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Neuroscience

Análisis multiplexado de la expresión génica de la retina y la accesibilidad a la cromatina utilizando scRNA-Seq y scATAC-Seq

Published: March 12, 2021 doi: 10.3791/62239
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2,3,4,5,6
1Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Psychiatry and Behavioral Science, The Johns Hopkins Hospital, 3Department of Ophthalmology, The Johns Hopkins Hospital, 4Department of Neurology, The Johns Hopkins Hospital, 5Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Kavli Neuroscience Discovery Institute, Johns Hopkins University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Aquí, los autores muestran la utilidad de MULTI-seq para fenotipar y posteriormente emparejar scRNA-seq y scATAC-seq en la caracterización de los perfiles de accesibilidad transcriptómica y cromatina en la retina.

Abstract

Las potentes técnicas de secuenciación de próxima generación ofrecen un análisis sólido y completo para investigar cómo funcionan las redes reguladoras de genes de la retina durante el desarrollo y en los estados de enfermedad. La secuenciación de ARN unicelular nos permite perfilar de forma exhaustiva los cambios en la expresión génica observados en el desarrollo de la retina y la enfermedad a nivel celular, mientras que el ATAC-Seq unicelular permite perfilar el análisis de la accesibilidad a la cromatina y la unión al factor de transcripción a una resolución similar. Aquí se describe el uso de estas técnicas en la retina en desarrollo, y se demuestra MULTI-Seq, donde las muestras individuales se etiquetan con un complejo oligonucleótido-lípido modificado, lo que permite a los investigadores aumentar el alcance de los experimentos individuales y reducir sustancialmente los costos.

Introduction

Comprender cómo los genes pueden influir en el destino celular juega un papel clave en el interrogatorio de procesos como la enfermedad y la progresión embrionaria. Las complejas relaciones entre los factores de transcripción y sus genes diana se pueden agrupar en redes reguladoras de genes. La creciente evidencia coloca estas redes reguladoras de genes en el centro de la enfermedad y el desarrollo a través de los linajes evolutivos1. Mientras que las técnicas anteriores, como la qRT-PCR, se centraban en un solo gen o conjunto de genes, la aplicación de la tecnología de secuenciación de alto rendimiento permite el perfil de transcriptomas celulares completos.

RNA-seq ofrece una visión de la transcriptómica a gran escala 2,3. La secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) brinda a los investigadores la capacidad no solo de perfilar transcriptomas, sino también de vincular tipos celulares específicos con perfiles de expresión génica4. Esto se logra bioinformáticamente alimentando perfiles celulares individuales en algoritmos de clasificación utilizando marcadores genéticos conocidos5. La multiplexación mediante secuenciación de índices marcados con lípidos (MULTI-seq) ofrece una diversidad sin precedentes en el número de perfiles scRNA-Seq que se pueden recoger6. Esta técnica basada en lípidos difiere de otras técnicas de indexación de muestras, como el hashing celular, que se basan en la presencia de antígenos de superficie y anticuerpos de alta afinidad en lugar de la integración de la membrana plasmática7. Ahora no solo es posible perfilar los perfiles de expresión génica en tipos de células, sino que se pueden combinar diferentes experimentos en una sola biblioteca de secuenciación, lo que reduce drásticamente el costo de un experimento individual de scRNA-seq6. El costo de scRNA-seq puede parecer prohibitivo para su uso en experimentos de fenotipado donde se analizan muchos genotipos, condiciones o muestras de pacientes diferentes, pero la multiplexación permite la combinación de hasta 96 muestras en una sola biblioteca6.

El perfil de la expresión génica a través de scRNA-seq no ha sido la única técnica basada en secuenciación de alto rendimiento que revoluciona la comprensión actual de cómo los mecanismos moleculares dictan el destino celular. Si bien comprender qué transcripciones de genes están presentes en una célula permite la identificación del tipo de célula, igualmente importante es comprender cómo la organización genómica regula el desarrollo y la progresión de la enfermedad. Los primeros estudios se basaron en la detección de la escisión mediada por DNasa de secuencias no unidas a histonas, seguida de la secuenciación de los fragmentos de ADN resultantes para identificar regiones de cromatina abierta. Por el contrario, el ensayo de una sola célula para la secuenciación de cromatina accesible de transposones (scATAC-seq) permite a los investigadores sondear el ADN con un transposón domesticado para perfilar fácilmente la cromatina abierta en el nivel de nucleótido único8. Esto ha pasado por una escala similar a scRNA-seq y ahora los investigadores pueden identificar tipos de células individuales y perfilar fenotipos en miles de genomas individuales8.

El emparejamiento de scRNA-seq y scATAC-seq ha permitido a los investigadores la capacidad de perfilar miles de células para determinar poblaciones celulares, organización genómica y redes reguladoras de genes en modelos de enfermedades y procesos de desarrollo 9,10,11,12. Aquí, los autores describen cómo utilizar primero MULTI-seq para condensar el fenotipado de una miríada de modelos animales y emplear scRNA-seq y scATAC-seq pareados para obtener una mejor comprensión del paisaje de la cromatina y las redes reguladoras en estos modelos animales.

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Protocol

El uso de animales para estos estudios se realizó utilizando protocolos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Johns Hopkins, de conformidad con las pautas de ARRIVE, y se realizaron de acuerdo con las pautas y regulaciones relevantes.

1. MULTI-seq

  1. Preparación de medios
    1. Preparar y equilibrar el inhibidor ovomucoide, 10 mg de inhibidor ovomucoide y 10 mg de albúmina por ml de Earle's Balanced Salt Solution (EBSS), durante 30 min antes de usar13. Equilibrar con 95% O2:5% CO2 en una incubadora.
      1. Preparar solución de disociación de papaína, 20 unidades/ml de papaína y 0,005% de DNasa en EBSS, durante esta etapa de incubación13.
        NOTA: Un vial de solución de DNasa será suficiente para 5 muestras. Es posible que sea necesario reconstituir viales adicionales si se realiza MULTI-seq en más de 5 muestras.
    2. Preparar soluciones de oligocódigo de barras modificados con lípidos.
      1. Haga una dilución de código de barras única para cada muestra combinando 0,5 μL de solución madre de código de barras de 100 μM con 4,5 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
      2. Para preparar la solución de anclaje: código de barras en una relación molar de 1: 1, combine 4.4 μL de dilución de código de barras de 10 μM, 0.9 μL de solución de anclaje de 50 μM y 16.7 μL de PBS y colóquelo en hielo. La concentración final tanto para las hebras de código de barras como para las hebras de anclaje debe ser de 2 μM.
      3. Para preparar la solución de coanclaje, combine 0,88 μL de solución de coanclaje de 50 μM y 21,12 μL de PBS y colóquela en hielo. La concentración final del coanclaje debe ser de 2 μM. Multiplique los volúmenes en este paso por 1,1 veces el número de muestras.
    3. Para producir BSA al 1% en PBS, disuelva 0.1 g de albúmina sérica bovina (BSA) en 10 ml de PBS y colóquelo en hielo.
    4. Para hacer PBS con inhibidor de la RNasa, combine 2,5 μL de 40 U/μL inhibidor de la RNasa con 197,5 μL de PBS y guárdelo en hielo. Multiplique los volúmenes en este paso por 1,1 veces el número de muestras.
  2. Disociación de la muestra
    1. Eutanasia a los animales a través de la luxación cervical y / o asfixia de CO2 de acuerdo con los requisitos institucionales de la IACUC. El método para la eutanasia dependerá de los requisitos institucionales y del organismo modelo utilizado.
    2. Diseccionar la retina de ambos ojos en PBS frío bajo un microscopio de disección y transferir a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml utilizando una pipeta de transferencia.
    3. Transfiera 500 μL de la solución de papaína a un tubo de 1,5 ml para cada muestra.
    4. Coloque las muestras en la solución de papaína e inmediatamente cubra los tubos.
    5. Incubar los tubos que contienen las muestras a 37 °C, 5% CO2 durante 30 min. Invierta los viales 3 veces cada 10 minutos. Las muestras deben disociarse progresivamente con cada ronda de inversiones.
    6. Devuelva los viales a temperatura ambiente y triture cada muestra 3-4 veces con una pipeta de 1 ml ajustada a 300 μL.
    7. Permita que cualquier pedazo de tejido no disociado que quede después de la trituración se asiente.
    8. Retire la suspensión celular turbia mientras evita cualquier trozo de tejido no disociado y coloque la suspensión celular de cada muestra en un nuevo tubo estéril de 15 ml con tapa de rosca.
    9. Centrifugar las suspensiones celulares a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
    10. Durante la etapa de centrifugación, prepare el medio de resuspensión celular.
      1. Mezclar 857 μL de EBSS (Vial 1) con 95 μL de solución reconstituida de inhibidor de albúmina-ovomucoide en un tubo estéril de 1,5 ml con tapón de rosca. Añadir 48 μL de solución de DNasa guardada de 1.1.1. Multiplique los volúmenes en este paso por 1,1 veces el número de muestras.
    11. Deseche el sobrenadante, con cuidado de retener los gránulos celulares, y vuelva a suspender inmediatamente los gránulos celulares en una solución de resuspensión celular de 1 ml preparada en el paso 1.2.10.
    12. Preparar gradiente de densidad discontinuo.
      1. Para cada muestra, agregue 1,6 ml de solución inhibidora de ovomucoide a un nuevo tubo estéril tapado con tornillo de 15 ml y coloque cuidadosamente la suspensión celular en la parte superior. La interfaz entre las dos capas del gradiente debe ser visible, pero cierta mezcla no afecta los resultados.
    13. Centrifugar los gradientes de densidad discontinua a 70 x g durante 6 min a temperatura ambiente. Las células disociadas deben filtrarse en la parte inferior de los tubos, mientras que los fragmentos de membrana permanecen en la interfaz.
    14. Deseche el sobrenadante y agregue 200 μL de PBS para lavar las células peletizadas. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
    15. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células en 180 μL de PBS con inhibidor de la RNasa. Pase las células a través de un colador de células de 40 μm en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml.
  3. Código de barras de celda
    1. Agregue 20 μL de solución de anclaje: código de barras a cada muestra y pipete suavemente para mezclar. Asegúrese de que cada muestra reciba una solución única de anclaje: código de barras e incube en hielo durante 5 minutos.
      1. Preparar los materiales necesarios para la generación de perlas de gel en emulsión (GEM) y el código de barras durante esta incubación14.
    2. Añadir 20 μL de solución de anclaje conjunto a cada muestra y pipetear suavemente para mezclar. Incubar en hielo durante 5 min.
    3. Añadir 1 ml de BSA al 1% en PBS a cada muestra y centrifugar las células a 300 x g durante 5 min a 4 °C.
    4. Retire el sobrenadante sin perturbar el gránulo celular y agregue 400 μL de BSA helada al 1% en PBS. Centrifugadora a 300 x g durante 5 min a 4 °C.
      1. Repita el paso 1.3.4 para un total de 2 lavados. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender en 400 μL de BSA helada al 1% en PBS.
    5. Determine la concentración de células para cada muestra utilizando un hemocitómetro.
      1. Determine el número total de celdas a cargar para cada muestra. Normalmente, este es el número total de celdas deseadas dividido por el número de muestras. Sin embargo, si se perdió una réplica biológica para una condición, su parte puede dividirse entre las otras réplicas biológicas de esa condición.
      2. Divida el número de celdas deseadas para cada muestra por la concentración celular de esa muestra calculada en el paso 3.5 para determinar el volumen requerido para cargar el número deseado de células.
    6. Combine los volúmenes calculados en el paso 3.5.2 de cada muestra en un nuevo tubo de centrífuga estéril de 1,5 ml. Es prudente duplicar el volumen tomado de cada muestra en caso de fallo de la generación de GEM.
      1. Determinar la concentración celular "final" de las muestras combinadas utilizando un hemocitómetro.
  4. Generación GEM y códigos de barras
    1. Utilice muestras combinadas para generar y código de barras GEMs14.
  5. Limpieza posterior a GEM-RT y amplificación de CDNA
    1. Prepare los materiales para la limpieza de la transcriptasa inversa posterior a GEM y la amplificación de ADNc de acuerdo con las instrucciones del fabricante con las siguientes modificaciones14. Realice la limpieza posterior a GEM-RT por selección de tamaño14.
      1. Aumentar el volumen de etanol al 80% preparado en 2 mL.
      2. Preparar la mezcla de amplificación de ADNc sobre hielo14. Añadir 1 μL de imprimación MULTI-seq de 2,5 μM a la mezcla de amplificación de ADNc. Vórtice para 5 s y centrífuga para 5 s en una mini centrífuga de sobremesa.
    2. Realizar la amplificación deaDNc 14. El ADNc se puede almacenar a 4 °C durante un máximo de 72 h en este punto.
    3. Realice la limpieza de ADNc por selección de tamaño14. El ADNc de transcripción endógena se puede almacenar a 4 °C durante un máximo de 72 h o a -20 °C durante un máximo de 4 semanas en este punto.
      1. No descarte el sobrenadante de la primera ronda de selección de tamaño. Esta fracción contiene los códigos de barras de muestra. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml.
      2. Guarde el sobrenadante en hielo.
    4. Vórtice para resuspend paramagnética basada en perlas reactivo de selección de tamaño y agregar 260 μL de reactivo de selección de tamaño paramagnético basado en perlas (final 3.2x) y 180 μL de isopropanol 100% (1.8x) al sobrenadante. Pipetear la mezcla 10 veces e incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
    5. Coloque el tubo en un estante magnético y espere a que la solución se despeje. Luego retire y deseche el sobrenadante.
    6. Añadir 500 μL de etanol al 80% a las perlas y dejar reposar durante 30 s. Retire y deseche el sobrenadante.
      1. Repetir para un total de 2 lavados.
    7. Centrifuga brevemente las cuentas y vuelve al bastidor magnético. Inicie un temporizador durante 2 minutos.
    8. Retire el etanol restante con una pipeta P10 y seque al aire las perlas en el bastidor magnético durante el resto de los 2 minutos. No exceda de 2 min.
    9. Retire las perlas del bastidor magnético y vuelva a suspenderlas en un tampón de elución (EB) de 100 μL. Pipete a fondo para resuspend.
    10. Incubar a temperatura ambiente durante 2 min.
    11. Vuelva al bastidor magnético y espere a que la solución se despeje.
    12. Transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga fresco de 1,5 ml.
    13. Repita los pasos 1.5.4 a 1.5.12. Reducir a la mitad el volumen de EB del búfer utilizado en el paso 1.5.9.
    14. Determine la concentración de ADN de código de barras y la distribución del tamaño utilizando un kit de ensayo de alta sensibilidad dsDNA y un fluorómetro y analizador de fragmentos15,16. El CDNA de código de barras se puede almacenar a 4 °C durante un máximo de 72 h o a -20 °C durante un máximo de 4 semanas en este punto.
  6. Construcción de bibliotecas de códigos de barras
    1. Preparar 1 mL de etanol al 80%.
    2. Prepare la mezcla maestra de PCR de la biblioteca de códigos de barras en un tubo de tira de PCR estéril: combine 26,25 μL de 2x mezcla lista de PCR de inicio en caliente, 2,5 μL de imprimación Universal i5 de 10 μM, 2,5 μL de imprimación RPI de 10 μM, 3,5 ng de ADNc de código de barras (volumen determinado por la concentración del Paso 5.14) y suficiente agua libre de nucleasas para llevar el volumen final a 50 μL.
      1. Utilice un cebador RPI único para cada biblioteca de códigos de barras si se secuencian varias bibliotecas MULTI-seq.
    3. Someta la mezcla maestra de la biblioteca de códigos de barras a una PCR de preparación de la biblioteca: 95 ° C durante 5 min; 10 ciclos de 98 °C durante 15 s, 60 °C durante 30 s, 72 °C durante 30 s; 72 °C durante 1 min; y luego mantener a 4 °C.
    4. Vórtice para resuspendir el reactivo de selección de tamaño paramagnético basado en cuentas.
    5. Retire el producto de PCR del termociclador y agregue 80 μL (1.6x) de reactivo de selección de tamaño paramagnético basado en perlas. Pipeta a fondo.
    6. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Coloque en el separador de imanes en la posición alta y espere a que la solución se despeje.
    7. Retire y deseche el sobrenadante.
    8. Agregue 200 μL de etanol al 80% a las perlas y deje reposar durante 30 s. Retire y deseche el sobrenadante.
      1. Repita el paso 1.6.8 para un total de 2 lavados.
    9. Centrifuga brevemente el tubo y colócalo en el separador magnético en la posición baja. Inicie un temporizador durante 2 minutos.
    10. Retire el etanol restante con una pipeta P20 y seque al aire las perlas en el separador magnético durante el resto de los 2 minutos. No exceda de 2 min.
    11. Retire el tubo del separador magnético y vuelva a suspender las perlas en 25 μL de eb tampón. Mezcle bien las pipetas para volver a suspender las cuentas.
    12. Incubar durante 2 min a temperatura ambiente.
    13. Vuelva al separador magnético en la posición baja y espere a que la solución se despeje. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de tira de PCR.
    14. Cuantificar la concentración de la biblioteca de expresiones y la biblioteca de códigos de barras y la distribución del tamaño de los fragmentos utilizando el kit de ensayo de alta sensibilidad adsDNA y el fluorómetro y el analizador de fragmentos.
  7. 3' Construcción de la Biblioteca de Expresión Génica
    1. Realice la construcción de la biblioteca de expresión génica de 3' de acuerdo con las instrucciones del fabricante14.
  8. Secuenciación
    1. Además de la biblioteca endógena de ADNc amplificada en el paso 7, envíe la biblioteca de códigos de barras amplificada en el paso 6. Para simplificar, envíe estas bibliotecas por separado o, como medida rentable, incluya una alícuota del material de código de barras de muestra con la biblioteca endógena de ADNc. Apunta a entre 20.000-50.000 cDNA y 3.000-5.000 lecturas de códigos de barras por celda.
    2. Convierta los archivos bcl de secuenciación resultantes en archivos fastq por cellranger mkfastq y cuente las matrices generadas a partir de estos por el recuento de cellranger.
    3. Muestras de Deconvolute después del análisis de Cellranger utilizando el paquete deMULTIplex r disponible en el repositorio multi-seq de GitHub (https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/MULTI-seq).

2. Emparejado scRNA-seq y scATAC-seq

  1. Tejido de congelación flash para scATAC-seq y fijación de metanol de células de la retina para scRNA-seq
    1. Preparación de medios
      1. Para preparar las soluciones para la disociación retiniana, repita los pasos 1.1.1 y 1.1.4.
      2. Prepare un baño de hielo seco con etanol en un pequeño cubo de hielo.
      3. Prepare 15 ml de etanol al 70% agregando 10,5 ml de etanol a 4,5 ml de agua libre de nucleasas.
      4. Agregue suficiente hielo seco al cubo de hielo (preferiblemente en forma de gránulos) para que 15 ml de líquido se eleven para cubrir el hielo. Añadir los 15 mL de etanol.
      5. Coloque PBS sobre hielo y 1 ml de alícuotas de 100% metanol en un conveniente congelador de -20 °C.
    2. Preparación de muestras
      1. Siga los pasos 1.2.1 y 1.2.2 para aislar las retinas; sin embargo, esta vez coloque cada retina en un tubo de microcentrífuga separado.
      2. Para las muestras destinadas a scATAC-seq, retire cualquier líquido del tubo de la microcentrífuga con una pipeta P200 e inmediatamente cubra y coloque el tubo en un baño de hielo seco con etanol para congelar la muestra.
      3. Para las muestras destinadas a scRNA-seq, para disociar las células, repita los pasos 1.2.3 a 1.2.15 en la retina diseccionada.
      4. Centrifugar las células a 300 x g durante 3 min a temperatura ambiente.
      5. Retire el sobrenadante sin interrumpir el gránulo celular.
      6. Agregue 1 ml de PBS refrigerado y mezcle suavemente 10 veces o hasta que las celdas estén completamente suspendidas.
      7. Centrifugadora a 300 x g durante 5 min a 4 °C.
        1. Repita los pasos 2.1.2.5 a 2.1.2.7 para un total de 2 lavados.
      8. Retire el sobrenadante sin interrumpir el gránulo celular.
      9. Agregue 100 μL de PBS refrigerado y mezcle suavemente 10 veces o hasta que las células estén completamente suspendidas.
      10. Comience a vórtice el tubo a la velocidad más baja. Agregue 900 μL de metanol refrigerado (-20 ° C) gota a gota mientras continúa vórtice suavemente el tubo para evitar que las células se agrupen.
      11. Incubar las células en hielo durante 15 min.
      12. Determine la concentración de las células fijas utilizando un hemocitómetro.
      13. Evaluar la eficacia del paso de fijación utilizando el azul de tripano. Una alta fracción de células viables indica que se requiere más tiempo de fijación.
      14. Conservar el tejido congelado y las células fijas a -80 °C.
  2. Aislamiento de núcleos de tejido congelado flash para scATAC-seq
    1. Preparación de medios
      1. Preparar el tampón de dilución de lisis combinando 9,77 mL de agua libre de nucleasa, 100 μL de 1 M Tris-HCl (pH 7,4), 100 μL de 1 M De NaCl, 30 μL de 1 M MgCl2 y 0,1 g de BSA.
      2. Prepare el tampón de dilución de lisis con anticipación, como el día anterior, y guárdelo a 4 °C. El día del protocolo, colóquelo en hielo.
      3. Equilibra el tampón de núcleos 20x proporcionado por el fabricante del kit scATAC desde -20 °C hasta temperatura ambiente. Vórtice y centrífuga brevemente.
      4. Prepare el tampón de lisis 1x incubando una solución de digitonina al 5% en un baño de agua a 65 °C hasta que el precipitado se disuelva. A continuación, combine 2 ml de tampón de dilución de lisis, 20 μL de Tween-20 al 10%, 20 μL de sustituto nonidet P40 (alternativamente puede etiquetarse IGEPAL) y 4 μL de digitonina.
      5. Guarde el tampón de lisis 1x en hielo.
      6. Para preparar el tampón de lisis 0.1x, combine 1.8 ml de tampón de dilución de lisis con 200 μL del tampón de lisis 1x y guárdelo en hielo.
      7. Para preparar el tampón de lavado, combine 2 ml de tampón de dilución de lisis y 20 μL de Tween-20 al 10% y guárdelo en hielo.
      8. Para preparar el tampón de núcleos diluidos, combine 950 μL de agua libre de nucleasa con 50 μL de tampón de núcleos (20x) y guárdelo en hielo.
    2. Aislamiento de núcleos
      1. No descongele la muestra antes de la lisis. Añadir 500 μL de tampón de lisis 0,1x refrigerado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contenga la muestra congelada. Homogeneizar inmediatamente 15x usando un mortero de pellets.
      2. Incubar durante 5 min sobre hielo. Preparar los materiales necesarios para la transposición de scATAC durante esta etapa de incubación17.
      3. Mezcla de pipetas 10x con una pipeta de 1 mL e incuba durante 10 min sobre hielo. Preparación completa de los materiales necesarios para la transposición de scATAC durante esta etapa de incubación si aún no se ha completado. Es innecesario preparar más Diluted Nuclei Buffer.
      4. Añadir 500 μL de tampón de lavado refrigerado a las células lisadas. Mezcla de pipetas 5x.
      5. Pase la suspensión a través de un colador de células de 70 μm a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Filtre ~ 300 μL a la vez usando un nuevo colador de células de 70 μm cada vez.
      6. Pase el flujo recolectado a través de un colador de células de 40 μm a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y guárdelo en hielo.
      7. Determine la concentración de núcleos utilizando un hemocitómetro. Sobre la base de la concentración de núcleos y el volumen total de la suspensión celular, calcule el número total de núcleos disociados.
      8. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C y retirar el sobrenadante sin interrumpir el pellet de núcleos.
      9. Para crear el stock de núcleos basado en el recuento total de núcleos determinado en el paso 2.2.2.7., resuspenda los núcleos en suficiente amortiguación de núcleos diluidos para alcanzar una concentración de núcleos deseada.
        NOTA: La concentración de núcleos deseados se basa en la recuperación de núcleos objetivo para el experimento scATAC-seq y se determina a partir de las Pautas de concentración de núcleos que se encuentran en el protocolo del fabricante17. Por ejemplo, si finalmente se desean 10.000 núcleos, la concentración de núcleos deseada para el núcleo es de entre 3.080 y 7.700 núcleos/μL. Podría ser mejor apuntar a la mitad del rango en concentración.
      10. Determine la concentración de núcleos utilizando un hemocitómetro.
      11. Proceder inmediatamente a la transposición scATAC utilizando el material de núcleos preparado17.
  3. Rehidratación de células fijas de metanol para uso en scRNA-Seq
    1. Preparación para los medios de comunicación
      1. Para preparar el tampón de lavado/dilución, disuelva 0,01 g de BSA en 1 ml de PBS. A continuación, añadir 12,5 μL de inhibidor de la RNasa de 40 U/μL y mezclar suavemente. Almacenar en hielo.
    2. Rehidratación celular
      1. Células fijas de metanol centrífuga en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml a 3000 x g durante 10 min a 4 °C. A continuación, retire el sobrenadante.
      2. Añadir un tampón de lavado/dilución refrigerado de 200 μL al tubo de la microcentrífuga. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C y retirar el sobrenadante. Repetir para un total de 2 lavados.
        NOTA: Prepare los materiales necesarios para la generación de GEM y el código de barras durante los dos pasos anteriores14.
      3. Para preparar el stock celular, basado en el número total de células calculado en 2.1.2.12., resuspenda las células en suficiente tampón de lavado/dilución para lograr la concentración celular deseada. Las concentraciones celulares preferidas están entre 700 y 1200 células/μL.
      4. Determine la concentración celular del stock celular utilizando un hemocitómetro.
      5. Proceda inmediatamente a la generación de GEM y al código de barras utilizando el stock deceldas 14.
    3. Secuenciación
      1. Al realizar análisis de curso de tiempo (como en el desarrollo o la enfermedad), secuenciar múltiples muestras en una ejecución multiplexada (es decir, múltiples bibliotecas en una sola celda de flujo) para reducir la variación técnica.

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Representative Results

Este flujo de trabajo establece una estrategia para la investigación de fenotipos de desarrollo y procesos regulatorios utilizando la secuenciación de células individuales. La multiplexación de muestras MULTI-seq permite un ensayo inicial de fenotipado de bajo costo, mientras que la recolección y fijación emparejadas de muestras para scRNA-seq y scATAC-seq permite una investigación más profunda (Figura 1).

El código de barras MULTI-seq permite la secuenciación combinada de múltiples muestras y su posterior deconvolución computacional. La muestra de origen se puede determinar para cada celda en función de su expresión de código de barras (Figura 2A). Estas muestras combinadas se pueden analizar como un único conjunto de datos con el fin de agrupar células e identificar tipos de células (Figura 2B). Debido a que cada celda tiene un código de barras antes de la generación de GEM, los dobletes de celda tendrán una alta probabilidad de mostrar expresión para múltiples códigos de barras MULTI-seq y, por lo tanto, la mayoría de los dobletes se pueden identificar y eliminar antes de la agrupación y la identificación del tipo de celda (Figura 2C). El aumento del número de células utilizadas en el paso de generación de GEM aumentará la proporción de dobletes encontrados. scATAC-seq se puede utilizar para generar un conjunto de datos con tipos de células que coincidan con los encontrados por scRNA-seq (Figura 2D). El emparejamiento de la expresión génica scRNA-seq y la información de accesibilidad del ADN scATAC-seq permite la reconstrucción de las redes reguladoras de genes.

Figure 1
Figura 1: Esquema que demuestra el uso de MULTI-Seq en el análisis inicial, seguido de análisis separados de scRNA-Seq y scATAC-Seq en la caracterización en profundidad de fenotipos, tratamientos o estados de enfermedad de interés. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Representaciones de reducción dimensional UMAP de datos MULTI-seq para una serie alélica de ratones knockout P0 Sstr2 que demuestran (a) la deconvolución del genotipo para cada célula en el conjunto de datos y (b) la identificación de tipos de células en el conjunto de datos. La sobrecarga de las celdas durante la generación de GEM y el paso de código de barras dará como resultado un aumento en los dobletes de celdas como los que se ven en (c), que muestra los datos de (a) y (b) antes de la eliminación y el reclustering del doblete. En (d), datos de scATAC-Seq de células GFP positivas obtenidas en E16 de explantes de retina electroporados con un plásmido de control que expresa GFP en E14. Los tipos de células se anotan en función de la accesibilidad de los genes específicos del tipo de célula. Esta figura ha sido modificada de Weir, K., Kim, D. W., Blackshaw, S. Regulación de la neurogénesis retiniana por señalización de somatostatina. bioRxiv 2020.09.26.314104 (2020) doi:10.1101/2020.09.26.31410418 y datos originales no publicados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El poder de MULTI-seq se deriva de la integración perfecta de datos de múltiples condiciones o modelos experimentales y el enorme beneficio en términos de costo y limitación de los efectos de lote. La utilización de MULTI-seq ofrece una profundidad de fenotipado de laboratorio sin precedentes. Los métodos de multiplexación no genéticos como el hashing celular o el hashing de núcleos abrieron la puerta a muestras multiplexadas mediante el uso de anticuerpos con código de barras 7,19,20. Sin embargo, esto se basa en la disponibilidad de anticuerpos de alta afinidad que reconocen las proteínas de superficie expresadas en las células o sus núcleos, lo que no será posible si estos anticuerpos no están disponibles o las células no expresan antígenos nucleares o de superficie celular apropiados7. Debido a que MULTI-seq utiliza códigos de barras oligo modificados con lípidos para incorporarse de manera estable en las células o sus núcleos, permite a los investigadores recopilar datos transcriptómicos de hasta 96 muestras frescas o fijas de una manera más barata y más ampliamente aplicable6.

Se sugiere y muestra el seguimiento del fenotipado multi-Seq inicial con scRNA-Seq y scATAC-Seq pareados para obtener una comprensión de la organización genómica que coincide con los datos transcriptómicos1. Esto no solo da una idea de las regiones de heterocromatina y eucromatina, sino también una valiosa comprensión de las redes de factores de transcripción que impulsan la expresión génica. Se puede utilizar un enfoque multiómico para revelar los cambios dinámicos de cromatina que tienen lugar en puntos clave de las decisiones sobre el destino celular y determinar las trayectorias celulares en el desarrollo y la enfermedad 1,21,22. Esto se puede lograr a través de la sujeción bioinformática de los datos a pseudotiempo, interacciones cis-reguladoras y análisis de huella 5,23,24,25. La fijación de las muestras y la secuenciación múltiple en una ejecución multiplexada reduce las fuentes de efecto por lotes, lo que permite la comparación entre muestras, como a través de un experimento de curso de tiempo. El número de muestras de tejido requeridas depende del alcance del experimento. Al examinar los fenotipos asociados con los puntos de tiempo embrionarios, las retinas individuales a menudo son suficientes y pueden proporcionar cientos de miles de células. Una sola retina puede no proporcionar suficientes células en esquemas experimentales más complejos: electroporaciones ex vivo de explantes retinianos, sondeo de poblaciones celulares raras o modelos genéticos con activación insuficiente de CRE. Si bien una sola retina puede proporcionar unos pocos cientos de células, estas no capturarán toda la complejidad del tejido. Para tales experimentos, se requerirá optimización basada en las necesidades de un investigador. Utilizando estas técnicas, uno puede obtener información sobre cómo los genes analizados en MULTI-seq se regulan durante procesos dinámicos como el desarrollo y la enfermedad.

La regulación de las redes reguladoras de genes se encuentra en el corazón de la comprensión de los procesos celulares y cómo contribuyen al desarrollo y la enfermedad 1,26,27. El flujo de trabajo presentado aquí se puede utilizar para identificar estas redes reguladoras de genes en tipos celulares específicos. Sin embargo, este protocolo ha sido optimizado para su uso con tejido retiniano de ratón. La optimización de varios pasos, como el tiempo de lisis o disociación, las velocidades / tiempos de centrifugación y el número de pasos de filtración pueden ser necesarios para maximizar el número de células o núcleos y minimizar los restos celulares en suspensiones celulares de otros tipos de tejidos, muestras ex vivo o especies, ya sea que las muestras sean frescas, congeladas o fijadas en metanol. Es posible que sea necesario aumentar el tiempo de fijación de metanol si las muestras muestran altos niveles de células viables con tinción de azul tripano. La técnica MULTI-seq introduce muchos pasos de lavado adicionales sobre el scRNA-seq tradicional. Para evitar la eliminación accidental de células o ADN valiosos, es prudente optimizar las velocidades de centrifugación y mantener los sobrenadantes que normalmente se descartarían en el código de barras celular, la limpieza posterior a GEM RT y los pasos de construcción de la biblioteca de códigos de barras en hielo hasta que se haya verificado que ese paso es exitoso. Una limitación de MULTI-seq es el número limitado de células, y por lo tanto muestras, que se pueden secuenciar desde un solo pozo en el paso de generación gem. Se recomienda no tratar de sobrecargar excesivamente las células durante este paso para evitar un aumento sustancial en la captura de células dobles. Evite cargar un pozo GEM con más de 20.000 celdas. Más bien, se pueden preparar múltiples pozos a partir de una sola suspensión combinada y multiplexar durante la secuenciación. Esto requerirá preparar un volumen lo suficientemente grande de suspensión celular para la generación de GEM y la adición de réplicas a los pasos 5, 6 y 7 y aumentará el costo de la secuenciación a medida que se necesiten más lecturas totales para más células. Con la optimización adecuada, este flujo de trabajo permitirá la identificación rentable y eficiente en el tiempo de fenotipos específicos del tipo de célula y redes reguladoras de genes.

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Disclosures

Nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Linda Orzolek del Johns Hopkins Transcriptomics and Deep Sequencing Core por su ayuda en la secuenciación de las bibliotecas producidas y a Lizhi Jiang por realizar los explantes de retina ex vivo .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette filter tips
10% Tween 20 Bio-Rad 1662404
100 µM Barcode Solution Request from Gartner lab https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested
=true
100% Ethanol Millipore Sigma E7023-500ML
100% Methanol Millipore Sigma 322415-100ML
10x Chip Holder 10x Genomics 1000195
10x Chromium controller & Accessory Kit 10x Genomics PN-120263
15mL Centrifuge Tube Quality Biological P886-229411
40 µm FlowMi Cell Strainer Bel-Art H13680-0040
50 µM Anchor Solution Sigma or request from Gartner lab https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested
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50 µM Co-Anchor Solution Sigma or request from Gartner lab https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested
=true
5200 Fragment Analyzer system Agilent M5310AA
70 um FlowMi cell strainer Bel-Art H13680-0070
Allegra X-12R Centrifuge VWR BK392302
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9647
Chromium Next GEM Chip G 10x Genomics PN-1000120
Chromium Next GEM Chip H 10x Genomics PN-1000161
Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.1 10x Genomics PN-1000175
Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1 10x Genomics PN-1000121
Digitonin Fisher Scientific BN2006
Dissection microscope Leica
DNA LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 22431021
Dry Ice
EVA Foam Ice Pan Tequipment 04393-54
FA 12-Capillary Array Short, 33 cm Agilent A2300-1250-3355
Fisherbrand Isotemp Water Bath Fisher Scientific 15-460-20Q
Forma CO2 Water Jacketed Incubator ThermoFisher Scientific 3110
Glycerol 50% Aqueous solution Ricca Chemical Company 3290-32
Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber Fisher Scientific 02-671-51B
Illumina NextSeq or NovaSeq Illumina
Kapa Hifi Hotstart ReadyMix HiFi 7958927001
Low TE Buffer Quality Biological 351-324-721
Magnesium Chloride Solution 1 M Sigma-Aldrich M1028
Magnetic Separator Rack for 1.5 mL tubes Millipore Sigma 20-400
Magnetic Separator Rack for 200 µL tubes 10x Genomics NC1469069
MULTI-seq Primer Sigma or IDT See sequence list
MyFuge Mini Centrifuge Benchmark Scientific C1008
Nonidet P40 Substitute Sigma-Aldrich 74385
Nuclease-free water Fisher Scientific AM9937
P2, P10, P20, P200, P1000 micropipettes Eppendorf
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation LK003150
PBS pH 7.4 (1X) Fisher Scientific 10010-023
Qiagen Buffer EB Qiagen 19086
Refridgerated Centrifuge 5424 R Eppendorf 2231000655
RNase-free Disposable Pellet Pestles Fisher Scientific 12-141-368
RNasin Plus RNase Inhibitor Promega N2615
RPI primer Sigma or IDT See sequence list
Single Index Kit N, Set A 10x Genomics PN-1000212
Single Index Kit T Set A 10x Genomics PN-1000213
Sodium Chloride Solution 5 M Sigma-Aldrich 59222C
SPRIselect Reagent Kit Beckman Coulter B23318
Standard Disposable Transfer Pipettes Fisher Scientific 13-711-7M
TempAssure PCR 8-tube strip USA Scientific 1402-4700
Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.4 Sigma-Aldrich T2194
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) Corning 25-900-CI
Universal I5 primer Sigma or IDT See sequence list
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems 4375786
Vortex Mixer VWR 10153-838

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References

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Neurociencia Número 169 Desarrollo Enfermedad scRNA-Seq scATAC-Seq MULTI-Seq multiplex Cromatina
Análisis multiplexado de la expresión génica de la retina y la accesibilidad a la cromatina utilizando scRNA-Seq y scATAC-Seq
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Weir, K., Leavey, P., Santiago, C.,… More

Weir, K., Leavey, P., Santiago, C., Blackshaw, S. Multiplexed Analysis of Retinal Gene Expression and Chromatin Accessibility Using scRNA-Seq and scATAC-Seq. J. Vis. Exp. (169), e62239, doi:10.3791/62239 (2021).

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