Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Multiplexed analyse van retinale genexpressie en chromatinetoegankelijkheid met behulp van scRNA-Seq en scATAC-Seq

Published: March 12, 2021 doi: 10.3791/62239
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2,3,4,5,6
1Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Psychiatry and Behavioral Science, The Johns Hopkins Hospital, 3Department of Ophthalmology, The Johns Hopkins Hospital, 4Department of Neurology, The Johns Hopkins Hospital, 5Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Kavli Neuroscience Discovery Institute, Johns Hopkins University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Hier tonen de auteurs het nut van MULTI-seq voor fenotypering en daaropvolgende gepaarde scRNA-seq en scATAC-seq bij het karakteriseren van de transcriptomische en chromatinetoegankelijkheidsprofielen in retina.

Abstract

Krachtige sequencingtechnieken van de volgende generatie bieden robuuste en uitgebreide analyse om te onderzoeken hoe retinale genregulerende netwerken functioneren tijdens de ontwikkeling en in ziektetoestanden. Single-cell RNA sequencing stelt ons in staat om genexpressieveranderingen waargenomen in retinale ontwikkeling en ziekte op cellulair niveau uitgebreid te profileren, terwijl eencellige ATAC-Seq het mogelijk maakt om analyse van chromatinetoegankelijkheid en transcriptiefactorbinding te profileren met een vergelijkbare resolutie. Hier wordt het gebruik van deze technieken in het zich ontwikkelende netvlies beschreven en MULTI-Seq gedemonstreerd, waarbij individuele monsters worden gelabeld met een gemodificeerd oligonucleotide-lipidencomplex, waardoor onderzoekers zowel de reikwijdte van individuele experimenten kunnen vergroten als de kosten aanzienlijk kunnen verlagen.

Introduction

Begrijpen hoe genen het lot van cellen kunnen beïnvloeden, speelt een sleutelrol bij het ondervragen van processen zoals ziekte en embryonale progressie. De complexe relaties tussen transcriptiefactoren en hun doelgenen kunnen worden gegroepeerd in genregulerende netwerken. Toenemend bewijs plaatst deze genregulerende netwerken in het centrum van zowel ziekte als ontwikkeling in evolutionaire afstammingslijnen1. Terwijl eerdere technieken zoals qRT-PCR zich richtten op een enkel gen of een set genen, maakt de toepassing van high-throughput sequencing-technologie de profilering van volledige cellulaire transcriptomen mogelijk.

RNA-seq biedt een inkijkje in grootschalige transcriptomics 2,3. Single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) geeft onderzoekers de mogelijkheid om niet alleen transcriptomen te profileren, maar ook specifieke celtypen te koppelen aan genexpressieprofielen4. Dit wordt bioinformatisch bereikt door individuele celprofielen in te voeren in sorteeralgoritmen met behulp van bekende genmarkers5. Multiplexing met behulp van lipid-tagged indices sequencing (MULTI-seq) biedt ongekende diversiteit in het aantal scRNA-Seq profielen dat kan worden verzameld6. Deze op lipiden gebaseerde techniek verschilt van andere monsterindexeringstechnieken zoals cel-hashing die afhankelijk zijn van de aanwezigheid van oppervlakteantigenen en antilichamen met hoge affiniteit in plaats van plasmamembraanintegratie7. Niet alleen is het nu mogelijk om genexpressieprofielen in celtypen te profileren, maar verschillende experimenten kunnen worden gecombineerd in een enkele sequencingbibliotheek, waardoor de kosten van een individueel scRNA-seq-experiment drastisch worden verlaagd6. De kosten van scRNA-seq lijken misschien onbetaalbaar voor gebruik in fenotyperingsexperimenten waarbij veel verschillende genotypen, aandoeningen of patiëntmonsters worden geanalyseerd, maar multiplexing maakt de combinatie van maximaal 96 monsters in een enkele bibliotheek mogelijk6.

Profilering van genexpressie via scRNA-seq is niet de enige high-throughput sequencing-gebaseerde techniek geweest om een revolutie teweeg te brengen in het huidige begrip van hoe moleculaire mechanismen het lot van cellen dicteren. Hoewel het begrijpen van welke gentranscripten in een cel de identificatie van het celtype mogelijk maakt, is het net zo belangrijk om te begrijpen hoe genomische organisatie de ontwikkeling en ziekteprogressie reguleert. Vroege studies waren gebaseerd op het detecteren van DNase-gemedieerde splitsing van sequenties die niet gebonden zijn aan histonen, gevolgd door sequencing van de resulterende DNA-fragmenten om gebieden van open chromatine te identificeren. Daarentegen stelt eencellige assay voor transposon toegankelijke chromatine sequencing (scATAC-seq) onderzoekers in staat om DNA te onderzoeken met een gedomesticeerd transposon om gemakkelijk open chromatine te profileren op het enkele nucleotideniveau8. Dit is door een vergelijkbare schaal gegaan als scRNA-seq en nu kunnen onderzoekers individuele celtypen en profielfenotypen identificeren in duizenden individuele genomen8.

De koppeling van scRNA-seq en scATAC-seq heeft onderzoekers de mogelijkheid gegeven om duizenden cellen te profileren om celpopulaties, genomische organisatie en genregulerende netwerken in ziektemodellen en ontwikkelingsprocessen te bepalen 9,10,11,12. Hier schetsen de auteurs hoe ze eerst MULTI-seq kunnen gebruiken om fenotypering van een groot aantal diermodellen te condenseren en gepaarde scRNA-seq en scATAC-seq te gebruiken om een beter begrip te krijgen van het chromatinelandschap en regulerende netwerken in deze diermodellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Het gebruik van dieren voor deze studies werd uitgevoerd met behulp van protocollen die zijn goedgekeurd door het Johns Hopkins Animal Care and Use Committee, in overeenstemming met de ARRIVE-richtlijnen, en werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voorschriften.

1. Multi-seq

  1. Media voorbereiding
    1. Bereid en balanceer ovomucoïde remmer, 10 mg ovomucoïde remmer en 10 mg albumine per ml Earle's Balanced Salt Solution (EBSS), gedurende 30 minuten voorafgaand aan gebruik13. Equilibrate met 95% O2:5% CO2 in een incubator.
      1. Bereid papaïnedissociatie-oplossing, 20 eenheden /ml papaïne en 0,005% DNase in EBSS, tijdens deze incubatiestap13.
        OPMERKING: Eén injectieflacon DNase-oplossing is voldoende voor 5 monsters. Extra injectieflacons moeten mogelijk worden gereconstitueerd als multi-seq op meer dan 5 monsters wordt uitgevoerd.
    2. Bereid lipide gemodificeerde oligo barcoding oplossingen.
      1. Maak een unieke barcodeverdunning voor elk monster door 0,5 μL 100 μM barcode stockoplossing te combineren met 4,5 μL Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
      2. Om anker:barcode-oplossing te bereiden met een molaire verhouding van 1:1, combineert u 4,4 μL 10 μM barcodeverdunning, 0,9 μL 50 μM ankeroplossing en 16,7 μL PBS en plaatst u deze op ijs. De uiteindelijke concentratie voor zowel de streepjescodestrengen als de ankerstrengen moet 2 μM zijn.
      3. Om co-ankeroplossing te bereiden, combineert u 0,88 μL co-ankeroplossing van 50 μM en 21,12 μL PBS en plaatst u deze op ijs. De uiteindelijke concentratie van het coanker moet 2 μM zijn. Vermenigvuldig de volumes in deze stap met 1,1x het aantal monsters.
    3. Om 1% BSA in PBS te maken, lost u 0,1 g runderserumalbumine (BSA) op in 10 ml PBS en plaatst u het op ijs.
    4. Om PBS met RNase-remmer te maken, combineert u 2,5 μL 40 U/μL RNase-remmer met 197,5 μL PBS en slaat u deze op ijs op. Vermenigvuldig de volumes in deze stap met 1,1x het aantal monsters.
  2. Dissociatie van monsters
    1. Euthanaseer dieren door cervicale dislocatie en/of CO 2-asfyxie in overeenstemming met institutionele IACUC-vereisten. De methode voor euthanasie zal afhangen van de institutionele vereisten en het gebruikte modelorganisme.
    2. Ontleed het netvlies van beide ogen in koude PBS onder een dissectiemicroscoop en breng het over naar een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml met behulp van een transferpipet.
    3. Breng 500 μL van de papaïneoplossing over in een buis van 1,5 ml voor elk monster.
    4. Plaats monsters in de papaïne-oplossing en sluit de buisjes onmiddellijk af.
    5. Incubeer de buizen met de monsters bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 30 minuten. Keer de injectieflacons 3 keer om de 10 minuten om. De monsters moeten geleidelijk dissociëren met elke ronde van inversies.
    6. Breng de injectieflacons terug naar kamertemperatuur en triturate elk monster 3-4 keer met een pipet van 1 ml ingesteld op 300 μL.
    7. Laat alle stukjes onverdeeld weefsel die overblijven na trituratie bezinken.
    8. Verwijder de troebele celsuspensie terwijl u stukjes niet-gesuspend weefsel vermijdt en plaats de celsuspensie van elk monster in een nieuwe steriele buis met schroefdeksel van 15 ml.
    9. Centrifugeer de celsuspensies bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    10. Bereid tijdens de centrifugatiestap de cel resuspensiemedia voor.
      1. Meng 857 μL EBSS (injectieflacon 1) met 95 μL gereconstitueerde albumine-ovomucoïderemmeroplossing in een steriele buis met schroefdeksel van 1,5 ml. Voeg 48 μL DNase-oplossing toe die is opgeslagen vanaf 1.1.1. Vermenigvuldig de volumes in deze stap met 1,1x het aantal monsters.
    11. Gooi het supernatant weg, zorg ervoor dat de celpellets worden vastgehouden en resuspenseer de celpellets onmiddellijk in 1 ml cel resuspensieoplossing bereid in stap 1.2.10.
    12. Bereid discontinu dichtheidsgradiënt voor.
      1. Voeg voor elk monster 1,6 ml ovomucoïderemmeroplossing toe aan een nieuwe steriele buis met schroefdeksel van 15 ml en leg de celsuspensie er voorzichtig op. De interface tussen de twee lagen van het verloop moet zichtbaar zijn, maar enige vermenging heeft geen invloed op de resultaten.
    13. Centrifugeer de discontinue dichtheidsgradiënten bij 70 x g gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur. De gedissocieerde cellen moeten op de bodem van de buizen pelleteren, terwijl membraanfragmenten op het grensvlak blijven.
    14. Gooi het supernatant weg en voeg 200 μL PBS toe om de gepelletiseerde cellen te wassen. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    15. Gooi het supernatant weg en resuspensieer de cellen in 180 μL PBS met RNase-remmer. Laat de cellen door een celzeef van 40 μm in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml gaan.
  3. Cel barcodering
    1. Voeg 20 μL anker:barcode-oplossing toe aan elk monster en pipetteer voorzichtig om te mengen. Zorg ervoor dat elk monster een unieke anker:barcode-oplossing krijgt en incubeer gedurende 5 minuten op ijs.
      1. Bereid de materialen voor die nodig zijn voor het genereren van gelparel-in-emulsie (GEM) en barcodering tijdens deze incubatie14.
    2. Voeg 20 μL co-ankeroplossing toe aan elk monster en pipetteer voorzichtig om te mengen. Incubeer op ijs gedurende 5 minuten.
    3. Voeg 1 ml ijskoude 1% BSA in PBS toe aan elk monster en centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    4. Verwijder het supernatant zonder de celpellet te verstoren en voeg 400 μL ijskoude 1% BSA toe aan PBS. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
      1. Herhaal stap 1.3.4 voor een totaal van 2 wasbeurten. Verwijder het supernatant en resuspendeer in 400 μL ijskoude 1% BSA in PBS.
    5. Bepaal de concentratie van cellen voor elk monster met behulp van een hemocytometer.
      1. Bepaal het totale aantal cellen dat voor elk monster moet worden geladen. Meestal is dit het totale aantal gewenste cellen gedeeld door het aantal monsters. Als echter een biologische replicaat voor één aandoening verloren is gegaan, kan het aandeel ervan worden verdeeld over de andere biologische replicaties van die aandoening.
      2. Deel het gewenste aantal cellen voor elk monster door de celconcentratie van dat monster, berekend in stap 3.5, om het volume te bepalen dat nodig is om het gewenste aantal cellen te laden.
    6. Combineer de in stap 3.5.2 berekende volumes van elk monster in een nieuwe steriele centrifugebuis van 1,5 ml. Het is verstandig om het volume van elk monster te verdubbelen in geval van uitval van gem-generatie.
      1. Bepaal de "uiteindelijke" celconcentratie van de gecombineerde monsters met behulp van een hemocytometer.
  4. GEM generatie en barcodering
    1. Gebruik gecombineerde voorbeelden om GEMs14 te genereren en een streepjescode van te maken.
  5. Post GEM-RT Cleanup en cDNA-versterking
    1. Bereid materialen voor na GEM reverse transcriptase cleanup en cDNA-versterking voor volgens de instructies van de fabrikant met de volgende wijzigingen14. Voer na GEM-RT opschoning uit op maatselectie14.
      1. Verhoog het volume van 80% ethanol bereid door 2 ml.
      2. Bereid cDNA Amplification Mix op ijs14. Voeg 1 μL 2,5 μM MULTI-seq primer toe aan het cDNA Amplification mengsel. Vortex voor 5 s en centrifuge voor 5 s in een benchtop minicentrifuge.
    2. Voer cDNA-versterking uit14. De cDNA kan op dit moment maximaal 72 uur bij 4 °C worden bewaard.
    3. Voer cDNA-opschoning uit op basis van grootteselectie14. Het endogene transcript cDNA kan op dit moment tot 72 uur bij 4 °C of tot 4 weken bij -20 °C worden bewaard.
      1. Gooi het supernatant niet weg uit de eerste ronde van de grootteselectie . Deze fractie bevat de voorbeeld barcodes. Breng het supernatant over in een nieuwe steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml.
      2. Bewaar het supernatant op ijs.
    4. Vortex om paramagnetische kraal-gebaseerde grootte selectie reagens te resuspenderen en 260 μL paramagnetische kraal-gebaseerde grootte selectie reagens (laatste 3,2x) en 180 μL van 100% isopropanol (1,8x) toe te voegen aan het supernatant. Pipetteer het mengsel 10 keer en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Plaats de buis op een magnetisch rek en wacht tot de oplossing is verdwenen. Verwijder vervolgens het supernatant en gooi het weg.
    6. Voeg 500 μL 80% ethanol toe aan de kralen en laat 30 s staan. Verwijder het supernatant en gooi het weg.
      1. Herhaal dit voor een totaal van 2 wasbeurten.
    7. Centrifugeer de kralen kort en keer terug naar het magnetische rek. Start een timer gedurende 2 minuten.
    8. Verwijder de resterende ethanol met een P10-pipet en droog de kralen op het magnetische rek aan de lucht gedurende de rest van de 2 minuten. Niet langer dan 2 min.
    9. Verwijder de kralen uit het magnetische rek en resuspendeer in 100 μL elutiebuffer (EB). Pipetteer grondig om te resuspenderen.
    10. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 min.
    11. Keer terug naar het magnetische rek en wacht tot de oplossing is verdwenen.
    12. Breng het supernatant over in een verse microcentrifugebuis van 1,5 ml.
    13. Herhaal stap 1.5.4 tot en met 1.5.12. Halveer het volume buffer EB dat in stap 1.5.9 is gebruikt.
    14. Bepaal de barcode-DNA-concentratie en -grootteverdeling met behulp van een dsDNA-testkit met hoge gevoeligheid en fluorometer en fragmentanalysator15,16. De barcode cDNA kan op dit moment tot 72 uur bij 4 °C of tot 4 weken bij -20 °C worden bewaard.
  6. Barcode bibliotheek constructie
    1. Bereid 1 ml 80% ethanol.
    2. Bereid barcodebibliotheek PCR-mastermix voor in een steriele PCR-stripbuis: combineer 26,25 μL 2x hot start PCR ready mix, 2,5 μL 10 μM Universal i5 primer, 2,5 μL 10 μM RPI primer, 3,5 ng barcode cDNA (volume bepaald door concentratie vanaf stap 5.14) en voldoende nucleasevrij water om het uiteindelijke volume op 50 μL te brengen.
      1. Gebruik een unieke RPI-primer voor elke streepjescodebibliotheek als meerdere MULTI-seq-bibliotheken samen zijn gesequenced.
    3. Onderwerp de mastermix van de barcodebibliotheek aan een pcr voor bibliotheekvoorbereiding: 95 °C gedurende 5 minuten; 10 cycli van 98 °C gedurende 15 s, 60 °C gedurende 30 s, 72 °C gedurende 30 s; 72 °C gedurende 1 min; en vervolgens vasthouden op 4 °C.
    4. Vortex om het op paramagnetische kraal gebaseerde grootteselectiereagens te resuspenderen.
    5. Verwijder het PCR-product uit de thermocycler en voeg 80 μL (1,6x) paramagnetisch op kraal gebaseerd maatselectiereagens toe. Pipetteer grondig.
    6. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Plaats op de magneetscheider in de hoge positie en wacht tot de oplossing is verdwenen.
    7. Verwijder het supernatant en gooi het weg.
    8. Voeg 200 μL 80% ethanol toe aan de kralen en laat 30 s staan. Verwijder het supernatant en gooi het weg.
      1. Herhaal stap 1.6.8 voor een totaal van 2 wasbeurten.
    9. Centrifugeer de buis kort en plaats op de magnetische separator in de lage positie. Start een timer gedurende 2 minuten.
    10. Verwijder de resterende ethanol met een P20-pipet en droog de kralen op de magnetische afscheider aan de lucht gedurende de rest van de 2 minuten. Niet langer dan 2 min.
    11. Verwijder de buis uit de magnetische afscheider en resuspenseer de kralen in 25 μL buffer EB. Pipetmix grondig om de kralen te resuspenderen.
    12. Incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
    13. Keer terug naar de magnetische separator in de lage positie en wacht tot de oplossing is verdwenen. Breng het supernatant over op een nieuwe PCR-stripbuis.
    14. Kwantificeer expressiebibliotheek en barcodebibliotheekconcentratie en fragmentgrootteverdeling met behulp van adsDNA high sensitivity assay kit en fluorometer en fragment analyzer.
  7. 3'Gene Expression Library Constructie
    1. Voer 3 'genexpressie bibliotheek constructie volgens de instructies van de fabrikant14.
  8. Sequencing
    1. Naast de endogene cDNA-bibliotheek die in stap 7 is versterkt, dient u de streepjescodebibliotheek in die in stap 6 is versterkt. Voor de eenvoud dient u deze bibliotheken afzonderlijk in, of als een kosteneffectieve maatregel een aliquot van het voorbeeldbarcoderingsmateriaal opnemen met de endogene cDNA-bibliotheek. Streef tussen 20.000-50.000 cDNA en 3.000-5.000 barcode reads per cel.
    2. Converteer de resulterende sequencing bcl-bestanden naar fastq-bestanden door cellranger mkfastq en tel matrices die hieruit worden gegenereerd door cellranger count.
    3. Deconvolute samples post Cellranger analyse met behulp van het deMULTIplex r pakket beschikbaar op de MULTI-seq GitHub repository (https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/MULTI-seq).

2. Gepaarde scRNA-seq en scATAC-seq

  1. Flash freeze weefsel voor scATAC-seq en methanol fixatie van retinale cellen voor scRNA-seq
    1. Media voorbereiding
      1. Om de oplossingen voor retinale dissociatie voor te bereiden, herhaalt u stap 1.1.1 en 1.1.4.
      2. Bereid een ethanol droogijsbad voor in een kleine ijsemmer.
      3. Bereid 15 ml 70% ethanol door 10,5 ml ethanol toe te voegen aan 4,5 ml nucleasevrij water.
      4. Voeg voldoende droogijs toe aan de ijsemmer (bij voorkeur in pelletvorm) dat 15 ml vloeistof stijgt om het ijs te bedekken. Voeg de 15 ml ethanol toe.
      5. Plaats PBS op ijs en 1 ml aliquots van 100% methanol in een handige vriezer van -20 °C.
    2. Monstervoorbereiding
      1. Volg stap 1.2.1 en 1.2.2 om netvliezen te isoleren; plaats deze keer echter elk netvlies in een aparte microcentrifugebuis.
      2. Voor de monsters die bestemd zijn voor scATAC-seq, verwijder alle vloeistof uit de microcentrifugebuis met behulp van een P200-pipet en dop onmiddellijk en plaats de buis in een ethanol-droogijsbad om het monster te bevriezen.
      3. Voor de monsters bestemd voor scRNA-seq, om de cellen te dissociëren, herhaalt u stap 1.2.3 tot en met 1.2.15 op het ontleedde netvlies.
      4. Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
      5. Verwijder het supernatant zonder de celpellet te verstoren.
      6. Voeg 1 ml gekoelde PBS toe en pipetteer voorzichtig 10 keer of totdat de cellen volledig zijn gesuspendeerd.
      7. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
        1. Herhaal stap 2.1.2.5 tot en met 2.1.2.7 voor een totaal van 2 wasbeurten.
      8. Verwijder het supernatant zonder de celpellet te verstoren.
      9. Voeg 100 μL gekoeld PBS toe en meng voorzichtig 10x of totdat de cellen volledig zijn gesuspendeerd.
      10. Begin met het vortexen van de buis bij de laagste snelheidsinstelling. Voeg druppelsgewijs 900 μL gekoelde methanol (-20 °C) toe terwijl u de buis voorzichtig blijft vortexen om te voorkomen dat de cellen samenklonteren.
      11. Incubeer de cellen op ijs gedurende 15 minuten.
      12. Bepaal de concentratie van de vaste cellen met behulp van een hemocytometer.
      13. Beoordeel de werkzaamheid van de fixatiestap met behulp van trypan blue. Een hoog percentage levensvatbare cellen geeft aan dat er meer fixatietijd nodig is.
      14. Bewaar het ingevroren weefsel en de vaste cellen bij -80 °C.
  2. Kernen isolatie van flash bevroren weefsel voor scATAC-seq
    1. Media voorbereiding
      1. Bereid de lysisverdunningsbuffer door 9,77 ml nucleasevrij water, 100 μL 1 M Tris-HCl (pH 7,4), 100 μL 1 M NaCl, 30 μL 1 M MgCl2 en 0,1 g BSA te combineren.
      2. Bereid de lysisverdunningsbuffer van tevoren voor, zoals de dag ervoor, en bewaar bij 4 °C. Op de dag van het protocol op ijs zetten.
      3. Equilibrate 20x kernenbuffer geleverd door de fabrikant van de scATAC-kit van -20 °C tot kamertemperatuur. Vortex en centrifuge kort.
      4. Bereid de 1xlysisbuffer door 5% Digitonin-oplossing in een waterbad van 65 °C te incuberen totdat het neerslag is opgelost. Combineer vervolgens 2 ml lysisverdunningsbuffer, 20 μL 10% Tween-20, 20 μL Nonidet P40 Substitute (kan als alternatief IGEPAL worden genoemd) en 4 μL Digitonine.
      5. Bewaar de 1x lysis buffer op ijs.
      6. Om de 0,1x lysisbuffer te bereiden, combineert u 1,8 ml lysisverdunningsbuffer met 200 μL van de 1x lysisbuffer en slaat u deze op ijs op.
      7. Om de wasbuffer te bereiden, combineert u 2 ml lysisverdunningsbuffer en 20 μL 10% Tween-20 en bewaart u deze op ijs.
      8. Om de verdunde kernenbuffer te bereiden, combineert u 950 μL nucleasevrij water met 50 μL kernenbuffer (20x) en slaat u het op ijs op.
    2. Kernen isolatie
      1. Ontdooi het monster niet voordat het wordt gelogen. Voeg 500 μL gekoelde 0,1x lysisbuffer toe aan een microcentrifugebuis van 1,5 ml die het bevroren monster bevat. Homogeniseer onmiddellijk 15x met behulp van een pellet stamper.
      2. Incubeer gedurende 5 minuten op ijs. Bereid de materialen voor die nodig zijn voor scATAC-transpositie tijdens deze incubatiestap17.
      3. Pipetmix 10x met een pipet van 1 ml en incubeer gedurende 10 minuten op ijs. Volledige voorbereiding van de materialen die nodig zijn voor scATAC-transpositie tijdens deze incubatiestap als deze nog niet is voltooid. Het is niet nodig om meer Verdunde Kernen Buffer te bereiden.
      4. Voeg 500 μL gekoelde wasbuffer toe aan de gelyseerde cellen. Pipetmix 5x.
      5. Laat de suspensie door een celzeef van 70 μm in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml gaan. Filter ~300 μL per keer met behulp van een nieuwe celzeef van 70 μm.
      6. Voer de verzamelde flowthrough door een celzeef van 40 μm in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml en bewaar deze op ijs.
      7. Bepaal de kernconcentratie met behulp van een hemocytometer. Bereken op basis van de kernconcentratie en het totale volume van de celsuspensie het totale aantal gedissocieerde kernen.
      8. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant zonder de kernkorrel te verstoren.
      9. Om de kernenvoorraad te creëren op basis van het totale aantal kernen bepaald in stap 2.2.2.7., resuspenseer je de kernen in voldoende verdunde kernenbuffer om een gewenste kernconcentratie te bereiken.
        OPMERKING: De gewenste kernconcentratie is gebaseerd op het gerichte kernherstel voor het scATAC-seq-experiment en wordt bepaald aan de hand van de nucleiconcentratierichtlijnen in het protocol van de fabrikant17. Als bijvoorbeeld uiteindelijk 10.000 kernen gewenst zijn, ligt de gewenste kernconcentratie voor de Kernenvoorraad tussen 3.080 en 7.700 kernen/μL. Het is misschien het beste om te streven naar het midden van het bereik in concentratie.
      10. Bepaal de kernconcentratie met behulp van een hemocytometer.
      11. Ga onmiddellijk over tot scATAC-transpositie met behulp van de voorbereide kernen17.
  3. Rehydratatie van vaste Methanol-cellen voor gebruik in scRNA-Seq
    1. Media voorbereiding
      1. Om de was-/verdunningsbuffer voor te bereiden, lost u 0,01 g BSA op in 1 ml PBS. Voeg vervolgens 12,5 μL 40 U/μL RNase Inhibitor toe en meng voorzichtig. Bewaren op ijs.
    2. Celrehydratatie
      1. Centrifugeer methanol vaste cellen in een microcentrifugebuis van 1,5 ml bij 3000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verwijder vervolgens het supernatant.
      2. Voeg 200 μL gekoelde was-/verdunningsbuffer toe aan de microcentrifugebuis. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 min bij 4 °C en verwijder het supernatant. Herhaal dit voor een totaal van 2 wasbeurten.
        OPMERKING: Bereid de materialen voor die nodig zijn voor het genereren van GEM en barcodering tijdens de vorige twee stappen14.
      3. Om de celvoorraad voor te bereiden, op basis van het totale celgetal berekend in 2.1.2.12., resuspenseer je de cellen in voldoende was-/verdunningsbuffer om de gewenste celconcentratie te bereiken. Voorkeurscelconcentraties liggen tussen 700 en 1200 cellen/μL.
      4. Bepaal de celconcentratie van de celvoorraad met behulp van een hemocytometer.
      5. Ga onmiddellijk over tot GEM-generatie en barcodering met behulp van de celvoorraad14.
    3. Sequencing
      1. Bij het uitvoeren van tijdsloopanalyse (zoals bij ontwikkeling of ziekte), sequence meerdere monsters in een multiplexed run (d.w.z. meerdere bibliotheken op een enkele stroomcel) om technische variatie te verminderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Deze workflow beschrijft een strategie voor onderzoek naar ontwikkelingsfenotypen en regelgevende processen met behulp van single cell sequencing. MULTI-seq sample multiplexing maakt een eerste goedkope fenotyperingstest mogelijk, terwijl gepaarde verzameling en fixatie van monsters voor scRNA-seq en scATAC-seq meer diepgaand onderzoek mogelijk maakt (figuur 1).

MULTI-seq barcoding maakt de gecombineerde sequencing van meerdere monsters en hun daaropvolgende computationele deconvolutie mogelijk. Het monster van oorsprong kan voor elke cel worden bepaald op basis van hun streepjescode-expressie (figuur 2A). Deze gecombineerde monsters kunnen worden geanalyseerd als een enkele dataset met het oog op celclustering en celtype-identificatie (figuur 2B). Omdat elke cel vóór de GEM-generatie een streepjescode heeft, hebben celdubbellieten een grote kans om expressie te tonen voor meerdere MULTI-seq-streepjescodes en kan een meerderheid van de doubletten daarom worden geïdentificeerd en verwijderd voorafgaand aan clustering en identificatie van het celtype (figuur 2C). Het verhogen van het aantal cellen dat wordt gebruikt in de GEM-generatiestap zal het aandeel gevonden doubletten verhogen. scATAC-seq kan worden gebruikt om een dataset te genereren met celtypen die overeenkomen met die gevonden door scRNA-seq (figuur 2D). De koppeling van scRNA-seq genexpressie en scATAC-seq DNA toegankelijkheidsinformatie maakt de reconstructie van genregulerende netwerken mogelijk.

Figure 1
Figuur 1: Schematische waaruit het gebruik van MULTI-Seq in de initiële analyse blijkt, gevolgd door afzonderlijke scRNA-Seq- en scATAC-Seq-analyse in diepgaande karakterisering van fenotypen, behandelingen of ziektetoestanden van belang. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: UMAP dimensionale reductierepresentaties van MULTI-seq-gegevens voor een allelische reeks P0 Sstr2 knock-out muizen die (a) de deconvolutie van het genotype voor elke cel in de dataset aantonen en (b) de identificatie van celtypen in de dataset. Overbelasting van cellen tijdens de GEM-generatie en barcoderingsstap zal resulteren in een toename van celdubbelen zoals die te zien zijn in (c), die de gegevens toont van (a) en (b) vóór doubletverwijdering en reclustering. In (d) scATAC-Seq-gegevens van GFP-positieve cellen verkregen op E16 van retinale explantaten geëlektropoeerd met een GFP-expresserende controleplasmide op E14. Celtypen worden geannoteerd op basis van de toegankelijkheid van celtypespecifieke genen. Dit cijfer is gewijzigd van Weir, K., Kim, D. W., Blackshaw, S. Regulatie van retinale neurogenese door somatostatine signalering. bioRxiv 2020.09.26.314104 (2020) doi:10.1101/2020.09.26.31410418 en originele, niet-gepubliceerde gegevens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De kracht van MULTI-seq komt voort uit de naadloze integratie van gegevens uit meerdere experimentele omstandigheden of modellen en het enorme voordeel in termen van kosten en het beperken van batcheffecten. Het gebruik van MULTI-seq biedt een laboratorium ongekende fenotyperingsdiepte. Niet-genetische multiplexingmethoden zoals cell hashing of nuclei hashing openden de deur naar multiplexed samples door het gebruik van barcode-antilichamen 7,19,20. Dit is echter afhankelijk van de beschikbaarheid van antilichamen met een hoge affiniteit die oppervlakte-eiwitten herkennen die tot expressie komen op cellen of hun kernen, wat niet mogelijk zal zijn als deze antilichamen niet beschikbaar zijn of de cellen geen geschikt celoppervlak of nucleaire antigenen tot expressie brengen7. Omdat MULTI-seq lipide-gemodificeerde oligo-barcodes gebruikt om stabiel in de cellen of hun kernen op te nemen, kunnen onderzoekers transcriptomische gegevens van maximaal 96 verse of vaste monsters op een goedkopere en breder toepasbare manier verzamelen6.

Het opvolgen van de initiële MULTI-Seq fenotypering met gepaarde scRNA-Seq en scATAC-Seq wordt voorgesteld en getoond om inzicht te krijgen in de genomische organisatie die samenvalt met de transcriptomische gegevens1. Dit geeft niet alleen een idee van de heterochromatine- en euchromatineregio's, maar ook een waardevol begrip van de transcriptiefactornetwerken die genexpressie stimuleren. Een multi-omische benadering kan worden gebruikt om de dynamische chromatineveranderingen te onthullen die plaatsvinden op belangrijke punten van beslissingen over het lot van cellen en cellulaire trajecten in ontwikkeling en ziektete bepalen 1,21,22. Dit kan worden bereikt door de gegevens bioinformatisch te onderwerpen aan pseudotime, cis-regulerende interacties en footprinting-analyse 5,23,24,25. Het fixeren van de monsters en het sequencen van meerdere in een multiplexed run vermindert bronnen van batcheffect, waardoor vergelijking tussen monsters mogelijk wordt, zoals via een tijdscursusexperiment. Het aantal benodigde weefselmonsters is afhankelijk van de reikwijdte van het experiment. Bij het onderzoeken van de fenotypen geassocieerd met embryonale tijdspunten, zijn enkele netvliezen vaak voldoende en kunnen honderdduizenden cellen leveren. Een enkel netvlies levert mogelijk niet genoeg cellen in complexere experimentele schema's: ex vivo elektroporaties van retinale explantaten, tasten naar zeldzame celpopulaties of genetische modellen met onvoldoende CRE-activering. Hoewel een enkel netvlies een paar honderd cellen kan leveren, zullen deze niet de volledige weefselcomplexiteit vastleggen. Voor dergelijke experimenten is optimalisatie vereist op basis van de behoeften van een onderzoeker. Met behulp van deze technieken kan men inzicht krijgen in hoe de genen geanalyseerd in MULTI-seq worden gereguleerd tijdens dynamische processen zoals ontwikkeling en ziekte.

Regulatie van genregulerende netwerken vormt de kern van het begrijpen van cellulaire processen en hoe ze bijdragen aan ontwikkeling en ziekte 1,26,27. De hier gepresenteerde workflow kan worden gebruikt om deze genregulerende netwerken in specifieke celtypen te identificeren. Dit protocol is echter geoptimaliseerd voor gebruik met netvliesweefsel van muizen. Optimalisatie van verschillende stappen, zoals lysis of dissociatietijd, centrifugatiesnelheden / -tijden en het aantal filtratiestappen, kan nodig zijn om het aantal cellen of kernen te maximaliseren en het celafval in celsuspensies van andere weefseltypen, ex vivo monsters of soorten te minimaliseren, ongeacht of monsters vers, bevroren of gefixeerd in methanol zijn. De fixatietijd van methanol moet mogelijk worden verhoogd als monsters hoge niveaus van levensvatbare cellen met trypanblauwe kleuring vertonen. De MULTI-seq techniek introduceert veel extra wasstappen ten opzichte van traditionele scRNA-seq. Om de onbedoelde verwijdering van waardevolle cellen of DNA te voorkomen, is het verstandig om centrifugatiesnelheden te optimaliseren en supernatanten te behouden die normaal gesproken zouden worden weggegooid in de celbarcoding, post-GEM RT-opschoning en de bouw van barcodebibliotheek op ijs totdat die stap is geverifieerd om succesvol te zijn. Een beperking van MULTI-seq is het beperkte aantal cellen, en dus monsters, dat kan worden gesequenced uit een enkele put in de GEM-generatiestap. Het wordt aanbevolen om tijdens deze stap niet te proberen cellen overmatig te overbelasten om een aanzienlijke toename van doubletcelopname te voorkomen. Vermijd het laden van een GEM-put met meer dan 20.000 cellen. Integendeel, meerdere putten kunnen worden voorbereid uit een enkele gecombineerde ophanging en gemultiplext tijdens de sequencing. Dit vereist het voorbereiden van een voldoende groot volume celsuspensie voor GEM-generatie en de toevoeging van replicaties aan stap 5, 6 en 7 en zal de kosten van sequencing verhogen naarmate er meer totale reads nodig zijn voor meer cellen. Met de juiste optimalisatie zal deze workflow kosten- en tijdsefficiënte identificatie van celtypespecifieke fenotypen en genregulerende netwerken mogelijk maken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Niets te onthullen.

Acknowledgments

We bedanken Linda Orzolek van de Johns Hopkins Transcriptomics en Deep Sequencing Core voor hulp bij het sequentiëren van de geproduceerde bibliotheken en Lizhi Jiang voor het uitvoeren van de ex vivo retinale explantaten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette filter tips
10% Tween 20 Bio-Rad 1662404
100 µM Barcode Solution Request from Gartner lab https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested
=true
100% Ethanol Millipore Sigma E7023-500ML
100% Methanol Millipore Sigma 322415-100ML
10x Chip Holder 10x Genomics 1000195
10x Chromium controller & Accessory Kit 10x Genomics PN-120263
15mL Centrifuge Tube Quality Biological P886-229411
40 µm FlowMi Cell Strainer Bel-Art H13680-0040
50 µM Anchor Solution Sigma or request from Gartner lab https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested
=true
50 µM Co-Anchor Solution Sigma or request from Gartner lab https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested
=true
5200 Fragment Analyzer system Agilent M5310AA
70 um FlowMi cell strainer Bel-Art H13680-0070
Allegra X-12R Centrifuge VWR BK392302
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9647
Chromium Next GEM Chip G 10x Genomics PN-1000120
Chromium Next GEM Chip H 10x Genomics PN-1000161
Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.1 10x Genomics PN-1000175
Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1 10x Genomics PN-1000121
Digitonin Fisher Scientific BN2006
Dissection microscope Leica
DNA LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 22431021
Dry Ice
EVA Foam Ice Pan Tequipment 04393-54
FA 12-Capillary Array Short, 33 cm Agilent A2300-1250-3355
Fisherbrand Isotemp Water Bath Fisher Scientific 15-460-20Q
Forma CO2 Water Jacketed Incubator ThermoFisher Scientific 3110
Glycerol 50% Aqueous solution Ricca Chemical Company 3290-32
Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber Fisher Scientific 02-671-51B
Illumina NextSeq or NovaSeq Illumina
Kapa Hifi Hotstart ReadyMix HiFi 7958927001
Low TE Buffer Quality Biological 351-324-721
Magnesium Chloride Solution 1 M Sigma-Aldrich M1028
Magnetic Separator Rack for 1.5 mL tubes Millipore Sigma 20-400
Magnetic Separator Rack for 200 µL tubes 10x Genomics NC1469069
MULTI-seq Primer Sigma or IDT See sequence list
MyFuge Mini Centrifuge Benchmark Scientific C1008
Nonidet P40 Substitute Sigma-Aldrich 74385
Nuclease-free water Fisher Scientific AM9937
P2, P10, P20, P200, P1000 micropipettes Eppendorf
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation LK003150
PBS pH 7.4 (1X) Fisher Scientific 10010-023
Qiagen Buffer EB Qiagen 19086
Refridgerated Centrifuge 5424 R Eppendorf 2231000655
RNase-free Disposable Pellet Pestles Fisher Scientific 12-141-368
RNasin Plus RNase Inhibitor Promega N2615
RPI primer Sigma or IDT See sequence list
Single Index Kit N, Set A 10x Genomics PN-1000212
Single Index Kit T Set A 10x Genomics PN-1000213
Sodium Chloride Solution 5 M Sigma-Aldrich 59222C
SPRIselect Reagent Kit Beckman Coulter B23318
Standard Disposable Transfer Pipettes Fisher Scientific 13-711-7M
TempAssure PCR 8-tube strip USA Scientific 1402-4700
Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.4 Sigma-Aldrich T2194
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) Corning 25-900-CI
Universal I5 primer Sigma or IDT See sequence list
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems 4375786
Vortex Mixer VWR 10153-838

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370, (2020).
  2. Nagalakshmi, U., et al. The Transcriptional Landscape of the Yeast Genome Defined by RNA Sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
  3. Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
  4. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50, 96 (2018).
  5. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36, 411-420 (2018).
  6. McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 16, 619-626 (2019).
  7. Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19, 224 (2018).
  8. Chen, X., Miragaia, R. J., Natarajan, K. N., Teichmann, S. A. A rapid and robust method for single cell chromatin accessibility profiling. Nature Communications. 9, 5345 (2018).
  9. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. , 8598 (2020).
  10. Clark, B. S., et al. Single-Cell RNA-Seq Analysis of Retinal Development Identifies NFI Factors as Regulating Mitotic Exit and Late-Born Cell Specification. Neuron. 102, 1111-1126 (2019).
  11. Zheng, Y., et al. A human circulating immune cell landscape in aging and COVID-19. Protein Cell. 11, 740-770 (2020).
  12. Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37, 925-936 (2019).
  13. Worthington Biochemical Corporation. Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , (2020).
  14. 10x Genomics. Chromium Single Cell 3' Reagent Kits v3 User Guide. , (2020).
  15. Agilent. DNF-468 HS Genomic DNA 50 kb Kit Quick Guide for Fragment Analyzer Systems. , (2015).
  16. ThermoFisher Scientific. Qubit dsDNA HS Assay Kits. ThermoFisher Scientific. , (2015).
  17. 10x Genomics. Chromium Single Cell ATAC Reagent Kits User Guide (v1.1 Chemistry). , (2020).
  18. Weir, K., Kim, D. W., Blackshaw, S. Regulation of retinal neurogenesis by somatostatin signaling. bioRxiv. , (2020).
  19. Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14, 865-868 (2017).
  20. Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10, 2907 (2019).
  21. Ma, S., et al. Chromatin Potential Identified by Shared Single-Cell Profiling of RNA and Chromatin. Cell. , (2020).
  22. Buenrostro, J. D., et al. Integrated Single-Cell Analysis Maps the Continuous Regulatory Landscape of Human Hematopoietic Differentiation. Cell. 173, 1535-1548 (2018).
  23. Pliner, H. A., et al. Cicero Predicts cis-Regulatory DNA Interactions from Single-Cell Chromatin Accessibility Data. Molecular Cell. 71, 858-871 (2018).
  24. Granja, J. M., et al. ArchR: An integrative and scalable software package for single-cell chromatin accessibility analysis. BioRxiv. , (2020).
  25. Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177, 1888-1902 (2019).
  26. METABRIC Group. The genomic and transcriptomic architecture of 2,000 breast tumours reveals novel subgroups. Nature. 486, 346-352 (2012).
  27. Izadi, F. Differential Connectivity in Colorectal Cancer Gene Expression Network. Iranian Biomedical Journal. 23, 34-46 (2019).

Tags

Neurowetenschappen Ontwikkeling Ziekte scRNA-Seq scATAC-Seq MULTI-Seq multiplex Chromatine
Multiplexed analyse van retinale genexpressie en chromatinetoegankelijkheid met behulp van scRNA-Seq en scATAC-Seq
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weir, K., Leavey, P., Santiago, C.,… More

Weir, K., Leavey, P., Santiago, C., Blackshaw, S. Multiplexed Analysis of Retinal Gene Expression and Chromatin Accessibility Using scRNA-Seq and scATAC-Seq. J. Vis. Exp. (169), e62239, doi:10.3791/62239 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter