological | 351-324-721 | |
| Magnesium Chloride Solution 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Magnetic Separator Rack for 1.5 mL tubes | Millipore Sigma | 20-400 | |
| Magnetic Separator Rack for 200 µL tubes | 10x Genomics | NC1469069 | |
| MULTI-seq Primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| MyFuge Mini Centrifuge | Benchmark Scientific | C1008 | |
| Nonidet P40 Substitute | Sigma-Aldrich | 74385 | |
| Nuclease-free water | Fisher Scientific | AM9937 | |
| P2, P10, P20, P200, P1000 micropipettes | Eppendorf | ||
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | |
| PBS pH 7.4 (1X) | Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Qiagen Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| Refridgerated Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 2231000655 | |
| RNase-free Disposable Pellet Pestles | Fisher Scientific | 12-141-368 | |
| RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2615 | |
| RPI primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| Single Index Kit N, Set A | 10x Genomics | PN-1000212 | |
| Single Index Kit T Set A | 10x Genomics | PN-1000213 | |
| Sodium Chloride Solution 5 M | Sigma-Aldrich | 59222C | |
| SPRIselect Reagent Kit | Beckman Coulter | B23318 | |
| Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| TempAssure PCR 8-tube strip | USA Scientific | 1402-4700 | |
| Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) | Corning | 25-900-CI | |
| Universal I5 primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4375786 | |
| Vortex Mixer | VWR | 10153-838 |
References
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