Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Multiplekset analyse af retinal genekspression og kromatintilgængelighed ved hjælp af scRNA-Seq og scATAC-Seq

Published: March 12, 2021 doi: 10.3791/62239
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2,3,4,5,6
1Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Psychiatry and Behavioral Science, The Johns Hopkins Hospital, 3Department of Ophthalmology, The Johns Hopkins Hospital, 4Department of Neurology, The Johns Hopkins Hospital, 5Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Kavli Neuroscience Discovery Institute, Johns Hopkins University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Her viser forfatterne nytten af MULTI-seq til phenotyping og efterfølgende parret scRNA-seq og scATAC-seq til karakterisering af transkriptomiske og kromatin tilgængelighedsprofiler i nethinden.

Abstract

Kraftfulde næste generations sekventeringsteknikker tilbyder robust og omfattende analyse for at undersøge, hvordan retinale genregulerende netværk fungerer under udvikling og i sygdomstilstande. Enkeltcelle RNA-sekventering giver os mulighed for omfattende at profilere genekspressionsændringer observeret i retinal udvikling og sygdom på celleniveau, mens enkeltcellet ATAC-Seq gør det muligt at profilere analyse af kromatintilgængelighed og transkriptionsfaktorbinding ved lignende opløsning. Her beskrives brugen af disse teknikker i nethinden, og MULTI-Seq demonstreres, hvor individuelle prøver mærkes med et modificeret oligonukleotid-lipidkompleks, hvilket gør det muligt for forskere både at øge omfanget af individuelle eksperimenter og reducere omkostningerne væsentligt.

Introduction

At forstå, hvordan gener kan påvirke celleskæbne, spiller en central rolle i forhørsprocesser som sygdom og embryonal progression. De komplekse forhold mellem transkriptionsfaktorer og deres målgener kan grupperes i genregulerende netværk. Stigende beviser placerer disse genregulerende netværk i centrum for både sygdom og udvikling på tværs af evolutionære slægter1. Mens tidligere teknikker såsom qRT-PCR fokuserede på et enkelt gen eller et sæt gener, giver anvendelsen af high-throughput sekventeringsteknologi mulighed for profilering af komplette cellulære transkriptomer.

RNA-seq giver et indblik i transkriptomik i stor skala 2,3. Enkeltcelle RNA-sekventering (scRNA-seq) giver efterforskere mulighed for ikke kun at profilere transkriptomer, men forbinde specifikke celletyper med genekspressionsprofiler4. Dette opnås bioinformatisk ved at fodre individuelle celleprofiler i sorteringsalgoritmer ved hjælp af kendte genmarkører5. Multiplexing ved hjælp af lipidmærkede indekssekventering (MULTI-seq) tilbyder hidtil uset mangfoldighed i antallet af scRNA-Seq-profiler, der kan indsamles6. Denne lipidbaserede teknik adskiller sig fra andre prøveindekseringsteknikker såsom cellehashing, der er afhængige af tilstedeværelsen af overfladeantigener og antistoffer med høj affinitet i stedet for plasmamembranintegration7. Ikke alene er det nu muligt at profilere genekspressionsprofiler i celletyper, men forskellige eksperimenter kan kombineres til et enkelt sekventeringsbibliotek, hvilket dramatisk sænker omkostningerne ved et individuelt scRNA-seq-eksperiment6. Omkostningerne ved scRNA-seq kan virke uoverkommelige til brug i fænotypeforsøg, hvor mange forskellige genotyper, tilstande eller patientprøver analyseres, men multiplexing tillader kombinationen af op til 96 prøver i et enkelt bibliotek6.

Profilering af genekspression via scRNA-seq har ikke været den eneste high-throughput sekventeringsbaserede teknik til at revolutionere den nuværende forståelse af, hvordan molekylære mekanismer dikterer celle skæbne. Mens forståelse af, hvilke gen transkripter der er til stede i en celle, muliggør identifikation af celletype, er det lige så vigtigt at forstå, hvordan genomisk organisation regulerer udvikling og sygdomsprogression. Tidlige undersøgelser var afhængige af at detektere DNase-medieret spaltning af sekvenser, der ikke var bundet til histoner, efterfulgt af sekventering af de resulterende DNA-fragmenter for at identificere regioner med åbent kromatin. I modsætning hertil giver enkeltcelleassay til transposon tilgængelig kromatinsekventering (scATAC-seq) forskere mulighed for at undersøge DNA med en domesticeret transposon for let at profilere åbent kromatin på enkeltnukleotidniveau8. Dette har gennemgået en lignende skalering som scRNA-seq, og nu kan efterforskere identificere individuelle celletyper og profilfænotyper på tværs af tusindvis af individuelle genomer8.

Parringen af scRNA-seq og scATAC-seq har gjort det muligt for forskere at profilere tusindvis af celler til at bestemme cellepopulationer, genomisk organisation og genregulerende netværk i sygdomsmodeller og udviklingsprocesser 9,10,11,12. Her skitserer forfatterne, hvordan man først kan bruge MULTI-seq til at kondensere fænotypning af et utal af dyremodeller og anvende parret scRNA-seq og scATAC-seq for at få en bedre forståelse af kromatinlandskabet og regulatoriske netværk i disse dyremodeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Brugen af dyr til disse undersøgelser blev udført ved hjælp af protokoller godkendt af Johns Hopkins Animal Care and Use Committee i overensstemmelse med ARRIVE-retningslinjerne og blev udført i overensstemmelse med relevante retningslinjer og regler.

