Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Analyse multiplexée de l’expression génique rétinienne et de l’accessibilité de la chromatine à l’aide de scRNA-Seq et scATAC-Seq

Published: March 12, 2021 doi: 10.3791/62239
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2,3,4,5,6
1Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Psychiatry and Behavioral Science, The Johns Hopkins Hospital, 3Department of Ophthalmology, The Johns Hopkins Hospital, 4Department of Neurology, The Johns Hopkins Hospital, 5Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Kavli Neuroscience Discovery Institute, Johns Hopkins University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Ici, les auteurs démontrent l’utilité de MULTI-seq pour le phénotypage et les scRNA-seq et scATAC-seq appariés ultérieurs dans la caractérisation des profils d’accessibilité transcriptomique et chromatine dans la rétine.

Abstract

De puissantes techniques de séquençage de nouvelle génération offrent une analyse robuste et complète pour étudier le fonctionnement des réseaux de régulation des gènes rétiniens pendant le développement et dans les états pathologiques. Le séquençage de l’ARN unicellulaire nous permet de profiler de manière exhaustive les changements d’expression génique observés dans le développement rétinien et la maladie au niveau cellulaire, tandis que l’ATAC-Seq unicellulaire permet de profiler l’analyse de l’accessibilité de la chromatine et de la liaison au facteur de transcription à une résolution similaire. Ici, l’utilisation de ces techniques dans la rétine en développement est décrite, et MULTI-Seq est démontré, où les échantillons individuels sont marqués avec un complexe oligonucléotide-lipide modifié, permettant aux chercheurs à la fois d’augmenter la portée des expériences individuelles et de réduire considérablement les coûts.

Introduction

Comprendre comment les gènes peuvent influencer le devenir cellulaire joue un rôle clé dans l’interrogation de processus tels que la maladie et la progression embryonnaire. Les relations complexes entre les facteurs de transcription et leurs gènes cibles peuvent être regroupées dans des réseaux de régulation des gènes. De plus en plus de preuves placent ces réseaux de régulation des gènes au centre de la maladie et du développement à travers les lignées évolutives1. Alors que les techniques précédentes telles que la qRT-PCR se concentraient sur un seul gène ou un ensemble de gènes, l’application de la technologie de séquençage à haut débit permet le profilage de transcriptomes cellulaires complets.

RNA-seq offre un aperçu de la transcriptomique à grande échelle 2,3. Le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) donne aux chercheurs la possibilité non seulement de profiler les transcriptomes, mais aussi de relier des types cellulaires spécifiques aux profils d’expression génique4. Ceci est réalisé bioinformatiquement en alimentant des profils cellulaires individuels dans des algorithmes de tri à l’aide de marqueurs de gènes connus5. Le multiplexage à l’aide du séquençage d’indices marqués par les lipides (MULTI-seq) offre une diversité sans précédent dans le nombre de profils scRNA-Seq pouvant être collectés6. Cette technique à base de lipides diffère des autres techniques d’indexation des échantillons telles que le hachage cellulaire qui reposent sur la présence d’antigènes de surface et d’anticorps de haute affinité au lieu de l’intégration de la membrane plasmique7. Non seulement il est maintenant possible de profiler les profils d’expression génique en types de cellules, mais différentes expériences peuvent être combinées en une seule bibliothèque de séquençage, ce qui réduit considérablement le coût d’une expérience individuelle scRNA-seq6. Le coût de scRNA-seq peut sembler prohibitif pour une utilisation dans des expériences de phénotypage où de nombreux génotypes, conditions ou échantillons de patients différents sont analysés, mais le multiplexage permet de combiner jusqu’à 96 échantillons dans une seule bibliothèque6.

Le profilage de l’expression des gènes via scRNA-seq n’a pas été la seule technique basée sur le séquençage à haut débit à révolutionner la compréhension actuelle de la façon dont les mécanismes moléculaires dictent le destin cellulaire. Bien que la compréhension des transcriptions génétiques présentes dans une cellule permette d’identifier le type de cellule, il est tout aussi important de comprendre comment l’organisation génomique régule le développement et la progression de la maladie. Les premières études reposaient sur la détection d’un clivage médié par la DNase de séquences non liées aux histones, suivie d’un séquençage des fragments d’ADN résultants pour identifier les régions de chromatine ouverte. En revanche, le test unicellulaire pour le séquençage de la chromatine accessible aux transposons (scATAC-seq) permet aux chercheurs de sonder l’ADN avec un transposon domestiqué pour profiler facilement la chromatine ouverte au niveau de nucléotide unique8. Cela a subi une mise à l’échelle similaire à scRNA-seq et maintenant les chercheurs peuvent identifier des types de cellules individuelles et profiler des phénotypes sur des milliers de génomes individuels8.

L’appariement de scRNA-seq et scATAC-seq a permis aux chercheurs de profiler des milliers de cellules pour déterminer les populations cellulaires, l’organisation génomique et les réseaux de régulation des gènes dans les modèles de maladie et les processus de développement 9,10,11,12. Ici, les auteurs expliquent comment utiliser d’abord MULTI-seq pour condenser le phénotypage d’une myriade de modèles animaux et utiliser scRNA-seq et scATAC-seq appariés pour mieux comprendre le paysage de la chromatine et les réseaux de régulation dans ces modèles animaux.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

L’utilisation d’animaux pour ces études a été menée à l’aide de protocoles approuvés par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de Johns Hopkins, conformément aux lignes directrices d’ARRIVE, et a été effectuée conformément aux lignes directrices et aux règlements pertinents.

1. MULTI-seq

  1. Préparation des médias
    1. Préparer et équilibrer l’inhibiteur ovomucoïde, 10 mg d’inhibiteur ovomucoïde et 10 mg d’albumine par mL de solution saline équilibrée (EBSS) d’Earle, pendant 30 minutes avant utilisation13. Équilibrer avec 95% O2:5% CO2 dans un incubateur.
      1. Préparer une solution de dissociation de la papaïne, 20 unités/mL de papaïne et 0,005 % de DNase dans l’EBSS, au cours de cette étape d’incubation13.
        REMARQUE: Un flacon de solution de DNase sera suffisant pour 5 échantillons. Des flacons supplémentaires peuvent devoir être reconstitués si vous effectuez MULTI-seq sur plus de 5 échantillons.
    2. Préparer des solutions de codage à barres oligo modifiées par les lipides.
      1. Effectuez une dilution unique du code-barres pour chaque échantillon en combinant 0,5 μL de solution mère de code-barres de 100 μM avec 4,5 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
      2. Pour préparer une solution d’ancrage:code-barres à un rapport molaire de 1:1, mélanger 4,4 μL de dilution de code-barres de 10 μM, 0,9 μL de solution d’ancrage de 50 μM et 16,7 μL de PBS et placer sur de la glace. La concentration finale pour les brins de code-barres et les brins d’ancrage doit être de 2 μM.
      3. Pour préparer la solution de co-ancrage, mélanger 0,88 μL de solution de co-ancrage de 50 μM et 21,12 μL de PBS et placer sur de la glace. La concentration finale de la co-ancre doit être de 2 μM. Multipliez les volumes de cette étape par 1,1 fois le nombre d’échantillons.
    3. Pour produire 1 % de BSA dans le PBS, dissoudre 0,1 g d’albumine sérique bovine (BSA) dans 10 mL de PBS et placer sur de la glace.
    4. Pour fabriquer du PBS avec un inhibiteur de la RNase, combinez 2,5 μL d’inhibiteur de 40 U/μL de RNase avec 197,5 μL de PBS et stockez-le sur de la glace. Multipliez les volumes de cette étape par 1,1 fois le nombre d’échantillons.
  2. Dissociation de l’échantillon
    1. Euthanasier les animaux par luxation cervicale et/ou asphyxie au CO2 conformément aux exigences institutionnelles de l’IACUC. La méthode d’euthanasie dépendra des exigences institutionnelles et de l’organisme modèle utilisé.
    2. Disséquer la rétine des deux yeux dans un PBS froid sous un microscope à dissection et transférer dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 mL à l’aide d’une pipette de transfert.
    3. Transférer 500 μL de la solution de papaïne dans un tube de 1,5 mL pour chaque échantillon.
    4. Placez les échantillons dans la solution de papaïne et boucher immédiatement les tubes.
    5. Incuber les tubes contenant les échantillons à 37 °C, 5% de CO2 pendant 30 min. Inverser les flacons 3 fois toutes les 10 minutes. Les échantillons doivent se dissocier progressivement à chaque cycle d’inversions.
    6. Remettre les flacons à température ambiante et triturer chaque échantillon 3 à 4 fois avec une pipette de 1 mL réglée sur 300 μL.
    7. Laissez les morceaux de tissu non dissocié restant après la trituration se déposer.
    8. Retirez la suspension cellulaire trouble tout en évitant tout morceau de tissu non dissocié et placez la suspension cellulaire de chaque échantillon dans un nouveau tube stérile à bouchon vissé de 15 mL.
    9. Centrifuger les suspensions de cellules à 300 x g pendant 5 min à température ambiante.
    10. Au cours de l’étape de centrifugation, préparer le milieu de remise en suspension cellulaire.
      1. Mélanger 857 μL d’EBSS (flacon 1) avec 95 μL de solution reconstituée d’inhibiteur d’albumine-ovomucoïde dans un tube stérile de 1,5 mL à bouchon vissé. Ajouter 48 μL de solution de DNase économisée à partir du 1.1.1. Multipliez les volumes de cette étape par 1,1 fois le nombre d’échantillons.
    11. Jeter le surnageant, en prenant soin de retenir les pastilles cellulaires, et remettre immédiatement en suspension les pastilles cellulaires dans une solution de remise en suspension cellulaire de 1 mL préparée à l’étape 1.2.10.
    12. Préparer un gradient de densité discontinu.
      1. Pour chaque échantillon, ajouter 1,6 mL de solution d’inhibiteur d’ovomucoïde dans un nouveau tube stérile à bouchon vissé de 15 mL et superposer soigneusement la suspension cellulaire sur le dessus. L’interface entre les deux couches du dégradé doit être visible, mais certains mélanges n’affectent pas les résultats.
    13. Centrifuger les gradients de densité discontinus à 70 x g pendant 6 min à température ambiante. Les cellules dissociées doivent s’agglomérer au fond des tubes tandis que les fragments de membrane restent à l’interface.
    14. Jeter le surnageant et ajouter 200 μL de PBS pour laver les cellules granulées. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à température ambiante.
    15. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 180 μL de PBS avec un inhibiteur de la RNase. Faire passer les cellules à travers une passoire cellulaire de 40 μm dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 mL.
  3. Codage à barres cellulaire
    1. Ajouter 20 μL de solution anchor:barcode à chaque échantillon et pipette doucement pour mélanger. Assurez-vous que chaque échantillon reçoit une solution d’ancrage:code-barres unique et incuber sur de la glace pendant 5 min.
      1. Préparer les matériaux nécessaires à la génération de billes de gel en émulsion (GEM) et au codage à barres au cours de cette incubation14.
    2. Ajouter 20 μL de solution de co-ancrage à chaque échantillon et pipeter doucement pour mélanger. Incuber sur de la glace pendant 5 min.
    3. Ajouter 1 mL de BSA glacé à 1 % dans du PBS à chaque échantillon et centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min à 4 °C.
    4. Retirez le surnageant sans perturber la pastille cellulaire et ajoutez 400 μL glacé à 1 % de BSA dans le PBS. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C.
      1. Répétez l’étape 1.3.4 pour un total de 2 lavages. Retirer le surnageant et remettre en suspension dans 400 μL de glace froide à 1 % de BSA dans le PBS.
    5. Déterminer la concentration de cellules pour chaque échantillon à l’aide d’un hémocytomètre.
      1. Déterminez le nombre total de cellules à charger pour chaque échantillon. En règle générale, il s’agit du nombre total de cellules souhaitées divisé par le nombre d’échantillons. Cependant, si une réplique biologique pour une condition a été perdue, sa part peut être divisée entre les autres répliques biologiques de cette condition.
      2. Divisez le nombre de cellules souhaitées pour chaque échantillon par la concentration cellulaire de cet échantillon calculée à l’étape 3.5 afin de déterminer le volume requis pour charger le nombre de cellules souhaité.
    6. Combiner les volumes calculés à l’étape 3.5.2 de chaque échantillon dans un nouveau tube centrifuge stérile de 1,5 mL. Il est prudent de doubler le volume prélevé sur chaque échantillon en cas d’échec de la génération GEM.
      1. Déterminer la concentration cellulaire « finale » des échantillons combinés à l’aide d’un hémocytomètre.
  4. Génération GEM et codage à barres
    1. Utilisez des échantillons combinés pour générer et code-barres GEMs14.
  5. Nettoyage post-GEM-RT et amplification de l’ADNc
    1. Préparer les matériaux pour le nettoyage post-transcriptase inverse GEM et l’amplification de l’ADNc conformément aux instructions du fabricant avec les modifications suivantes14. Effectuez le nettoyage post-GEM-RT par sélection de taille14.
      1. Augmenter le volume d’éthanol à 80 % préparé de 2 mL.
      2. Préparer le mélange d’amplification de l’ADNc sur la glace14. Ajouter 1 μL d’amorce MULTI-seq de 2,5 μM au mélange d’amplification de l’ADNc. Vortex pendant 5 s et centrifugeuse pendant 5 s dans une mini centrifugeuse de paillasse.
    2. Effectuer une amplification de l’ADNc14. L’ADNc peut être stocké à 4 °C jusqu’à 72 h à ce stade.
    3. Effectuez le nettoyage de l’ADNc par sélection de taille14. L’ADNc transcription endogène peut être conservée à 4 °C jusqu’à 72 h ou à -20 °C jusqu’à 4 semaines à ce stade.
      1. Ne jetez pas le surnageant du premier tour de sélection de taille . Cette fraction contient les exemples de codes-barres. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation stérile de 1,5 mL.
      2. Conservez le surnageant sur la glace.
    4. Vortex pour remettre en suspension le réactif de sélection de taille à base de billes paramagnétiques et ajouter 260 μL de réactif de sélection de taille à base de perles paramagnétiques (3,2x final) et 180 μL d’isopropanol à 100% (1,8x) au surnageant. Pipettez le mélange 10 fois et incubez à température ambiante pendant 5 min.
    5. Placez le tube sur une grille magnétique et attendez que la solution disparaisse. Ensuite, retirez et jetez le surnageant.
    6. Ajouter 500 μL d’éthanol à 80 % aux billes et laisser reposer pendant 30 s. Retirez et jetez le surnageant.
      1. Répétez l’opération pour un total de 2 lavages.
    7. Centrifugez brièvement les billes et retournez au rack magnétique. Démarrez une minuterie pendant 2 min.
    8. Retirez l’éthanol restant avec une pipette P10 et séchez à l’air libre les billes sur la grille magnétique pendant le reste des 2 minutes. Ne pas dépasser 2 min.
    9. Retirez les billes du rack magnétique et remettez en suspension dans un tampon d’élution (EB) de 100 μL. Pipette à fond pour remettre en suspension.
    10. Incuber à température ambiante pendant 2 min.
    11. Retournez au rack magnétique et attendez que la solution disparaisse.
    12. Transférer le surnageant dans un tube de microcentrifugation frais de 1,5 mL.
    13. Répétez les étapes 1.5.4 à 1.5.12. Réduire de moitié le volume de tampon EB utilisé à l’étape 1.5.9.
    14. Déterminer la concentration d’ADN de code-barres et la distribution de la taille à l’aide d’un kit de dosage haute sensibilité dsDNA et d’un fluoromètre et d’un analyseur defragments 15,16. L’ADNc à code-barres peut être conservé à 4 °C jusqu’à 72 h ou à -20 °C jusqu’à 4 semaines à ce stade.
  6. Construction d’une bibliothèque de codes-barres
    1. Préparer 1 mL d’éthanol à 80 %.
    2. Préparez le mélange maître PCR de la bibliothèque de codes à barres dans un tube de bande PCR stérile : combinez 26,25 μL de 2x mélange prêt pour la PCR à démarrage à chaud, 2,5 μL d’apprêt Universal i5 de 10 μM, 2,5 μL d’amorce RPI de 10 μM, 3,5 ng d’ADNc de code-barres (volume déterminé par la concentration à partir de l’étape 5.14) et suffisamment d’eau sans nucléase pour porter le volume final à 50 μL.
      1. Utilisez une introduction RPI unique pour chaque bibliothèque de codes-barres si plusieurs bibliothèques MULTI-seq sont séquencées ensemble.
    3. Soumettre le mélange maître de la bibliothèque de codes-barres à une préparation de bibliothèque PCR: 95 °C pendant 5 min; 10 cycles de 98 °C pendant 15 s, 60 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 30 s; 72 °C pendant 1 min; puis maintenir à 4 °C.
    4. Vortex pour remettre en suspension le réactif de sélection de taille à base de perles paramagnétiques.
    5. Retirez le produit PCR du thermocycleur et ajoutez 80 μL (1,6x) de réactif de sélection de taille à base de billes paramagnétiques. Pipette à fond.
    6. Incuber à température ambiante pendant 5 min. Placez le séparateur magnétique en position haute et attendez que la solution disparaisse.
    7. Retirez et jetez le surnageant.
    8. Ajouter 200 μL d’éthanol à 80% aux billes et laisser reposer pendant 30 s. Retirez et jetez le surnageant.
      1. Répétez l’étape 1.6.8 pour un total de 2 lavages.
    9. Centrifugez brièvement le tube et placez-le sur le séparateur magnétique en position basse. Démarrez une minuterie pendant 2 min.
    10. Retirez l’éthanol restant avec une pipette P20 et séchez à l’air les billes sur le séparateur magnétique pendant le reste des 2 minutes. Ne pas dépasser 2 min.
    11. Retirez le tube du séparateur magnétique et remettez en suspension les billes dans 25 μL de tampon EB. Mélangez soigneusement la pipette pour remettre les perles en suspension.
    12. Incuber pendant 2 min à température ambiante.
    13. Revenez au séparateur magnétique en position basse et attendez que la solution disparaisse. Transférez le surnageant dans un nouveau tube à bande PCR.
    14. Quantifiez la concentration de la bibliothèque d’expressions et de la bibliothèque de codes-barres et la distribution de la taille des fragments à l’aide du kit de dosage haute sensibilité adsDNA et du fluoromètre et de l’analyseur de fragments.
  7. 3' Construction de la bibliothèque d’expression génique
    1. Effectuer la construction de la bibliothèque d’expression génique 3' selon les instructions du fabricant14.
  8. Séquençage
    1. En plus de la bibliothèque d’ADNc endogène amplifiée à l’étape 7, soumettez la bibliothèque de codes-barres amplifiée à l’étape 6. Pour plus de simplicité, soumettez ces bibliothèques séparément ou, à titre de mesure rentable, incluez une aliquote de l’échantillon de matériel de codage à barres avec la bibliothèque d’ADNc endogène. Ciblez entre 20 000 et 50 000 ADNc et 3 000 à 5 000 lectures de codes-barres par cellule.
    2. Convertissez les fichiers bcl de séquençage résultants en fichiers fastq par cellranger mkfastq et comptez les matrices générées à partir de ceux-ci par cellranger count.
    3. Exemples déconvolutes après l’analyse Cellranger à l’aide du package deMULTIplex r disponible dans le référentiel GitHub MULTI-seq (https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/MULTI-seq).

2. ScRNA-seq apparié et scATAC-seq

  1. Tissu de congélation éclair pour scATAC-seq et fixation au méthanol des cellules rétiniennes pour scRNA-seq
    1. Préparation des médias
      1. Pour préparer les solutions pour la dissociation rétinienne, répétez les étapes 1.1.1 et 1.1.4.
      2. Préparez un bain de glace carbonique à l’éthanol dans un petit seau à glace.
      3. Préparer 15 mL d’éthanol à 70 % en ajoutant 10,5 mL d’éthanol à 4,5 mL d’eau sans nucléase.
      4. Ajoutez suffisamment de glace carbonique au seau à glace (de préférence sous forme de granulés) pour que 15 ml de liquide s’élèvent pour recouvrir la glace. Ajouter les 15 mL d’éthanol.
      5. Placez le PBS sur de la glace et 1 mL d’aliquotes de méthanol à 100 % dans un congélateur pratique à -20 °C.
    2. Préparation des échantillons
      1. Suivre les étapes 1.2.1 et 1.2.2 pour isoler les rétines; cependant, cette fois, placez chaque rétine dans un tube de microcentrifugation séparé.
      2. Pour les échantillons destinés à scATAC-seq, retirer tout liquide du tube de microcentrifugation à l’aide d’une pipette P200 et immédiatement boucher et placer le tube dans un bain de glace sèche à l’éthanol pour geler l’échantillon.
      3. Pour les échantillons destinés à scRNA-seq, pour dissocier les cellules, répétez les étapes 1.2.3 à 1.2.15 sur la rétine disséquée.
      4. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 3 min à température ambiante.
      5. Retirez le surnageant sans perturber la pastille cellulaire.
      6. Ajouter 1 mL de PBS réfrigéré et mélanger doucement la pipette 10 fois ou jusqu’à ce que les cellules soient complètement en suspension.
      7. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C.
        1. Répétez les étapes 2.1.2.5 à 2.1.2.7 pour un total de 2 lavages.
      8. Retirez le surnageant sans perturber la pastille cellulaire.
      9. Ajouter 100 μL de PBS réfrigéré et mélanger doucement 10x ou jusqu’à ce que les cellules soient complètement en suspension.
      10. Commencez à vortexer le tube à la vitesse la plus basse. Ajouter 900 μL de méthanol réfrigéré (-20 °C) goutte à goutte tout en continuant à tourbillonner doucement le tube pour empêcher les cellules de s’agglutiner.
      11. Incuber les cellules sur de la glace pendant 15 min.
      12. Déterminer la concentration des cellules fixes à l’aide d’un hémocytomètre.
      13. Évaluez l’efficacité de l’étape de fixation à l’aide du bleu de trypan. Une fraction élevée de cellules viables indique que plus de temps de fixation est nécessaire.
      14. Conservez les tissus congelés et les cellules fixes à -80 °C.
  2. Isolement des noyaux à partir de tissus congelés flash pour scATAC-seq
    1. Préparation des médias
      1. Préparer le tampon de dilution de la lyse en combinant 9,77 mL d’eau sans nucléase, 100 μL de 1 M Tris-HCl (pH 7,4), 100 μL de 1 M NaCl, 30 μL de 1 M MgCl2 et 0,1 g de BSA.
      2. Préparez le tampon de dilution de la lyse à l’avance, comme la veille, et conservez-le à 4 °C. Le jour du protocole, placer sur la glace.
      3. Equilibrer le tampon de noyaux 20x fourni par le fabricant du kit scATACde -20 °C à température ambiante. Vortex et centrifugeuse brièvement.
      4. Préparer le tampon de lyse 1x en incubant une solution de digitonine à 5 % dans un bain-marie à 65 °C jusqu’à dissolution du précipité. Combinez ensuite 2 mL de tampon de dilution de lyse, 20 μL de 10 % de Tween-20, 20 μL de Nonidet P40 Substitute (peut également être étiqueté IGEPAL) et 4 μL de Digitonin.
      5. Conservez le tampon de lyse 1x sur de la glace.
      6. Pour préparer le tampon de lyse 0,1x, mélanger 1,8 mL de tampon de dilution de lyse avec 200 μL du tampon de lyse 1x et stocker sur de la glace.
      7. Pour préparer le tampon de lavage, mélanger 2 mL de tampon de dilution de lyse et 20 μL de Tween-20 à 10 % et conserver sur de la glace.
      8. Pour préparer le tampon de noyaux dilués, combinez 950 μL d’eau sans nucléase avec 50 μL de tampon de noyaux (20x) et stockez-le sur de la glace.
    2. Isolement des noyaux
      1. Ne pas décongeler l’échantillon avant la lyse. Ajouter 500 μL de tampon de lyse 0,1x réfrigéré à un tube de microcentrifugation de 1,5 mL contenant l’échantillon congelé. Homogénéiser immédiatement 15x à l’aide d’un pilon à granulés.
      2. Incuber pendant 5 min sur de la glace. Préparer le matériel nécessaire à la transposition de scATAC au cours de cette étape d’incubation17.
      3. Pipette mélanger 10x avec une pipette de 1 mL et incuber pendant 10 min sur de la glace. Préparation complète des matériaux nécessaires à la transposition de scATAC au cours de cette étape d’incubation si elle n’est pas déjà terminée. Il n’est pas nécessaire de préparer plus de tampon de noyaux dilués.
      4. Ajouter 500 μL de tampon de lavage réfrigéré aux cellules lysées. Mélange de pipette 5x.
      5. Faire passer la suspension à travers une passoire cellulaire de 70 μm dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Filtrez ~300 μL à la fois à l’aide d’une nouvelle passoire cellulaire de 70 μm à chaque fois.
      6. Passez le flux collecté à travers une passoire cellulaire de 40 μm dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL et stockez-le sur de la glace.
      7. Déterminez la concentration de noyaux à l’aide d’un hémocytomètre. Sur la base de la concentration de noyaux et du volume total de la suspension cellulaire, calculez le nombre total de noyaux dissociés.
      8. Centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C et retirer le surnageant sans perturber la pastille de noyau.
      9. Pour créer le stock de noyaux en fonction du nombre total de noyaux déterminé à l’étape 2.2.2.7., remettez les noyaux en suspension dans suffisamment de tampon de noyaux dilués pour atteindre la concentration de noyaux souhaitée.
        REMARQUE: La concentration de noyaux souhaitée est basée sur la récupération ciblée des noyaux pour l’expérience scATAC-seq et est déterminée à partir des lignes directrices sur la concentration de noyaux trouvées dans le protocole17 du fabricant. Par exemple, si 10 000 noyaux sont finalement souhaités, la concentration de noyaux souhaitée pour le stock de noyaux est comprise entre 3 080 et 7 700 noyaux / μL. Il serait peut-être préférable de viser le milieu de la plage de concentration.
      10. Déterminez la concentration de noyaux à l’aide d’un hémocytomètre.
      11. Procéder immédiatement à la transposition scATAC en utilisant le stock de noyauxpréparés 17.
  3. Réhydratation des cellules fixes au méthanol pour une utilisation dans scRNA-Seq
    1. Préparation des médias
      1. Pour préparer le tampon de lavage/dilution, dissoudre 0,01 g de BSA dans 1 mL de PBS. Ajouter ensuite 12,5 μL d’inhibiteur de 40 U/μL de RNase et mélanger doucement. Conserver sur la glace.
    2. Réhydratation cellulaire
      1. Centrifuger les cellules fixes au méthanol dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL à 3000 x g pendant 10 min à 4 °C. Retirez ensuite le surnageant.
      2. Ajouter 200 μL de tampon de lavage/dilution réfrigéré au tube de microcentrifugation. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 °C et retirer le surnageant. Répétez l’opération pour un total de 2 lavages.
        REMARQUE: Préparez les matériaux requis pour la génération gem et le codage à barres au cours des deux étapes précédentes14.
      3. Pour préparer le stock cellulaire, sur la base du nombre total de cellules calculé au point 2.1.2.12., remettez les cellules en suspension dans un tampon de lavage/dilution suffisant pour atteindre la concentration cellulaire souhaitée. Les concentrations cellulaires préférées se situent entre 700 et 1200 cellules/μL.
      4. Déterminer la concentration cellulaire du stock cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre.
      5. Passez immédiatement à la génération GEM et au codage à barres à l’aide du stock de cellules14.
    3. Séquençage
      1. Lorsque vous effectuez une analyse de l’évolution temporelle (comme dans le développement ou la maladie), séquencez plusieurs échantillons dans une exécution multiplexée (c’est-à-dire plusieurs bibliothèques sur une seule cellule de flux) pour réduire les variations techniques.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ce flux de travail présente une stratégie pour l’étude des phénotypes de développement et des processus de régulation à l’aide du séquençage unicellulaire. Le multiplexage d’échantillons MULTI-seq permet un test de phénotypage initial à faible coût, tandis que la collecte et la fixation appariées d’échantillons pour scRNA-seq et scATAC-seq permettent une enquête plus approfondie (Figure 1).

Le codage à barres MULTI-seq permet le séquençage combiné de plusieurs échantillons et leur déconvolution informatique ultérieure. L’échantillon d’origine peut être déterminé pour chaque cellule en fonction de leur expression de code-barres (Figure 2A). Ces échantillons combinés peuvent être analysés sous la forme d’un ensemble de données unique à des fins de regroupement cellulaire et d’identification du type de cellule (figure 2B). Étant donné que chaque cellule est codée par code-barres avant la génération GEM, les doublets de cellule auront une forte probabilité de montrer l’expression de plusieurs codes-barres MULTI-seq et une majorité de doublets peuvent donc être identifiés et supprimés avant le regroupement et l’identification du type de cellule (Figure 2C). L’augmentation du nombre de cellules utilisées dans l’étape de génération GEM augmentera la proportion de doublets trouvés. scATAC-seq peut être utilisé pour générer un jeu de données avec des types de cellules correspondant à ceux trouvés par scRNA-seq (Figure 2D). L’appariement de l’expression génique scRNA-seq et des informations d’accessibilité de l’ADN scATAC-seq permet la reconstruction des réseaux de régulation des gènes.

Figure 1
Figure 1 : Schéma démontrant l’utilisation de MULTI-Seq dans l’analyse initiale, suivie d’une analyse séparée de scRNA-Seq et scATAC-Seq dans la caractérisation approfondie des phénotypes, des traitements ou des états pathologiques d’intérêt. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Représentations de réduction dimensionnelle UMAP des données MULTI-seq pour une série allélique de souris knock-out P0 Sstr2 démontrant (a) la déconvolution du génotype pour chaque cellule de l’ensemble de données et (b) l’identification des types de cellules dans l’ensemble de données. La surcharge des cellules pendant l’étape de génération et de codage à barres GEM entraînera une augmentation des doublets cellulaires comme ceux observés dans (c), qui montre les données de (a) et (b) avant l’élimination et le reclusage des doublets. En (d), les données scATAC-Seq provenant de cellules GFP positives obtenues à E16 à partir d’explants rétiniens électroporés avec un plasmide témoin exprimant le GFP à E14. Les types de cellules sont annotés en fonction de l’accessibilité des gènes spécifiques au type cellulaire. Cette figure a été modifiée à partir de Weir, K., Kim, D. W., Blackshaw, S. Régulation de la neurogenèse rétinienne par signalisation de la somatostatine. bioRxiv 2020.09.26.314104 (2020) doi:10.1101/2020.09.26.31410418 et données originales non publiées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

La puissance de MULTI-seq provient de l’intégration transparente des données provenant de plusieurs conditions ou modèles expérimentaux et de l’énorme avantage en termes de coût et de limitation des effets de lot. L’utilisation de MULTI-seq offre une profondeur de phénotypage sans précédent en laboratoire. Des méthodes de multiplexage non génétiques telles que le hachage cellulaire ou le hachage de noyaux ont ouvert la porte à des échantillons multiplexés grâce à l’utilisation d’anticorps à code-barres 7,19,20. Cependant, cela dépend de la disponibilité d’anticorps de haute affinité qui reconnaissent les protéines de surface exprimées sur les cellules ou leurs noyaux, ce qui ne sera pas possible si ces anticorps ne sont pas disponibles ou si les cellules n’expriment pas la surface cellulaire appropriée ou les antigènes nucléaires7. Parce que MULTI-seq utilise des codes-barres oligo modifiés par les lipides pour s’incorporer de manière stable dans les cellules ou leurs noyaux, il permet aux chercheurs de recueillir des données transcriptomiques à partir de jusqu’à 96 échantillons frais ou fixes d’une manière moins chère et plus largement applicable6.

Le suivi du phénotypage initial MULTI-Seq avec scRNA-Seq apparié et scATAC-Seq est suggéré et présenté pour acquérir une compréhension de l’organisation génomique qui coïncide avec les données transcriptomiques1. Cela donne non seulement une idée des régions de l’hétérochromatine et de l’euchromatine, mais aussi une compréhension précieuse des réseaux de facteurs de transcription qui déterminent l’expression des gènes. Une approche multi-omique peut être utilisée pour révéler les changements dynamiques de la chromatine qui se produisent à des points clés des décisions de devenir cellulaire et déterminer les trajectoires cellulaires dans le développement et la maladie 1,21,22. Cela peut être accompli en soumettant bioinformatiquement les données à des interactions pseudo-temporelles, cis-régulatrices et à une analyse de l’empreinte 5,23,24,25. La correction des échantillons et le séquençage multiple dans une exécution multiplexée réduisent les sources d’effet de lot, ce qui permet une comparaison entre les échantillons, par exemple dans le cadre d’une expérience de parcours temporel. Le nombre d’échantillons de tissus requis dépend de la portée de l’expérience. Lors de l’examen des phénotypes associés aux points temporels embryonnaires, les rétines simples sont souvent suffisantes et peuvent fournir des centaines de milliers de cellules. Une seule rétine peut ne pas fournir suffisamment de cellules dans des schémas expérimentaux plus complexes: électroporations ex vivo d’explants rétiniens, sondage pour des populations de cellules rares ou modèles génétiques avec une activation CRE insuffisante. Bien qu’une seule rétine puisse fournir quelques centaines de cellules, celles-ci ne captureront pas toute la complexité tissulaire. Pour de telles expériences, une optimisation sera nécessaire en fonction des besoins du chercheur. En utilisant ces techniques, on peut mieux comprendre comment les gènes analysés dans MULTI-seq sont régulés au cours de processus dynamiques tels que le développement et la maladie.

La régulation des réseaux de régulation des gènes est au cœur de la compréhension des processus cellulaires et de la façon dont ils contribuent au développement et à la maladie 1,26,27. Le flux de travail présenté ici peut être utilisé pour identifier ces réseaux de régulation des gènes dans des types de cellules spécifiques. Cependant, ce protocole a été optimisé pour une utilisation avec le tissu rétinien de souris. L’optimisation de diverses étapes, telles que le temps de lyse ou de dissociation, les vitesses/temps de centrifugation et le nombre d’étapes de filtration, peut être nécessaire pour maximiser le nombre de cellules ou de noyaux et minimiser les débris cellulaires dans les suspensions cellulaires provenant d’autres types de tissus, d’échantillons ex vivo ou d’espèces, que les échantillons soient frais, congelés ou fixés dans du méthanol. Le temps de fixation du méthanol peut devoir être augmenté si les échantillons montrent des niveaux élevés de cellules viables avec coloration au bleu trypan. La technique MULTI-seq introduit de nombreuses étapes de lavage supplémentaires par rapport au scRNA-seq traditionnel. Pour éviter l’élimination accidentelle de cellules ou d’ADN précieux, il est prudent d’optimiser les vitesses de centrifugation et de maintenir les surnageants qui seraient normalement jetés dans le codage à barres cellulaire, le nettoyage post-GEM RT et les étapes de construction de la bibliothèque de codes-barres sur la glace jusqu’à ce que cette étape ait été vérifiée pour réussir. L’une des limites de MULTI-seq est le nombre limité de cellules, et donc d’échantillons, qui peuvent être séquencés à partir d’un seul puits dans l’étape de génération GEM. Il est recommandé de ne pas essayer de surcharger excessivement les cellules au cours de cette étape pour éviter une augmentation substantielle de la capture de cellules doublet. Évitez de charger un puits GEM avec plus de 20 000 cellules. Au contraire, plusieurs puits peuvent être préparés à partir d’une seule suspension combinée et multiplexés pendant le séquençage. Cela nécessitera la préparation d’un volume suffisant de suspension cellulaire pour la génération de GEM et l’ajout de répliques aux étapes 5, 6 et 7 et augmentera le coût du séquençage car davantage de lectures totales sont nécessaires pour plus de cellules. Avec une optimisation appropriée, ce flux de travail permettra une identification rentable et rapide des phénotypes spécifiques au type cellulaire et des réseaux de régulation des gènes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions Linda Orzolek du Johns Hopkins Transcriptomics and Deep Sequencing Core pour son aide dans le séquençage des bibliothèques produites et Lizhi Jiang pour l’exécution des explants rétiniens ex vivo .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette filter tips
10% Tween 20 Bio-Rad 1662404
100 µM Barcode Solution Request from Gartner lab https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested
=true
100% Ethanol Millipore Sigma E7023-500ML
100% Methanol Millipore Sigma 322415-100ML
10x Chip Holder 10x Genomics 1000195
10x Chromium controller & Accessory Kit 10x Genomics PN-120263
15mL Centrifuge Tube Quality Biological P886-229411
40 µm FlowMi Cell Strainer Bel-Art H13680-0040
50 µM Anchor Solution Sigma or request from Gartner lab https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested
=true
50 µM Co-Anchor Solution Sigma or request from Gartner lab https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested
=true
5200 Fragment Analyzer system Agilent M5310AA
70 um FlowMi cell strainer Bel-Art H13680-0070
Allegra X-12R Centrifuge VWR BK392302
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9647
Chromium Next GEM Chip G 10x Genomics PN-1000120
Chromium Next GEM Chip H 10x Genomics PN-1000161
Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.1 10x Genomics PN-1000175
Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1 10x Genomics PN-1000121
Digitonin Fisher Scientific BN2006
Dissection microscope Leica
DNA LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 22431021
Dry Ice
EVA Foam Ice Pan Tequipment 04393-54
FA 12-Capillary Array Short, 33 cm Agilent A2300-1250-3355
Fisherbrand Isotemp Water Bath Fisher Scientific 15-460-20Q
Forma CO2 Water Jacketed Incubator ThermoFisher Scientific 3110
Glycerol 50% Aqueous solution Ricca Chemical Company 3290-32
Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber Fisher Scientific 02-671-51B
Illumina NextSeq or NovaSeq Illumina
Kapa Hifi Hotstart ReadyMix HiFi 7958927001
Low TE Buffer Quality Biological 351-324-721
Magnesium Chloride Solution 1 M Sigma-Aldrich M1028
Magnetic Separator Rack for 1.5 mL tubes Millipore Sigma 20-400
Magnetic Separator Rack for 200 µL tubes 10x Genomics NC1469069
MULTI-seq Primer Sigma or IDT See sequence list
MyFuge Mini Centrifuge Benchmark Scientific C1008
Nonidet P40 Substitute Sigma-Aldrich 74385
Nuclease-free water Fisher Scientific AM9937
P2, P10, P20, P200, P1000 micropipettes Eppendorf
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation LK003150
PBS pH 7.4 (1X) Fisher Scientific 10010-023
Qiagen Buffer EB Qiagen 19086
Refridgerated Centrifuge 5424 R Eppendorf 2231000655
RNase-free Disposable Pellet Pestles Fisher Scientific 12-141-368
RNasin Plus RNase Inhibitor Promega N2615
RPI primer Sigma or IDT See sequence list
Single Index Kit N, Set A 10x Genomics PN-1000212
Single Index Kit T Set A 10x Genomics PN-1000213
Sodium Chloride Solution 5 M Sigma-Aldrich 59222C
SPRIselect Reagent Kit Beckman Coulter B23318
Standard Disposable Transfer Pipettes Fisher Scientific 13-711-7M
TempAssure PCR 8-tube strip USA Scientific 1402-4700
Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.4 Sigma-Aldrich T2194
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) Corning 25-900-CI
Universal I5 primer Sigma or IDT See sequence list
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems 4375786
Vortex Mixer VWR 10153-838

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370, (2020).
  2. Nagalakshmi, U., et al. The Transcriptional Landscape of the Yeast Genome Defined by RNA Sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
  3. Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
  4. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50, 96 (2018).
  5. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36, 411-420 (2018).
  6. McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 16, 619-626 (2019).
  7. Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19, 224 (2018).
  8. Chen, X., Miragaia, R. J., Natarajan, K. N., Teichmann, S. A. A rapid and robust method for single cell chromatin accessibility profiling. Nature Communications. 9, 5345 (2018).
  9. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. , 8598 (2020).
  10. Clark, B. S., et al. Single-Cell RNA-Seq Analysis of Retinal Development Identifies NFI Factors as Regulating Mitotic Exit and Late-Born Cell Specification. Neuron. 102, 1111-1126 (2019).
  11. Zheng, Y., et al. A human circulating immune cell landscape in aging and COVID-19. Protein Cell. 11, 740-770 (2020).
  12. Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37, 925-936 (2019).
  13. Worthington Biochemical Corporation. Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , (2020).
  14. 10x Genomics. Chromium Single Cell 3' Reagent Kits v3 User Guide. , (2020).
  15. Agilent. DNF-468 HS Genomic DNA 50 kb Kit Quick Guide for Fragment Analyzer Systems. , (2015).
  16. ThermoFisher Scientific. Qubit dsDNA HS Assay Kits. ThermoFisher Scientific. , (2015).
  17. 10x Genomics. Chromium Single Cell ATAC Reagent Kits User Guide (v1.1 Chemistry). , (2020).
  18. Weir, K., Kim, D. W., Blackshaw, S. Regulation of retinal neurogenesis by somatostatin signaling. bioRxiv. , (2020).
  19. Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14, 865-868 (2017).
  20. Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10, 2907 (2019).
  21. Ma, S., et al. Chromatin Potential Identified by Shared Single-Cell Profiling of RNA and Chromatin. Cell. , (2020).
  22. Buenrostro, J. D., et al. Integrated Single-Cell Analysis Maps the Continuous Regulatory Landscape of Human Hematopoietic Differentiation. Cell. 173, 1535-1548 (2018).
  23. Pliner, H. A., et al. Cicero Predicts cis-Regulatory DNA Interactions from Single-Cell Chromatin Accessibility Data. Molecular Cell. 71, 858-871 (2018).
  24. Granja, J. M., et al. ArchR: An integrative and scalable software package for single-cell chromatin accessibility analysis. BioRxiv. , (2020).
  25. Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177, 1888-1902 (2019).
  26. METABRIC Group. The genomic and transcriptomic architecture of 2,000 breast tumours reveals novel subgroups. Nature. 486, 346-352 (2012).
  27. Izadi, F. Differential Connectivity in Colorectal Cancer Gene Expression Network. Iranian Biomedical Journal. 23, 34-46 (2019).

Tags

Neurosciences Numéro 169 Développement Maladie scRNA-Seq scATAC-Seq MULTI-Seq multiplex Chromatine
Analyse multiplexée de l’expression génique rétinienne et de l’accessibilité de la chromatine à l’aide de scRNA-Seq et scATAC-Seq
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weir, K., Leavey, P., Santiago, C.,… More

Weir, K., Leavey, P., Santiago, C., Blackshaw, S. Multiplexed Analysis of Retinal Gene Expression and Chromatin Accessibility Using scRNA-Seq and scATAC-Seq. J. Vis. Exp. (169), e62239, doi:10.3791/62239 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter