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Neuroscience

scRNA-SeqおよびscATAC-Seqを用いた網膜遺伝子発現およびクロマチンアクセシビリティの多重化解析

Published: March 12, 2021 doi: 10.3791/62239
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2,3,4,5,6
1Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Psychiatry and Behavioral Science, The Johns Hopkins Hospital, 3Department of Ophthalmology, The Johns Hopkins Hospital, 4Department of Neurology, The Johns Hopkins Hospital, 5Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Kavli Neuroscience Discovery Institute, Johns Hopkins University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

ここで著者らは、網膜におけるトランスクリプトームおよびクロマチンアクセシビリティプロファイルを特徴付ける際の表現型決定およびその後のscRNA-seqおよびscATAC-seqのペアに対するMULTI-seqの有用性を示す。

Abstract

強力な次世代シーケンシング技術は、網膜遺伝子調節ネットワークが発生中および疾患状態でどのように機能するかを調査するための堅牢で包括的な分析を提供します。単一細胞RNAシーケンシングは、網膜の発達および疾患において観察される遺伝子発現変化を細胞レベルで包括的にプロファイリングすることを可能にし、単一細胞ATAC-Seqは、クロマチンのアクセシビリティおよび転写因子結合の分析を同様の分解能でプロファイリングすることを可能にする。ここでは、発達中の網膜におけるこれらの技術の使用が説明され、個々のサンプルが修飾オリゴヌクレオチド - 脂質複合体で標識されるMULTI-Seqが実証され、研究者は個々の実験の範囲を拡大し、コストを大幅に削減することができます。

Introduction

遺伝子が細胞の運命にどのように影響するかを理解することは、病気や胚の進行などのプロセスを問う上で重要な役割を果たします。転写因子とその標的遺伝子との間の複雑な関係は、遺伝子調節ネットワーク内でグループ化することができる。山積みの証拠は、これらの遺伝子調節ネットワークを進化系統にわたる疾患と発達の両方の中心に置きます1。qRT-PCRなどの以前の技術は単一の遺伝子または遺伝子セットに焦点を当てていましたが、ハイスループットシーケンシング技術の適用により、完全な細胞トランスクリプトームのプロファイリングが可能になります。

RNA-seqは、大規模なトランスクリプトミクス2,3を垣間見ることができます。単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)により、研究者はトランスクリプトームをプロファイリングするだけでなく、特定の細胞型を遺伝子発現プロファイルとリンクさせることができます4。これは、既知の遺伝子マーカー5を用いて個々の細胞プロファイルを選別アルゴリズムに供給することによってバイオインフォマティクス的に達成される。脂質タグ付きインデックスシーケンシング(MULTI-seq)を用いた多重化は、収集可能なscRNA-Seqプロファイルの数に前例のない多様性をもたらします6。この脂質ベースの技術は、原形質膜組み込みの代わりに表面抗原および高親和性抗体の存在に依存する細胞ハッシュなどの他のサンプル索引付け技術とは異なります7。遺伝子発現プロファイルを細胞型にプロファイルできるようになっただけでなく、異なる実験を1つのシーケンシングライブラリにまとめることができ、個々のscRNA-seq実験のコストを大幅に削減できます6。scRNA-seqのコストは、多くの異なる遺伝子型、状態、または患者サンプルが分析される表現型実験での使用には法外に思えるかもしれませんが、多重化により、単一のライブラリ内の最大96サンプルの組み合わせが可能になります6。

scRNA-seqによる遺伝子発現のプロファイリングは、分子メカニズムが細胞の運命をどのように決定するかについての現在の理解に革命をもたらす唯一のハイスループットシーケンシングベースの技術ではありません。どの遺伝子転写産物が細胞内に存在するかを理解することは細胞型の同定を可能にするが、同様に重要なことは、ゲノム組織が発達および疾患進行をどのように調節するかを理解することである。初期の研究は、ヒストンに結合していない配列のDNaseを介した切断を検出し、続いて得られたDNA断片のシーケンシングに依存して、オープンクロマチンの領域を同定した。対照的に、トランスポゾンアクセシブルクロマチンシーケンシング(scATAC-seq)の単一細胞アッセイでは、研究者は家畜化トランスポゾンでDNAをプローブし、一塩基レベルでオープンクロマチンを容易にプロファイリングすることができます8。これはscRNA-seqと同様のスケーリングを経ており、研究者は何千もの個々のゲノムにわたって個々の細胞型を同定し、表現型をプロファイルすることができます8。

scRNA-seqとscATAC-seqの組み合わせにより、研究者は何千もの細胞をプロファイリングして、疾患モデルおよび発生過程における細胞集団、ゲノム組織、および遺伝子調節ネットワークを決定する能力が可能になりました9,10,11,12。ここで著者らは、まずMULTI-seqを利用して無数の動物モデルの表現型を凝縮し、ペアのscRNA-seqとscATAC-seqを使用して、これらの動物モデルにおけるクロマチンランドスケープと調節ネットワークをよりよく理解する方法を概説する。

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Protocol

これらの研究のための動物の使用は、ジョンズホプキンス動物ケアおよび使用委員会によって承認されたプロトコルを使用して、ARRIVEガイドラインに準拠して実施され、関連するガイドラインおよび規制に従って実施された。

1. マルチシーケンス

  1. メディアの準備
    1. 使用前に30分間、オボムコイド阻害剤、10mgのオボムコイド阻害剤、および10mgのアルブミンをアールズバランスソルト溶液(EBSS)のmLあたり調製して平衡化する13。インキュベーター内で95%O2:5%CO2で平衡化する。
      1. このインキュベーションステップ13の間に、EBSS中のパパイン解離溶液、20単位/mLパパインおよび0.005%DNaseを調製する。
        注:DNase溶液の1バイアルは、5サンプルに対して十分であろう。5つ以上のサンプルでMULTI-seqを実行する場合、追加のバイアルを再構成する必要があるかもしれません。
    2. 脂質修飾オリゴバーコード溶液を調製する。
      1. 0.5 μL の 100 μM バーコード原液と 4.5 μL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を組み合わせて、サンプルごとに独自のバーコード希釈を行います。
      2. アンカー:バーコード溶液を1:1のモル比で調製するには、4.4 μL の 10 μM バーコード希釈液、0.9 μL の 50 μM アンカー溶液、および 16.7 μL の PBS を組み合わせて氷の上に置きます。バーコードストランドとアンカーストランドの両方の最終濃度は2 μMにする必要があります。
      3. コアンカー溶液を調製するには、0.88 μL の 50 μM コアンカー溶液と 21.12 μL の PBS を組み合わせて氷の上に置きます。コアンカーの最終濃度は 2 μM で、このステップの体積にサンプル数の 1.1 倍を掛けます。
    3. PBSで1%BSAを作るには、0.1gのウシ血清アルブミン(BSA)を10mLのPBSに溶解し、氷の上に置きます。
    4. RNase阻害剤でPBSを作るには、2.5 μLの40 U/μLのRNase阻害剤と197.5 μLのPBSを組み合わせて氷上で保存します。このステップのボリュームにサンプル数の 1.1 倍を掛けます。
  2. サンプル解離
    1. 施設のIACUC要件に従って、子宮頸部脱臼および/またはCO2 窒息によって動物を安楽死させる。安楽死の方法は、使用される制度的要件およびモデル生物に依存するであろう。
    2. 解剖顕微鏡下で冷PBSで両眼から網膜を解剖し、トランスファーピペットを用いて滅菌1.5mL微量遠心チューブに移した。
    3. 500 μLのパパイン溶液を各サンプルの1.5 mLチューブに移す。
    4. サンプルをパパイン溶液に入れ、すぐにチューブにキャップを付けます。
    5. サンプルを含むチューブを37°C、5%CO2 で30分間インキュベートする。バイアルを10分ごとに3回反転させる。サンプルは、反転の各ラウンドで徐々に解離する必要があります。
    6. バイアルを室温に戻し、300 μLに設定した1 mLピペットで各サンプルを3〜4回トリチュレートします。
    7. 粉砕後に残っている解離していない組織の断片が沈降するのを待ちます。
    8. 解離していない組織片を避けながら白濁した細胞懸濁液を取り出し、各サンプルの細胞懸濁液を新しい滅菌15mLスクリューキャップチューブに入れます。
    9. 細胞懸濁液を300 x gで室温で5分間遠心分離する。
    10. 遠心分離工程中に、細胞再懸濁培地を準備する。
      1. 857 μL の EBSS (バイアル 1) と 95 μL の再構成アルブミン-オボムコイド阻害剤溶液を滅菌 1.5 mL のスクリューキャップ付きチューブに混ぜます。1.1.1から保存したDNase溶液を48μL加える。このステップのボリュームにサンプル数の 1.1 倍を掛けます。
    11. 上清を捨て、細胞ペレットを保持するように注意し、直ちにステップ1.2.10で調製した1mL細胞再懸濁溶液に細胞ペレットを再懸濁する。
    12. 不連続密度勾配を用意する。
      1. 各サンプルについて、1.6 mLのオボムコイド阻害剤溶液を新しい15 mL滅菌スクリューキャップチューブに加え、細胞懸濁液を慎重に上に重ねます。グラデーションの 2 つのレイヤー間のインターフェイスは表示する必要がありますが、一部の混合は結果には影響しません。
    13. 不連続密度勾配を70 x gで室温で6分間遠心分離する。解離した細胞は、膜断片が界面に残っている間に、チューブの底部にペレット状にすべきである。
    14. 上清を捨て、200 μLのPBSを加えてペレット状の細胞を洗浄する。室温で5分間300 x g で遠心分離する。
    15. 上清を捨て、RNase阻害剤を含む180μLのPBSに細胞を再懸濁する。細胞を 40 μm のセルストレーナーに通し、滅菌 1.5 mL の微量遠心チューブに入れます。
  3. セルバーコード
    1. 各サンプルに20 μLのアンカー:バーコード溶液を加え、ピペットを穏やかに混合します。各サンプルが固有のアンカー:バーコードソリューションを受け取り、氷上で5分間インキュベートすることを確認します。
      1. このインキュベーション中にゲルビーズインエマルジョン(GEM)生成およびバーコード化に必要な材料を準備する14。
    2. 各サンプルに20 μLのコアンカー溶液を加え、ピペットで穏やかに混合します。氷上で5分間インキュベートする。
    3. PBS中の氷冷1%BSAを各サンプルに1mL加え、細胞を300 x gで4°Cで5分間遠心分離する。
    4. 細胞ペレットを乱すことなく上清を除去し、PBSに氷冷1%BSAを400μL加える。300 x gで4°Cで5分間遠心分離する。
      1. 手順 1.3.4 を繰り返して、合計 2 回洗浄します。上清を除去し、PBS中の400μL氷冷1%BSAに再懸濁する。
    5. 血球計数器を用いて各試料の細胞の濃度を決定する。
      1. 各サンプルについてロードするセルの総数を決定します。典型的には、これは、所望の細胞の総数をサンプル数で割った値である。しかし、ある条件の生物学的複製が失われた場合、その分担はその条件の他の生物学的複製の間で分割される可能性があります。
      2. 各サンプルに必要なセル数を、ステップ 3.5 で計算したサンプルのセル濃度で除算し、必要なセル数をロードするために必要な体積を決定します。
    6. ステップ3.5.2で計算した容量を、新しい滅菌1.5mL遠心管内の各サンプルから組み合わせます。GEM生成に失敗した場合に備えて、各サンプルから採取した量を2倍にすることが賢明です。
      1. 血球計数器を用いて、組み合わせたサンプルの「最終」細胞濃度を決定する。
  4. GEM の生成とバーコード
    1. 結合されたサンプルを使用して、GEM 14を生成してバーコード化します。
  5. GEM-RT後のクリーンアップとcDNA増幅
    1. 以下の改変14を用いて、製造者の指示に従ってGEM逆転写酵素後クリーンアップおよびcDNA増幅のための材料を調製する。サイズ選択14 でポスト GEM-RT クリーンアップを実行します。
      1. 2mLで調製した80%エタノールの容量を増加させる。
      2. 氷上でcDNA増幅ミックスを調製する14.2.5 μM MULTI-seqプライマーを1 μL、cDNA増幅ミックスに加えます。ベンチトップミニ遠心分離機で5秒間のボルテックスと5秒間の遠心分離機。
    2. cDNA増幅を行う14.cDNAは、この時点で4°Cで最大72時間保存することができます。
    3. サイズ選択14によるcDNAクリーンアップを実行します。内因性転写産物cDNAは、この時点で4°Cで最大72時間、または-20°Cで最大4週間保存することができます。
      1. サイズ選択の最初のラウンドの上清を捨てないでください。この分数には、サンプルバーコードが含まれています。 上清を新しい滅菌1.5mL微量遠心チューブに移す。
      2. 上清を氷上に保存する。
    4. ボルテックスで常磁性ビーズベースのサイズ選択試薬を再懸濁し、260 μLの常磁性ビーズベースのサイズ選択試薬(最終3.2x)と180 μLの100%イソプロパノール(1.8x)を上清に加えます。混合物を10回ピペットにピペットし、室温で5分間インキュベートする。
    5. チューブを磁気ラックに置き、溶液がクリアされるのを待ちます。その後、上清を取り出して廃棄します。
    6. ビーズに500μLの80%エタノールを加え、30秒間放置する。上清を除去して廃棄する。
      1. 合計2回の洗浄を繰り返します。
    7. ビーズを短時間遠心分離し、磁気ラックに戻します。タイマーを2分間開始します。
    8. 残りのエタノールをP10ピペットで取り出し、磁気ラック上のビーズを残りの2分間風乾します。2分を超えないようにしてください。
    9. ビーズを磁気ラックから取り出し、100 μL 溶出バッファー (EB) に再懸濁します。ピペットで徹底的に蘇生させる。
    10. 室温で2分間インキュベートする。
    11. 磁気ラックに戻り、溶液がクリアされるのを待ちます。
    12. 上清を新鮮な1.5 mL微量遠心チューブに移します。
    13. 手順 1.5.4 ~ 1.5.12 を繰り返します。ステップ 1.5.9 で使用したバッファー EB のボリュームを半分にします。
    14. バーコードDNA濃度およびサイズ分布は、dsDNA高感度アッセイキットならびに蛍光光度計およびフラグメントアナライザー15、16を用いて決定する。バーコードcDNAは、この時点で4°Cで最大72時間、または-20°Cで最大4週間保存できます。
  6. バーコードライブラリの構築
    1. 1mLの80%エタノールを調製する。
    2. 滅菌 PCR ストリップチューブでバーコードライブラリー PCR マスターミックスを調製する: 26.25 μL の 2x ホットスタート PCR レディミックス、2.5 μL の 10 μM ユニバーサル i5 プライマー、2.5 μL の 10 μM RPI プライマー、3.5 ng のバーコード cDNA(ステップ 5.14 からの濃度で決定される容量)、および最終容量を 50 μL にするのに十分なヌクレアーゼフリー水を組み合わせます。
      1. 複数のMULTI-seqライブラリが一緒に配列されている場合は、バーコードライブラリごとに一意のRPIプライマーを使用します。
    3. バーコードライブラリーマスターミックスをライブラリー調製PCRに供する:95°Cで5分間;98 °C で 15 秒、60 °C で 30 秒、72 °C で 30 秒の 10 サイクル。72°Cで1分間;その後、4°Cで保持した。
    4. ボルテックスは常磁性ビーズベースのサイズ選択試薬を再懸濁させる。
    5. サーモサイクラーからPCR産物を取り出し、常磁性ビーズベースのサイズ選択試薬を80 μL(1.6x)加えます。徹底的にピペット。
    6. 室温で5分間インキュベートする。マグネットセパレータを高い位置に置き、溶液がクリアされるのを待ちます。
    7. 上清を除去して廃棄する。
    8. ビーズに200μLの80%エタノールを加え、30秒間放置する。上清を除去して廃棄する。
      1. 手順 1.6.8 を繰り返して、合計 2 回の洗浄を行います。
    9. チューブを短時間遠心分離し、磁気セパレーターの低い位置に置きます。タイマーを2分間開始します。
    10. 残りのエタノールをP20ピペットで取り出し、磁気セパレータ上のビーズを残りの2分間風乾します。2分を超えないようにしてください。
    11. 磁気分離器からチューブを取り出し、ビーズを25μLのバッファーEBに再懸濁します。ピペットで十分に混合し、ビーズを再懸濁します。
    12. 室温で2分間インキュベートする。
    13. 低い位置にある磁気セパレータに戻り、溶液がクリアされるのを待ちます。上清を新しいPCRストリップチューブに移します。
    14. 発現ライブラリーおよびバーコードライブラリーの濃度およびフラグメントサイズ分布を、adsDNA高感度アッセイキットおよび蛍光光度計およびフラグメント分析装置を用いて定量する。
  7. 3' 遺伝子発現ライブラリー構築
    1. 製造業者の指示に従って3'遺伝子発現ライブラリー構築を行う14.
  8. シークエンシング
    1. ステップ7で増幅された内因性cDNAライブラリに加えて、ステップ6で増幅されたバーコードライブラリを提出する。簡単にするために、これらのライブラリを別々に提出するか、または費用対効果の高い尺度として、内因性cDNAライブラリと共にサンプルバーコード材料のアリコートを含める。細胞あたり20,000~50,000 cDNA~3,000~5,000バーコード読み取りをターゲットにします。
    2. 結果のシーケンス bcl ファイルをセルレンジャー mkfastq によって fastq ファイルに変換し、セルレンジャー数によってこれらから生成された行列をカウントします。
    3. デコンボリュートサンプルは、MULTI-seq GitHubリポジトリ(https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/MULTI-seq)で入手可能なdeMULTIplex rパッケージを使用したセルレンジャー分析後のサンプルです。

2. 対をなす scRNA-seq および scATAC-seq

  1. scATAC-seqのためのフラッシュフリーズ組織およびscRNA-seqのための網膜細胞のメタノール固定
    1. メディアの準備
      1. 網膜解離のための溶液を調製するには、ステップ1.1.1および1.1.4を繰り返す。
      2. 小さな氷のバケツにエタノールドライアイスバスを準備します。
      3. ヌクレアーゼフリー水4.5mLに10.5mLのエタノールを加えて、15mLの70%エタノールを調製する。
      4. 氷のバケツにドライアイスを(できればペレット状で)加えて、15 mLの液体が氷を覆うだけになるようにします。15mLのエタノールを加える。
      5. 氷の上にPBSを置き、100%メタノールの1mLアリコートを便利な-20°Cの冷凍庫に入れます。
    2. サンプル調製
      1. 手順1.2.1および1.2.2に従って網膜を単離する。しかし、今回は各網膜を別々の微量遠心管に入れます。
      2. scATAC-seq宛てのサンプルの場合は、P200ピペットを使用して微量遠心チューブから液体を取り出し、直ちにキャップしてチューブをエタノールドライアイスバスに入れ、サンプルをフラッシュフリーズさせます。
      3. scRNA-seq宛てのサンプルについて、細胞を解離させるには、解剖した網膜上でステップ1.2.3~1.2.15を繰り返します。
      4. 細胞を300 x gで室温で3分間遠心分離する。
      5. 細胞ペレットを破壊せずに上清を除去する。
      6. 1mLのチルドPBSを加え、細胞が完全に懸濁するまで10回または穏やかにピペットミックスする。
      7. 300 x gで4°Cで5分間遠心分離する。
        1. 手順 2.1.2.5 ~ 2.1.2.7 を繰り返して、合計 2 回の洗浄を行います。
      8. 細胞ペレットを破壊せずに上清を除去する。
      9. 100 μL のチルド PBS を加え、10 倍または細胞が完全に懸濁するまで穏やかに混合します。
      10. 最低速度設定でチューブのボルテックスを開始します。900 μLのチルドメタノール(-20°C)を1滴ずつ加えながら、チューブを穏やかにボルテックスし続け、細胞が凝集するのを防ぎます。
      11. 氷上で細胞を15分間インキュベートする。
      12. 血球計数器を用いて固定細胞の濃度を決定する。
      13. トリパンブルーを用いて固定工程の有効性を評価する。生細胞の画分が高いことは、より多くの固定時間が必要であることを示す。
      14. 凍結組織および固定細胞を-80°Cで保存する。
  2. scATAC-seqのためのフラッシュ凍結組織からの核単離
    1. メディアの準備
      1. 溶解希釈バッファーは、ヌクレアーゼフリー水 9.77 mL、100 μL の 1 M Tris-HCl (pH 7.4)、1 M NaCl 100 μL、1 M MgCl2 の 30 μL、および BSA 0.1 g を組み合わせて調製します。
      2. 溶解希釈バッファーを前日などに先に用意し、4°Cで保存する。 プロトコルの日に、氷の上に置きます。
      3. scATACキットの製造元が提供する20x核バッファーを-20°Cから室温まで平衡化します。渦と遠心分離機を短時間。
      4. 沈殿物が溶解するまで65°Cの水浴中で5%ジギトニン溶液をインキュベートすることによって1x溶解緩衝液を調製する。次に、2 mLの溶解希釈バッファー、20 μLの10% Tween-20、20 μLのノニデットP40置換体(代わりにIGEPALと標識してもよい)、および4 μLのジギトニンを組み合わせる。
      5. 氷の上に1x溶解バッファーを保管します。
      6. 0.1x溶解バッファーを調製するには、1.8 mLの溶解希釈バッファーと200 μLの1x溶解バッファーを組み合わせて氷上で保存します。
      7. 洗浄バッファーを調製するには、2 mLの溶解希釈バッファーと20 μLの10% Tween-20を組み合わせて氷上で保存します。
      8. 希釈した核バッファーを調製するには、950 μL のヌクレアーゼフリー水と 50 μL の核バッファー (20x) を組み合わせ、氷上で保存します。
    2. 核分離
      1. 溶解前にサンプルを解凍しないでください。 凍結サンプルを入れた1.5 mLの微量遠心チューブに、冷却した0.1x溶解バッファーを500 μL加えます。ペレット乳棒を用いて直ちに15x均質化する。
      2. 氷の上で5分間インキュベートする。このインキュベーション工程17の間にscATAC転置に必要な材料を準備する。
      3. ピペットを1mLピペットで10x混合し、氷上で10分間インキュベートする。scATAC転置に必要な材料の準備を、このインキュベーションステップ中に完了していない場合は完了させる。希釈核バッファーをこれ以上用意する必要はありません。
      4. 溶解した細胞に500μLのチルド洗浄バッファーを加える。ピペットミックス5倍。
      5. 懸濁液を70 μmのセルストレーナーに通し、新しい1.5 mLの微量遠心チューブに入れます。毎回新しい70 μmセルストレーナーを使用して、一度に約300 μLをろ過します。
      6. 回収したフロースルーを40 μmのセルストレーナーに通し、新しい1.5 mLの微量遠心チューブに通し、氷上で保管します。
      7. 血球計数器を用いて核濃度を決定する。核濃度および細胞懸濁液の全体積に基づいて、解離した核の総数を計算する。
      8. 500 x gで4°Cで5分間遠心分離し、核ペレットを破壊せずに上清を除去した。
      9. ステップ2.2.2.7で決定された総核数に基づいて核ストックを作成するには、所望の核濃度に達するまで十分に希釈された核バッファーに核を再懸濁する。
        注:所望の核濃度は、scATAC-seq実験のための標的核回収に基づいており、製造業者のプロトコル17にある核濃度ガイドラインから決定される。例えば、最終的に10,000個の原子核が望まれる場合、原子核ストックの所望の原子核濃度は3,080~7,700個の核/μLである。集中力ではレンジの真ん中を目指すのがベストかもしれません。
      10. 血球計数器を用いて核濃度を決定する。
      11. 直ちに、調製した核ストック17を用いたscATAC転置に進む。
  3. scRNA-Seqで使用するためのメタノール固定細胞の再水和
    1. メディアの準備
      1. 洗浄/希釈バッファーを調製するには、0.01 g の BSA を 1 mL の PBS に溶解します。その後、12.5 μL の 40 U/μL RNase 阻害剤を加え、穏やかに混合します。氷の上に保管してください。
    2. 細胞の水分補給
      1. メタノール固定細胞を1.5 mLの微量遠心管中で3000 x gで4°Cで10分間遠心分離する。 その後、上清を除去します。
      2. 200 μL のチルド洗浄/希釈バッファーを微量遠心チューブに加えます。300 x gで4°Cで10分間遠心分離し、上清を除去した。合計2回の洗浄を繰り返します。
        メモ: 前の 2 つのステップ14 で、GEM の生成とバーコード化に必要な材料を準備します。
      3. 細胞ストックを調製するために、2.1.2.12で計算された総細胞数に基づいて、所望の細胞濃度を達成するために十分な洗浄/希釈バッファーに細胞を再懸濁する。好ましい細胞濃度は、700〜1200細胞/μLの間である。
      4. 血球計数器を用いて細胞ストックの細胞濃度を決定する。
      5. 直ちに細胞ストック14を用いたGEM生成及びバーコード化に進む。
    3. シークエンシング
      1. (発生や疾患のように)経時変化解析を実行する場合、複数のサンプルを多重化実行(すなわち、単一のフローセル上の複数のライブラリ)で配列決定して、技術的なばらつきを低減します。

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Representative Results

このワークフローは、単一細胞シーケンシングを使用して発生表現型と調節プロセスを調査するための戦略をレイアウトします。MULTI-seqサンプル多重化により、初期の低コストの表現型解析アッセイが可能になり、scRNA-seqおよびscATAC-seqのサンプルのペア収集と固定により、より詳細な調査が可能になります(図1)。

MULTI-seqバーコーディングにより、複数のサンプルのシーケンスとその後の計算デコンボリューションを組み合わせることができます。原産地のサンプルは、バーコード式に基づいて各セルについて決定することができる(図2A)。これらの結合されたサンプルは、細胞クラスタリングと細胞型識別の目的で単一のデータセットとして分析することができます(図2B)。各セルはGEM生成前にバーコード化されるため、セルダブレットは複数のMULTI-seqバーコードの発現を示す確率が高く、したがって、クラスタリングと細胞型識別の前にダブレットの大部分を識別および除去することができます(図2C)。GEM生成ステップで使用される細胞の数を増やすと、見つかったダブレットの割合が増加します。scATAC-seqを使用して、scRNA-seqによって見つかった細胞型と一致する細胞型を持つデータセットを生成することができます(図2D)。scRNA-seq遺伝子発現とscATAC-seq DNAアクセシビリティ情報のペアリングは、遺伝子調節ネットワークの構築を可能にする。

Figure 1
図1:初期解析におけるMULTI-Seqの使用を実証する概略図、続いて、関心のある表現型、治療、または疾患状態の詳細な特性評価における別々のscRNA-SeqおよびscATAC-Seq解析。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:P0 Sstr2 ノックアウトマウスの対立遺伝子系列のMULTI-seqデータのUMAP次元縮小表現は、(a)データセット内の各細胞の遺伝子型のデコンボリューションおよび(b)データセット内の細胞型の同定を実証した。GEM 生成およびバーコード化ステップ中にセルが過負荷になると、(c) に見られるようなセル ダブレットが増加し、ダブレットの除去と再クラスタリングの前に (a) と (b) からのデータが表示されます。(d)において、E14においてGFP発現コントロールプラスミドを用いてエレクトロポレーションした網膜外植体からE16で得られたGFP陽性細胞からのscATAC-Seqデータ。細胞型は、細胞型特異的遺伝子のアクセシビリティに基づいて注釈が付けられる。この図は、Weir, K., Kim, D. W., Blackshaw, S. Regulation of Retinal neurogenesis by somatostatin signalingから改変されたものである。 bioRxiv 2020.09.26.314104 (2020) doi:10.1101/2020.09.26.31410418 およびオリジナルの未公開データ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

MULTI-seqのパワーは、複数の実験条件またはモデルからのデータのシームレスな統合と、コストとバッチ効果の制限の面での莫大な利点に由来します。MULTI-seqを利用することで、実験室で前例のない表現型決定の深さが得られます。細胞ハッシュや核ハッシュなどの非遺伝的多重化方法は、バーコード化された抗体の使用を通じて多重化されたサンプルへの扉を開いた7、19、20。しかしながら、これは、細胞またはその核上に発現する表面タンパク質を認識する高親和性抗体の利用可能性に依存しており、これらの抗体が利用できない場合、または細胞が適切な細胞表面または核抗原を発現しない場合、これは不可能であろう7。MULTI-seqは脂質修飾オリゴバーコードを利用して細胞またはその核に安定に組み込むため、研究者は最大96個の新鮮または固定サンプルからトランスクリプトームデータを安価でより広く適用可能な方法で収集することができます6。

対をなすscRNA-SeqとscATAC-Seqを用いた最初のMULTI-Seq表現型決定のフォローアップが提案され、トランスクリプトームデータと一致するゲノム組織を理解するために紹介される1。これは、ヘテロクロマチンおよびユークロマチン領域のアイデアを与えるだけでなく、遺伝子発現を促進する転写因子ネットワークの貴重な理解も提供する。マルチオミックアプローチは、細胞運命決定の重要なポイントで起こる動的クロマチン変化を明らかにし、発生および疾患における細胞軌道を決定するために使用することができる1,21,22。これは、バイオインフォマティクス的にデータを疑似時間、シス調節相互作用およびフットプリント解析5、23、24、25に付すことによって達成することができる。多重化実行でサンプルを固定し、複数をシーケンシングすると、バッチ効果のソースが減少し、タイムコース実験などを通じてサンプル間での比較が可能になります。必要な組織サンプルの数は、実験の範囲に依存する。胚性時点に関連する表現型を調べる場合、単一の網膜で十分であることが多く、数十万個の細胞を提供することができる。単一の網膜は、網膜外植体のエクスビボエレクトロポレーション、希少細胞集団のプロービング、または不十分なCRE活性化を伴う遺伝子モデルなど、より複雑な実験スキームにおいて十分な細胞を提供しない可能性がある。単一の網膜は数百の細胞を提供するかもしれないが、これらは完全な組織の複雑さを捕捉しない。このような実験では、研究者のニーズに基づいた最適化が必要になります。これらの技術を利用することで、MULTI-seqで解析された遺伝子が、発生や疾患などの動的なプロセス中にどのように調節されているかについての洞察を得ることができます。

遺伝子調節ネットワークの調節は、細胞プロセスと、それらが発達と疾患にどのように寄与するかを理解することの中心にあります1,26,27。ここで提示するワークフローは、特定の細胞型におけるこれらの遺伝子調節ネットワークを同定するために使用することができる。しかしながら、このプロトコルは、マウス網膜組織での使用のために最適化されている。細胞または核の数を最大化し、サンプルが新鮮であるか、凍結されているか、またはメタノール中で固定されているかにかかわらず、他の組織タイプ、エクスビボサンプル、または種からの細胞懸濁液中の細胞破片を最小限に抑えるために、溶解または解離時間、遠心分離速度/回、および濾過ステップの数などのさまざまなステップの最適化が必要な場合があります。試料がトリパンブルー染色で高レベルの生細胞を示す場合、メタノール固定時間を長くする必要があるかもしれません。MULTI-seq技術は、従来のscRNA-seqよりも多くの追加の洗浄ステップを導入します。貴重な細胞やDNAが誤って廃棄されるのを避けるためには、遠心分離速度を最適化し、通常はセルバーコーディング、GEM RT後のクリーンアップ、バーコードライブラリ構築ステップで廃棄される上清を、そのステップが成功することが検証されるまで氷上で維持することが賢明です。MULTI-seqの1つの制限は、GEM生成ステップで単一のウェルから配列決定できる限られた数の細胞、したがってサンプルです。ダブレットセルの捕捉の大幅な増加を避けるために、このステップ中にセルを過度に過負荷にしようとしないことが推奨される。20,000 個を超えるセルを含む GEM 井戸のロードは避けてください。むしろ、複数のウェルを単一の組み合わせ懸濁液から調製し、シーケンシング中に多重化することができる。これには、GEM生成のために十分な量の細胞懸濁液を準備し、ステップ5、6、および7に反復を追加する必要があり、より多くの細胞に対してより多くの総読み取りが必要となるため、シーケンシングのコストが増加します。適切な最適化により、このワークフローにより、細胞型特異的表現型および遺伝子調節ネットワークのコスト効率と時間の効率的な同定が可能になります。

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Disclosures

開示するものは何もありません。

Acknowledgments

我々は、作製されたライブラリーのシーケンシングに協力してくれたJohns Hopkins Transcriptomics and Deep Sequencing CoreのLinda Orzolek氏と、 ex vivo 網膜外植体を実施したLizhi Jiang氏に感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette filter tips
10% Tween 20 Bio-Rad 1662404
100 µM Barcode Solution Request from Gartner lab https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested
=true
100% Ethanol Millipore Sigma E7023-500ML
100% Methanol Millipore Sigma 322415-100ML
10x Chip Holder 10x Genomics 1000195
10x Chromium controller & Accessory Kit 10x Genomics PN-120263
15mL Centrifuge Tube Quality Biological P886-229411
40 µm FlowMi Cell Strainer Bel-Art H13680-0040
50 µM Anchor Solution Sigma or request from Gartner lab https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested
=true
50 µM Co-Anchor Solution Sigma or request from Gartner lab https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested
=true
5200 Fragment Analyzer system Agilent M5310AA
70 um FlowMi cell strainer Bel-Art H13680-0070
Allegra X-12R Centrifuge VWR BK392302
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9647
Chromium Next GEM Chip G 10x Genomics PN-1000120
Chromium Next GEM Chip H 10x Genomics PN-1000161
Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.1 10x Genomics PN-1000175
Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1 10x Genomics PN-1000121
Digitonin Fisher Scientific BN2006
Dissection microscope Leica
DNA LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 22431021
Dry Ice
EVA Foam Ice Pan Tequipment 04393-54
FA 12-Capillary Array Short, 33 cm Agilent A2300-1250-3355
Fisherbrand Isotemp Water Bath Fisher Scientific 15-460-20Q
Forma CO2 Water Jacketed Incubator ThermoFisher Scientific 3110
Glycerol 50% Aqueous solution Ricca Chemical Company 3290-32
Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber Fisher Scientific 02-671-51B
Illumina NextSeq or NovaSeq Illumina
Kapa Hifi Hotstart ReadyMix HiFi 7958927001
Low TE Buffer Quality Biological 351-324-721
Magnesium Chloride Solution 1 M Sigma-Aldrich M1028
Magnetic Separator Rack for 1.5 mL tubes Millipore Sigma 20-400
Magnetic Separator Rack for 200 µL tubes 10x Genomics NC1469069
MULTI-seq Primer Sigma or IDT See sequence list
MyFuge Mini Centrifuge Benchmark Scientific C1008
Nonidet P40 Substitute Sigma-Aldrich 74385
Nuclease-free water Fisher Scientific AM9937
P2, P10, P20, P200, P1000 micropipettes Eppendorf
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation LK003150
PBS pH 7.4 (1X) Fisher Scientific 10010-023
Qiagen Buffer EB Qiagen 19086
Refridgerated Centrifuge 5424 R Eppendorf 2231000655
RNase-free Disposable Pellet Pestles Fisher Scientific 12-141-368
RNasin Plus RNase Inhibitor Promega N2615
RPI primer Sigma or IDT See sequence list
Single Index Kit N, Set A 10x Genomics PN-1000212
Single Index Kit T Set A 10x Genomics PN-1000213
Sodium Chloride Solution 5 M Sigma-Aldrich 59222C
SPRIselect Reagent Kit Beckman Coulter B23318
Standard Disposable Transfer Pipettes Fisher Scientific 13-711-7M
TempAssure PCR 8-tube strip USA Scientific 1402-4700
Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.4 Sigma-Aldrich T2194
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) Corning 25-900-CI
Universal I5 primer Sigma or IDT See sequence list
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems 4375786
Vortex Mixer VWR 10153-838

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References

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Tags

神経科学 第169号 発達 疾患 scRNA-Seq scATAC-Seq MULTI-Seq マルチプレックス クロマチン
scRNA-SeqおよびscATAC-Seqを用いた網膜遺伝子発現およびクロマチンアクセシビリティの多重化解析
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Weir, K., Leavey, P., Santiago, C.,… More

Weir, K., Leavey, P., Santiago, C., Blackshaw, S. Multiplexed Analysis of Retinal Gene Expression and Chromatin Accessibility Using scRNA-Seq and scATAC-Seq. J. Vis. Exp. (169), e62239, doi:10.3791/62239 (2021).

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