1. MULTI-seq

  1. Forberedelse af medier
    1. Ovomucoidhæmmer, ovomucoidhæmmer, ovomucoidhæmmer og 10 mg albumin pr. ml Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) fremstilles og afbalanceres i 30 minutter før brug13. Ligevægt med 95% O2:5% CO2 i en inkubator.
      1. Papaindissociationsopløsning, 20 enheder/ml papain og 0,005 % DNase fremstilles i EBSS under dette inkubationstrin13.
        BEMÆRK: Et hætteglas med DNase-opløsning vil være tilstrækkeligt til 5 prøver. Det kan være nødvendigt at rekonstituere yderligere hætteglas, hvis der udføres MULTI-seq på mere end 5 prøver.
    2. Forbered lipidmodificerede oligo stregkodningsopløsninger.
      1. Lav en unik stregkodefortynding for hver prøve ved at kombinere 0,5 μL 100 μM stregkodelageropløsning med 4,5 μL phosphatbufferet saltvand (PBS).
      2. For at forberede anker: stregkodeopløsning i 1: 1 molær forhold kombineres 4,4 μL 10 μM stregkodefortynding, 0,9 μL 50 μM ankeropløsning og 16,7 μL PBS og placeres på is. Slutkoncentrationen for både stregkodestrenge og ankerstrenge bør være 2 μM.
      3. For at forberede co-ankeropløsning kombineres 0,88 μL 50 μM co-anchor opløsning og 21,12 μL PBS og placeres på is. Den endelige koncentration af co-ankeret skal være 2 μM. Multiplicer volumenerne i dette trin med 1,1x antallet af prøver.
    3. For at fremstille 1% BSA i PBS opløses 0,1 g bovint serumalbumin (BSA) i 10 ml PBS og anbringes på is.
    4. For at fremstille PBS med RNase-hæmmer kombineres 2,5 μL 40 U/μL RNase-hæmmer med 197,5 μL PBS og opbevares på is. Multiplicer mængderne i dette trin med 1,1x antallet af prøver.
  2. Eksempel dissociation
    1. Afliv dyr gennem cervikal dislokation og /eller CO2 asfyksi i overensstemmelse med institutionelle IACUC-krav. Metode til eutanasi vil afhænge af institutionelle krav og anvendte modelorganisme.
    2. Disseker nethinden fra begge øjne i koldt PBS under et dissektionsmikroskop og overfør til et sterilt 1,5 ml mikrocentrifugerør ved hjælp af en overførselspipette.
    3. 500 μL papainopløsning overføres til et 1,5 ml rør for hver prøve.
    4. Anbring prøver i papainopløsningen, og hætterørene straks.
    5. Rørene indeholdende prøverne inkuberes ved 37 °C, 5 % CO2 i 30 min. Vend hætteglassene 3 gange hvert 10. minut. Prøverne skal gradvist adskilles med hver runde af inversioner.
    6. Hætteglassene returneres til stuetemperatur, og hver prøve tritureres 3-4 gange med en 1 ml pipette indstillet til 300 μL.
    7. Lad eventuelle stykker usocialt væv, der er tilbage efter trituration, sætte sig.
    8. Fjern den uklare cellesuspension, mens du undgår stykker usocialt væv, og anbring hver prøves cellesuspension i et nyt sterilt 15 ml skruelåget rør.
    9. Cellesuspensionerne centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
    10. Under centrifugeringstrinnet skal du forberede cellegensuspensionmediet.
      1. 857 μL EBSS (hætteglas 1) blandes med 95 μL rekonstitueret albumin-ovomucoidhæmmeropløsning i et sterilt 1,5 ml skruelåget rør. Der tilsættes 48 μL DNase-opløsning gemt fra 1.1.1. Multiplicer mængderne i dette trin med 1,1x antallet af prøver.
    11. Supernatanten kasseres, idet cellepillerne tilbageholdes, og cellepillerne straks resuspenderes i 1 ml cellegenopsuspensionsopløsning, der er fremstillet i trin 1.2.10.
    12. Forbered diskontinuerlig densitetsgradient.
      1. For hver prøve tilsættes 1,6 ml ovomucoidhæmmeropløsning til et nyt 15 ml sterilt skruelåget rør og lag forsigtigt cellesuspensionen ovenpå. Grænsefladen mellem de to lag af gradienten skal være synlig, men en vis blanding påvirker ikke resultaterne.
    13. Centrifuger de diskontinuerlige densitetsgradienter ved 70 x g i 6 minutter ved stuetemperatur. De dissocierede celler skal pelletere i bunden af rørene, mens membranfragmenter forbliver ved grænsefladen.
    14. Supernatanten kasseres, og der tilsættes 200 μL PBS for at vaske de pelleterede celler. Centrifuger ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
    15. Supernatanten kasseres, og cellerne resuspenderes i 180 μL PBS med RNase-hæmmer. Før cellerne gennem en 40 μm cellestam ind i et sterilt 1,5 ml mikrocentrifugerør.
  3. Celle stregkodning
    1. Der tilsættes 20 μL anker:stregkodeopløsning til hver prøve, og pipetter forsigtigt for at blande. Sørg for, at hver prøve modtager en unik anker: stregkodeopløsning og inkuberes på is i 5 minutter.
      1. Forbered de materialer, der kræves til gelperle-i-emulsion (GEM) generering og stregkodning under denne inkubation14.
    2. Der tilsættes 20 μL co-anchor opløsning til hver prøve, og pipetter forsigtigt for at blande. Inkuberes på is i 5 min.
    3. Der tilsættes 1 ml iskold 1% BSA i PBS til hver prøve, og cellerne centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    4. Fjern supernatanten uden at forstyrre cellepillen, og tilsæt 400 μL iskold 1% BSA i PBS. Centrifuger ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
      1. Trin 1.3.4 gentages for i alt 2 vaske. Supernatanten fjernes, og der resuspenderes i 400 μL iskold 1% BSA i PBS.
    5. Bestem koncentrationen af celler for hver prøve ved hjælp af et hæmocytometer.
      1. Bestem det samlede antal celler, der skal indlæses for hver prøve. Dette er typisk det samlede antal ønskede celler divideret med antallet af prøver. Men hvis en biologisk replikat for en tilstand gik tabt, kan dens andel opdeles blandt de andre biologiske replikater fra denne tilstand.
      2. Det ønskede antal celler for hver prøve divideres med cellekoncentrationen af prøven beregnet i trin 3.5 for at bestemme det volumen, der kræves for at indlæse det ønskede antal celler.
    6. De i trin 3.5.2 beregnede mængder fra hver prøve kombineres i et nyt sterilt centrifugeglas på 1,5 ml. Det er klogt at fordoble volumenet fra hver prøve i tilfælde af svigt i GEM-generering.
      1. Bestem "endelig" cellekoncentration af de kombinerede prøver ved hjælp af et hæmocytometer.
  4. GEM generation og stregkodning
    1. Brug kombinerede prøver til at generere og stregkode GEM'er14.
  5. Post GEM-RT Oprydning og cDNA-forstærkning
    1. Forbered materialer til oprydning efter GEM reverse transkriptase og cDNA-forstærkning i henhold til producentens anvisninger med følgende ændringer14. Udfør oprydning efter GEM-RT efter størrelsesvalg14.
      1. Forøg volumenet af 80% ethanol fremstillet med 2 ml.
      2. Forbered cDNA Amplification Mix på is14. Der tilsættes 1 μL 2,5 μM MULTI-seq primer til cDNA amplifikationsblandingen. Vortex til 5 s og centrifuge til 5 s i en stationær minicentrifuge.
    2. Udfør cDNA-forstærkning14. cDNA kan opbevares ved 4 °C i op til 72 timer på dette tidspunkt.
    3. Udfør cDNA-oprydning efter størrelsesvalg14. Den endogene transkript cDNA kan opbevares ved 4 ° C i op til 72 timer eller ved -20 ° C i op til 4 uger på dette tidspunkt.
      1. Kassér ikke supernatanten fra den første runde af størrelsesvalg . Denne fraktion indeholder prøvestregkoderne. Overfør supernatanten til et nyt sterilt 1,5 ml mikrocentrifugerør.
      2. Opbevar supernatanten på is.
    4. Vortex til resuspend paramagnetisk perlebaseret størrelsesvalgsreagens og tilsæt 260 μL paramagnetisk perlebaseret størrelsesvalgsreagens (endelig 3,2x) og 180 μL 100% isopropanol (1,8x) til supernatanten. Pipetter blandingen 10 gange og inkuberes ved stuetemperatur i 5 min.
    5. Placer røret på et magnetisk rack, og vent på, at opløsningen er klar. Fjern og kassér derefter supernatanten.
    6. Tilsæt 500 μL 80% ethanol til perlerne og lad stå i 30 s. Fjern og kassér supernatanten.
      1. Gentag i alt 2 vaske.
    7. Centrifuger kortvarigt perlerne og vend tilbage til magnetstativet. Start en timer i 2 min.
    8. Fjern den resterende ethanol med en P10-pipette, og lufttør perlerne på magnetstativet i resten af de 2 minutter. Må ikke overstige 2 min.
    9. Fjern perlerne fra magnetstativet, og resuspend i 100 μL elueringsbuffer (EB). Pipetter grundigt for at resuspend.
    10. Inkuberes ved stuetemperatur i 2 min.
    11. Vend tilbage til magnetstativet, og vent på, at opløsningen er klar.
    12. Overfør supernatanten til et frisk 1,5 ml mikrocentrifugerør.
    13. Trin 1.5.4 til 1.5.12 gentages. Volumenet af ebbuffer, der blev anvendt i trin 1.5.9, halveres.
    14. Bestem stregkode-DNA-koncentration og størrelsesfordeling ved hjælp af et dsDNA-analysesæt med høj følsomhed og fluorometer- og fragmentanalysator15,16. Stregkoden cDNA kan opbevares ved 4 °C i op til 72 timer eller ved -20 °C i op til 4 uger på dette tidspunkt.
  6. Opbygning af stregkodebibliotek
    1. Forbered 1 ml 80% ethanol.
    2. Forbered stregkodebibliotek PCR-masterblanding i et sterilt PCR-striprør: kombiner 26,25 μL 2x hot start PCR-klar blanding, 2,5 μL 10 μM Universal i5 primer, 2,5 μL 10 μM RPI primer, 3,5 ng stregkode cDNA (volumen bestemt ved koncentration fra trin 5.14) og nok nukleasefrit vand til at bringe det endelige volumen til 50 μL.
      1. Brug en unik RPI-primer til hvert stregkodebibliotek, hvis flere MULTI-seq-biblioteker sekventeres sammen.
    3. Udsæt stregkodebibliotekets mastermix til en biblioteksforberedelse PCR: 95 ° C i 5 min; 10 cyklusser på 98 °C i 15 s, 60 °C i 30 s, 72 °C i 30 s 72 °C i 1 min. og hold derefter ved 4 °C.
    4. Vortex for at resuspendere det paramagnetiske perlebaserede størrelsesvalgsreagens.
    5. Fjern PCR-produktet fra termocyklisten, og tilsæt 80 μL (1,6x) paramagnetisk perlebaseret reagens til valg af størrelse. Pipetter grundigt.
    6. Inkuberes ved stuetemperatur i 5 min. Anbring på magnetseparator i høj position, og vent på, at opløsningen er klar.
    7. Fjern og kassér supernatanten.
    8. Tilsæt 200 μL 80% ethanol til perlerne og lad dem stå i 30 s. Fjern og kassér supernatanten.
      1. Trin 1.6.8 gentages for i alt 2 vaske.
    9. Centrifuger røret kort og placer det på den magnetiske separator i lav position. Start en timer i 2 min.
    10. Fjern den resterende ethanol med en P20-pipette, og lufttør perlerne på magnetseparatoren i resten af de 2 minutter. Må ikke overstige 2 min.
    11. Røret fjernes fra den magnetiske separator, og perlerne sættes igen i 25 μL buffer EB. Pipette blandes grundigt for at genoplive perlerne.
    12. Inkuberes i 2 minutter ved stuetemperatur.
    13. Vend tilbage til den magnetiske separator i lav position, og vent på, at opløsningen er klar. Overfør supernatanten til et nyt PCR-strimmelrør.
    14. Kvantificer ekspressionsbibliotek og stregkodebibliotekskoncentration og fragmentstørrelsesfordeling ved hjælp af adsDNA-analysesæt med høj følsomhed og fluorometer- og fragmentanalysator.
  7. 3' Konstruktion af genekspressionsbibliotek
    1. Udfør 3' genekspressionsbibliotekskonstruktion i henhold til producentens anvisninger14.
  8. Sekventering
    1. Ud over det endogene cDNA-bibliotek, der blev forstærket i trin 7, skal du indsende stregkodebiblioteket, der er forstærket i trin 6. For nemheds skyld skal du indsende disse biblioteker separat eller som en omkostningseffektiv foranstaltning inkludere en aliquot af prøvelinjekodningsmaterialet med det endogene cDNA-bibliotek. Mål mellem 20.000-50.000 cDNA og 3.000-5.000 stregkodelæsninger pr. celle.
    2. Konverter de resulterende sekventerings bcl-filer til fastq-filer med cellranger mkfastq og tæl matricer genereret fra disse ved cellrangerantal.
    3. Dekonvolute prøver efter Cellranger-analyse ved hjælp af deMULTIplex r-pakken, der er tilgængelig på MULTI-seq GitHub-lageret (https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/MULTI-seq).

2. Parret scRNA-seq og scATAC-seq

  1. Flashfrysningsvæv til scATAC-seq og methanolfiksering af retinale celler til scRNA-seq
    1. Forberedelse af medier
      1. For at forberede opløsningerne til retinal dissociation gentages trin 1.1.1 og 1.1.4.
      2. Forbered et ethanol tørisbad i en lille isspand.
      3. Der fremstilles 15 ml 70 % ethanol ved tilsætning af 10,5 ml ethanol til 4,5 ml nukleasefrit vand.
      4. Tilsæt nok tøris til isspanden (helst i pilleform), at 15 ml væske vil stige for bare at dække isen. Tilsæt 15 ml ethanol.
      5. PBS anbringes på is og 1 ml alikvoter 100 % methanol i en praktisk -20 °C fryser.
    2. Forberedelse af prøver
      1. Følg trin 1.2.1 og 1.2.2 for at isolere nethinden; men denne gang placere hver nethinde i et separat mikrocentrifugerør.
      2. For prøver bestemt til scATAC-seq fjernes eventuel væske fra mikrocentrifugerøret ved hjælp af en P200-pipette og straks hættes og røret anbringes i ethanol-tørisbad for at flashfryse prøven.
      3. For prøverne bestemt til scRNA-seq gentages trin 1.2.3 til 1.2.15 på den dissekerede nethinde for at dissociere cellerne.
      4. Cellerne centrifugeres ved 300 x g i 3 minutter ved stuetemperatur.
      5. Fjern supernatanten uden at forstyrre cellepillen.
      6. Der tilsættes 1 ml kølet PBS, og bland forsigtigt 10 gange, eller indtil cellerne er helt suspenderet.
      7. Centrifuger ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
        1. Trin 2.1.2.5 til 2.1.2.7 gentages for i alt 2 vaske.
      8. Fjern supernatanten uden at forstyrre cellepillen.
      9. Der tilsættes 100 μL kølet PBS, og der blandes forsigtigt 10 gange, eller indtil cellerne er helt suspenderet.
      10. Begynd at hvirvle røret ved den laveste hastighedsindstilling. Tilsæt 900 μL kølet methanol (-20 °C) dråbe for dråbe, mens du fortsætter med forsigtigt at hvirvel røret for at forhindre cellerne i at klumpe.
      11. Inkuber cellerne på is i 15 min.
      12. Bestem koncentrationen af de faste celler ved hjælp af et hæmocytometer.
      13. Vurder effektiviteten af fikseringstrinnet ved hjælp af trypan blue. En høj brøkdel af levedygtige celler indikerer, at der kræves mere fikseringstid.
      14. Det frosne væv og de faste celler opbevares ved -80 °C.
  2. Kerner Isolering fra flash frosset væv til scATAC-seq
    1. Forberedelse af medier
      1. Lysisfortyndingsbufferen fremstilles ved at kombinere 9,77 ml nukleasefrit vand, 100 μL 1 M Tris-HCi (pH 7,4), 100 μL 1 M NaCl, 30 μL 1 MMgCl2 og 0,1 g BSA.
      2. Lysisfortyndingsbufferen klargøres forud, f.eks. dagen før, og den opbevares ved 4 °C. På protokollens dag skal du placere på is.
      3. 20x-nuklebuffer til ækvilibrering leveret af producenten af scATAC-kittet fra -20 °C til stuetemperatur. Vortex og centrifuge kort.
      4. 1x lysisbufferen klargøres ved at inkubere 5 % Digitonin-opløsning i et 65 °C vandbad, indtil bundfaldet er opløst. Kombiner derefter 2 ml lysisfortyndingsbuffer, 20 μL 10% Tween-20, 20 μL Nonidet P40-erstatning (kan alternativt mærkes IGEPAL) og 4 μL Digitonin.
      5. Opbevar 1x lysisbufferen på is.
      6. For at forberede 0,1x lysisbufferen kombineres 1,8 ml lysisfortyndingsbuffer med 200 μL af 1x lysisbufferen og opbevares på is.
      7. For at forberede vaskebufferen kombineres 2 ml lysisfortyndingsbuffer og 20 μL 10% Tween-20 og opbevares på is.
      8. For at forberede den fortyndede kernebuffer kombineres 950 μL nukleasefrit vand med 50 μL kernebuffer (20x) og opbevares på is.
    2. Isolering af kerner
      1. Optø ikke prøven før lysis. Der tilsættes 500 μL kølet 0,1x lysisbuffer til et 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende den frosne prøve. Homogeniser straks 15x ved hjælp af en pelletpestle.
      2. Inkuberes i 5 minutter på is. Forbered de materialer, der kræves til scATAC-transponering under dette inkubationstrin17.
      3. Pipette blandes 10 gange med en 1 ml pipette og inkuberes i 10 minutter på is. Komplet forberedelse af de materialer, der kræves til scATAC-transponering under dette inkubationstrin, hvis det ikke allerede er afsluttet. Det er unødvendigt at forberede mere fortyndet kernebuffer.
      4. Der tilsættes 500 μL kølet vaskebuffer til de lysede celler. Pipette blanding 5x.
      5. Før suspensionen gennem en 70 μm cellestam ind i et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør. Der filtreres ~300 μL ad gangen ved hjælp af en ny cellesi på 70 μm hver gang.
      6. Før den opsamlede gennemstrømning gennem en 40 μm cellestam ind i et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør og opbevar på is.
      7. Bestem kernekoncentrationen ved hjælp af et hæmocytometer. Baseret på kernekoncentrationen og det samlede volumen af cellesuspensionen beregnes det samlede antal dissocierede kerner.
      8. Centrifuger ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C, og supernatanten fjernes uden at forstyrre kernepellet.
      9. For at skabe kernestammen baseret på det samlede kerneantal bestemt i trin 2.2.2.7 resuspenderes kernerne i tilstrækkelig fortyndet kernebuffer til at nå en ønsket kernekoncentration.
        BEMÆRK: Ønsket kernekoncentration er baseret på den målrettede kernegenvinding til scATAC-seq-eksperimentet og bestemmes ud fra retningslinjerne for kernekoncentration, der findes i producentens protokol17. For eksempel, hvis 10.000 kerner i sidste ende ønskes, er den ønskede kernekoncentration for kernebestanden mellem 3.080 og 7.700 kerner / μL. Det kan være bedst at sigte mod midten af intervallet i koncentration.
      10. Bestem kernekoncentrationen ved hjælp af et hæmocytometer.
      11. Fortsæt straks til scATAC-transposition ved hjælp af det forberedte kernelager17.
  3. Rehydrering af methanolfaste celler til brug i scRNA-Seq
    1. Forberedelse af medier
      1. For at forberede vaske-/fortyndingsbufferen opløses 0,01 g BSA i 1 ml PBS. Derefter tilsættes 12,5 μL 40 U/μL RNase inhibitor og blandes forsigtigt. Opbevares på is.
    2. Celle rehydrering
      1. Centrifuger methanolfaste celler i et 1,5 ml mikrocentrifugerør ved 3000 x g i 10 minutter ved 4 °C. Fjern derefter supernatanten.
      2. Der tilsættes 200 μL køle-/fortyndingsbuffer til mikrocentrifugerøret. Centrifuger ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C, og fjern supernatanten. Gentag i alt 2 vaske.
        BEMÆRK: Forbered de materialer, der kræves til GEM-generering og stregkodning i løbet af de to foregående trin14.
      3. For at forberede cellebeholdningen, baseret på det samlede celleantal beregnet i punkt 2.1.2.12, resuspenderes cellerne i tilstrækkelig vaske-/fortyndingsbuffer til at opnå den ønskede cellekoncentration. Foretrukne cellekoncentrationer er mellem 700 og 1200 celler / μL.
      4. Bestem cellekoncentrationen af cellebestanden ved hjælp af et hæmocytometer.
      5. Fortsæt straks til GEM-generering og stregkodning ved hjælp af cellebeholdningen14.
    3. Sekventering
      1. Når du udfører tidsforløbsanalyse (som i udvikling eller sygdom), skal du sekvensere flere prøver i en multiplekset kørsel (dvs. flere biblioteker på en enkelt flowcelle) for at skære ned på teknisk variation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne arbejdsgang fastlægger en strategi for undersøgelse af udviklingsfænotyper og reguleringsprocesser ved hjælp af enkeltcellesekventering. MULTI-seq prøvemultiplexing muliggør en indledende billig fænotypningsassay, mens parret indsamling og fiksering af prøver til scRNA-seq og scATAC-seq giver mulighed for mere dybdegående undersøgelse (figur 1).

MULTI-seq-stregkodning muliggør kombineret sekventering af flere prøver og deres efterfølgende beregningsmæssige dekonvolution. Oprindelsesprøven kan bestemmes for hver celle baseret på deres stregkodeudtryk (figur 2A). Disse kombinerede prøver kan analyseres som et enkelt datasæt med henblik på celleklyngedannelse og identifikation af celletype (figur 2B). Da hver celle er stregkodet før GEM-generering, vil celledobletter have stor sandsynlighed for at vise udtryk for flere MULTI-seq stregkoder, og et flertal af dubletter kan derfor identificeres og fjernes inden klyngedannelse og identifikation af celletype (figur 2C). Forøgelse af antallet af celler, der anvendes i GEM-genereringstrinnet, vil øge andelen af fundne dubletter. scATAC-seq kan bruges til at generere et datasæt med celletyper, der matcher dem, der findes af scRNA-seq (figur 2D). Parringen af scRNA-seq genekspression og scATAC-seq DNA-tilgængelighedsinformation muliggør rekonstruktion af genregulerende netværk.

Figure 1
Figur 1: Skematisk demonstration af brugen af MULTI-Seq i indledende analyse efterfulgt af separat scRNA-Seq og scATAC-Seq analyse i dybdegående karakterisering af fænotyper, behandlinger eller sygdomstilstande af interesse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: UMAP-dimensionelle reduktionsrepræsentationer af MULTI-seq-data for en allelserie af P0 Sstr2 knockout-mus, der demonstrerer (a) dekonvolutionen af genotype for hver celle i datasættet og (b) identifikationen af celletyper i datasættet. Overbelastning af celler under GEM-generering og stregkodningstrin vil resultere i en stigning i celledobler som dem, der ses i (c), som viser dataene fra (a) og (b) før fjernelse af dubletter og tilbagesøgning. I (d) scATAC-Seq-data fra GFP-positive celler opnået ved E16 fra retinale explants elektroporeret med et GFP-ekspressivt kontrolplasmid ved E14. Celletyper kommenteres baseret på tilgængelighed af celletypespecifikke gener. Denne figur er blevet ændret fra Weir, K., Kim, D. W., Blackshaw, S. Regulering af retinal neurogenese ved somatostatin signalering. bioRxiv 2020.09.26.314104 (2020) doi:10.1101/2020.09.26.31410418 og originale, upublicerede data. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kraften i MULTI-seq stammer fra problemfri integration af data fra flere eksperimentelle forhold eller modeller og den enorme fordel med hensyn til omkostninger og begrænsning af batcheffekter. Brug af MULTI-seq tilbyder en laboratorie hidtil uset fænotypningsdybde. Ikke-genetiske multiplexingmetoder såsom cellehashing eller kerner hashing åbnede døren til multipleksede prøver ved brug af stregkodede antistoffer 7,19,20. Dette afhænger imidlertid af tilgængeligheden af antistoffer med høj affinitet, der genkender overfladeproteiner udtrykt på celler eller deres kerner, hvilket ikke vil være muligt, hvis disse antistoffer ikke er tilgængelige, eller cellerne ikke udtrykker passende celleoverflade eller nukleare antigener7. Fordi MULTI-seq bruger lipidmodificerede oligo stregkoder til stabilt at inkorporere i cellerne eller deres kerner, giver det forskere mulighed for at indsamle transkriptomiske data fra op til 96 friske eller faste prøver på en billigere og mere bredt anvendelig måde6.

Opfølgning på den indledende MULTI-Seq phenotyping med parret scRNA-Seq og scATAC-Seq foreslås og fremvises for at få en forståelse af den genomiske organisation, der falder sammen med de transkriptomiske data1. Dette giver ikke kun en idé om heterochromatin- og euchromatinregionerne, men også værdifuld forståelse af transkriptionsfaktornetværkene, der driver genekspression. En multi-omisk tilgang kan bruges til at afsløre de dynamiske kromatinændringer, der finder sted på nøglepunkter i celle skæbnebeslutninger og bestemme cellulære baner i udvikling og sygdom 1,21,22. Dette kan opnås ved bioinformatisk at udsætte dataene for pseudotid, cis-regulatoriske interaktioner og fodaftryksanalyse 5,23,24,25. Fastsættelse af prøverne og sekventering af flere i en multiplekset kørsel reducerer kilder til batcheffekt, hvilket muliggør sammenligning på tværs af prøver, f.eks. gennem et tidsforløbseksperiment. Antallet af vævsprøver, der kræves, afhænger af eksperimentets omfang. Ved undersøgelse af fænotyper forbundet med embryonale tidspunkter er enkelt nethinder ofte tilstrækkelige og kan give hundredtusindvis af celler. En enkelt nethinde giver muligvis ikke nok celler i mere komplekse eksperimentelle ordninger: ex vivo elektroporationer af retinale explants, sondering for sjældne cellepopulationer eller genetiske modeller med utilstrækkelig CRE-aktivering. Mens en enkelt nethinde kan give et par hundrede celler, vil disse ikke fange den fulde vævskompleksitet. For sådanne eksperimenter kræves optimering baseret på en forskers behov. Ved hjælp af disse teknikker kan man få indsigt i, hvordan de gener, der analyseres i MULTI-seq, reguleres under dynamiske processer som udvikling og sygdom.

Regulering af genregulerende netværk er kernen i forståelsen af cellulære processer, og hvordan de bidrager til udvikling og sygdom 1,26,27. Arbejdsgangen, der præsenteres her, kan bruges til at identificere disse genregulerende netværk i specifikke celletyper. Denne protokol er imidlertid optimeret til brug med musens retinale væv. Optimering af forskellige trin, såsom lysis eller dissociationstid, centrifugeringshastigheder / -tider og antal filtreringstrin kan være påkrævet for at maksimere antallet af celler eller kerner og minimere celleaffaldet i cellesuspensioner fra andre vævstyper, ex vivo-prøver eller arter, uanset om prøverne er friske, frosne eller fastgjort i methanol. Methanolfikseringstiden skal muligvis øges, hvis prøver viser høje niveauer af levedygtige celler med trypanblå farvning. MULTI-seq-teknikken introducerer mange ekstra vasketrin i forhold til traditionel scRNA-seq. For at undgå utilsigtet bortskaffelse af værdifulde celler eller DNA er det klogt at optimere centrifugeringshastigheder og vedligeholde supernatanter, der normalt ville blive kasseret i cellelinjekodningen, oprydning efter GEM RT og stregkodebibliotekets konstruktionstrin på is, indtil dette trin er blevet verificeret for at være vellykket. En begrænsning for MULTI-seq er det begrænsede antal celler og derfor prøver, der kan sekventeres fra en enkelt brønd i GEM-generationstrinnet. Det anbefales ikke at forsøge at overbelaste celler for meget i løbet af dette trin for at undgå en betydelig stigning i dobbeltcelleindfangning. Undgå at indlæse en GEM-brønd med mere end 20.000 celler. Snarere kan flere brønde fremstilles ud fra en enkelt kombineret suspension og multiplekses under sekventering. Dette vil kræve forberedelse af en stor nok mængde cellesuspension til GEM-generering og tilføjelse af replikater til trin 5, 6 og 7 og vil øge omkostningerne ved sekventering, da der er behov for flere samlede læsninger for flere celler. Med korrekt optimering vil denne arbejdsgang muliggøre omkostnings- og tidseffektiv identifikation af celletypespecifikke fænotyper og genregulerende netværk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Linda Orzolek fra Johns Hopkins Transcriptomics og Deep Sequencing Core for hjælp til sekventering af de producerede biblioteker og Lizhi Jiang for at udføre ex vivo retinal explants.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette filter tips
10% Tween 20 Bio-Rad 1662404
100 µM Barcode Solution Request from Gartner lab https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested
=true
100% Ethanol Millipore Sigma E7023-500ML
100% Methanol Millipore Sigma 322415-100ML
10x Chip Holder 10x Genomics 1000195
10x Chromium controller & Accessory Kit 10x Genomics PN-120263
15mL Centrifuge Tube Quality Biological P886-229411
40 µm FlowMi Cell Strainer Bel-Art H13680-0040
50 µM Anchor Solution Sigma or request from Gartner lab https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested
=true
50 µM Co-Anchor Solution Sigma or request from Gartner lab https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested
=true
5200 Fragment Analyzer system Agilent M5310AA
70 um FlowMi cell strainer Bel-Art H13680-0070
Allegra X-12R Centrifuge VWR BK392302
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9647
Chromium Next GEM Chip G 10x Genomics PN-1000120
Chromium Next GEM Chip H 10x Genomics PN-1000161
Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.1 10x Genomics PN-1000175
Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1 10x Genomics PN-1000121
Digitonin Fisher Scientific BN2006
Dissection microscope Leica
DNA LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 22431021
Dry Ice
EVA Foam Ice Pan Tequipment 04393-54
FA 12-Capillary Array Short, 33 cm Agilent A2300-1250-3355
Fisherbrand Isotemp Water Bath Fisher Scientific 15-460-20Q
Forma CO2 Water Jacketed Incubator ThermoFisher Scientific 3110
Glycerol 50% Aqueous solution Ricca Chemical Company 3290-32
Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber Fisher Scientific 02-671-51B
Illumina NextSeq or NovaSeq Illumina
Kapa Hifi Hotstart ReadyMix HiFi 7958927001
Low TE Buffer Quality Biological 351-324-721
Magnesium Chloride Solution 1 M Sigma-Aldrich M1028
Magnetic Separator Rack for 1.5 mL tubes Millipore Sigma 20-400
Magnetic Separator Rack for 200 µL tubes 10x Genomics NC1469069
MULTI-seq Primer Sigma or IDT See sequence list
MyFuge Mini Centrifuge Benchmark Scientific C1008
Nonidet P40 Substitute Sigma-Aldrich 74385
Nuclease-free water Fisher Scientific AM9937
P2, P10, P20, P200, P1000 micropipettes Eppendorf
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation LK003150
PBS pH 7.4 (1X) Fisher Scientific 10010-023
Qiagen Buffer EB Qiagen 19086
Refridgerated Centrifuge 5424 R Eppendorf 2231000655
RNase-free Disposable Pellet Pestles Fisher Scientific 12-141-368
RNasin Plus RNase Inhibitor Promega N2615
RPI primer Sigma or IDT See sequence list
Single Index Kit N, Set A 10x Genomics PN-1000212
Single Index Kit T Set A 10x Genomics PN-1000213
Sodium Chloride Solution 5 M Sigma-Aldrich 59222C
SPRIselect Reagent Kit Beckman Coulter B23318
Standard Disposable Transfer Pipettes Fisher Scientific 13-711-7M
TempAssure PCR 8-tube strip USA Scientific 1402-4700
Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.4 Sigma-Aldrich T2194
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) Corning 25-900-CI
Universal I5 primer Sigma or IDT See sequence list
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems 4375786
Vortex Mixer VWR 10153-838

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370, (2020).
  2. Nagalakshmi, U., et al. The Transcriptional Landscape of the Yeast Genome Defined by RNA Sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
  3. Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
  4. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50, 96 (2018).
  5. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36, 411-420 (2018).
  6. McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 16, 619-626 (2019).
  7. Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19, 224 (2018).
  8. Chen, X., Miragaia, R. J., Natarajan, K. N., Teichmann, S. A. A rapid and robust method for single cell chromatin accessibility profiling. Nature Communications. 9, 5345 (2018).
  9. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. , 8598 (2020).
  10. Clark, B. S., et al. Single-Cell RNA-Seq Analysis of Retinal Development Identifies NFI Factors as Regulating Mitotic Exit and Late-Born Cell Specification. Neuron. 102, 1111-1126 (2019).
  11. Zheng, Y., et al. A human circulating immune cell landscape in aging and COVID-19. Protein Cell. 11, 740-770 (2020).
  12. Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37, 925-936 (2019).
  13. Worthington Biochemical Corporation. Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , (2020).
  14. 10x Genomics. Chromium Single Cell 3' Reagent Kits v3 User Guide. , (2020).
  15. Agilent. DNF-468 HS Genomic DNA 50 kb Kit Quick Guide for Fragment Analyzer Systems. , (2015).
  16. ThermoFisher Scientific. Qubit dsDNA HS Assay Kits. ThermoFisher Scientific. , (2015).
  17. 10x Genomics. Chromium Single Cell ATAC Reagent Kits User Guide (v1.1 Chemistry). , (2020).
  18. Weir, K., Kim, D. W., Blackshaw, S. Regulation of retinal neurogenesis by somatostatin signaling. bioRxiv. , (2020).
  19. Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14, 865-868 (2017).
  20. Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10, 2907 (2019).
  21. Ma, S., et al. Chromatin Potential Identified by Shared Single-Cell Profiling of RNA and Chromatin. Cell. , (2020).
  22. Buenrostro, J. D., et al. Integrated Single-Cell Analysis Maps the Continuous Regulatory Landscape of Human Hematopoietic Differentiation. Cell. 173, 1535-1548 (2018).
  23. Pliner, H. A., et al. Cicero Predicts cis-Regulatory DNA Interactions from Single-Cell Chromatin Accessibility Data. Molecular Cell. 71, 858-871 (2018).
  24. Granja, J. M., et al. ArchR: An integrative and scalable software package for single-cell chromatin accessibility analysis. BioRxiv. , (2020).
  25. Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177, 1888-1902 (2019).
  26. METABRIC Group. The genomic and transcriptomic architecture of 2,000 breast tumours reveals novel subgroups. Nature. 486, 346-352 (2012).
  27. Izadi, F. Differential Connectivity in Colorectal Cancer Gene Expression Network. Iranian Biomedical Journal. 23, 34-46 (2019).

Tags

Neurovidenskab udgave 169 udvikling sygdom scRNA-seq scATAC-Seq MULTI-Seq multiplex kromatin
Multiplekset analyse af retinal genekspression og kromatintilgængelighed ved hjælp af scRNA-Seq og scATAC-Seq
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weir, K., Leavey, P., Santiago, C.,… More

Weir, K., Leavey, P., Santiago, C., Blackshaw, S. Multiplexed Analysis of Retinal Gene Expression and Chromatin Accessibility Using scRNA-Seq and scATAC-Seq. J. Vis. Exp. (169), e62239, doi:10.3791/62239 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter